Федеральное государственное образовательное учреждение высшего образования «СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Институт цветных металлов и материаловедения Кафедра органической и аналитической химии КУРСОВАЯ РАБОТА ПО ДИСЦИПЛИНЕ «СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА» ИССЛЕДОВАНИЕ КАМЕДИ СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИМИ МЕТОДОМИ АНАЛИЗА Руководитель ____________ Ю.Н. Маляр_ Студент ЦМ16-02С, 061620700 ____________ Т.М. Нурбоев Красноярск 2020 СОДЕРЖАНИЕ Введение……………………………………………………………...........3 1 Литературная часть………………………………………………….......4 1.1.1 Камедь……………………………………………………………......4 1.1.2 Галактоманнаны ………………….………………………...……….4 1.1.3 Ксантановая камедь………………………………………….............6 1.2 Спектроскопические методы анализа …………….………...……….8 1.2.1 Физические основы метода ЯМР…………………………...………9 1.2.3 Положение сигналов. Химический сдвиг…………………...…....12 1.2.4 Расщепление сигналов. Спин-спиновое взаимодействие…….....15 1.3. Исследование камеди спектроскопическим методом …………....18 1.3.1 ЯМР исследование…………………………………………………20 Заключение……………………………………………………………….23 Список литературы……………...……………………………………….24 2 ВВЕДЕНИЕ Полисахариды (гликаны) - это полимерные углеводы, молекулы которых построены из моносахаридных остатков, соединённых гликозидными связями. Хорошо известными резервными полисахаридами являются крахмал, галактоманнаны и некоторые р-глюканы. Структурные полисахариды можно разделить на два класса. К первому относят нерастворимые в воде полимеры, образующие волокнистые структуры и служащие армирующим материалом клеточной стенки (b-D-ксиланы и b-D-маннаны некоторых водорослей и высших растений). Ко второму классу относят гелеобразующие полисахариды. Характерными представителями являются галактаны, пектины и некоторые гемицеллюлозы высших растений. К защитным полисахаридам относят камеди высших растений (гетерополисахариды сложного состава и строения. Камеди (гуаровая камедь, камедь рожкового дерева, камедь конжака) являются одними из наиболее распространенных полисахаридов. В последнее время большое внимание исследователей привлекает камеди, которые широко используется в пищевой, нефтяной и косметической промышленности, к тому же она является нетоксичным, биосовместимым и относительно недорогим природным полимером [2]. Есть некоторые ограничения, но несмотря на это, они являются перспективными при химической модификации. Поэтому важно знать структуру камеди и её производных. Цель работы: изучить литературные данные об исследовании камедий спектроскопическими методами анализа. 3 Глава 1 ЛИТЕРАТУРНАЯ ЧАСТЬ 1.1.1 Камедь Камедями считают продукты, выделяющиеся из надрезов растений или получаемые в результате их промышленной переработки, а также относятся препараты на основе полисахаридов, продуцируемых некоторыми видами микроорганизмов. По своему происхождению камеди делятся на ботанические и микробные. К ботаническим относятся такие камеди как камедь карайи, гхатти, гуаровая камедь, камедь рожкового дерева, аравийская камедь (гуммиарабик). Микробные – это ксантановая и геллановая камеди. Химический состав камедей неоднороден: они относятся к гетерополисахаридам (гексозаны, пентазаны, полиурониды). По степени растворимости в воде камеди делятся на полностью растворимые (аравийская камедь), малорастворимые, но сильно набухающие (камеди вишни, сливы и другие) и нерастворимые (камеди лоха и трагаканта) [3]. 