Ю.Т. Дьяков, О.Л. Озерецковская, В.Г. Джавахия ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИТОПАТОЛОГИЯ ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ПРЕДИСЛОВИЕ 1 Часть I. ОБЩАЯ ФИТОПАТОЛОГИЯ 3 ГЛАВА 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ПАРАЗИТИЗМЕ 4 ТИПЫ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ХОЗЯИНА И ПАРАЗИТА СВОЙСТВА ПАРАЗИТОВ 4 6 ГЛАВА 2. МИКРООРГАНИЗМЫ - ПАРАЗИТЫ РАСТЕНИЙ ГРИБЫ – ВОЗБУДИТЕЛИ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ БАКТЕРИИ – ВОЗБУДИТЕЛИ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ ВИРУСЫ РАСТЕНИЙ И ВЫЗЫВАЕМЫЕ ИМИ БОЛЕЗНИ 22 22 29 34 ГЛАВА 3. ФЕНОМЕНОЛОГИЯ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ РАСТЕНИЙ И ПАРАЗИТОВ 48 ТИПЫ УСТОЙЧИВОСТИ ГЕНЕТИКА УСТОЙЧИВОСТИ ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ С ПАРАЗИТОМ ЧАСТЬ II. БИОХИМИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ РАСТЕНИЙ И ПАРАЗИТОВ ГЛАВА 4. ГОРИЗОНТАЛЬНАЯ ПАТОСИСТЕМА ФАКТОРЫ АТАКИ ПАРАЗИТОВ ФАКТОРЫ УСТОЙЧИВОСТИ ГЛАВА 5. ВЕРТИКАЛЬНАЯ ПАТОСИСТЕМА: ГЕНЫ АВИРУЛЕНТНОСТИ И ИХ ПРОДУКТЫ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДАННЫХ АБИОГЕННЫЕ ЭЛИСИТОРЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭЛИСИТОРЫ ЭНДОГЕННЫЕ, РАСТИТЕЛЬНЫЕ ИЛИ ВТОРИЧНЫЕ ЭЛИСИТОРЫ ГЕНЫ АВИРУЛЕНТНОСТИ И СПЕЦИФИЧЕСКИЕ 48 48 54 59 73 74 74 88 107 107 113 114 122 ЭЛИСИТОРЫ 131 ГЛАВА 6. ВЕРТИКАЛЬНАЯ ПАТОСИСТЕМА: ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ И ИХ ПРОДУКТЫ; ТРАНСДУКЦИЯ СИГНАЛА 144 ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДАМИ КЛАССИЧЕСКОЙ ГЕНЕТИКИ 144 ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ 146 ТРАНСДУКЦИЯ СИГНАЛА 152 ГЛАВА 7. ИММУННЫЙ ОТВЕТ ФИТОАЛЕКСИНЫ PR-БЕЛКИ АНТИВИРУСНЫЕ БЕЛКИ ИНГБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ФЕНИЛПРОПАНОИДЫ И ЛИГНИН ГЛИКОПРОТЕИНЫ, БОГАТЫЕ ОКСИПРОЛИНОМ СИСТЕМНАЯ ПРИОБРЕТЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ ГЛАВА 8. ГЕНЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ИХ ПРОДУКТЫ СУПРЕССОРЫ (ИМПЕДИНЫ) ПАТОТОКСИНЫ ФЕРМЕНТЫ, ДЕГРАДИРУЮЩИЕ АНТИМИКРОБНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ГЛАВА 9. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ХИМИЧЕСКАЯ ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ СОЗДАНИЕ УСТОЙЧИВЫХ К БОЛЕЗНЯМ РАСТЕНИЙ МЕТОДАМИ ГЕННОЙ НЖЕНЕРИИ СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕНЫХ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ВРУСНЫМ БОЛЕЗНЯМ СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К БАКТЕРИАЛЬНЫМ БОЛЕЗНЯМ ПОСРЕДСТВОМ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ ОГРАНИЧЕНИЯ, КОТОРЫЕ НЕОБХОДИМО УЧИТЫВАТЬ ПРИ КОММЕРЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ БИОИНЖЕНЕРНЫХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К БОЛЕЗНЯМ РАСТЕНИЙ РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА ПРЕДИСЛОВИЕ 169 169 177 181 185 190 195 199 220 221 227 238 243 243 246 254 265 277 285 287 В Советском Союзе в России написано много учебников и пособий по фитопатологии и иммунитету растений. За редким исключением (вроде экзотической «Эпифитотиологии» Л.А.Чулкиной с соавт.) они традиционны как по изложению (придерживаются утвержденным Министерством сельского хозяйства программам), так и по содержанию (не выходят за рамки сведений, полученных в первой половине ХХ века). Таким образом, революция, произошедшая в фундаментальной и прикладной биологии, в связи с использованием идей и методов молекулярной биологии и генетики, и оказавшая огромное влияние на развитие фитопатологии во всем мире, практически проходит мимо студентов и аспирантов, изучающих фитопатологию в России. Мы взяли на себя смелость ликвидировать существующий пробел и написать современное учебное пособие по фитопатологии, в котором были бы обобщены исследования в области молекулярных механизмов взаимодействия растений и их паразитов и практического использования этих исследований в фитобиотехнологиях. Книга состоит из двух частей. Первая часть «Общая фитопатология» не претендует на полноту. В ней отсутствует практически вся количественная фитопатология – методы учетов и прогнозов, анализ эпифитотий и т.д. Желающих ознакомиться с этими вопросами мы отсылаем к книге одного из авторов данного пособия Ю.Т.Дьякова «Популяционная биология фитопатогенных грибов» (М. Изд. «Муравей».1998). Задача первой части – подготовить читателя к усвоению последующих разделов, она является введением в молекулярную фитопатологию. Поэтому материал сознательно дан не полно и фрагментарно. Вторая часть целиком посвящена биохимии и молекулярной биологии взаимоотношений растений с паразитами. Поэтому в ней отсутствуют некоторые разделы, несомненно относящиеся к молекулярной фитопатологии, такие как молекулярные методы идентификации и количественных учетов паразитов, молекулярные механизмы токсичности фунгицидов и резистентности к ним фитопаразитов, неинфекционные болезни, связанные с физиологическими расстройствами, и др. Поскольку в книге основной материал посвящен наиболее горячим направлениям современной фитопатологии, по которым ведутся интенсивные исследования в разных странах, отдельные разделы книги могут быстро устареть. Но, в связи с тем, что учебник в отличие от научного обзора должен служить длительный срок, мы старались кроме фактических данных указывать на принципы, направления и перспективу исследований. Книга написана, как учебное пособие, поэтому в ней не цитированы все использованные литературные источники. Вместо этого в конце дан список книг и обзорных статей, способствующих более глубокому изучению тех или иных затронутых вопросов. Книга написана как спецкурс и предусматривает подготовленность читателя по общим вопросам генетики, физиологии растений, биохимии, молекулярной биологии. Мы надеемся, что она будет полезна не только для студентов и аспирантов университетов, сельскохозяйственных и лесных институтов, но и для преподавателей и научных сотрудников, работающих в разных областях фитопатологии и биотехнологии растений. О.Л. Озерецковской написаны разделы «Неспецифические элиситоры», «Абиотические элиситоры» и «Эндогенные элиситоры» в главе 5, «Трансдукция сигнала» в главе 6, глава 7 и раздел «Супрессоры (импедины)» в главе 8. В.Г. Джавахия написал разделы, посвященные антивирусным белкам в главах 4 и 7 и разделы, посвященные генной инженерии, в главе 9. Остальные главы и разделы написаны Ю.Т. Дьяковым. Он же осуществил общее редактирование текста. Авторы глубоко благодарны официальным рецензентам проф. В.А. Шкаликову (каф. фитопатологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева) и доктору биол. наук Д.Б. Дорохову (Центр биоинженерии РАН), а также научным сотрудникам ВНИИ фитопатологии Л. Щербаковой и Т.Н.Шманенковой и профессору МГУ М.Н. Мерзляку, сделавшим ценные замечания содержательного и редакционного характера. Часть I OБЩАЯ ФИТОПАТОЛОГИЯ Фитопатология - наука о болезнях растений. Как любая наука она в свою очередь включает ряд разделов: симптомология - изучение симптомов болезней растений; этиология - наука о возбудителях болезней растений; патологическая морфология, анатомия, физиология и биохимия; эпифитотиология - наука о массовых болезнях растений - эпифитотиях; иммунитет растений; гигиена, профилактика и терапия Как видно, фитопатология с одной стороны - раздел биологических наук ботаники, микологии, микробиологии, вирусологии, ибо направлена на исследование больного растения и возбудителей болезней, а с другой сельскохозяйственных наук - растениеводства, селекции, агрохимии, ибо направлена на создание условий, при которых потери полезных растений от болезней будут минимальными. Вышеупомянутые разделы фитопатологии объединяются в 3 блока вопросов: 1. Круг вопросов, связанных с болезнью индивидуального растения возбудители болезней, их развитие в растении, ответ восприимчивого и устойчивого растения на заражение. 2. Болезни растений в популяциях и факторы, влияющие на эпифитотии в природных фитоценозах и агроценозах. 3. Блок прикладных исследований, связанных с диагностикой, учетом, прогнозом и защитой растений от болезней, включая селекцию устойчивых сортов. Сквозная линия, объединяющая все перечисленные проблемы - изучение взаимодействий высшего и низшего организмов - растения-хозяина и паразита. Без знания, анализа и использования в практике этих взаимоотношений самые устойчивые сорта быстро потеряют устойчивость, самые активные фунгициды будут малоэффективны. ГЛАВА I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ПАРАЗИТИЗМЕ ТИПЫ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ХОЗЯИНА И ПАРАЗИТА Организмы в биоценозах могут вступать в различные взаимоотношения (табл.1) Таблица 1. Типы взаимоотношений организмов Типы взаимоотношений организмов Взаимовлияние 1-го на 2-й 2-го на 1-й нейтрализм 0 0 аменсализм - 0 комменсализм + 0 конкуренция - - паразитизм, хищничество + - мутуализм + + Примечание: /+/ - положительное влияние, /-/ - отрицательное влияние, /0/ - отсутствие влияния. По=видимому, отсутствия взаимовлияния двух организмов, находящихся в непосредственном контакте или контактирующих химически с помощью внеклеточных метаболитов, не может быть, и нули в таблице свидетельствуют лишь о том, что взаимодействия настолько слабы, что не могут быть зафиксированы применяемыми методами. Тем не менее, из приведенных в таблице типов взаимодействий фитопатолога интересуют прежде всего паразитизм и в меньшей степени комменсализм и мутуализм. Паразитизм - способность организма развиваться в (или на) другом организме и извлекать из него питательные вещества для собственного роста и размножения. Прежде чем перейти к рассмотрению особенностей паразитов, сделаем небольшое отступление. На том или ином виде растения паразитируют различные виды грибов, бактерий, вирусов и др. Их можно выделить и определить. Если растение выдернуть и оставить на том же месте, где росло, то через некоторое время начнется разложение растительных остатков грибами и бактериями, которые также можно выделить и определить. При сравнении двух списков микроорганизмов окажется, что в них почти нет общих видов. Из этого наблюдения вытекают два важных вывода: 1/ некоторые микроорганизмы (сапротрофы) заселяют только мертвые растительные ткани. Следовательно, живое растение, несмотря на наличие в нем необходимых им питательных веществ, недоступно из-за наличия каких-то защитных свойств, теряющихся после его гибели; 2/ многие грибы-паразиты, способные преодолевать защитные свойства живого растения, погибают или переходят в покоящееся состояние после его гибели. Оставим пока первый вывод, и остановимся на втором. Великий ботаник ХIX века А.деБари разделил микроорганизмы на 4 группы: 1/ облигатные сапрофиты – организмы, питающиеся мертвыми растительными остатками или почвенным гумусом и не способные развиваться на растениях; 2/ факультативные паразиты - организмы, ведущие сапротрофный образ жизни, но способные поражать ослабленные растения или их части; 3/ факультативные сапрофиты - паразиты, способные продолжать вегетативный рост и размножение на растительных остатках после гибели растения-хозяина; 4/ облигатные паразиты - организмы, способные извлекать питательные продукты только из клеток живого растения и после его гибели переходящие в покоящиеся формы или погибающие. Как видно, данная классификация исходит из соотношения сапротрофной и паразитической фаз в жизненном цикле микроорганизма. На живом растении встречаются облигатные паразиты, факультативные сапротрофы и значительно реже - факультативные паразиты. На мертвом растении - облигатные сапротрофы и факультативные паразиты и значительно реже факультативные сапротрофы. Однако эта классификация не объясняет причин сукцессии микроорганизмов после гибели растения-хозяина. Для их объяснения необходимо познакомиться со свойствами паразитов. СВОЙСТВА ПАРАЗИТОВ Трофность По типу питания микроорганизмы разделяют на сапротрофов, некротрофов и биотрофов. Первые извлекают питательные вещества из мертвых тканей, т.е. являются сапрофитами, вторые и третьи – паразиты. Однако, некротрофы прежде чем оккупировать какой-либо участок растения, убивают его своими токсичными выделениями, т.е. фактически, как и сапротрофы, питаются содержимым мертвых клеток, а биотрофы извлекают питательные вещества непосредственно из живых клеток. Различия между ними заключаются в соотношении скоростей гибели зараженной ткани (некроза) и развития паразита в растении. Если некроз опережает распространение паразита, следовательно, тип питания некротрофный, если же распространение паразита опережает некроз,- питание биотрофное. Существуют переходные формы между некротрофами и биотрофами гемибиотрофы, которые имеют смешанное питание. Сначала они питаются биотрофно, затем, после гибели зараженной ткани, продолжают развиваться в ней, питаясь некротрофно. А возбудитель парши яблони Venturia inaequalis образует внутритканевой (эндофитный) мицелий между мезофиллом и эпидермисом, не повреждая клеток (биотрофно), затем, после гибели клеток, распространяется в них некротрофно, и, наконец, после отмирания и опадения листьев продолжает развиваться в них сапротрофно. При некротрофном паразитизме воздействие на клетки хозяина более грубое, чем при биотрофном, некротрофный тип питания менее специализированный и, по-видимому, является первичным. Эволюцию типов питания от сапротрофии к биотрофии можно проследить у почвообитающих грибов, среди которых можно обнаружить различные переходные виды. Корни растений выделяют в окружающую среду большое число метаболитов, как полезных для почвенных микроорганизмов (аминокислоты, сахара и т.п.), так и токсичных для них (фитонциды), концентрация которых падает по мере удаления от корня. Организмы, приобретшие устойчивость к вредным метаболитам, получили возможность обитать вблизи корней, используя полезные. Возникла специфическая микрофлора ризосферы (вокруг корней) и ризопланы (на поверхности корней). Взаимоотношения ризосферных микроорганизмов с растениями близки к комменсализму, ибо растение оказывает на них отчетливое положительное влияние, в то время как влияние микроорганизмов на растение незначительно. У ризосферных микроорганизмов можно обнаружить некоторую специализацию к видам растений. Ризосферные микроорганизмы растут в направлении градиента концентрации метаболитов, диффундирующих из корней. Диффузия веществ резко усиливается в результате ранения поверхности корня. Наиболее неспециализированная и примитивная группа некротрофных паразитов раневые некротрофы, по-видимому, возникли из ризосферных микроорганизмов. Показано, например, что зооспоры раневого паразита гриба Pythium ultimum концентрируются около пораненного участка корня. Другой раневой паразит Rhizoctonia solani имеет оптимум развития на искусственной среде при температуре 250, в то время как наиболее сильно поражает корни хлопчатника при температуре 170. Такая разница температурных оптимумов обусловлена тем, что корни хлопчатника при 180 выделяют в окружающую среду в 7 раз больше аминокислот и сахаров, чем при 300. Раневые паразиты могут неопределенно долго развиваться сапротрофно в почве (факультативные паразиты) и обладают разнообразными антибиотическими веществами, необходимыми для конкуренции за субстрат с другими микроорганизмами; они не способны проникать через неповрежденные участки растений. Попадая в ранки, они выделяют в ткань хозяина токсические продукты (фитотоксины), которые убивают клетки, расширяя некроз - плацдарм существования паразита, и часто вызывают гибель всего растения. После этого они продолжают развиваться на растительных остатках сапротрофно. Следующий эволюционный этап - дальнейшее развитие некротрофного паразитизма. Он связан с несколькими свойствами некротрофов: 1/. С приобретением способности внедряться в неповрежденные части растения, прободением кутикулы и верхней стенки эпидермальных клеток или через устьица. Прободение клеточных покровов осуществляется механическим давлением и ферментативной деградацией составляющих их полимеров. Механическое прободение. У многих фитопатогенных грибов проросток споры заканчивается утолщенной нашлепкой - апрессорием. Формирование апрессориев индуцируется кутикулярным воском, поэтому проростки спор фитопатогенных грибов не образуют апрессориев на листьях, с которых удалена кутикула, и in vitro. Подошва апрессория плотно приклеивается к субстрату с помощью внеклеточных углеводов и (или) низкомолекулярных гидрофобных белков гидрофобинов, играющих роль вакуумной смазки. Клеточная стенка подошвы двухслойная, состоит из тонкой наружной и более плотной внутренней оболочек. В оболочке, возвышающейся над субстратом, у многих грибов откладывается меланин - темный пигмент, состоящий из конденсированных ароматических колец, и имеющий свойства молекулярной ловушки пропускать растворы внутрь клетки, но не выпускать их наружу. Поэтому в апрессории развивается высокое тургорное давление, приводящее к разрыву наиболее тонкой наружной оболочки подошвы и пробиванию клеточных покровов прорастающей вниз инфекционной гифой, которая покрыта внутренней оболочкой апрессория. Например, апрессорий возбудителя пирикуляриоза риса гриба Magnoporthe grisea (конидиальная стадия - анаморфа Pyricularia oryzae) развивает давление, равное 8 миллипаскалей; для создания клеткой такого давления необходимо, чтобы концентрация растворов в ней превышала 3 М (Talbot et al.,1996). Химическая деградация клеточных покровов. Фитопатогенные грибы и бактерии обладают большим набором ферментов, разрушающих углеводные полимеры, из которых построены клеточные стенки растений. Во-первых, с помощью этих ферментов паразит проникает в клетку и питается ее содержимым. Во-вторых, эти ферменты у некротрофных паразитов настолько активны, что снимают стенку с большей части клетки; лишенный прочного каркаса протопласт разрушается вследствие осмотических явлений, и клетка погибает, теряя иммунные свойства живого..