1.1.2 Галактоманнаны (гуаровая дерева, камедь конжака) Являются резервными камедь, углеводами, камедь рожкового представляющими собой полисахаридный запас клеточных стенок разнообразных альбуминовых или эндоспермных семян. Галактоманнаны построены из цепей полностью линейного (1→4)- (β-Dманнана, к которым, посредством (1→6)-α- гликозидных связей, через равные интервалы присоединены боковые цепи, состоящие из единичных остатков α-Dгалактозы (рисунок 1) [5]. Эти полидисперсные галактоманнаны можно легко отличить друг от друга по различному соотношению маннозы и галактозы, которое находится в интервале между 1,6: 1 и приблизительно 3,5: 1. Такое большое количество галактозных боковых ответвлений; составляющее около 20...40 % от общей 4 массы, предотвращает прочную когезию основной цепи, что препятствует образованию кристаллических зон. Соотношение маннозы и галактозы составляет приблизительно 4,5: 1, 3 :1 и 2: 1 для камеди рожкового дерева, камеди конжака и гуаровой камеди соответственно. Как известно, остатки галактозы неравномерно распределены вдоль цепочки, состоящей из маннозных остатков. Присутствие галактозы ведет к образованию межмолекулярных связей, поэтому если гуаровая камедь хорошо растворима в холодной воде, то две другие упомянутые камеди для полного растворения необходимо нагреть до температуры 80 – 90 °С [4]. Рисунок 1 - Химическая структура галактоманнанов (КРД – камедь рожкового дерева). Гидроксильные группы в молекулах галактоманнанов могут быть модифицированы с образованием неионных, анионных, катионных и амфотерных производных. Первичные и вторичные гидроксильные группы обладают практически одинаковой реакционной способностью. Обычно получают случайное распределение заменителей. Каждый остаток галактозы в боковых цепях содержит по четыре ОН-группы. Остаток маннозы основной цепи при наличии в нем галактозного бокового заместителя имеет две 5 свободные вторичные ОН-группы, а незамещенный маннозный остаток - три ОН-группы. Максимальная средняя степень замещения (СЗ), следовательно, равна трем. Введение дополнительных заменителей на каждую гидроксильную группу приводит к молярному замещению. На рисунке 2 представлена схематичная модель ассоциации молекул галактоманнанов при гелеобразовании [6]. Рисунок 2 - Схематичная модель ассоциации молекул галактоманнанов при гелеобразовании. Галактоманнаны чувствительны к действию сильных кислот, органических кислот, таких как лимонная, уксусная и аскорбиновая, щелочей в присутствии воздуха, сильных окислителей, особенно при повышенных температурах, а также к действию рентгеновских лучей. При подобных воздействиях возможен различный уровень деполимеризации макромолекул. 1.1.3 Ксантановая камедь Ксантановая камедь – внеклеточный полисахарид, продуцируемый микроорганизмами Xanthomonas campestris. Первичная структура ксантановой камеди, изображенная на рисунке 3, состоит из линейно связанных (1→4) молекул (β-В-глюкозы, которые образуют основную цепь), 6 где каждый второй глюкозный остаток (при третьем углеродном атоме) содержит боковую цепь из трех моносахаридных единиц. Трисахарид боковой цепи включает остаток глюкуроновой кислоты, соединенный (1→4) связью с концевым единичным остатком маннозы и (1→2) связью - со вторым остатком маннозы, примыкающим к основной цепи. Приблизительно 50 % концевых маннозных остатков содержит пируватную группу, а неконцевые (примыкающие к основной цепи) - ацетатную группу при шестом углеродном атоме. [7]. Исследования методом рентгеновской дифракции ориентированных волокон камеди ксантана позволили идентифицировать конформацию молекулы ксантана как правозакрученную пятивитковую спираль с шагом 4,7 нм, в которой длина дисахаридного структурного фрагмента основной цепи, соответственно, составляет 0,94 нм. В этой конформации трисахаридная боковая цепь связана с основной цепью и стабилизирует общую конформацию с помощью взаимодействий нековалентной природы, в основном, водородных связей. В растворе боковые цепи окружают основную цепь молекулы, обеспечивая тем самым защиту лабильной β-(1→4) связи от внешних воздействий. Считается, что именно это защита обусловливает стабильность камеди при неблагоприятных условиях. Растворы ксантановой камеди с низкой ионной силой подвергаются термическому переходу. Впервые это обнаружили по характерным сигмоидальным кривым изменения вязкости 1 %-ных растворов, не содержащих солей [8]. Более поздние исследования с использованием оптического вращения и кругового дихроизма подтвердили, что изменение вязкости сопровождается конформационными переходами ксантана. Эти результаты согласуются с переходом закрученной спирали. Была выдвинута гипотеза, что ксантановую спираль в растворе следует считать жестким стержнем. Переход является термически обратимым с восстановлением исходного состояния структуры при охлаждении. Ксантановая камедь в растворе способна также к 7 формированию межмолекулярных ассоциаций, результатом которых является образование сложной сети слабо связанных между собой молекул. Рисунок 3 - Первичная структура ксантановой камеди. Ксантановая камедь растворима в холодной воде с образованием растворов, которые проявляют свойства высоко псевдопластической жидкости. Вязкость растворов остается стабильной в широком диапазоне значений рН и температур. Кроме того, этот полисахарид не подвержен ферментативной деградации. Ксантановая камедь вступает в синергическое межмолекулярное взаимодействие с галактоманнанами - гуаровой камедью и камедью рожкового дерева (КРД), а также с конжаковым маннаном. Результатом этого являются улучшенные показатели вязкости при взаимодействии с гуаровой камедью и низкими концентрациями КРД. Взаимодействие с камедью рожкового дерева и конжаковым маннаном при более высоких концентрациях приводит к образованию мягких, эластичных и термообратимых гелей [9]. 1.2 Спектроскопические методы анализа К спектроскопическим методам относят физические методы, основанные на взаимодействии электромагнитного излучения с веществом 8 (или испускании электромагнитного излучения веществом после его возбуждения). Эти процессы приводят к различным энергетическим переходам, которые регистрируются экспериментально в виде поглощения, испускания, отражения и рассеяния электромагнитного излучения. Спектроскопические методы подразделяют на атомные и молекулярные. Аналитическими сигналами в этих методах могут быть доля поглощенного атомами (молекулами) электромагнитного излучения или величина испускаемого атомами излучения (эмиссионные методы) (рисунок 4). [10]. Рисунок 4 – Классификация спектроскопических методов. 1.2.1 Физические основы метода ЯМР Для идентификации и установления строения органических соединений в настоящее время применяются физико-химические методы. Среди этих методов одним из наиболее оперативных и информативных является ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Химики-органики часто используют спектры ЯМР сразу вслед за первой несложной очисткой реакционной смеси. Ядра атомов характеризуются массой, зарядом и спином. Спин или собственный момент частицы является фундаментальной квантовой характеристикой, не имеющей классических аналогий. В соответствии с представлениями квантовой механики состояния ядерного 9 спина квантованы. Для описания числа дискретных состояний спинового момента введено понятие спинового квантового числа I. Ядра с четным числом протонов и нейтронов имеют спиновое квантовое число (или просто спин) I = 0. Ядра с нечетными числами протонов и нейтронов обладают целочисленным спином (I = 1, 2, …). Ядра с числами протонов и нейтронов разной четности обладают полуцелыми спиновыми числами (I = 1/2, 3/2, 5/2, …). В ядрах с I ≥ 1 распределение зарядов отличается от сферического. Эта асимметрия описывается электрическим квадрупольным моментом, который взаимодействует с соседними зарядами и влияет на время релаксации. Ядра с I ≠ 0 имеют магнитный момент, вектор которого параллелен вектору спинового момента. Такие ядра называются магнитными. Связь между значением магнитного момента µ и спина выражается соотношением: µ = γħI, где ħ = h/2π, (1) h – постоянная Планка, γ - ядерное гиромагнитное отношение (постоянное для данного атомного ядра). Ядра с I = 0 не имеют магнитного момента и не дают сигнала ЯМР. К ним относятся наиболее распространенные изотопы 12 C, 16 O, 28 Si. Наиболее благоприятные для спектроскопии ЯМР ядра со спином 1/2 (без квадрупольного момента), ядра с высоким естественным содержанием в природной смеси изотопов, ядра с большой абсолютной величиной гиромагнитного отношения, например, 1 H или 19 F. Значительно ниже чувствительность для ЯМР 13C или 29Si из-за низкого