В-третьих, разрушая срединную пластинку (межклеточный цемент, склеивающий клетки в ткани), паразиты приобретают возможность продвигаться в зараженной ткани растения. Наконец, в-четвертых, продукты деградации полимеров клеточной стенки моносахариды, используются паразитами для питания. 2/. С увеличением продолжительности пребывания паразита в растительных тканях вследствие более мягкого или локального токсического действия. Как видно, движущая сила эволюционного процесса - стремление уйти от конкуренции с почвообитающими сапротрофами в свободную нишу - живое растение, недоступное, вследствие иммунных свойств живой клетки, для большинства микроорганизмов. Самый простой способ преодолеть клеточный иммунитет - убить клетки хозяина. Но гибель хозяина означает возврат к конкуренции с почвообитающими организмами. Поэтому эволюция паразитизма это путь к биотрофии, означающий замену грубого преодоления иммунных свойств живого хозяина - некротрофии, мягкими способами, при которых клетки хозяина остаются длительное время живыми. Это достигается благодаря особенностям метаболизма биотрофных паразитов, отличающим их от некротрофов: 1. Снижение разнообразия и концентрации токсичных для растения метаболитов, в частности, гидролитических ферментов (табл.2). Например, у возбудителя мучнистой росы ячменя Erysiphe graminis гидролитические ферменты выделяются только из кончика инфекционной гифы и их активность проявляется только на расстоянии 0.1 мкм от гифы. 2. Отсутствие механического повреждения мембран вследствие апопластного (вне плазмалеммы) развития. Многие фитопатогенные бактерии и некоторые грибы развиваются исключительно в межклетном пространстве, выделяя в среду ферменты, которые разрыхляют клеточные стенки растений и способствуют диффузии питательных веществ в межклеточное пространство. Другие (биотрофные грибы) вызывают локальное растворение клеточных оболочек и через образующееся отверстие проникают в клетку, но, не разрывая плазмалеммы, впячивают ее и образуют расширенную или даже разветвленную структуру гаусторий (рис. 1), окруженный продолжением плазмалеммы экстрагаусториальной мембраной. Последняя несколько отличается от нормальной плазмалеммы химическим составом (иначе окрашивается, не имеет интрамембранных включений, стеринов и АТФ-азной активности) и многочисленными инвагинациями, свидетельствующими об активном транспорте веществ через мембрану. Между клеточной стенкой гаустории и экстрагаусториальной мембраной находится экстрагаусториальный матрикс, "нейтральная полоса", через которую осуществляется обмен метаболитами и который защищает партнеров от взаимного отравления токсичными продуктами. Таким образом, наряду с обычной для грибов адсорбцией питательных веществ всей поверхностью мицелия, биотрофы имеют и специальный трофический орган - гаусторий. Таблица 2. Активность внеклеточных ферментов, разрушающих углеводы клеточной оболочки растений (в ммол/мин х см2.) у двух фитопатогеннных грибов - некротрофа Verticillium albo-atrum (I) и биотрофа Uromyces fabae (II) Ферменты I II эндополигалактуроназа 200 0 экзополигалактуроназа 0 5 эндопектатлиаза 150 0 целлюлаза Сх 775 0 61 10 4 14 62 9 арабиназа галактаназа ксиланаза 3. Выделение в зараженные ткани растения биологические активных веществ, активизирующих их метаболизм и улучшающих условия жизни паразита. Биотрофные паразиты, в отличие от некротрофных, выделяют в зараженные ткани не столько токсичные для них продукты, сколько вещества гормональной природы, регулирующие метаболизм. Ржавчинные, головневые, тафриновые и другие грибы, многие фитопатогенные бактерии выделяют в растения индолилуксусную кислоту, гибереллины, цитокинины и другие соединения, которые приводят к значительным морфолого-физиологическим изменениям растения-хозяина: А/. Усиливается приток продуктов фотосинтеза в зараженные участки растения. Это показано, например, с помощью радиоавтографии зараженных ржавчиной листьев пшеницы, которая росла в атмосфере радиоактивно меченого углекислого газа (14СО2). На рис. 2 показано, что радиоактивная метка концентрируется в зоне заражения. Один из механизмов усиления транспорта продуктов фотосинтеза в зону заражения - перехват их паразитом и включение в соединения, отсутствующие у растения. Так, первичный продукт фотосинтеза - глюкоза потребляется растением на энергетические процессы и синтезы структурных и запасных продуктов. В клетках гриба глюкоза быстро трансформируется в шестиатомный спирт маннит, дисахарид трегаллозу, вследствие чего содержание глюкозы в зоне заражения резко падает и она транспортируется вдоль градиента концентрации. Б/. Это часто сопровождается разрастанием зараженных тканей, формированием опухолей, галлов и т.п. новообразований. В/. Зараженные участки растений стареют медленнее незараженных, дольше сохраняют ювенильное состояние. Листья после обрывания желтеют вследствие разрушения хлоропластов. Однако вокруг пустул ржавчины долго сохраняются зеленые островки. Г/. Увеличивается общая неспецифическая стойкость протопласта к повреждающим действиям. Известный американский фитопатолог Ярвуд, много сделавший для выяснения природы биотрофии, заражал одну половинку листа фасоли биотрофным паразитом (ржавчинными или мучнисто-росяными грибами), а вторую оставлял незараженной. Затем весь лист подвергался воздействиям, вызывающим повреждение и гибель клеток (высокие и низкие температуры, ядовитые поллютанты и др.). Во всех случаях зараженные половинки листьев оказывались более стойкими, чем незараженные и погибали при более интенсивных воздействиях. Поскольку причины гибели клеток от разных воздействия также различны, можно сделать вывод об общем повышение стойкости протопластов клеток зараженных растений. Таким образом, биотрофные паразиты осуществляют ту или иную степень интеграции с хозяйскими клетками. Наибольшая интеграция осуществляется фитопатогенными вирусами, а среди эукариот - паразитическими красными водорослями. Облигатные паразиты составляют более 15% родов морских красных водорослей. Они имеют мелкие редуцированные бесцветные (утратившие фотосинтетические пигменты) талломы. Большинство видов адельфопаразиты, паразитирующие на родственных видах водорослей (из одного семейства), некоторые виды (аллопаразиты) специализированы к паразитированию на неродственных видах. При контакте с клеткой хозяина паразитическая отчленяет мелкую конъюкторную клетку с ядром, которая сохраняет связь с талломом паразита через гликопротеиновую пробку (рис. 3). Конъюкторная клетка сливается с хозяйской клеткой и переливает в нее ядро, а у некоторых видов также митохондрии и протопластиды, которые реплицируются в хозяйских клетках и через межклеточные связи переходят в соседние клетки, вытесняя ядра и митохондрии хозяина. После определенного периода паразитического существования талломы некоторых паразитов приобретают пигментацию возможно за счет транспорта в них не только питательных веществ хозяина, но и его пластид. У некоторых видов красных водорослей под влиянием информации, внесенной паразитом, вокруг зараженного места начинается усиленное деление клеток, формирование раковой опухоли. Геном многих вирусов включает лишь несколько генов, необходимых для синтеза собственных компонентов - белка и нуклеиновой кислоты. Вирусы лишены ферментов энергетического обмена и белоксинтезирующего аппарата. Синтез необходимых ферментных и структурных белков происходит на рибосомах хозяйской клетки с использованием ее энергозапасающих молекул, а в некоторых случаях и ферментов, катализирующих синтез РНК. Таким образом, облигатный паразитизм может осуществляться на уровне органелл и даже молекул. Биотрофный способ питания позволяет паразиту длительное время находиться в тканях растения-хозяина. Однако за это приобретение была заплачена дорогая цена: а/ потеря антибиотических веществ и снижение активности ферментов, разрушающих полимеры растительного происхождения; б/ изменение структуры мембран, вследствие чего биотрофы выделяют в окружающую среду органические соединения; в/ высокая "пригнанность" собственного метаболизма к метаболизму хозяина, специализация к поражению только определенных видов растений. Поэтому после гибели хозяина многие биотрофные паразиты не способны возвратиться к сапротрофному питанию, не выдерживают конкуренции с некротрофами и сапротрофами (экологически облигатные паразиты), не могут заражать не родственные своему хозяину растения, а некоторые не способны даже культивироваться на искусственных питательных средах (физиологически облигатные паразиты). С другой стороны, биотрофный паразитизм, по крайней мере на первой фазе, представляет собой форму симбиотрофизма, ибо паразит находится в живых клетках или тканях хозяина и даже стимулирует их метаболизм. По-видимому, биотрофный паразитизм и симбиоз грибов и бактерий - две ветви эволюции фитопатогенов от некротрофии к биотрофии. Как видно, тип питания вызывает глубокие изменения в метаболизме и морфогенезе паразитов. Поэтому трофность является важным таксономическим признаков, по которому разделяют виды некоторых грибов и бактерий. Например, среди видов грибов рода Cladosporium есть облигатные сапротрофы, развивающиеся на органических субстратах растительного или животного происхождения, различных материалах и изделиях и даже на жидком топливе; есть очень слабые паразиты, способные заражать отмирающие ткани растений; есть виды с выраженым некротрофным питанием и, наконец, биотрофы (табл.3). Биотрофы имеют более крупные конидии, чем сапротрофы, отличаются слабой активностью ферментов утилизации аминного азота и деградации углеводных полимеров, высокой чувствительностью к антибиотическим веществам сапротрофных микроорганизмов и, следовательно, низкой конкурентоспособностью с ними. Некротрофы занимают промежуточное положение. Среди фитофторовых грибов можно также обнаружить сапротрофов, развивающихся на растительных остатках в водоемах и влажной почве (Phytophthora gonapodyides), слабо специализированных некротрофных (P.cactorum) и высоко специализированных биотрофных (P.infestans) паразитов. Также в роде Pseudomonas встречаются сапротрофные виды бактерий, например, P.aeruginosa, которая живет в почве и может вызывать загнивание ран (синегнойная палочка); сапротрофные виды, способные поражать ослабленные или стареющие растения (некоторые штаммы P.fluorescens) и активные биотрофные паразиты (P.syringae). Таблица 3. Свойства грибов из рода Cladosporium (Левкина,1974) Виды Длина Потребление Активность ферментов (усл.ед.) Летальная конидий, аминного мкм полигалактуроназы амилазы концентра- азота, ция трихоте- мкг/мл цина, мкг/мл _______________________________________________________________ Биотрофы fulvum 23.0 2.5 22 8 0.12 Некротрофы cucumerinum 11.4 6.4 34 0.46 paeoniae 7.8 7.0 33 40 0.97 9.6 6.7 33 37 0.71 macrocarpum 6.0 11.7 80 cladosporioides 7.6 8.7 92 59 15.6 sphaerospermum 9.3 9.6 65 42 3.9 herbarum 6.8 8.4 71 47 7.8 7.4 9.6 77 49 7.8 Среднее Cапротрофы Среднее 3.9 Специализация Паразиты растений имеют различные типы специализации: Филогенетическая специализация - это специализация по таксонам растений-хозяев. На этом основании выделяют монофагов, поражающих растения в пределах одного рода (или нескольких близких родов), олигофагов, специализированных в пределах семейства растений-хозяев, и полифагов, поражающих растения из многих семейств, порядков и даже классов. Биотрофы концентрируются среди моно- и олигофагов, некротрофы - среди олиго- и полифагов. Это понятно, ибо биотрофия предусматривает высокую «пригнанность» обмена паразита к типу обмена хозяина. Например, гриб Phytophthora infestans поражает много видов, относящихся к подроду Eusolanum сложного рода Solanum, но не поражает виды, относящиеся к подроду Stellatipillium того же рода. Это свойство биотрофов используется в систематике растений при установлении степени родства между видами растений с неясным таксономическим статусом. В процессе экспериментальных исследований представления об олиго- и полифагии многих паразитов пересматривались. Первый пересмотр широты специализации был сделан 100 лет назад, когда шведский фитопатолог Эрикссон показал, что споры возбудителя стеблевой ржавчины злаков Puccinia graminis, взятые с пшеницы, заражают только пшеницу, но не другие злаки. Следовательно, неразличимые по морфологии штаммы оказались физиологически различными, а вид олигофага Р.graminis включает в себя несколько специализированных форм. В связи с этим, после видового названия многих фитопатогенных грибов указывают специализированную форму, например, P.graminis f.sp.(formae speciales) tritici (пшеничная форма возбудителя стеблевой ржавчины); Erysiphe graminis f.sp.hordei (ячменная форма возбудителя мучнистой росы злаков). Таким образом, если по типу трофности проводят разделение видов, то по специализации проводят внутривидовую дифференциацию, разделение видов на специализированные формы. Второй удар по полифагии был нанесен в последнюю четверть века, после того, как стало известно, что морфологические виды многих грибов представляют собой комплексы, состоящие из большого числа генетически изолированных друг от друга биологических видов-двойников. Например, гриб Rhizoctonia solani, живущий в почве в форме стерильного мицелия, но иногда способный формировать базидиальную стадию (телеоморфу) Thanotephorus cucumeris, - полифаг, поражающий всходы огромного числа видов голосеменных и покрытосеменных растений. Однако, было обнаружено, что гифы отдельных штаммов сливаются с гифами лишь некоторых других. Поскольку для этого гриба взаимная миграция ядер через гифальные анастомозы - единственный путь обмена генетической информацией, неанастомозирующие штаммы представляют собой генетически обособленные биологические виды. Их называют анастомозными группами (АГ) с порядковыми номерами. Описано более десяти анастомозных групп, из них наиболее распространены четыре: АГ1. Встречается в поверхностном слое почвы и паразитирует на широком круге растений (в основном, бобовых и злаковых). Вызывает гнили семян, всходов и взрослых растений. Описаны три подгруппы, различающиеся специализацией: АГ1-1А, вызывающая гниль колосковых чешуй риса, АГ1- 1В вызывает паутинистую гниль вегетативных тканей разных растений, и АГ1-1С, поражающая сахарную свеклу и гречиху. АГ2. По частоте взаимных анастомозов изоляты АГ2 разделяют на подгруппы АГ2-1 (выделяют преимущественно из крестоцветных) и АГ2-2 (из маревых и других растений). Подгруппа АГ2-2, в свою очередь, подразделяется на изоляты, вызывающие ожог влагалищ ситника (IIIB), и корневую гниль сахарной свеклы (IYB). АГ3. Поражает главным образом пасленовые растения, вызывая такие широко распространенные болезни картофеля, как черная парша клубней, гниль ростков, белая ножка. АГ4. Широко специализированная группа, вызывающая гнили семян и всходов растений из семейств Chenopodiaceae, Solanaceae, Fabaceae, Rosaceae и др. Содержит несколько подгрупп, различающихся комплексом признаков, включая специализацию: АГ4-1 паразитирует на сахарной свекле, АГ4-2 - на льне; АГ4-3 - на картофеле. По-видимому, предковые штаммы Rhizoctonia solani обитали в почве как сапротрофы или слабые неспециализированные паразиты ослабленных растений. Из целинных почв выделена группа штаммов, названная АГВ1. Эти штаммы сапротрофны и анастомозируют с штаммами из других групп. При переходе в агроценозы, где большие площади заняты одинаковыми по восприимчивости растениями (одним сортом) возникли штаммы, способные поражать эти растения. Для того, чтобы не снизить паразитические свойства вновь возникших штаммов генами сапротрофных форм при анастомозах, возникли генетические барьеры между ними. Гипотетическая эволюция анастомозных групп R.solani показана на рис. 4. Аналогичная ситуация описана у другого фитопатогенного гриба Phytophthora megasperma. По морфологическим (размеру ооспор), физиологическим (температурному оптимуму для роста), молекулярным (структуре некоторых белков и ДНК) признакам и паразитической специализации этот вид разделен на два - P.megasperma и P.sojae. Первый полифаг, поражающий разные растения (хвойные, розоцветные и др.), второй олигофаг, встречающийся на бобовых. Последний, в свою очередь, разделяют на штаммы, специализированные к сое, люцерне, гороху и др., которым присваивают статус видов, подвидов или специализированных форм. Даже у такого неспециализированного паразита, как возбудитель серой гнили земляники, капусты, подсолнечника и других растений Botrytis cinerea, по-видимому идет эволюция в направлении сужения специализации. Об этом свидетельствует наличие в роде Botrytis наряду с широко специализированным видом B.cinerea более узко специализированных B.allii (на луке), B.tulipae (на тюльпанах), B.fabae (на конских бобах) и др. В то же время новые молекулярно-генетические данные вызвали необходимость объединения некоторых узкоспециализированных видов в один. Так у нескольких десятков видов фитопатогенных бактерий рода Pseudomonas, разделявшихся по специализации на табаке, фасоли, сое и других растенияххозяевах, различия в структуре ДНК оказались настолько незначительными, что они были объединены в один вид с узко-специализированными патологическими вариантами. Также сделано объединение видов грибов из рода Alternaria, поражающих грушу, яблоню, землянику и др., в вид A.alternata. Онтогенетическая специализация проявляется в приуроченности паразита к отдельным этапам онтогенеза растения-хозяина. Изучению онтогенетической специализации паразитов большое значение придавал известный фитопатолог М.