природного содержания и меньшего значения ядерного гиромагнитного отношения. Очень сложно определяющие наблюдать чувствительность ЯМР 17 фактора O, для которого действуют все три неблагоприятно. Спиновое число I определяет возможные ориентации mI магнитного момента во внешнем однородном магнитном поле. Число таких ориентаций равно 2I+1. В данной работе будут рассматриваться ядра 1 H и 13C, для которых I = 10 1/2. Для них возможны две ориентации во внешнем магнитном поле: параллельная приложенному полю mI = +1/2 и антипараллельная mI = −1/2. Рисунок 5 – Зависимость энергии ядерных спинов от магнитной индукции внешнего постоянного магнитного поля. Принципиальная особенность поведения квантового магнитного момента состоит в том, что частица может принимать только несколько разрешенных значений энергии. Эти уровни можно обнаружить при поглощении или выделении кванта излучения hν. Различие энергии двух ядерных спинов со спиновым числом 1/2 во внешнем магнитном поле с магнитной индукцией B составляет γħB. Основное уравнение ЯМР, называемое условием резонанса: hν = ∆E = γħB. (2) Как следствие, получаем уравнение, которое связывает частоту электромагнитного излучения ν (Гц) с индукцией магнитного поля B ν = γB/2π. (3) Современные ЯМР-спектрометры работают в импульсном режиме. Ампулу с веществом помещают в магнитное поле, которое создаётся сверхпроводящим соленоидом. После короткого электромагнитного импульса с частотой, близкой к резонансной ЯМР-частоте, записывают на компьютер отклик образца – сигнал спада свободной индукции (FID – free induction decay). FID может быть преобразован с помощью математического Фурье-пребразования в обычный ЯМР-спектр. Процедуру импульсного воздействия и записи FID-а можно многократно повторить с целью 11 повышения чувствительности. Это особенно важно для наблюдения ядер с малой естественной распространённостью, например, 13C. При повторении N накоплений интенсивность полезного сигнала по отношению к случайному шуму возрастает в √ N раз [11]. 1.2.3 Положение сигналов. Химический сдвиг В молекуле атомные ядра, окруженные электронами, соседствуют с другими магнитными ядрами, в результате чего эффективное магнитное поле в месте расположения ядра не совпадает с внешним магнитным полем, в котором помещён образец. Резонансные частоты ЯМР сдвигаются под влиянием экранирующего действия электронных оболочек. Это явление было названо химическим сдвигом. В спектре ЯМР имеется не один, а ряд пиков. Относительное положение пиков поглощения, отражающее различное окружение, может дать очень подробную информацию о строении молекул. В постоянном магнитном поле электроны атома создают вторичное магнитное поле, направленное вблизи ядра против внешнего магнитного поля. Электронная оболочка в некоторой степени защищает (экранирует) ядро от действия внешнего магнитного поля. Электронное окружение атомов в молекулах в результате образования химических связей становится асимметричным. Если ядро входит в состав молекулы, то, во-первых, направление и величина вторичного поля зависят от строения молекулы и её ориентации относительно внешнего поля, во-вторых, теоретическое выражение для экранирования содержит дополнительный член, который имеет противоположный знак (дезэкранирование) [12]. В жидких веществах, где в результате теплового движения молекула быстро меняет свою ориентацию в пространстве, анизотропия химического сдвига усредняется по всем ориентациям молекулы в магнитном поле. Выражать химический сдвиг в единицах частоты (Гц) неудобно, поскольку в 12 этом случае он зависит от внешнего магнитного поля и, следовательно, от рабочей частоты ЯМР спектрометра ν0 (от 200 до 900 МГц для 1H). Поэтому химические сдвиги δ измеряют в безразмерных единицах – миллионных долях от рабочей частоты спектрометра. δ = ∆ν·106 /ν0, (4) где ∆ν - расстояние от интересующей нас линии до линии эталона, измеренное в герцах. В качестве эталона в ЯМР 1 H и 13 C используют сигнал тетраметилсилана (ТМС) (CH3)4Si, который добавляют к исследуемым соединениям [15]. Вследствие низкой электроотрицательности экранирование атомов 1H и 13 атома кремния C в ТМС больше, чем во многих других органических молекулах. В результате большинство сигналов ЯМР появляется с одной стороны от сигнала ТМС: в более слабом поле. В δ-шкале положение сигнала ТМС принято за 0.0 м. д. Положительным значениям δ отвечает сдвиг в слабое поле. Большинство химических сдвигов органических соединений лежат между 0 и 10 м. д., а в спектрах 13 1 H C от 0 до 200 м. д. Ранее в ЯМР 1H наряду с δ-шкалой применялась τ-шкала. Такую шкалу можно встретить в старых публикациях. В τ-шкале положение сигнала ТМС принимали за 10.0 м. д. τ = 10 – δ. (5) Можно считать, что величина экранирования любого ядра слагается из трех различных вкладов в соответствии с тем, что электронные токи на различных атомах можно рассматривать как сумму нескольких составляющих. Основные вклады в экранирование вносят следующие факторы: 1. Диамагнитное экранирование, обусловленное циркуляцией электронов в том же атоме, ядро которого рассматривается. Возрастание электронной плотности на 1s-орбитали атома водорода приводит к увеличению экранирования (к уменьшению значения δ химического сдвига). 13 Это можно проиллюстрировать, сравнивая химические сдвиги CH4, CH3Br и CH3NO2. В этом ряду обнаруживается постепенное увеличение значений δ от 0.92 к 2.62 и 4.28 м. д. –I- Эффект у нитрогруппы сильнее, чем у брома. Электронная плотность вокруг протона метильной группы снижается при переходе от метана к нитрометану, а, следовательно, уменьшается и экранирование. 2. Поправки к величине диамагнитного экранирования, обусловленные вкладом возбужденных состояний, так называемые парамагнитные токи в том же атоме. Эти поправки приводят к дезэкранированию, то есть к уменьшению экранирования при возрастании электронной плотности вокруг атома. Для ядер 1H и 13C этот вклад в экранирование, в общем, мал, однако для тяжелых ядер он может стать главным. 3. Комбинированное влияние диамагнитных и парамагнитных токов соседних атомов. Этот эффект достигает наибольшей величины, если электроны на ближайшем соседнем атоме имеют большую и анизотропную магнитную восприимчивость. Особенно важен этот эффект в случае замкнутой оболочки линейной молекулы типа ацетилена или для кольцевых электронных токов в циклических системах, например, в бензоле. Рисунок 6 – Схема возникновения дополнительного хим. сдвига, обусловленного анизотропией магнитной восприимчивости молекул. 14 При расположении перпендикулярно полю, плоскости ароматического возникающие кольцевые кольца токи бензола индуцируют вторичное поле, силовые линии которого направлены против внешнего поля над и под плоскостью кольца, в то время как на периферии кольца направление силовых линий обоих полей совпадают. В результате протоны, находящиеся на периферии, испытывают дезэкранирующее влияние. При расположении ароматического кольца вдоль внешнего поля столь значительных электронных токов не возникает, так что вклад в экранирование от кольцевых токов не исчезает при хаотических поворотах молекул в жидкости. Усреднение по всем ориентациям приводит к остаточному дезэкранирующему эффекту. В случае молекулы ацетилена значительное вторичное поле индуцируется при расположении молекулы вдоль внешнего магнитного поля. При этом в области расположения протонов его силовые линии направлены против внешнего поля, что приводит к дополнительному экранированию. Число сигналов в спектре ЯМР 1H даёт информацию о том, сколько групп эквивалентных протонов, или сколько «типов» протонов имеется в молекуле. Магнитно-эквивалентные протоны – это химически, а значит, и стереохимически эквивалентные протоны. Площадь под сигналом в спектре ЯМР 1Н прямо пропорциональна числу протонов, вызывающих сигнал [13]. 1.2.4 Расщепление сигналов. Спин-спиновое взаимодействие В спектрах дополнительное высокого расщепление, разрешения вызванное часто непрямым обнаруживается спин-спиновым взаимодействием ядер. Спин-спиновая связь возникает между ядрами, соединенными ковалентной связью или системой связей. Магнитные ядра индуцирую вокруг себя магнитные поля, в результате чего в электронной оболочке молекулы возникает магнитный момент, вызывающий расщепление 15 магнитных уровней соседних магнитных ядер. Расщепление отражает окружение поглощающих протонов, но не электронами, а другими соседними протонами. Рассмотрим в качестве примера соединение, в котором у двух соседних атомов углерода имеется соответственно пара вторичных протонов и третичный протон. Магнитное поле, которое «чувствует» вторичный протон - CH2−CH < может немного увеличиваться или уменьшаться магнитным моментом соседнего протона. Увеличиваться, если третичный протон ориентирован в направлении приложенного поля, или уменьшаться, если третичный протон ориентирован против приложенного поля. Сигнал расщепляется на два пика: дублет с пиками равной интенсивности (рисунок 7). Рисунок 7 – Схема расщепления сигналов ЯМР 1Н во фрагменте -СН2−СН< На третичный протон -CH2−CH< влияют спины двух соседних протонов. Существуют четыре равновероятные комбинации ориентации спинов для этих двух протонов, две из которых эквивалентны. Сигнал третичного протона расщепляется на три симметрично расположенных пика: триплет с относительными интенсивностями 1: 2: 1, отражающими двойную вероятность двух эквивалентных комбинаций. В общем случае группа n эквивалентных протонов расщепляет соседний сигнал в ЯМР-спектре на (n+1) пик. Таким образом, площадь пика отражает число поглощающих протонов, а мультиплетность расщепления отражает число соседних протонов. Расстояние между линиями мультиплета называется константой спинспинового взаимодействия J (КССВ). 16 Простые правила для мультиплетности справедливы только в том случае, когда различие химических сдвигов (∆ν, Гц) многократно превышает КССВ. На практике это означает, что должно соблюдаться условие ∆ν/J> 6. Вблизи границ этого условия уже наблюдаются отклонения от идеального соотношения линий мультиплета. Это так называемый «эффект крыши», когда внутренние пики, т.е. пики, расположенные ближе к другому мультиплету, с которым первый взаимодействует, больше внешних [13]. Рассмотрим изменения, наблюдаемые в спектре ЯМР 1 Н фрагмента CH2−CH< при уменьшении разницы химических сдвигов -CH2- и >CH-групп (рисунок 8). По мере уменьшения соотношения ∆ν/J изменяются интенсивности линий, появляются дополнительные линии, расстояния между линиями становятся различными. Такие сложные спектры могут быть проанализированы только с использованием компьютерных программ. Рисунок 8 – Спектры ЯМР 1Н фрагмента -CH2−CH< при различных соотношениях разницы хим. сдвигов –СН2- и -СН< групп к величине КССВ. Спин-спиновое взаимодействие имеет следующие основные свойства: 17 1. Спин-спиновое взаимодействие не индуцируется внешним магнитным полем. Поэтому КССВ J в отличие от химического сдвига ν, измеренного в герцах, не зависит от рабочей частоты. 2. Не наблюдается расщепления вследствие взаимодействия между эквивалентными протонами. Например, протоны СН3-группы не расщепляются между собой; также не наблюдается расщепления между протонами при С-1 и С-2 в 1,2-дихлорэтане Cl-CH2-CH2-Cl. 3. Константа J зависит от свойств и числа связей и от геометрии молекулы. Геминальные константы относятся к протонам, разделенным двумя связями, например, Н−С−Н. Эти константы занимают диапазон от –23 Гц (циклопентадиен) до +40 Гц (формальдегид) [11]. Для метана 2 JHH = −12.5 Гц. Вицинальные константы 3 JHH возникают за счет взаимодействия через 3 связи, например, Н−С−С−Н. Эти константы практически всегда положительны и занимают диапазон 0÷20 Гц. Карплус показал, что константа 3 JHH в этаноподобных молекулах зависит от двугранного угла ϕ. Характерной особенностью карплусовской зависимости является существенное уменьшение КССВ при ϕ ≈ 90° и максимальные значения при ϕ = 0° и ϕ =180°. Прямые КССВ между протоном и изотопом углерода-13 можно наблюдать в спектрах ЯМР 1 Н по сигналам 13С-сателлитов. Константы 1 JHС зависят главным образом от гибридизации атома С [12]. Для углерода в sp3 -состоянии 1JHС = 125÷135, для sp2 - 1JHС = 155÷172, а для sp1 - 1JHС = 248÷251 [14]. 