С.Дунин, ибо, регулируя скорость протекания восприимчивой фазы онтогенеза с помощью агротехнических или иных приемов, можно значительно снизить потери от болезни. Некоторые грибы (возбудители твердой головни пшеницы Tilletia tritici, парши яблони Venturia ineaqualis, корневых гнилей всходов) поражают только молодые растения или их органы, в то время как другие (возбудители фитофтороза картофеля Phytophthora infestans, вертициллезного увядания хлопчатника Verticillium dahliae и др.) поражают, наоборот, стареющие растения. Имеются также и широко специализированные паразиты, сопровождающие восприимчивое растение в течение всей его жизни (например, фузариозы злаков). Однако, в ряде случаев широкая онтогенетическая специализация, как и филогенетическая, оказывается мнимой. Так, известный нам уже гриб Rhizoctonia solani сопровождает растения сахарной свеклы от семян (плесневение проростков и всходов) до зрелых корнеплодов после уборки (кагатная гниль). Однако, оказалось, что всходы поражают штаммы АГ4, а кагатную гниль вызывают штаммы АГ2-2, т.е. разные биологические виды. Тканевая (гистотропная) и органотропная специализации. Некоторые паразиты развиваются только в определенных органах и тканях растений. Так, одни вирусы поражают флоэму, другие - паренхиму. Грибы и бактерии, вызывающие инфекционное увядание (вилт), находятся в ксилеме растений и нарушают транспорт воды из корней в надземные части. Возбудитель рака картофеля гриб Synchytrium endobioticum поражает столоны и клубни, но не корни. Многие грибы и бактерии, вызывающие образование пятен, поражают только или главным образом листья. При изучении органотропной специализации необходимо различать такие понятия, как зона заражения (части растения, в которых находится паразит) и зона заболевания (части растения, на которых проявляются внешние симптомы болезни. Эти зоны могут совпадать и не совпадать (табл. 4). Споры ржавчинных грибов заражают листья злаков, мицелий распространяется внутри листа на небольшое расстояние, после чего формируется спороношение, в виде ржавого порошка, обнажающегося через разрыв эпидермиса. Такие же местные симптомы вызывают многие грибы и бактерии, поражающие листья. Головневые грибы заражают формирующиеся семена или молодые всходы злаков и развиваются внутри растения системно. После образования генеративных органов (колосьев, метелок) мицелий переходит в них, усиленно там развивается и распадается на темноокрашенные споры, отчего колосья приобретают обугленный вид. Следовательно, заражено все растение, а заболевание проявляется только на генеративных органах. Таблица 4. Зоны заражения и заболевания у растений ¦ Зона заражения ¦ ¦ местная общая ¦ местная общая ¦ местная местная ¦ ¦ Зона заболевания ¦ ¦ общая общая ¦ ржавчины злаков головня злаков ¦ ¦ Примеры корневые гнили ¦ ¦ ¦ вирусные болезни Многие возбудители корневых гнилей находятся только в корнях, но вызывают ослабление роста, пожелтение и даже гибель всего растения. Наконец большинство вирусов растений распространены по всему растению и вызывают общее его заболевание. Патогенность Патогенность – основное свойство фитопатогенных организмов. Этот термин можно рассматривать в узком и широком смысле слова. В узком смысле патогенность – способность вызывать повреждения у зараженного растения. В этом смысле некротрофы, приводящие к быстрой гибели растения или их части, более патогенны, чем биотрофы с их щадящим действием на растения. В широком смысле патогенность – рассматривается как комплекс признаков, отличающих паразитов от непаразитов. Однако, как видно из данных, представленных в табл. 3, паразиты отличаются от сапрофитов большим числом признаков (и, следовательно, генов) – морфологических, физиологических, биохимических. Для изучения сложного понятия патогенность, его можно разделить на качественную и количественную составляющие. Качественная составляющая патогенности – вирулентность, - представляет собой способность данного генетически однородного штамма паразита развиваться за счет генетически однородного образца растения-хозяна. По вирулентности виды фитопатогенных организмов дифференцируют на специализированные формы и расы. Физиологической расой или расой по хозяину называют группу штаммов, вирулентных к образцам растений, имеющих одинаковые гены устойчивости. В связи с качественным характером вирулентности нельзя говорить о более высоком или низком ее уровне, но можно характеризовать расы с более или менее широкой вирулентностью, подразумевая под этим число генетически разнородных образцов растений, поражаемых сравниваемыми расами. Агрессивность – количественный компонент патогенности. Под агрессивностью понимают степень патогенности расы, т.е. способность вызвать массовое поражение восприимчивых растений – эпифитотию. В понятие агрессивности входят: 1/. Минимальная инфекционная нагрузка. По этому показателю биотрофные грибы, многие виды которых способны вызывать заражение одной спорой, более агрессивны, чем некротрофные; у последних проростки спор должны предварительно сформировать анастомозирующую сеть, в которой в результате амплификации генопродуктов накопится необходимое для заражения количество метаболитов – ферментов, токсинов и др. 2/. Короткий латентный период (от заражения до образования потомства), обусловливающий образование нескольких последовательных генераций в течение одного сезона (полициклическое развитие). 3/. Обильное образование потомства. Таким образом, в отличие от вирулентности можно говорить о большей или меньшей агрессивности. Соотношение агрессивности вирулентности показано на схеме (табл. 5) Таблица 5. Пораженность образцов растений штамами паразита (в баллах) __________________________________________________________________ Штаммы паразита Сорта растений А Б В а 1 2 1 б 0 0 4 в 4 4 4 Штамм а имеет широкую вирулентность (поражает все три сорта), но низкую агрессивность; штамм б – высокую агрессивность, но узкую вирулентность; штамм с – широкую вирулентность и высокую агрессивность. Таким образом, штаммы, авирулентные к данному сорту, для него не агрессивны, а вирулентные для него штаммы могут иметь разную степень агрессивности. ГЛАВА II. МИКРООРГАНИЗМЫ - ПАРАЗИТЫ РАСТЕНИЙ ГРИБЫ - ВОЗБУДИТЕЛИ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ Общая характеристика Грибы выделены в отдельную группу организмов, отличающихся как от растений, так и от животных, прежде всего типом питания. Грибы не автотрофы, у них нет хлоропластов, они могут утилизировать лишь запасенную в органических соединениях энергию. Это отличает их от растений. В отличие от животных грибы - осмотрофы, они питаются всасыванием питательных веществ из окружающей среды. Эти особенности питания наложили отпечаток на морфологию и физиологию грибов: 1/, Тело большинства грибов представлено мицелием, состоящим из сильно разветвленных гриф. Такое строение позволяет максимально оккупировать субстрат, будь то почва или растение, для извлечения из него питательных веществ. Грибы всасывают питательные вещества всем телом. 2/. Осмотрофный тип питания заставляет все вегетативное тело гриба максимально погрузиться в субстрат, но при этом становится трудно распространяться и оккупировать новые субстраты. Поэтому споры грибов выносятся над субстратом на специальных, часто сложно устроенных структурах (спорангио- и конидиеносцах, плодовых телах). Спороносящие структуры эндофитных грибов, паразитирующих в тканях растений, освобождаются через устьица или разрывы эпидермиса. 3/. Грибы в качестве источников энергии должны утилизировать сложные органические соединения, которые вследствие большого молекулярного веса не могут проходить в клетку через оболочки. Поэтому грибы выделяют в окружающую среду ферменты-деполимеразы, вызывающие деградацию полимеров. Грибы - источники высокоактивных деполимераз. 4/. Грибы должны создавать в клетках высокое тургорное давление для того, чтобы вода с растворенными питательные веществами поступала из субстрата в мицелий. И сапротрофные, и паразитные грибы питаются в основном растительными тканями. Связь грибов с растениями, по-видимому, сложилась на самых ранних этапах их эволюции. Самые примитивные грибы - хитридиомицеты и оомицеты паразитируют на самых примитивных растениях - водорослях. Некоторые микологи считают, что грибы вышли на сушу под покровами вышедших на сушу растений, как их паразиты и симбионты. Полагают также, что симбиотические грибы обеспечили адапатацию зеленых растений к наземному существованию. Почти нет грибов, живущих в симбиозе с животными, но огромное число видов грибов находится в постоянных симбиотических связях с растениями. Ферментативный аппарат грибов настроен на разложение углеводов - строительного материала и запасных питательных веществ растений. Поэтому не только паразитические грибы избрали объектами своего нападения в основном растения, но и сапротрофные грибы питаются трупами растений, оставляя трупы животных бактериям. Почти исключительно грибы участвуют в разложении мертвой древесины. Система грибов и болезни растений, вызываемые ими Царство грибов включает представителей нескольких независимо эволюционирующих групп (отделов). Фитопатогеннные грибы входят в состав следующих отделов и классов: ОТДЕЛ MYXOMYCOTA (миксомицеты или слизевики) - скорее животные, чем грибы, ибо гаплоидная стадия их жизненного цикла представлена свободноживущими зооспорами и амебами, а диплоидная - плазмодием, не покрытым клеточной оболочкой и способным к амебообразным движениям в направлении более благоприятных условий жизни (таксисам). Подобно животным, плазмодии способны не только к адсорбционному питанию, но и к заглатыванию мелких клеток (бактерий, дрожжей). Класс Plasmodiophoromycetes - облигатные паразиты, развивающиеся на подземных органах растений и вызывающих их разрастание (кила крестоцветных) или растрескивание (порошистая парша картофеля). II. ОТДЕЛ HETEROCONTHOPHYCOTA (разножгутиковые) - скорее водоросли, чем грибы, ибо имеют разножгутиковые зооспоры, целлюлозу и глюкан в оболочке (у большинства грибов - хитин и глюкан), оогамный половой процесс, сходные с водорослями направления метаболизма. К грибам примыкают потерявшие хлоропласты гетероконты. Класс Labyrinthulomycetes - водные организмы, формирующие плазмодии в виде анастомозирующей сети в теле крупных водорослей (макрофитов) или морской травы зостеры. Часто вызывают гибель пораженных растений. Класс Oomycetes - водные и наземные организмы, большинство видов имеет мицелий без перегородок. Размножаются зооспорами с двумя неравными по длине и форме жгутиками. Половой процесс оогамия. Питаются сапротрофно на остатках растительного или животного происхождения или паразитируют на водорослях, корневой системе и надземных частях растений. Многие оомицеты вызывают вредоносные болезни (корневые гнили, ложные мучнистые росы). III. ОТДЕЛ EUMYCOTA (истинные грибы). Класс Chytrydiomycetes - организмы, живущие в воде, влажной почве и в желудках жвачных животных. Разные виды формируют плазмодий, ризомицелий (центральные "собирательные" клетки и разветвленные мицелиальные отростки без ядер) или настоящий мицелий с ядрами без перегородок. Размножаются подвижными зооспорами, имеющими 1 направленный назад гладкий жгутик. Многие виды паразитируют на водорослях и наземных растениях. Класс Zygomycetes - организмы, имеющие мицелий без перегородок, неподвижные споры, у большинства видов, формирующиеся эндогенно (в спорангиях) и половой процесс, сходный с коньюгацией (зигогамия). Питаются сапротрофно или симбиотрофно (как микоризообразователи) в почве, но могут вызывать загнивание созревших сочных органов растений (земляники, капусты, лука); многие виды паразитируют на насекомых. Класс Ascomycetes - формируют мицелий с перегородками, имеющими поры в центре. Размножаются неподвижными спорами, формирующимися экзогенно (конидиями). Образующаяся при половом процессе зигота сразу редукционно делится с образование восьми (реже четырех) эндогенных гаплоидных мейоспор (аскоспор) в асках (сумках). Многие виды утратили половой процесс и размножаются исключительно конидиями (их выделяли в отдельный класс несовершенные грибы Deuteromycetes). Сапротрофные виды обитают в почве, на мертвых растениях, навозе травоядных животных. Паразиты вызывают массовые заболевания растений. Класс Basidiomycetes - формируют мицелий с сложно-устроенными долипоровыми перегородками. Размножаются конидиями и мейоспорами (базидиоспорами), которые в отличие от аскомицетов формируются по 4 экзогенно на выростах (стеригмах) специальных клеток - базидий. Вызывают массовые болезни культурных и дикорастущих травянистых и древесных растений, разложение мертвой древесины; многие виды вступают в симбиотические ассоциации с корнями растений (эктотрофная микориза). Почти во всех перечисленных классах есть паразиты растений из разных трофических групп: Некротрофы. вызывают следующие основные группы болезней: Корневые гнили вызывает множество почвообитающих грибов, часто раневых паразитов. Основные виды: Olpidium brassicae (класс Chytrydiomycetes) - возбудитель черной ножки капустной рассады; Pythium ultimum из класса Oomycetes (корнеед свеклы, хлопчатника, лесных пород и др.); Thielaviopsis (Thielavia) basicola из класса Ascomycetes, возбудитель черной корневой гнили табака, гороха, хлопчатника; Rhizoctonia solani (Thanothephorus сucumeris) из класса Basidiomycetes (корневые гнили свеклы, хлопчатника, лесных пород и множества других видов растений). Раковые поражения коры деревьев часто вызывается раневыми паразитами, которые поселяются на мертвых подмороженных или поврежденных иным образом участках, выделяют в окружающие ткани токсины и после гибели оккупируют их. Таковы Phytophthora cactorum (Oomycetes), поражающая плодовые из семейства Rosaceae; сумчатые грибы из родов Valsa, Nectria и Cryphonectria, вызывающие поражения ветвей и стволов лиственных пород; Ржавчинные грибы из семейства Melampsoreceae, эциальная стадия которых вызывает раковые поражения коры хвойных пород (сосны, можжевельника). Трахеомикозы - поражение сосудов ксилемы. Характерно для многих сумчатых и несовершенных грибов, развивающихся в сосудах и вследствие выделения гидролитических ферментов и токсинов, нарушающих ксилемный транспорт. Внешнее проявление болезней - увядание при отсутствии дефицита влаги. Грибы из родов Verticillium и Fusarium могут сапротрофно существовать в почве и заражают растения из многих порядков через повреждения корневой системы. Грибы из рода Ophiostoma (=.Ceratocystis) циркулируют только на видах широколиственных растений и заражают цветки во время питания насекомых, заспоренных конидиями. Стволовые гнили обычно вызваны трутовыми или агариковыми грибами из класса Basidiomycetes. Наиболее вредоносны Heterobasidium annosum (корневая губка) и Armillaria mellea (осенний опенок), заражающие деревья через корни; Phellinus igniarius (ложный трутовик), Fomitopsis pinicola (окаймленный трутовик) и другие, споры которых попадают в ткани дерева через повреждения стволов и ветвей. Послеуборочные гнили - одна и наиболее вредоносных групп болезней по следующим причинам: 1/ хранящаяся продукция, как правило, имеет высокое содержание воды в клетках (сочные плоды, корнеплоды и др.); 2/ отделенные от растения органы имеют пониженную сопротивляемость по сравнению с находящимися на растении; 3/ потеря иммунитета в процессе созревания плодов сложилась вследствие необходимости их сгнивания для освобождения семян. В связи с этим большинство возбудителей болезней растений при хранении неспециализированные некротрофные паразиты, как это показано в таблице 6, в то время как биотрофы и гемибиотрофы поражают вегетирующие растения. Из класса оомицетов Phytophthora cactorum часто является причиной гнили яблок; среди зигомицетов гниль плодов земляники вызывает Rhizopus nigricans и другие виды. Больше всего возбудителей болезней растений при хранении отмечено среди сумчатых и несовершенных грибов: Glomerella cingulata (возбудитель горькой гнили яблок), Botrytis cinerea и Sclerotinia sclerotiorum (возбудители серой и белой гнилей многих растений), виды рода Phoma (гнили корней моркови и свеклы), виды рода Penicillium (гнили плодов цитрусовых) и другие. Таблица 6. Соотношение некротрофных и биотрофных грибных болезней овощных и плодовых культур по данным отечественных учебников по фитопатологии __________________________________________________________________ Культуры Биотрофы в том числе, % и гемиби- в отрофы в поле поле и при Некротрофы при в том числе, % в хране- в поле поле и при хранении нии при хране- хранении нии Картофель 3 67 33 0 10 20 30 50 Капуста 2 100 0 0 8 37 50 13 Свекла 4 75 25 0 5 20 20 60 Морковь 0 4 0 50 50 Лук 3 1 0 0 100 0 0 100 Гемибиотрофы вызывают большей частью локальные повреждения листьев пятнистости. Большинство возбудителей этих болезней - сумчатые и несовершенные грибы из родов Mycosphaerella (белые пятнистости), Alternaria, Septoria, Venturia и др. Грибы родов Colletotrichum, Gloeosporium при поражении сочных частей растений (створок бобов, плодов дыни, огурца) вызывают более глубокие язвы, названные антракнозами. Биотрофы вместе с симбиотрофами (включая лишайники) - составляют около половины описанных видов грибов (табл.7). Основные болезни, вызванные биотрофными грибами: Налеты спороношений паразитов на поверхности пораженных органов (листьев, стеблей, плодов). Широко распространены белые или буроватые налеты, названные настоящими и ложными мучнистыми росами. Первые вызывают аскомицеты из порядка Erysiphales. Мицелий большинства мучнисторосяных грибов распространяется по поверхности пораженного органа и лишь гаустории погружены в эпидермальные клетки. Здесь же на поверхности формируются и конидиеносцы с цепочками конидий, придающих налетам порошащий вид. Ложную мучнистую росу вызывают оомицеты из порядка Peronosporales, мицелий которых развивается эндофитно, а налет образован выходящими через устьица спорангиеносцами и спорангиями. Поскольку устьица расположены с нижней стороны листа, в отличие от настоящих мучнистых рос налеты от ложных также образованы с нижней стороны Таблица 7. Распределение биотрофных грибов в царстве Mycota (Lewis, 1973) ¦Группы ¦Всего видов ¦ ¦Протистоидные грибы* ¦ 1600 ¦Зигомицеты ¦ 600 ¦Аскомицеты не лишайники ¦ ¦ лишайники ¦ Всего ¦ 500 ( 32%) 150 ( 25%) 15000 ¦ 4000 ( 27%) 18000 ¦ 18000 (100%) ¦ 12000 ¦ 7000 ( 58%) 15000 ¦ 150 ( 1%) 62200 ¦ 29800 ( 48%) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Базидиомицеты ¦Дейтеромицеты в том числе биотрофов * грибы, формирующие зооспоры (оомицеты,хитридиомицеты и др.) . Пустулы, образованные разрывами эпидермиса, обнажающими спороношения паразита, характерны для порядка Uredinales (ржавчинные) базидиальных грибов. Головня - темные, как бы обугленные участки пораженной ткани, характерны для базидиальных грибов из порядка Ustilaginales (головные). Эти грибы поражают только травянистые однодольные или двудольные растения, вызывая симптомы головни в генеративных органах или на стеблях и листьях. Гиперплазия и гипертрофия. Часто поражение биотрофными паразитами вызывает изменение гормонального баланса растения и интенсивное разрастание зараженных органов или тканей вследствие усиления деления клеток или их растяжения. Галлообразование и возникновение деформаций вызывают грибы из разных классов: миксомицет Plasmodiophora brassicae (кила корней крестоцветных); оомицет Albugo candida (белая ржавчина); хитридиомицет Synchytrium endobiolicum (рак картофеля); аскомицеты из порядка Taphrinales (деформации разных органов); базидиомицет Ustilago maydis (пузырчатая головня кукурузы) и др. БАКТЕРИИ – ВОЗБУДИТЕЛИ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ Общие сведения о фитопатогенных бактериях Бактерии - самые мелкие клеточные организмы с прокариотным строением клеток. Их размеры колеблются от 0,5 до 4.5 мкм в длину и от 0,3 до 0.6 мкм в ширину. Некоторые виды по размерам приближаются к крупным вирусам. На плотных питательных средах фитопатогенные бактерии образуют блестящие или матовые, прозрачные или мутные, иногда окрашенные в желтый цвет колонии. Некоторые бактерии образуют вокруг клеток капсулы, формирующиеся вследствие выделения наружу полисахаридов. Одна из функций слизистых капсул - предохранение клеток от высыхания и действия солнечной радиации. Кроме того капсулы защищают фитопатогенные бактерии от связывания их клеток, находящихся эндофитно в межклетном пространстве растений, оболочками клеток хозяина. Поэтому капсульные формы бактерий более вирулентны, чем бескапсульные. На пораженных бактериями органах растений часто заметен эксудат - слизистые выделения бактерий, образующих капсулы. По форме различают несколько типов бактериальных клеток и их скоплений, однако, большинство фитопатогенных бактерий имеют клетки в виде прямых или слабо изогнутых палочек. Иногда палочки образуют легко распадающиеся цепочки (как у возбудителя бактериального ожога овса Pseudomonas syringae pv.coronafaciens). У коринебактерий такие цепочки могут даже ветвиться, а у актиномицетов ветвящиеся цепочки образуют длинные разветвленные нити (мицелий). У некоторых бактерий (род Bacillus) внутри клеток образуются эндоспоры, которые покрыты толстыми оболочками и могут выдерживать без потери жизнеспособности неблагоприятные воздействия окружающей среды. Большинство фитопатогеннных бактерий подвижно. Жгутики, с помощью которых осуществляется движение, располагаются полярно (на концах клетки) и перитрихально (по всей поверхности). Полярные жгутики могут быть одиночными (у монотрихов) или в виде пучка (у лофотрихов). Система фитопатогенных бактерий и вызываемые ими болезни. Долгое время в основе системы бактерий лежали такие признаки, как строение клеточной стенки (по данным окрашивания по Граму), морфология, способность к спорообразованию и ферментативная активность (определяется по сбраживанию различных белков, углеводов и проч.). Для системы фитопатогенных бактерий большое значение имели симптомы вызываемых болезней (например, бактерии, вызывающие мягкие гнили вследствие разложения пектина, выделяли в род Pectobacterium) и круг поражаемых растений (в связи с чем видовое название бактерий часто соответствовало названию растения-хозяина: (Pseudomonas tabaci, например). Применение молекулярных методов (анализа структуры ДНК) показало, что гены, под контролем которых находятся казавшиеся важнейшими признаки, такие как продукция ферментов или специализация к хозяевам, занимают настолько небольшие участки генома, что не могут иметь большой диагностической ценности. На основе гибридизации ДНК различных штаммов возникло понятие о геномных видах, к которым относят штаммы, имеющие более 70% гибридизирующихся участков и различия в температуре плавления ДНК, не превышающие 50. Молекулярная классификация, включающая секвенирование (определение последовательности нуклеотидов) рибосомальных генов, ДНКДНК и ДНК-РНК гибридизацию и другие приемы, позволила избежать противоречия фенетических классификаций. В настоящее время применяют комплексные системы, сочетающие на разных по иерархии таксономических уровнях молекулярные и фенотипические данные. Согласно таким классификациям, фитопатогенные бактерии включаются в следующие таксоны: ОТДЕЛ FIMICUTES (грам-положительные). Род Вacillus - подвижные спорообразующие перитрихи. B.megathericum - возбудитель гнили плодов кабачка, тыквы, картофеля,кукурузы и других растений главным образом в южный районах. Может длительное время обитать в почве, питаясь сапротрофно. Род Clavibacter (= Corynebacterium) - неподвижные бактерии, образующие цепочки. C.michiganense – бактерии, обитающие в ксилеме пасленовых и вызывающие инфекционное увядание (вилт), c двумя подродами: subsp.michiganense - возбудителем бактериального рака томатов и subsp.sepedonicum - возбудителем кольцевой гнили картофеля. ОТДЕЛ GRACILICUTES (грам- отрицательные) Сем.Enterobacteriaceae. Подвижные перитрихи, объединенные в род Erwinia, вызывают два типа болезней: Ожоги наземных частей растений, вызванные инфильтрацией в зараженные ткани бактериальных токсинов. E.amylovora вызывает почернение цветков и листьев яблони и груши. Мокрые гнили клубней, стеблей, плодов различных растений, вследствие распада зараженных тканей под действием пектолитических ферментов. E.carotovora, E.chrysanthemi, E.atroseptica и др. Сем.Pseudomonadaceae. Подвижные моно- или лофотрихи. Включает роды Pseudomonas, Burkholderia и Xanthomonas. Представители последнего образуют пигмент, вследствие чего их колонии окрашены в желтый цвет. Бактерии из рода Pseudomonas вызывают несколько типов болезней: P.savastanoi pv.savastanoi - опухоли на ветках пораженных олеандров и маслин. Многие псевдомонады заражают листья разных видов растений, вызывая образование пятен, окруженных светлым ореолом (вследствие инфильтрации в окружающие ткани бактериального токсина, вызывающего распад хлоропластов. Их разделяли на виды, на основе специализации: P.tabaci возбудитель бактериальной рябухи табака, P.phaseolicola - возбудитель ореольной пятнистости фасоли и т.д. Применение методов геносистематики показало, что различия между ними не выходят за пределы внутривидовых вариаций, поэтому 45 видов, вызывающих пятнистости листьев, было объединено в два вида, которому по правилу приоритета присвоено название P.syringae и P.savastanoi с большим числом патологических вариантов: P.syringae pv.tabaci, P.savastanoi pv.phaseolicola и др. Burkholderia (=Pseudomonas) solanaсearum- вызывает опасное заболевание трахеобактериоз или южное бактериальное увядание пасленовых. Бактерии из рода Хаnthomonas вызывают пятнистости листьев и других пораженных органов (гоммоз хлопчатника и др.), поражение сосудов (сосудистый бактериоз капусты), гнили плодов (бактериоз огурца) и другие болезни. Как и в предыдущем случае, многим видам присвоен статус патологических вариантов внутри видов X.campestris, X.axonopodis, X.oryzae, X.vesicatoria. Сем.Rhizobiaceae. Подвижные бактерии с полярными жгутиками. Вызывают опухоли пораженных частей растений. Род Rhizobium включает клубеньковых бактерий, которые, внедряясь в клетки корней бобовых растений, вызывают их разрастание (образование клубеньков). В клубеньках бактерии с помощью фермента нитрогеназы включают молекулярный азот из воздуха в химические соединения, которые усваиваются растениями. Поэтому, несмотря на некоторый вред, наносимый бактериями (отток питательных веществ в зараженные участки корня для формирования клубеньков и питания бактерий), присутствие ризобий в корнях дает растению большие выгоды (мутуалистический симбиоз). Среди видов рода Agrobacterium наиболее распространен A.tumefaciens. Попадая из почвы через ранки в ткани растений, эти бактерии вызывают разрастание зараженной ткани, образование галла. Чаще всего - раковые наросты возникают на прикорневой части стебля (корончатые галлы), но могут формироваться на корнях, стеблях, листьях и других частях растений. Бактериальным раком поражаются растения, относящиеся более, чем к 40 семействам двудольных растений, среди них такие важные, как виноград, яблоня, подсолнечник, томаты и др. Другой распространенный вид A.rhizogenes вызывает усиленное разрастание корней пораженных растений. Опухолевый рост индуцирует крупная Ti (tumor inducing) плазмида, которая выходит из бактериальных клеток в зараженные растительные; участок этой плазмиды интегрируется в растительную хромосому; реплицируется и экспрессируется в ней, как дополнительные гены. Клетка начинает синтезировать ростовые вещества, вызывающие образование галла, и особые аминокислоты (опины), недоступные для усвоения растением, но служащие питанием для бактерий. После того, как были выяснены своеобразные черты взаимоотношений агробактерий с растительными клетками, пристальное внимание к ним проявили не только фитопатологи, но и молекулярные биологи. Ведь Tiплазмида - удобный вектор, который можно нагрузить полезными генами и передать их растению от донора, разделенного с акцепторным видом репродуктивным барьером нескрещиваемости. A.tumefaciens стала излюбленным объектом при генных манипуляций с растениями. ОТДЕЛ TENERICUTES (бактерии без оболочек или микоплазмы) Микоплазмы представляют собой мелкие бактерии, лишенные клеточной стенки и поэтому меняющие форму клеток. Многие микоплазмы имеют овальную форму, переходящую в грушевидную, гантелевидную и т.д. Другие представляют собой вытянутые спирально скрученные клетки (спироплазмы). Микоплазмы - биотрофные паразиты, обитающие в сосудах пораженных растений (большинство видов - в флоэме). Они нарушают флоэмный транспорт метаболитов и регуляцию ростовых процессов, вследствие чего вызывают такие симптомы, как мелколистность, чрезмерная кустистость, хлороз. Передача от растения к растению осуществляется сосущими насекомыми. Облигатный внутриклеточный паразитизм, способ передачи и симптомы вызываемых болезней сближают фитопатогенные (фитоплазмы) микоплазмы с вирусами. ГРУППА AСTINOMYCETES (актиномицеты). Актиномицеты образуют тонкий, разветвленный мицелий со спорами, которые формируются на концах гиф свободно или в спорангиях. Хотя они имеют типично прокариотные клетки, их таксономический статус внутри эубактерий не ясен. Актиномицеты - почвенные сапротрофы, развивающиеся в богатых органическим веществом почвах, однако, некоторые виды рода Streptomyces могут заражать клубни картофеля, вызывая их поверхностные поражения (обыкновенная парша). ВИРУСЫ РАСТЕНИЙ И ВЫЗЫВАЕМЫЕ ИМИ БОЛЕЗНИ Строение вирусов растений К вирусам относят неклеточных прокариот, имеющих следующие общие черты: 1/ наличие только одного типа нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК); 2/ отсутствие собственной белоксинтезирующей системы (рибосом); 3/ отсутствие ферментов энергетического обмена. Эти особенности ставят вирусы в полную зависимость от хозяина: все вирусы - облигатные паразиты бактерий, растений или животных. Химический состав вирусов значительно более простой, чем состав самых мелких бактерий. Все вирусы содержат одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, покрытых молекулами белка одного типа (у некоторых вирусов имеется несколько типов белков оболочки), которые образуют кристаллические структуры. У наиболее сложно устроенных вирусов эти структуры погружены в наружную мембрану, имеющую в своем составе белки, липиды и углеводы. Геном вирусов. Основные функции нуклеиновых кислот у клеточных организмов репликация, транскрипция и трансляция разделены между двумя типами молекул - двухтяжной ДНК и однотяжной РНК. При репликации молекула ДНК расплетается и на каждой цепи с помощью фермента ДНК-полимеразы строится комплементарная ей вторая цепь. При транскрипции на цепочке ДНК (плюс-нити) фермент РНК-полимераза строит в определенном направлении (от 5' конца молекулы к 3’ концу) комплементарную ей цепочку РНК (минус-нить). При трансляции на молекуле РНК, как на матрице, в обратном направлении (от 3' к 5' концу) с помощью аппарата рибосом из отдельных аминокислот синтезируется молекула белка. У вирусов один тип молекулы (РНК или ДНК) выполняет все три функции репликации, транскрипции и трансляции. К тому же у большинства вирусов эти молекулы имеют однотяжные структуры, которые могут нести плюс или минусфункции (табл. 8). Таблица 8. Структура геномов вирусов растений Типы генома Число вирусов процент _________________________________________________________ 1-тяжная ДНК 26 4 2-тяжная ДНК 13 2 1-тяжная РНК (плюс-цепь) 470 76 85 14 26 + 4 1-тяжная РНК (минус-цепь) 2-тяжная РНК все вирусы грибов ____________________________________________________________ Как видно, только небольшое число вирусов растений имеют двухтяжные информационные молекулы, считывание информации с которых осуществляется аналогично клеточным организмам. Большинство фитопатогенных вирусов имеют одну полифункциональную /+/-цепь РНК. Ее функции – хранение и реализация информации. Кроме того /+/РНК является инфекционной молекулой. После попадания вирусной частицы, содержащей /+/цепь РНК, в клетку, прежде всего происходит декапсуляция, т.