1.3 Исследование камеди спектроскопическим методом В качестве объекта исследования была выбрана камедь пажитника. Муку пажитника (100 г) экстрагировали н-гексаном при комнатной температуре и центрифугировали (1ч.). Осадок обрабатывали 70% этанолом и продолжили центрифугирование(1ч.). 18 Полученный осадок тщательно экстрагировали при комнатной температуре, в течение 1 часа. После центрифугирования, Ph водной фазы доводили до 4,5 с помощью разбавленной уксусной кислоты при 48 ° C. Полученный полисахарид дополнительно подвергали очистке (осаждением комплексом меди). Водный раствор, дополнительно очищали с помощью GPC на геле TSK (HW-65F). Эксперименты проводились на Bruker DRX 600 - спектрометр, работающий на частотах 600,13 и 150,91 МГц для 1 H и 13 C соответственно. Образец полисахарида (9 мг) растворяли в D2O (0,5 мл) и анализировали при температуре 343 К с использованием 5 - мм QNP (X (13C, 15N, 31P) / 1H; Z-градиент). В качестве внутреннего стандарта был использован t-BuOH (1H: 1,23 м.д., 13C: 31,3 м.д) [16] При дальнейшей очистке полисахарида с помощью ГПХ (gel TSK) выделялись две основные фракции, Fra.1 (высокомолекулярная) и Fra.2(низкомолекулярная). Fra.1 была однородной и отражалась острым пиком, тогда как Fra.2 была слегка гетерогенной с небольшой широкой вершиной (рисунок 10). Рисунок 10 – Профиль полисахарида ГПХ на gel ТSК (HW-65F). 19 Таблица 2. Соотношение галактозы и маннозы во фракциях AEPB. Fra.1 и Fra.2 содержали галактозу и маннозу в соотношение 1: 1,04 и 1: 1,12 соответственно. Разница в соотношение галактозы и маннозы может быть связана с расщеплением цепи. Из этого был сделан вывод, что галактоманнан в пажитнике устойчив, так как, демонстрирует заметно меньшую потерю кристалличности при высыхании, по сравнению с камедями рожкового дерева, гуара или таро. Вариации галактозы к единицам маннозы в семени галактоманнана объясняется наличием различных соотношений галактозил-маннозил- трансфераз между видами, а также модификациями после осаждения [17]. 1.3.1 ЯМР исследование ЯМР является позволяющих одним установить из наиболее структуру информативных полисахаридов, а в методов, частности галактоманнанов. В данном исследовании были задействованы методы анализа ЯМР 1H и 13 C. А также двухмерное исследование HSQC. Были вычислены химическое сдвиги по ЯМР и записаны в таблицу 3. Результаты как 1D, так и 2D исследований 1 H и 13 C ЯМР дали полное и надежное распределение сигналов. 20 Таблица 3. Химические сдвиги 1 H и 13 C Fra.1. Ранее было установлено, что соотношение галактозы к маннозе 1:1. Соответственно было необходимо узнать, как будет замещаться основная маннозная цепь. Количество аномерных протонов хорошо разделено. Однако обнаружено, что два сигнала галактозы на H-6 перекрываются, как показано одним кросс-пиком HSQC и его интенсивность в спектре 1H. Положение C-6 β-D-маннопиранозильного звена представляет особый интерес. Этот резонанс наблюдается при δ 68,00 м.д, что соответствует β-Dманнопиранозилу. Это явное доказательство наличия β-D-маннозил замещения. Отсутствие других резонансов, присваиваемых 1H или 13C β-Dманнопиранозила, неразветвленного по HO-6, указывает на непрерывное замещение D-маннозильных остатков. Соответственно, для значения δ C-6 6-O замещенной β-D-маннозы (δ 69,2 м.д.) наблюдался низкий сдвиг поля на 15,9 м.д. по сравнению с незамещенной (δ 63,3 м.д.). На рисунке 11 показан спектр HMBC высокомолекулярной камеди пажитника. Соответствующие дальние связи C ± H составляющих гликозильных остатков очевидны. Наблюдается H-1 (gal) при δ 5,02 связан с резонансом 13 C при δ 68,00 (C-6 β-man), в то время как H-4 при δ 3,87 связан с резонансом 21 C при δ 13 101,8 (C-1 β-man). Это также подтверждается другим кросс-пиком при δ 3,80 (H-6 для β-man), который связан с резонансом 13C при δ 100,2 (C-1 для a-gal). Эти выводы подтверждают структуру галактоманнана. Рисунок 11 – 1H – 13C HMBC спектр Fra.1. Согласно данным ЯМР спектроскопии 1Н 13С так же гетероядерной двумерной 2D спектроскопии было построена структурная единица высокомолекулярного галактоманнана пажитника (рисунок 12). Рисунок 12 – Повторяющаяся единица галактоманнана пажитника. Таким образом, очевидны аномерные связи между остатками, β-man(1→4) -β-man и a-gal- (1→6) -β-man (рисунок 12) [18]. 22 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изучены литературные данные по 18 источникам об исследовании 1 камеди 3 спектроскопическими методами анализа. Согласно данным ЯМР 1Н 13 С установлено, что присутствует цепочка из β-D-маннозы. Основная цепь связана по (1→4) положению гликозидными связями, а по (1→6) с боковыми ответвлениями с галактозами. Благодаря изучению соотношения галактозы и маннозы 1:1 можно сделать вывод, что данная камедь является однородным и водорастворимым полимером. Разница в соотношение галактозы и маннозы может быть связана с расщеплением цепи. Из этого был сделан вывод, что галактоманнан в пажитнике физически более устойчив, так как, демонстрирует заметно меньшую потерю кристалличности при высыхании, по сравнению с камедями рожкового дерева, гуара или таро. 23 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1 Кочетков, Н.К. Химия природных соединений / Кочетков Н.К., Торгов И.В., Ботвиник М.М. — К.:Наука, 1960. — 561c. 2 Тюкавкина, Н.А. Биоорганическая химия: учебник / Бауков Ю.И., Зурабян С.Э. – М.:Дрофа, 2010. – 416с. 3 Черных, В.П. Органическая химия / В.П. Черных — Х.:Основа, 1997. — 248c. 4 Сильверстейн, Р. Спектрометрическая идентификация органических соединений / Р. Сильверстейн, Г. Басслер, Т. Моррил. – М.:БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. – 577с. 5 Abbasi, S. Challenges towards characterization and applications of a novel hy-drocolloid: Persian gum. Current Opinion in Colloid & Interface Science / S. Abbasi // Nutrition and Food Sciences Research. – 2017. – V.28. – P.37–45. 6 Тенфорд, П.М. Физическая химия полимеров / П.М. Тенфорд. – М.:«Химия», 1965. – 547с. 7 Терпукова, А.Ф. О термических свойствах арабиногалактана / А.Ф. Терпукова, М.М. Чочиева, С.Д. Антоновский // Химия древесины. – 1978. – №2. – С.101-106. 8 Криштанова, Н.А. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств / Н.А. Криштанова, М.Ю. Сафонова, В.Ц. Болотова // ВестникВГУ. Серия химия. Биология. Фармация. – 2005. – №1. – С.212-221. 9 Кочетков, Н.К. Методы химии углеводов / H.K.Кочетков. – М.:Мир, 1967. – 286с. 10 Фаррар, Т. Импульсная и фурье-спектроскопия ЯМР / Т. Фаррар, Э. Беккер. – М.:Мир,1973. – 164с. 11 Чижика, В.И. Практикум по магнитному резонансу: Учеб.пособие / В.И. Чижика. – СПб.:СПбУ, 2003. – 184с. 24 12 Лундин, А.Г. Ядерный магнитный резонанс, основы и применения / А.Г. Лундин, Э.И. Федин. – Новосибирск: Наука, 1980. – 192С. 13 Липкинд, Г.М. Структурный анализ полисахаридов с линейным повторяющимся звеном на ЭВМ по данным спектров 13С-ЯМР / Г.М. Липкинд, A.C. Шашков, Н.К. Кочетков // Биоорганичекая химия. – 1987. – №6. –С.833-841. 14 Криштанова, Н.А. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств / Н.А. Криштанова, М.Ю. Сафонова, В.Ц. Болотова // ВестникВГУ. Серия химия. Биология. Фармация. – 2005. – №1. – С.296-303. 15 Неверова, Н.А. Исследование камеди лиственницы Гмелина / Н.А. Неверова, Е.Н. Медведева, А.А. Левчук, В.А. Бабкин // Химия растительного сырья. – 2017. – №2. –139с. 16 Bock, K. Thogersen, H. Nuclear magnetic resonance spectroscopy in the study of mono- and oligosaccharides.Annual Report of NMR Spectroscopy / K. Bock, H. Thogersen // Carbohydr. Polym. – 1982. – №13 – P.1-57. 17 Dea, I. C. M. Chemistry and interactions of seed galactomannans.Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry / I. C. M. Dea, A. Morrison // Carbohydr. Polym. – 1975. – V.31 – P.241-312. 18 Ramesh, H.P. Two-dimensional NMR spectroscopic studies of fenugreek (Trigonellafoenum-graecum L.) galactomannan without chemical fragmentation / H.P. Ramesh, K. Yamaki, H. Ono, T. Tsushida // Carbohydrate Polymers. – 2001. – №45. – P.69-77. 25