е. освобождение молекулы РНК от покрывающих ее белковых молекул. Этот процесс осуществляется на рецепторах клетки протеазами растения-хозяина. Следующий процесс - репликация катализируется ферментом РНК-зависимой РНК-полимеразой (репликазой), которая у большинства вирусов растений кодируется собственным геномом. РНК типичного для этой группы вируса табачной мозаики (ВТМ) кодирует 4 белка (рис. 5). Трансляция начинается с 5' конца молекулы - синтеза 126 и 183 kDa белков - компонентов репликазы. Эти белки появляются в клетке на ранних этапах инфекционного процесса поэтому их называют ранними белками. У другого вируса желтой мозаики турнепса (ВЖМТ) в зараженной клетке образуется гибридная репликаза: один ее компонент 115 kDa, кодируется вирусным геномом, а второй - белок с молекулярной массой 45 kDa - геномом клетки хозяина. По-видимому, использование ферментной системы хозяина для репликации вирусных РНК обычное явление, ибо для многих зараженных вирусами растений характерно резкое увеличение синтеза РНК-зависимой РНК полимеразы при заражении. РНК полимераза строит /-/цепь РНК, комплементарную /+/цепи вирусной РНК. В результате этого в зараженной клетке появляется репликативная форма вирусной РНК (РФ РНК), представляющая частично или полностью двухцепочную структуру. /-/Цепь служит матрицей для синтеза новых молекул вирусной /+/РНК, а последняя функционирует как mРНК при трансляции на рибосомах клетки хозяина поздних вирусных белков. У ВТМ таковы 30kDa транспортный белок и 17.5 kDa структурный белок оболочки (рис.5). Наконец, последний процесс - инкапсуляция заключается в созревании целой частицы самосборки молекул структурного белка на поверхности РНК. Таким образом, у вирусов с /+/цепью РНК после попадания в клетку частица вируса исчезает и происходит дезъюнктивное (разобщенное) размножение нового поколения вирусов,более сходное с заводским конвейером, нежели размножением клеточных организмов (синтез отдельных компонентов, который осуществляется подчас в разных компартментах клетки, и сборка целых частиц). У вирусов, имеющих /-/цепь РНК, последняя неинфекционна, ибо не может функционировать в качестве матричной РНК. Поэтому кроме покрытых белком молекул РНК в частице содержатся и ферменты, в частности РНК- транскриптаза и др., и все это покрыто дополнительной оболочкой, содержащей липиды. Такая частица входит в клетку хозяина как "Ноев ковчег" с собственными ферментами. В дальнейшем синтез нового поколения вирусов осуществляется не разобщенно, а в одном компартменте. В отличие от клеточных организмов, геном вирусов испытывает дефицит информации, ибо может кодировать всего несколько белков. У некоторых вирусов молекула нуклеиновой кислоты несет не четыре, как РНК ВТМ, а несколько больше рамок считывания, однако, увеличение запаса информации должно сопровождаться увеличением длины информационной молекулы, а одноцепочные молекулы, характерные для большинства вирусов, не имеют структурной жесткости, присущей двухцепочным, и при увеличении длины теряют необходимую для узнавания ферментами структуру. Проблему лимита информации разные вирусы решают по-разному: 1/. Фрагментирование генома. При центрифугировании некоторых вирусов, выделенных из зараженных растений, в градиенте плотности цезия или сахарозы (в центрифужную пробирку наслаивают растворы хлористого цезия или сахарозы от более концентрированного к менее концентрированным, сверху помещают исследуемый препарат и центрифугируют; смесь частиц в препарате, различающихся молекулярной массой, хорошо разделяется в градиенте на отдельные фракции) было обнаружено, что они представляют собой смесь более крупных и мелких частиц. Каждая фракция в отдельности неинфекционна или слабо инфекционна, а смесь обладает высокой инфекционностью. В растении соотношение крупных и мелких частиц обычно постоянно. Было обнаружено, что хотя частицы покрыты одинаковыми молекулами белка, их РНК отличается по структуре и кодируемым белкам, например, в длинных частицах РНК кодирует синтез ранних белков- ферментов, а в коротких - структурных белков оболочки. Первые способны заражать растения и формировать новое поколение РНК, но нестабильны и не способны сохраняться вне клетки растения, вторые стабильны, но не могут заражать растения и размножаться в них. У вирусов погремковости табака, кольцевой пятнистости малины, черной кольцевой пятнистости томатов, мозаики огурца и др. обнаружено по два компонента; у вируса мозаики коровьего гороха - три, а у вируса мозаики люцерны - четыре. 2/. Использование помощника. Выше говорилось, что недостаток информации заставил некоторые вирусы использовать ферменты клетки хозяина в процессе репликации и трансляции. Есть вирусы (их предложено называть вирусоидами), которые имеют молекулу РНК, состоящую всего из нескольких сот нуклеотидов и не способную кодировать больше одного белка (например, структурного белка оболочки). Остальные белки, необходимые для внутриклеточного созревания, вирус получает от другого вируса-помощника, и поэтому не может существовать в клетках, незараженных помощников. Таков вирус SV - сателлит вируса некроза табака (ВНТ). Он никогда не присутствует в свободных от ВНТ растениях и хотя покрыт собственной белковой оболочкой, использует ранние белки, кодируемые ВНТ. 3/. Независимая от помощников репликация короткой кольцевой молекулы РНК, не имеющей информации о структурном белке. Эти молекулы (вироиды) способны самореплицироваться в растении и вызывать серьезные заболевания (веретеновидность клубней картофеля и др.). Структурные вирусные белки. Молекулы структурных белков вирусов растений объединяются друг с другом определенным образом в кристаллические структуры, называемые капсидами. Одну или несколько тесно сближенных белковых молекул, из которых складывается капсид, называют морфологической единицей или капсомером. Капсомеры у разных вирусов уложены в спиральные трубки (вирусы со спиральной симметрией) или в многоугольники (вирусы с икосаэдрической симметрией). Капсид, содержащий внутри нуклеиновую кислоту вируса, называют нуклеокапсидом. Вирусы со спиральной симметрией имеют под электронным микроскопом вид палочек или нитей. Внутри спирально уложенных молекул белка (капсомеров) проходит нить РНК, также свернутая в спираль, шаг которой повторяет шаг спирали капсида. Форма вирусных частиц зависит от соотношения длины частицы к ее ширине. Если такое отношение меньше 50, то вирусные частицы имеют вид палочек (таковы вирусы прогремковости табака с размером частиц 130-210х20 нм и табачной мозаики с размером 300х18 нм). При отношении длины частицы к ширине 50 и более раз, они имеют вид гибких нитей. Такой вид имеют частицы группы Х вируса картофеля (480-580х10 нм), Y вируса картофеля (750х15 нм) и др. А длина частиц вируса желтухи свеклы достигает 2000 нм при толщине всего 10 нм. Вирусы с кубической (икасоэдрической) симметрией капсида имеют форму икосаэдров - многоугольников с 12 вершинами и 20 гранями. Вершины многоугольников образованы капсомерами, состоящими из пяти агрегированных молекул белка (пентамеров), а грани и ребра - из большого числа (кратного 20) капсомеров, состоящих из 6 белковых молекул (гексамеров). У большинства вирусов растений с кубической симметрией капсида содержится 180 молекул белка (12 пентамеров и 20 гексамеров). Наконец, у некоторых вирусов растений (бронзовости табака, желтой карликовости картофеля и др.) длинный нуклеокапсид со спиральной симметрией или несколько нуклеокапсидов (если вирус имеет фрагментированный геном), заключены в наружную мембрану, из белков плотно упакованных в гексагональную структуру, и липидов. Таким образом, вирусные частицы, наблюдаемые в электронном микроскопе, представляют собой покоящиеся структуры (вирионы). В вегетативной фазе в процессе внутриклеточного размножения вирионов их нет. Зрелые вирусные частицы следующего поколения образуют в зараженных клетках вирусные включения в виде различного рода кристаллов или аморфных Х-тел, в которых вирусные частицы перемешаны с цитоплазмой клетки хозяина. Включения могут формироваться в цитоплазме (ВТМ, УВК и др.), ядрах (вирусы желтухи свеклы, желтой мозаики ячменя), хлоропластах (вирусы желтой мозаики турнепса, штриховатости ячменя), митохондриях (вирус погремковости табака), вакуолях (вирусы огуречной мозаики, некроза табака, ХВК). Вирионы некоторых вирусов (ВТМ, ХВК) накапливаются в зараженных клетках в очень высокой концентрации и чрезвычайно устойчивы к внешним воздействиях (нагреванию, высушиванию). Другие вирусы (вирус бронзовости томатов, УВК) нестойкие и инактивируются при значительно более мягких воздействиях. Симптомы вирусных болезней По тканевой специализации вирусы разделяют на паренхимные и флоэмные. .Первые находятся в клетках листовой паренхимы и вызывают различные ее повреждения. Самый обычный симптом болезней, вызываемых паренхимными вирусами - чередования темно-зеленых и более светлых участков листа мозаика. Светлые участки могут быть светло-зелеными (зеленая мозаика), желтыми (желтая мозаика) и белыми (белая мозаика). При инфекции ВТМ и некоторыми другими мозаичными вирусами мозаичная расцветка наблюдается только в том случае, если листья были заражены в молодом возрасте; инфекция зрелых листьев протекает бессимптомно. В светлых участках содержится в 250 раз больше вирусных частиц и в 4 раза меньше хлорофилла, чем в темно-зеленых. Вследствие задержки роста светлых участков возникают деформации зараженных листьев - пузыревидные вздутия участков листа, морщинистость вследствие более глубокого расположения жилок, а в некоторых случаях разрушение листовой паренхимы, которая сохраняется только в непосредственной близости от жилок. При некоторых вирусных болезнях светлые участки распределены по листу не случайно, а образуют рисунки в виде колец (кольцевые мозаики), волнистых полос (гравировки) и др. Часто заболевания сопровождаются некротическими поражениями жилок листа (полосчатые мозаики), переходящими на черешки и стебли (стрик томатов, вызванный ВТМ). Флоэмные вирусы вызывают заболевания, которые ранее по сходству с болезнью желтуха астр называли желтухами. Сейчас, однако, показано, что желтуху астр вызывает не вирус, а бактерия без оболочки - микоплазма. Локализация вирусов в флоэме часто приводит к повреждению флоэмного тока и скручиванию листьев, переполненных продуктами фотосинтеза. Скручиванием листьев часто болеют картофель и хлопчатник. Многие флоэмные вирусы нарушают обмен фитогормонов, вследствие чего возникают различного рода уродливости - тератоморфы: превращение вегетативных органов в генеративные, пролиферации цветка и отдельных его частей, чрезмерная кустистость, карликовость и др. Сохранение и распространение фитопатогенных вирусов Сохранение. Все вирусы не могут размножаться, а большинство - и длительно сохраняться вне живых клеток растений. Лучший источник их сохранения в зимний период - вегетативные части зараженных растений. Поэтому наибольший урон вирусы наносят растениям, размножаемым вегетативно - картофелю, плодово-ягодным породам, цветочным культурам. Накапливаясь из года в год, вирусы вызывают постепенное снижение продуктивности и изменение присущих сорту признаков, получившие название вырождения. Поскольку большинство вирусов имеет широкий круг хозяев, большую угрозу для сельскохозяйственных растений имеет зараженность сорных и дикорастущих растений, в зимующих органах которых могут сохраняться потенциально опасные вирусы. Сложнее обстоит дело с сохранением вирусов в семенах. Лишь для 18% вирусов растений обнаружена способность сохраняться в семенах, причем число инфицированных семян, сформированных на зараженных растениях, может колебаться от долей до 100%. Однако даже низкая зараженность семян представляет угрозу будущему урожаю; подсчитано, например, что наличие в посевном материале 0,1% семян нута, зараженных вирусом крапчатости, дает 20000 зараженных растений на 1 акре. Наиболее часто в семенах сохраняются вирусы мозаики люцерны, штриховатой мозаики ячменя, обыкновенной и южной мозаики фасоли, мозаики сои, крапчатости нута, кольцевой пятнистости малины и др. Как видно, большинство вирусов сохраняется в семенах бобовых растений, что связано с анатомическими особенностями формирования их зародышей. Наиболее стойкие вирусы, такие как ВТМ, могут сохраняться на поверхности семян. Вероятность сохранения этого вируса на семенах зависит от строения плодов зараженных растений. Сочная мякоть плодов томатов образует на поверхности семян засыхающую пленку, в которой частицы вируса могут сохраняться до посадки; в сухих коробочках табака вероятность прилипания частиц вируса к поверхности семян очень мала, поэтому семена, взятые с пораженных растений, обычно не инфицированы. Некоторые вирусы сохраняются в теле их переносчиков. Распространение вирусов может быть вертикальное (от родителей потомству) и горизонтальное (от зараженных растений здоровым). Вертикальное распространение вегетативными частями растений и семенами рассмотрено выше. Горизонтальное распространение может осуществляться по-разному. Контактное распространение происходит при соприкосновении листьев или корней зараженных и здоровых растений. При смыкании растений в рядках на трущихся друг о друга поверхностях листьев возникают мелкие ранки (например, поломка волосков), через которые содержащий вирусы сок переходит из одного растения в другое. Следовательно, контактная передача возможна только для вирусов, накапливающихся в эпидермальных клетках (флоэмные вирусы при контакте передаваться не могут) и способных сохраняться без инактивации в соке. Для таких вирусов, как ВТМ, ХВК, вирус желтой мозаики турнепса контактный способ является преобладающим. Особенно большую угрозу представляет распространение вирусов контактным способом в период ухода за растениями, связанного с их повреждениями культивация, пасынкование томатов, ломка листьев табака и др. С помощью прививки передаются все известные вирусы. Такой способ распространения имеет большое значение в плодоводстве, где растения размножают прививкой на подвои. Прививкой распространяются такие вредоносные болезни, как мозаика яблони, розеточность персика, курчавость хмеля. Некоторые вирусы (карликовости сливы, штриховатости табака, скручивания листьев вишни и др.) могут адсорбироваться на пыльце в складках экзины и распространяться от больных растений к здоровым ветром или насекомымиопылителями. Наиболее распространенный в природе способ распространения вирусов векторный (с помощью переносчиков). Большинство переносчиков вирусов относится к членистоногим животным (насекомым, клещам), имеющим колюще-сосущий ротовой аппарат. Все они питаются жидкой пищей (растительным соком), поэтому первая функция ротового аппарата - всасывание сока. Чтобы добраться до клеток растения, надо проколоть покровные ткани, поэтому вторая функция ротового аппарата - прокалывание. Эти животные выделяют в клетки растения слюнные ферменты, гидролизующие полимеры растений до более простых производных. Поэтому третья функция ротового аппарата - слюновыделение. Ротовой аппарат этих насекомых превратился в щетинки, одни из которых, прокалывают покровы, а другие, имеющими подобно шприцу внутреннюю полость нагнетают слюнный фермент и всасывают сок. Особенности питания колюще-сосущих членистоногих создают идеальные условия для распространения вирусов. А для флоэмных вирусов передача переносчиками - единственный природный способ попадания в восприимчивую ткань (их переносчики питаются флоэмным соком). По взаимоотношению с переносчиками вирусы разделяют на неперсистентные (стилетные) и персистентные (циркулятивные). Переносчики стилетных вирусов приобретают их очень быстро, в течении 30 сек- 2 мин питания (из клеток эпидермиса, ибо за такой короткой период стилет не проникает более глубоко); сразу после питания способны передавать вирусы здоровым растениям и быстро теряют способность к передаче (вирофорность). Из этих данных видно, что так передаются только паренхимные вирусы, причем основной механизм передачи - адсорбция частиц на стилете. Об этом свидетельствует потеря вирофорности насекомых после линьки, когда сбрасываются все хитиновые части, включая стилет. Однако, механической адсорбцией на стилете передачу вирусов объяснить нельзя, ибо некоторые вирусы, включая ВТМ, несмотря на высокую концентрацию частиц в соке, насекомыми не передаются; известна определенная взаимная специализация вирусов и переносчиков и даже наличие вирусов-помощников при передаче насекомыми. Например, некоторые вирусы картофеля (аукубы-мозаики и др.) не передаются тлями, однако, если картофель заражен смесью вирусов аукубымозаики и У (УВК), оба вируса передаются тлями. Следовательно, УВК служит помощником вируса аукубы-мозаики в передаче тлями. В геноме УВК содержится ген, кодирующий 58 кD белок, названный helper component (HP), способствующий связыванию вирусных частиц с определенными местами стилета. Мутации этого гена делают вирус неспособным к передаче тлями. Более сложные взаимоотношения с переносчиками имеют персистентные вирусы. Переносчики приобретают вирусы после более длительного периода питания (более 30 минут). Следовательно, к этой группе относятся все флоэмные вирусы. После периода питания необходим определенный латентный период (от нескольких дней до нескольких недель), чтобы насекомое приобрело способность к заражению здоровых растений, однако эта способность сохраняется у него длительный период (иногда в течение всей жизни). Вирусы всасываются с соком, попадают в кишечник, через стенки которого проникают в гемолимфу, разносятся по телу, попадают в слюнные железы, а из них через другое отверстие стилета нагнетаются в новое растение. На такую циркуляцию в теле переносчика необходимо время, определяемое как латентный период. В теле переносчиков многие персистентные вирусы размножаются и откладываются в виде кристаллических или аморфных включений. У некоторых цикад вирусные частицы попадают в яйцеклетки и передаются трансовариально (через яйцо) новому поколению. Стилетная передача характерна для тлей, циркулятивная - для многих животных - тлей, цикад, трипсов, клещей и др. Почвообитающие вирусы распространяются нематодами и грибами. Нематодами передается свыше 20 вирусов, многие из которых вызывают кольцевые пятнистости на листьях и сохраняются в семенах. Важнейшие из них - вирусы вееролистности винограда, кольцевой пятнистости малины, розеточности персика, кольцевой пятнистости и погремковости табака. Их переносчики - свободно живущие нематоды из родов Xiphinema, Trichodorus, Longodorus. Они также имеют хитиновый стилет и питаются, всасывая клеточный сок. Передача разных вирусов осуществляется стилетным или циркулятивным способами. Все эти вирусы имеют фрагментированный геном, состоящий из двух типов частиц; на более короткой нити РНК расположен ген, определяющий специфичность к вектору (структурный белок). Грибы, передающие вирусы растений, относятся к классу Chytridiomycetes. Вирусы некроза табака и разрастания жилок салата передаются грибом Olpidium brassica, который часто встречается на корнях многих растений, причем первый вирус находится на поверхности зооспор и оказывается под оболочкой только после инцистирования зооспор на корневых волосках, а второй всегда находится внутри зооспор. Несколько вирусов злаков (желтая мозаика ячменя, американская мозаика пшеницы, мозаика овса) передаются хитридиевым грибом Polimyxa graminis, паразитирующим на корнях злаков. Номенклатура вирусов Попытки создать иерархическую систему вирусов, наподобие линнеевской системы клеточных организмов (отдел - класс - порядок - семейство - род - вид) были неудачными вследствие полифилетического происхождения вирусов. Поэтому были созданы неиерархические системы, по которым вирусы, имеющие сходные свойства, объединяли в группы без попыток установления каких-либо иерархических связей между группами (за редкими исключениями). Для характеристики группы используют криптограммы, описывающие молекулярные и биологические признаки в виде четырех дробей: 1. В числителе - тип нуклеиновой кислоты (R - РНК, D - ДНК); в знаменателе - число тяжей нуклеиновой кислоты. 2. В числителе - молекулярная масса нуклеиновой кислоты (kD); в знаменателе - процентное содержание нуклеиновой кислоты в частице. 3. В числителе - форма вирусных частиц (S - сферические, Е - удлиненные); в знаменателе - форма нуклеокапсида. 4. В числителе - хозяин (S - семенные растения, I - беспозвоночные, V позвоночные, Fu - грибы); в знаменателе - перeносчик (Ар - тли, Аu - цикадки,Cl - жуки, Di мухи,комары, Ne - нематоды, Fu - грибы). 0 - отсутствие признака; * - признак не исследован. По перечисленным признакам вирусы растений объединяют в группы, которым присваивается название типового представителя каждой группы. Некоторые группы перечислены ниже: Тобравирусы (R/1; 2,3/5+0,6-1,3/5; E/E; S/Ne) - вирусы группы погремковости табака (tobacco rattle virus). Содержат фрагментированный геном из двух типов частиц, что показано на криптограмме. Вызывает образование некротических пятен в мякоти клубней картофеля. Ауровирусы (R/1; 2/5; E/E; S/Fu) - вирусы американской мозаики пшеницы (передается грибoм Polynyxa graminis) и моп-топ картофеля (передается возбудителем порошистой парши картофеля миксомицетом Spongospora subterranea, вызывает образование некротических разводов в мякоти клубней картофеля). Тобамовирусы (R/1; 2/5; E/E; S/O) - вирусы группы мозаики табака. Потексвирусы (R/1; 2,2/6; E/E; S/0) - группа X-вируса картофеля. Вызывают мозаичные симптомы. Включает также вирусы аукуба мозаики картофеля (желтые пятна на листьях), желтой мозаики клевера и др. Карлавирусы (R/1; */6; E/E; S/Ap) – группа S- и М-вирусов картофеля и вируса латентной мозаики гвоздики. Потивирусы (R/1; 3,5/5; E/E; S/Ap) - группа У-вируса картофеля. Включает также вирусы мозаики фасоли, оспу слив (шарка) и другие. Клостеровирусы (R/1; 4,3/5; E/E; S/Ap) - группа вируса желтухи свеклы и тристецы цитрусовых. Включает вирусы с самыми длинными частицами (до 2000 нм) и самой крупной молекулой (+) РНК (до 20000 пар оснований). Кукумовирусы (R/1; 1,3/19+1,1/19+0,8/19; S/S; S/Ap) - группа вируса огуречной мозаики. Один из наиболее широкораспространенных вирусов, заражающий растения более чем из 40 семейств. Имеет фрагментированный геном. В эту группу входят также вирус аспермии томатов. Тимовирусы (R/1; 2/37; S/S; S/Cl) - группа вируса желтой мозаики турнепса, передающегося насекомыми с грызущим ротовым аппаратом (жуками). Комивирусы (R/1; 2,3/34 + 1,5/28; S/S; S/Cl) – группа вируса мозаики коровьего гороха с двухкомпонентным геномом. Включает также вирус мозаики редиса. Бромовирусы (R/1; 1,1/23 + 10/22 + 0,7/21; S/S; S/*) – группа вируса мозаики костра безостого с трехкомпонентным геномом. Переносчики неизвестны, но легко передается механически. Тобасвирусы (R/1; 1,5/18; S/S; S/*) – группа вируса кустистой карликовости томатов. Лютеовирусы (R/1; 2/*; S/S; S/Ap) – группа вирусов скручивания листьев картофеля и желтой карликовости ячменя. Флоэмные вирусы, передающиеся тлями. Неповирусы (R/1; 2,4/43+1,4-2,3/30-40; S/S; S/Ne) - вирусы, передающиеся нематодами и семенами. Включает вирусы черной кольцевой пятнистости томатов, кольцевой пятнистости табака, кольцевой пятнистости малины и др. Каулимовирусы (D/2; 4,5/16; S/S; S/Ap) - группа вируса мозаики цветной капусты, содержащего двухтяжную ДНК. Рабдовирусы (R/1; 4/2; U/E; S,I,V/Ap,Au,Di,0) - группа вирусов, имеющих пулевидную форму вириона (наружной мембраны). Включает вирусы, поражающие растения (желтой карликовости картофеля, закукливание злаков и др.), позвоночные животные (везикулярного стоматита, бешенства) и насекомых (сигма вирус дрозофилы). Передаются разными насекомыми. ГЛАВА III ФЕНОМЕНОЛОГИЯ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ РАСТЕНИЙ И ПАРАЗИТОВ ТИПЫ УСТОЙЧИВОСТИ С феноменологической точки зрения фитопатологи давно обнаружили существование по крайней мере двух типов устойчивости растений ко многим болезням. Ван дер Планк (1963) назвал их вертикальной и горизонтальной устойчивостью (ВУ ГУ). По его определению «Если сорт устойчив к нескольким расам патогена, мы называем такую устойчивость вертикальной или перпендикулярной. Если устойчивость равномерно распределяется на все расы патогена, мы называем такую устойчивость горизонтальной или латеральной» (Ван дер Планк, 1966). Пояснить различия между ними можно с помощью рисунка, на котором представлена реакция 4-х сортов картофеля к расам возбудителя фитофтороза Phytophthora infestans (рис. 6). Сорта Ранняя Роза и Вольтман не имеют ВУ, но различаются степенью ГУ. Поэтому первый сорт поражается всеми расами одинаково сильно, а второй – одинаково слабо. Сорта Домодедовский и Олев также различаются степенью ГУ, но имеют и ВУ, поэтому они устойчивы к разным расам (Домодедовскй – к расам 0 и 1.4, но поражается расой 3, а Олев устойчив к расам 0 и 3 но поражается расой 1.4). Поскольку эти сорта различаются также ГУ, их поражение вирулентным расами не одинаково: Домодедовский поражается сильно, а Олев – умеренно. Таким образом, основные различия между ВУ и ГУ – специфическая или неспецифическая реакция на заражение разными штаммами патогена. Однако это свойство сопряжено с другими, что видно из приведенного ниже примера. Если скрестить упомянутые выше сорта картофеля Агрономический (устойчив к определенным расам фитофторы) с сортом Ранняя Роза (восприимчив к тем же расам), то полученное гибридное потомство F1 будет столь же устойчиво, как и устойчивый родитель. Популяция растений F2 будет расщепляться в отношении 3 устойчивых : 1 восприимчивый, что свидетельствует о моногенном доминантном наследовании устойчивости. Гибриды F1 и F2 от скрещивания сортов Вольтман и Ранняя Роза (различаются степенью ГУ) дадут расщепление по поражаемости на несколько классов, причем большая часть потомства окажется промежуточной между родителями. Некоторые признаки, по которым различаются ВУ и ГУ, приведены в табл. 9. Таблица 9. Различия между ВУ и ГУ Признаки ВУ ГУ Генетический контроль олигогенный полигенный Фенотипическое выражение качественное количественное (альтернативное) (неальтернативное) Модификация внешними слабая сильная условиями Взаимоотношения с паразитом расоспецифические неспецифические Механизмы устойчивости разные механизмы активные защитные реакции Рассмотрим эти различия подробнее ГЕНЕТИКА УСТОЙЧИВОСТИ Вариация любого признака организма, включая его реакцию на заражение, зависит как от его генотипа, так и от условий его жизни. Эта двойная зависимость описывается уравнением VP=VG+VE, где VP - фенотипическая варианса, VG - генотипическая варианса, а VE варианса, обусловленная внешней средой (экологическая варианса). Вклад экологической вариансы устанавливают по поведению одного генотипа в разных условиях жизни. Генотипическая варианса более сложна, ибо часто контролируется несколькими генами, которые к тому же могут взаимодействовать друг с другом. Допустим на проявление какого-либо признака оказывает влияние локус А с двумя аллелями А1 и А2, причем гомозигота А1А1 обеспечивает наибольшее выражение признака, а А2А2 наименьшее: А2А2______________________________А1А1. Генетическую вариансу, обусловленную гомозиготой А1А1, обозначим как y11=m+a, вариансу гомозиготы А2А2, как y22=m-a, а вариансу гетерозиготы y12=m+d, где m - среднее из двух гомозигот; а - 1/2 различий между гомозиготами, а d - отклонение гетерозиготы от средней между гомозиготами. Часто на проявление признака оказывают слияние не один, а несколько генов (В, С и др.). Поэтому подобные же процедуры можно проделать и с ними. Если между аллелями А1 и А2, В1 и В2 и т.д. нет взаимодействия, то d=0, а y12=1/2(y11+y22)=m. В этом случае общая генетическая варианса обусловлена лишь числом локусов, определяющих данный признак, и называется невзаимодействующей или аддитивной (А). Однако, наряду с числом генов, на проявление признака оказывает влияние и их взаимодействие. Взаимодействие аллельных генов называют доминантностью (D). Она указывает на отклонение показателя гетерозигот от среднего между гомозиготами и имеет величину d (при d=a наблюдается полная доминантность аллеля А1 над А2). Кроме взаимодействия аллельных генов возможно неаллельное взаимодействие или эпистаз (I), при котором одни гены влияют на проявление признака, контролируемого другими, часто несцепленными с ними генами. Таким образом, общая генетическая варианса описывается уравнением VG=VA+VD+VI, а общая фенотипическая: VP=VA+VD+VI+VE Рассмотрим вклад отдельных составляющих генетической компоненты фенотипической вариации в проявление вертикальной и горизонтальной устойчивости. Доминантность Как следует из вышеприведенного примера, доминантность оказывает решающее влияние на проявление ВУ (первое поколение показывает такую же устойчивость, как и один из родителей). Как правило, устойчивость к грибам доминантная, а к вирусам часто рецессивна, однако, часто один и тот же ген устойчивости может быть доминантным по отношению к одной расе патогена и рецессивным по отношению к другой. Вероятно это связано с эффектом дозы гена: для придания устойчивости к более “слабой” расе достаточно одной дозы (гетерозиготности), в то время как по отношению к более “сильной” расе требуется две дозы. Например, ген Rp3 кукурузы по отношению к расе 901 возбудителя ржавчины Puccinia sorgi является доминантным (устойчивы гомои гетерозиготы), в то время как по отношению к расе 933 - рецессивным (устойчивы только гомозиготы). На эффект дозы гена может влиять не только генотип паразита: как было показано в предыдущем примере, но и условия заражения. Так растения гороха, гетерозиготные по генам устойчивости к вирусам желтой мозаики фасоли и желтой мозаики бобов, при температуре 180 и ниже устойчивы, а при температуре 270 и выше восприимчивы, в то время как гомозиготы не изменяют реакции при изменении температуры. Вышеприведенный пример с фитофторозом картофеля свидетельствует о том, что для горизонтальной устойчивости доминантность не играет заметной роли: ибо гетерозиготы промежуточны по устойчивости между родителями ( d равно нулю). Эпистаз Логически эпистаз на вертикальную устойчивость может оказывать большее влияние, чем на горизонтальную, ибо вероятность модификации одного гена выше, чем многих. Случаи проявления эпистаза при генетическом анализе устойчивости немного, причем эпистатическое расщепление потомства по устойчивости может быть вызвано не только взаимодействием генов растения, т.е. истинным генетическом эпистазом, но и внешними условиями, в частности, смешанным заражением, т,е, экологическим эпистазом, анализ которого провел индийских фитопатолог Г.Сиду. Например, скрещивают два растения, имеющие гены устойчивости AA,bb и aaBB, причем ген A контролирует доминантную устойчивость к паразиту Х,а ген B - к паразиту Y. Во втором поколении при отсутствии сцепления произойдет дигибридное расщепление: 9АB: 3Аb: 3aB: 1ab. Следовательно, при отсутствии взаимодействия между паразитами расщепление к каждому паразиту в отдельности будет близким к 3 устойчивые : 1 восприимчивый, а по отношению к обоим паразитам - 9 устойчивых к Х и к Y, 3 устойчивых к Х, но не к Y, 3 устойчивых к Y, но не к Х и 1 восприимчивый к обоим. Известны, однако, случаи когда заражение растения одним паразитом усиливает или ослабляет его устойчивость к последующем заражению другим; при этом соотношение расщепляющихся классов в F2 будет отличаться от вышеописанного, напоминая расщепление при эпистазе. Например, заражение устойчивых к фузариозному увяданию томатов Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici возбудителем болезни делает их устойчивым и к вертициллезному увяданию (возбудитель - Verticillium albo-atrum), т.е. растения, зараженные паразитом Х, становятся устойчивыми и к паразиту Y. В этом случае дигибридное расщепление во втором поколении 9AB: 3Ab :3aB: 1ab преобразится следующим образом: к паразиту Х (фузариозу) 3:1, к паразиту Y (вертициллезу) - 15:1 (двухлокусный доминантный эпистаз), и к смеси паразитов - Х+Y - 12: 3: 1 (первые два класса устойчивы к обоим паразитам, третий - только к вертициллезу и четвертый - восприимчив к обоим); такое расщепление характерно для однолокусного доминатного эпистаза. Может быть обратная ситуация: зараженные паразитом Х растения теряют свою устойчивость к последующему заражению паразитом Y (наблюдается при смешанном заражении томатов фузариозом и галловой нематодой). В этом случае во втором поколении будет следующая картина заражения: по отношению к паразиту Х - 3:1, к паразиту Y - 9:7 (двухлокусный рецессивный эпистаз), а к смеси X+Y - 9:3:4 (однолокусный рецессивный эпистаз). Из этих данных вытекает два практически важных вывода: 1/. При проведении генетического анализа во избежание артефактов необходимо тщательно следить за чистотой инфекционного фона; заражение должно проводиться генетически однородным штаммом паразита. 2/. При обнаружении эпистатических отношений в расщепляющемся потомстве необходимо тщательное фитопатологическое изучение взаимоотношений двух паразитов в растении и с растением, ибо наличие вышеописанных взаимодействий может внести коррективы в программу скрещиваний на устойчивость и в систему мероприятий по борьбе с возбудителями этих болезней. Аддитивность При вертикальной устойчивости 1 ген может придавать растению настолько высокую степень устойчивости, что добавление еще одного или нескольких генов не может существенно повлиять на фенотип; поэтому вклад аддитивной варианты в общую генетическую варианту незначителен. Иное дело ГУ: каждый ген, как мы видели, вносит небольшой, фенотипически малозаметный вклад, а общая степень устойчивости определяется суммой генов, т.е.аддитивностью. Таким образом, главное генетическое различие ВУ и ГУ заключает не в числе генов, управляющих устойчивостью, а в соотношении взаимодействующих и невзаимодействующих эффектов. Если преобладают взаимодействующие эффекты (доминантность и эпистаз), то наблюдается дискретное расщепление, характерное для ВУ; если преобладает аддитивность, то наблюдается непрерывное расщепление, характерное для ГУ. Эти различия можно наглядно продемонстрировать биноминальным расщеплением (Vanderplank,1982): При разложении бинома (r+s)n, где r - аллели, контролирующие устойчивость, s - аллели, контролирующие восприимчивость, а n - число локусов, возникнут следующие соотношения r и s аллелей: 1 локус (r+s)2 = r2+2rs+s2. Если r полностью доминирует над s, то гомо- и гетерозиготы будут одинаково устойчивыми, а разложение бинома соответствовать моногибридному расщеплению потомства F2, т.е. 3:1. Если же доминирования нет вообще: то мы будет наблюдать не два, а три расщепляющихся класса - высокоустойчивый, промежуточный и восприимчивый в соотношении 1:2:1. 2 локуса (r+s)4 = r4+4r3s +6r2s2+4rs3+s4. Если r полностью доминирует над s: то опять же, гомо- и гетерозиготы, имеющие аллель r, составят один класс устойчивых, и только гомозигота по аллелю s в обоих генах составит класс восприимчивых, и расщепление соответствует дигибридному - 15r :1s. Если же доминирование отсутствует, а степень устойчивости определяется лишь дозой гена (числом r-аллелей), то по изменению степени устойчивости будут наблюдаться 5 расщепляющихся классов соотношение которых соответствует Гауссовской кривой нормального распределения. 3 локуса (r+s)3 =r6+6r5s+15r4s2+20r3s3+15r2s4+6rs5+s6. При полном доминировании из семи генетически различных классов шесть (имеющих аллель r), будут фенотипически одинаково устойчивыми и только один восприимчив, причем их соотношение соответствует тригибридному расщеплению в F2 - 63:1. При отсутствии доминирования степень устойчивости пропорциональна числу r-аллелей и бином разложится на 7 фенотипически разных классов (фактически будет наблюдаться непрерывное распределение, соответствующее нормальной кривой). Таким образом, в отсутствии взаимодействия генов, т.е. при наличии только аддитивной вариансы даже гетерозиготность по одному локусу устойчивости может дать непрерывный ряд фенотипического расщепления, соответствующий горизонтальной устойчивости. Модификация внешними условиями (экологическая варианса) Горизонтальная устойчивость проявляется в поле и может быть ослаблена или даже потеряна при искусственном заражении в условиях, благоприятных для развития болезни. Вертикальная устойчивость проявляется в более широком диапазоне внешних условий (температуры, влажности, освещенности), при использовании более концентрированного инокулюма и на большей протяженности жизненного цикла растения, чем горизонтальная. Например, отбор на вертикальную устойчивость к листовым паразитам злаков (ржавчинным и мучнисто-росяным грибам) проводят обычно в фазе проростков, которые лишены горизонтальной устойчивости. Однако и гены вертикальной устойчивости могут различаться по реакции на условия заражения. У льна, например, описано несколько локусов, в которых картируются гены специфический (вертикальной) устойчивости к ржавчине. В локусе L гены устойчивости L1, L2 и L3 в зависимости от использованной для заражения расы дают лишь две альтернативы: полный иммунитет или полную восприимчивость, а реакция гена N2 варьирует в зависимости от освещенности. Поскольку при вертикальной устойчивости наибольший вклад в проявление признака вносят взаимодействующие гены, а роль аддитивной и экологической варианс незначительна, фенотипическую вариансу с некоторой долей упрощения можно изобразить, как VP=VD+VI При проявлении горизонтальной устойчивость основную роль играют аддитивные гены и внешняя среда, т.е. VP=VA+VE Отсюда ясно, что коэффициент наследования (h =VG/VP) для вертикальной устойчивости гораздо выше: чем для горизонтальной, и поэтому первую гораздо легче использовать в селекции устойчивых к болезням сортов сельскохозяйственных растений, чем вторую. ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ Качественный и количественный характер проявления вертикальной и горизонтальной устойчивости сказываются на симптомах болезни у растений, обладающих этими формами устойчивости. Вертикальная устойчивость чаще всего проявляется в форме реакции сверхчувствительности (СВЧ), т.е. активной реакции зараженных клеток, выражающейся в их гибели и сопровождающейся гибелью или прекращением развития паразита в тканях. Чаще всего реакция сверхчувствительности проявляется в виде небольшого некроза, возникающего вскоре после заражения в месте внедрения паразита. Так при фитофторозе картофеля любой ген устойчивости дает такую реакцию при заражении листьев авирулентной расой. При этом спороношение паразита полностью подавлено. Более разнообразно проявление вертикальной устойчивости у пшеницы, зараженной ржавчинными грибами. Например, шкала учета типов реакции пшеницы на заражение возбудителем стеблевой ржавчины Puccinia graminis f.sp.tritici (шкала Стекмена) основана на соотношении двух показателей: размера пустулы и интенсивности защитной реакции (некроза или хлороза) (рис. 7). В этой шкале 5 основных типов реакции 0-4 (от хлороза без пустулы до крупной пустулы без хлороза), один смешанный тип (Х), при котором типы реакции разных частей листа не одинаковы, и много дополнительных подтипов (0;, 2+, 3= и т.д.). Все типы и подтипы, при которых вокруг места заражения или образовавшейся небольшой пустулы возникает защитная реакция (некроз или хлороз), часто объединяют в одну реакцию устойчивости R (от английского resistance - устойчивость); реакции, при которых вокруг крупной или средней величины пустулы нет защитного некроза (типа 3 и 4), объединяют в реакцию S (succeptibility - восприимчивость). Таким образом, в отличие от фитофтороза картофеля, при реакциях устойчивости пшеницы к ржавчинным грибам, контролируемых некоторыми генами вертикальной устойчивости, возможно внутритканевое развитие и даже споруляция паразита, хотя количество образующихся спор значительно ниже, чем в восприимчивых растениях. По-видимому, скорость включения защитных реакций и интенсивность их протекания (экспрессия) для разных генов устойчивости неодинаковы. Удобно изучать степень экспрессивности разных генов вертикальной устойчивости при болезнях, вызываемых мучнисто-росяными грибами. Их мицелий простирается по поверхности листа; после образования первичного гаустория в эпидермальной клетке и питания образуются вторичные гифы, формирующие гаустории в соседние клетки эпидермиса. Удалив с листа с помощью прозрачной липкой ленты эпидермис с мицелием, можно проводить цитологические наблюдения за развитием гриба, а сняв мицелий, можно изучать накопление в нем питательных веществ, полученных из растения. В лаборатории американского фитопатолога Эллингбо было показано, что ген вертикальной устойчивости пшеницы Pm1 почти полностью подавляет развитие вторичных гиф паразита; ген Pm2 включает защитные механизмы позже и не влияет на развитие вторичных гиф, но вызывает образование некроза или хлороза через 3-4 дня после заражения; ген Pm3 подавляет развитие лишь 6070% инфекции, в то время как 30-40% развивается нормально и образует спороношение. В других опытах мучнистой росой заражали листья пшеницы, получившие из питательного раствора радиоактивную серу. Через разные интервалы мицелий снимали и определяли накопление в нем радиоактивности. Оказалось, что вынос серы резко подавлялся в присутствии генов Pm1 и Pm4 уже через 16 час после внедрения, т.е. эти гены быстро включают защитные реакции; ген Pm3 подавлял вынос серы лишь через 20 час и не так резко, как Pm1 и Pm4; ген Pm2 - через 24 часа. Горизонтальная устойчивость дает в чистом виде восприимчивый тип реакции (3 или 4 по шкале Стекмена). Степень устойчивости сорта выражается в снижении числа пятен на растении и числа спор в одном пятне. Произведение этих двух показателей: названное И.Г.Одинцовой и Л.А.Михайловой индексом устойчивости, является хорошим выражением степени горизонтальной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине. Следовательно, наблюдая поведение сортов в поле на инфекционном фоне, можно по проявлению болезни установить форму их устойчивости: если наблюдается реакция сверхчувствительности, то сорт обладает вертикальной устойчивостью к распространенным в поле расам патогена, если же два сорта, не различаясь типом пятен, имеют в одинаковых условиях достоверные различия в числе пятен, то один из сортов имеет более высокую горизонтальную устойчивость. Однако, такое заключение может быть сделано лишь как сугубо предварительное, ибо число пятен не всегда отражает тип устойчивости. Часто при вертикальной устойчивости реакция сверхчувствительности протекает настолько быстро, что видимого некроза не возникает (устойчивость выражается отсутствием симптомов болезни). Если полевая популяция паразита состоит из смеси вирулентных и авирулентных рас, то первые вызовут образование пятен болезни, а наличие вторых будет выражаться как снижение числа инфекционных пятен, т.е. как типичная горизонтальная устойчивость. Такое явление наблюдали японские фитопатологи при изучении устойчивости риса к пирикуляриозу. Возбудитель болезни гриб Magnoporthe grisea имеет высокую спонтанную изменчивость, поэтому полевые популяции обычно представлены смесью рас, и число пятен на листьях определяется часто не столько степенью горизонтальной устойчивости, сколько числом генов вертикальной устойчивости к полевым расам (табл.10). Таблица 10. Поражаемость сортов риса пирикуляриозом в полевых условиях (Ahn,Ou,1982) Сорта Число пятен на растении Число авирулентных рас Зенит 2 64 Катактара DA-2 14 55 Канто 51 39 40 Лакроссе 66 19 Кхао-тан-хенг 17 97 4 Сорта Зенит и Катактара ведут себя как имеющие горизонтальную устойчивость (мало инфекционных пятен ), хотя на самом деле содержат много эффективных генов вертикальной устойчивости, наличие которых не позволяет формировать симптомы заражения большинству спор, попадающих на листья. Эти данные показывают, что для оценки степени горизонтальной устойчивости в присутствии вертикальной надо использовать вирулентные для данного сорта расы. Для изучения горизонтальной устойчивости голландский фитопатолог К.Цадокс предложил метод анализа инфекционного цикла, т.е. изучение всех его этапов от попадания спор на поверхность растения до образования новых спор (табл. 11). Из таблицы видно, что на каждом этапе инфекционного цикла плотность популяции снижается. Увеличение числа пустул по сравнению с числом внутритканевых колоний объясняется тем, что из одной колонии могут возникнуть две пустулы: на верхней и нижней сторонах листа. Долю инфекционных единиц на каждой стадии цикла, то есть отношение их к исходному числу инфекционных единиц, выражает показатель lt; долю инфекционных единиц, погибших на каждом этапе - показатель gt, а долю выживших - 1-gt, который вычисляется делением числа инфекционных единиц на последующем этапе цикла на числе единиц на предыдущем этапе (ПО, АП, ВА и т.д.). Таблица 11. Компонентный анализ инфекционного цикла бурой ржавчины пшеницы (изолят 1037) на листьях сорта пшеницы Рубин (Zadoks,Schein,1979) Время Стадия (сутки) Инфекци- Gt 1-gt онных Отноше- lt ния единиц на 103 устьиц 1,00 1 ЧПС 273 0,11 0,89 АП 0,93 1 ЧА 243 0,55 0,45 ВА 0,83 3 ЧПВ 110 0,16 0,84 ГВ 0,37 3 ЧГ 92 0,33 0,67 КГ 0,31 9 ЧК 61 -0,53 1,53 ПК 0,21 10 ЧП 94 Примечания: ЧПС - число проросших спор; ЧА - число апрессориев; ЧПВ число подустичных везикул; ЧГ - число гиф; ЧК - число колоний внутри листа; ЧП - число пустул; АП - число апрессориев - к числу проросших спор; ВА число везикул - к числу апрессориев; ГВ - число гиф - к числу везикул; КГ число колоний - к числу гиф; ПК - число пустул - к числу колоний. Сравнение показателя gt у сортов с различным уровнем горизонтальной устойчивости может дать важную информацию для выявления этапа инфекционного цикла, на котором выражается действие генов горизонтальной устойчивости данных сортов. Чем выше показатель gt, тем сильнее выражена горизонтальная устойчивость. У показанного в таблице сорта Рубин наивысший показатель (0,55) приходится на этап между формирование апрессориев и подустьичных везикул, во время которого число инфекционных единиц уменьшается вдвое. Скрещиванием сортов, устойчивость которых проявляется на разных этапах инфекционного цикла, можно совместить разные гены горизонтальной устойчивости и тем самым получить гибриды, трансгрессивные по устойчивости. Еще сложнее обстоит дело при оценке горизонтальной и вертикальной устойчивости для системных болезней. В полевых условиях при испытании редко наблюдается абсолютная непоражаемость или 100%-ная поражаемость сорта, поэтому различия между устойчивым и восприимчивым сортом даже при наличии вертикальной устойчивости количественные. Например, граница между устойчивыми и восприимчивыми к головневым грибам сортами злаков в 10% пораженности установлена чисто эмпирически. Сорта, пораженные менее чем на 10%, рассматриваются как имеющие вертикальную устойчивость, а сорта, пораженные сильнее, как имеющие ту или иную степень горизонтальной устойчивости. Часто приходится учитывать также и степень пораженности, ибо разные сорта при одинаковом проценте пораженных растений могут сильно различаться интенсивностью развития болезни, например при такой системной болезни, как вертициллезный вилт хлопчатника (возбудитель Verticillium dahliae). По-видимому, пораженность определяется в таких случая экспрессивностью и пенетрантность генов устойчивости: от пенетрантности генов зависит число пораженных растений, а от их экспрессивности - степень пораженности. Такие представления позволяют вести направленную селекцию на повышение экспрессивности и пенетрантности генов устойчивости, однако связь этих свойств генов с вертикальной и горизонтальной устойчивостью остается неясной. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ С ПАРАЗИТОМ Феноменология взаимоотношений По определению вертикальная устойчивость расоспецифична, а горизонтальная - неспецифична. Расоспецифичность проявляется в потере генами устойчивости своей эффективности при заражении растений вирулентными расами патогена. Вопрос о расоспецифичности не столь прост, как кажется. Вот, например, данные по взаимодействию сортов хлопчатника и штаммов возбудителя фузариоза (табл.12) Таблица 12. Взаимоотношения сортов хлопчатника с штаммами Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum (Сидорова, Акмурадов,1983) Физиологическая Реакция сортов Хлопчатника раса 8763-И 9647 Ташкент-1 1 Восприимчив Устойчив Устойчив 2 Восприимчив Восприимчив Устойчив 3 Восприимчив Восприимчив Восприимчив Представленные в таблице данные свидетельствуют о различиях в устойчивости сортов и патогенности штаммов, однако, здесь отсутствуют перекрестные показатели: следовательно: отсутствует взаимодействие между штаммом и сортом. Согласно определению Вандерпланка, на взаимоотношения вертикального типа может указывать только наличие перекрестных взаимодействий между сортами и расами по типу фитофтороза картофеля: сорт картофеля Любимец восприимчив к расе 1 и устойчив к расе 2, в то время как сорт Веселовский, наоборот, восприимчив к расе 2, но устойчив к расе 1. Различия между этими двумя примерами выявляются и в ранжировании сортов хозяина и штаммов патогена. В отношении фузариоза хлопчатника ранг сортовой устойчивости при заражении разными расами и ранг расовой патогенности при заражении разных сортов не меняется: во всех случаях сорт 8763-И наименее, а сорт Ташкент-1 наиболее устойчивы; также во всех случаях раса 1 наименее, а раса 3 наиболее патогенны. В отношении фитофтороза картофеля мы наблюдаем перемену ранга в степени устойчивости двух сортов при испытании ее разными расами и перемену патогенности двух рас на разных сортах. Только второй случай свидетельствует о дифференциальных взаимодействиях и: следовательно, наличии вертикальной устойчивости растений и вирулентности их паразитов. Первый показывает общую вариацию в свойствах устойчивости и патогенности, присущую растениям и паразитам, т.е. горизонтальную устойчивость и агрессивность. Гены устойчивости растенияхозяина и гены агрессивности паразита действуют одинаково и аддитивно, но в зависимости от числа генов устойчивости (или восприимчивости) и агрессивности в системе хозяин-паразит можно ожидать различные степени поражения растений. Допустим, у сортов хлопчатника и штаммов его паразита имеется увеличивающееся число аддитивных генов восприимчивости и агрессивности, причем если сумма генов агрессивности паразита и восприимчивости хозяина меньше четырех, то развивается реакция устойчивости, а при 4-х и более генов растение восприимчиво. Тогда таблица примет следующий вид (табл. 13) Таким образом, ранжирование - хороший инструмент для определения типа взаимоотношений между сортами хозяина и штаммами паразита (горизонтальные взаимоотношение аддитивны, вертикальные - неаддитивны). Статистические методы (например, коэффициент ранговой корреляции) позволяют определить достоверность отклонения эмпирических данных от установленного ранга. Таблица 13. Дифференциальные взаимоотношения между сортами хлопчатника и штаммами F.oxysporum, основанные на аддитивно-взаимодействующих генах агрессивности и восприимчивости Штаммы Число генов паразита агрессивности Сорта 8763-И Число генов хлопчатника 9647 Ташкент-1 восприимчив. 3 2 Устойчив 1 I 1 Восприимчив Устойчив II 2 Восприимчив Восприимчив Устойчив III 3 Восприимчив Восприимчив Восприимчив Второй метод, широко применяемый при определении специфичности взаимоотношений между хозяином и паразитом,- двухфакторный дисперсионный анализ, с первым фактором - сортами растения и вторым штаммами паразита. Отсутствие достоверной взаимодействующей вариансы свидетельствует от отсутствии вертикальных взаимоотношений. При хорошо выраженной вертикальной устойчивости взаимодействующая варианса высоко достоверна. Использование дисперсионного анализа позволяет оценить силу взаимодействия между сортами и штаммами. Например, обычно считают, что у штаммов осеннего опенка Armillaria mellea отсутствует специализация в отношении древесных пород. Однако обработка экспериментальных данных показала наличие слабого взаимодействия, свидетельствующего о небольшой компоненте дисперсии, ответственной за дифференциальные взаимодействия штаммов опенка с лесными породами. Оценку наличия или отсутствия взаимодействия определяют не абсолютно, а статистически по произвольно выбранному критерию (5, 1, 0.1% уровень значимости). Поэтому взаимодействующая варианса, достоверная при одном уровне, может быть недостоверной при более жесткой оценке или при оценке разных по численности выборок (изменении степеней свободы). Следовательно, существуют многочисленные переходы между высокой степенью дифференциальных взаимодействий, характерных для типичной вертикальной устойчивости - вирулентности, и отсутствием дифференциальных взаимодействий, характерных для горизонтальной устойчивости-агрессивности. Во многих работах показано, например, наличие взаимодействующей вариансы и нарушение ранга при типичной горизонтальной устойчивости (табл. 14). Таблица 14. Процент поверхности листьев ячменя, покрытой пустулами ржавчины (Puccinia dispersa) (Parlevliet,1978) Сорта Расы 11-1 18 1-2 22 24 Берак 8,1 6,7 3,1 5,0 0,9 Юлия 4,5 12,1 1,8 1,1 0,6 Как видно из таблицы, в двух случаях нарушен ранг устойчивости и агрессивности (у изученных сортов восприимчивый тип инфекции ко всем расам и полигенное наследование свидетельствуют о типично горизонтальных взаимоотношениях): 1/ сорт Юлия более устойчив, чем сорт Берак ко всем расам за исключением расы 18; 2/ расы 22 1,2 меняют ранги на тех же сортах. Другой пример - достоверные взаимодействия штаммов возбудителя бурой ржавчины (P.recondita) и сортов пшеницы (Дербентская черноколосая и Саратовская 29), не имеющих выраженной вертикальной устойчивости и различающихся лишь числом пустул ржавчины (табл. 15). Таблица 15. Дисперсионный анализ числа пустул трех штаммов бурой ржавчины пшеницы на листьях двух сортов пшеницы, различающихся степенью горизонтальной устойчивости (Одинцова, Шеломова, 1983) Источники Степени свободы Сумма квадратов Дисперсия варьирования Сорта 1 20,0 20,7 Штаммы 2 14,4 7,2 Сорта х штаммы 2 16,2 8,1 Подобные данные заставили усомниться в полной независимости систем хозяина и паразита при горизонтальной устойчивости, постулированной Вандерпланком. Голландские фитопатологи Цадокс и Парлевлит считают, что специфичность есть и при горизонтальной устойчивости, но взаимодействующий эффект очень низкий и приближается к величине ошибки опыта, вследствие чего может быть не обнаружен (тем более, что при значительной величине экологической вариансы, присущей горизонтальной устойчивости, этот эффект может быть замаскирован варьированием степени устойчивости под влиянием внешних условий). Таким образом, при анализе взаимоотношений с паразитом, как и при анализе генетического контроля устойчивости, важнейшее отличие горизонтальной и вертикальной устойчивости заключается в соотношении взаимодействующих и невзаимодействующих эффектов. При наличии только (или почти только) взаимодействия наблюдается вертикальная устойчивость, при полном (или почти полном) отсутствии взаимодействия - горизонтальная. Промежуточные типы указывают на отсутствие гиатуса между ними. Почти все возможные типы взаимоотношений можно выразить в виде таблицы с тремя варьирующими признаками и двумя категориями вариации каждого признака (табл.16). Таблица 16. Типы взаимоотношений растений с паразитами (Carson,Carson,1989) Системы Признаки устойчивости Генетический контроль Экспрессия генов Специфичность 1 Моногенный Качественная Есть 2 Моногенный Количественная Есть 3 Полигенный Качественная Есть 4 Полигенный Количественная Есть 5 Моногенный Качественная Нет 6 Моногенный Количественная нет 7 Полигенный Качественная нет 8 Полигенный Количественная нет Среди восьми состояний четыре (состояния 1-4) соответствуют вертикальной устойчивости по Вандерпланку (есть специфичность во взаимоотношениях с паразитом) и четыре (5-8) - горизонтальной. Однако комплексу признаков вертикальной устойчивости, приведенных в таблице 15, удовлетворяет лишь состояние 1, а всем признакам горизонтальной - состояние 8. Многие из промежуточных состояний известны. Например, описана полигенная, количественная, но специфическая устойчивость пшеницы к бурой ржавчине (состояние 4), моногенная, качественная, но не специфическая устойчивость кукурузы к Cochliobolus carbonum. Генетика взаимоотношений Генетика взаимоотношений предусматривает проведение параллельного генетического анализа устойчивости растения и патогенности его паразита. Последний возможен для фитопатогенных грибов, имеющих половой процесс сумчатых, базидиальных, оомицетов. Наибольшее значение для изучения природы взаимоотношений паразита и хозяина сыграли исследования ржавчинных грибов. Методы гибридологического анализа возбудителя стеблевой ржавчины Puccinia graminis разработали в 40-годах ХХ века канадские фитопатологи М.Ньютон и Т.Джонсон. Половой процесс у этого гриба протекает на листьях барбариса, где гаплоидные спермации оплодотворяют гаплоидные гифы спермогониев. Образующиеся вследствие оплодотворения двуядерные (дикариотические) эциоспоры заражают пшеницу, на стеблях которой летом образуются урединиоспоры, ростки которых способны снова заражать пшеницу. К осени в зараженных стеблях формируются покоящиеся телиоспоры, в которых после зимовки осуществляются кариогамия, мейоз и формирование тетрады гаплоидных базидиоспор, осуществляющих первичное заражение барбариса (рис.8). Для проведения гибридизации кустики барбариса в вазонах закрывают ламповым стеклом “летучая мышь”, прикрытым чашкой Петри, на внутреннюю поверхность которой прикрепляют соломку пшеницы с телиоспорами, прошедшими (для стимулирования прорастания) воздействие отрицательными температурами. Формирующиеся базидиоспоры попадают на листья барбариса и заражают их. Спермации из возникших в местах заражения спермогониев стерильной платиновой иглой переносят в другие спермогонии. Если оплодотворяют спермогонии, возникшие в результате заражения базидиоспорами той же расы, то проводят инбридинг, если же переносят спермации в спермогонии, возникшие после заражения другой расой - проводят гибридизацию. Поскольку P.graminis - гетероталличен и вероятность оплодотворения равна 50%, примерно половина оплодотворенных спермогониев сформирует на нижней стороне листа эции. Эциоспоры переносят на проростки пшеницы, не имеющей эффективных генов вертикальной устойчивости, чтобы не потерять среди гибридных спор слабо вирулентные сегреганты. Образующимися урединиоспорами заражают сорта пшеницы, контрастные по устойчивости к родительским штаммам ржавчины, и по реакции на заражение судят о доминантности или рецессивности генов вирулентности (табл. 17). Таблица 17 . Вирулентность двух рас и их гибридов Р.graminis f.sp.tritici к некоторым сортам пшеницы (Johnson,Newton,1946) Расы Тип инфекции на Канред сортах Арнаутка Вернал 9 0 4 4 36 4 1 0 9 х 36 0 4 0 Как видно из таблицы, вирулентность расы 9 для сорта Арнаутка доминантна, а для сорта Вернал - рецессивна; вирулентность расы 36 для сорта Канред также рецессивна. Потомство F1 можно довести до формирование телиоспор, а затем повторить скрещивания, чтобы получить F2, F3, B1 и т.д. (табл. 18). Таблица 18. Расщепление по вирулентности к сортам пшеницы гибридов F2 между расами 9 и 36 P.graminis f.sp.tritici (Johnson,Newton,1946) Число гибридов, вызвавших реакции Сорта Ожидаемое 0-1 4 227 98 243,7 : 61,3 (3:1) Арнаутка 83 242 81,3 : 243,7 (1:3) Вернал 307 18 304,7 : 20,3 (15:1) Канред расщепление Таким образом, вирулентность расы 9 к сорту Арнаутка контролируется одним доминантным геном, а к сорту Вернал - двумя рецессивными; вирулентность расы 36 к сорту Канред определяется одним рецессивным геном. Используя описанный метод Х.Флор провел перекрестный гибридологический анализ генов устойчивости льна к ржавчине и генов вирулентности возбудителя ржавчины Melampsora lini к льну (табл. 19). Таблиица 19. Схема наследования устойчивости и вирулентности в системе лен-ржавчина (из Флор,1962) Расы паразита Сорта хозяина F1 Оттава Бомбей R1r2r2 F2 Отношение 11 32 43 r1r1R2- R1r1R2r2 9 (9) (3) (3) (1) R:S 22 (a1a1A2-) + - - + + - - 3:1 24 (A1-a2a2) - + - + - + - 3:1 F1 (A1a1A2a2) - - - + - - - 15:1 F2 (A1-A2-) - 78 (9) - - + - - - 15:1 (A1-a2a2) - 23 (3) + - - + - - 3:1 (a1a1A2-) + 27 (3) - - - - + - 3:1 (a1a1a2a2) + 5 (1) + + + + + + - В очерченном пунктиром квадрате показаны взаимоотношения двух сортов и рас. Знаком (-) обозначена реакция устойчивости/авирулентности (что однозначно); знаком (+) - реакция восприимчивости/вирулентности. Поскольку гетерозиготы хозяина и паразита (F1) соответственно устойчивы к обеим расам или авирулентны к обоим сортам, устойчивость и авирулентность управляются доминантными генами хозяина и паразита, а восприимчивость или вирулентность проявляются при наличии гомозиготных рецессивных аллелей доминантных генов устойчивости и авирулентности. В F2 отношение 3:1 устойчивых и восприимчивых к каждой расе гибридов растений и авирулентных и вирулентных к каждому сорту гибридов паразита свидетельствует о присутствии одного доминантного гена. Наличие четырех классов реакций в F2 показывает, что в популяциях хозяина и паразита имеется по два независимо расщепляющихся гена. Расщепление популяций F2 хозяина или паразита, взаимодействующих с F1 популяциями партнеров, по реакции на заражение соответствует 15:1, что указывает на наличие взаимодействующих пар генов хозяина и паразита. Эти данные привели Флора к выводу о наличии взаимодействующих генов (вернее, генопродуктов) хозяина и паразита, сформулированному как теория ген-на ген. Как видно из приведенной таблицы, если растение обладает каким-либо доминантным геном устойчивости (R1 у сорта Оттава или R2 у сорта Бомбей), то оно может поражаться лишь такой расой патогена, которая имеет комплементарный ему рецессивный ген авирулентности (а1 у расы 22 или а2 у расы 24). Несовместимая реакция (устойчивости/авирулентности) проявляется только в том случае, если оба взаимодействующих гена (хозяина и паразита) доминантны. Из теории Флора вытекает, что присутствие в геноме растения-хозяина доминантного гена устойчивости не выявляется при отсутствии соответствующего ему доминантного гена авирулентности (сорт Оттава поражается расой 22, а сорт Бомбей - расой 24, несмотря на наличие у них генов устойчивости R1 и R2 соответственно). Также в геноме паразита наличие доминантного аллеля авирулентности не будет выявлено при отсутствии соответствующего ему гена устойчивости. Более того, в отсутствии каких-либо доминантных генов устойчивости хозяина соответствующие им гены вирулентности (рецессивные аллели генов авирулентности) паразитов также не будут выявляться. Генетические исследования многих болезней растений, последовавшие после работ Флора, в основном подтвердили его выводы. Было показано, что а/ гены устойчивости (R от английского слова resistance) чаще доминантны, а гены вирулентности (p oт английского слова pathogenicity или a от слова avirulence) - рецессивны; б/ R-гены часто аллельны или тесно сцеплены друг с другом, а Ргены обычно расщепляются независимо; в/ R и P-гены обычно взаимодействуют на основе теории “ген-на-ген”. Первый вывод свидетельствует о том, что независимо от взаимодействующих генотипов паразита и хозяина возможны только два результирующих фенотипа - R и S или “минус” и “плюс” или 0 и 1. Это положение хорошо иллюстрируется при изображении взаимоотношений паразита и хозяина в виде диаллельной схемы (квадратной сетки) (табл. 20). Таблица 20. Диаллельные взаимоотношения хозяина и паразита в системе “генна-ген” Генотип растения-хозяина Генотип паразита АА (или Аа) аа RR ( или Rr) - (R) + (S) Rr + (S) + (S) Примечание: R - устойчивость (несовместимость), S - восприимчивость (совместимость) Описаны, однако, случаи неполной доминантности генов устойчивости и авирулентности. В такой ситуации могут наблюдаться не два, а три фенотипа в квадратной сетке: “минус”, “плюс” и промежуточный. Например, канадский фитопатолог Д.Самборский обнаружил штамм возбудителя бурой ржавчины пшеницы, который вызывал у сорта пшеницы Трансфер, гомозиготного по гену устойчивости Lr9, образование реакции 1+ вместо обычной для этого гена реакции 0. Инбридинг, проведенный по вышеописанному методу Джонсона и Ньютон, показал, что ген авирулентности гетерозиготен, и позволил выделить изоляты, гомозиготные по этому гену. Взаимоотношения между этими культурами гриба и сортами пшеницы показаны на табл. 21. Таблица 21. Патогенность (тип реакции на заражение) сегреганатов авирулентного к сорту Трансфер штамма Puccinia recondita (Samborski,1963) Генотип хозяина Генотип А9А9 Патогена А9а9 а9а9 Lr9Lr9 0 1+ 4 Lr9lr9 0 3 4 lr9lr9 4 4 4 Вторая особенность организации генов устойчивости и авирулентности аллельность или тесное сцепление первых, но не вторых, также оказывает влияние на результаты взаимоотношений. Так как у диплоидного организма может быть только два аллельных состояния гена, число возможных комбинаций генов устойчивости меньше: чем генов авирулентности. Например, в системе из двух аллельных генов устойчивости и двух соответствующих им несцепленных генов авирулентности может быть 4 комбинации генов у хозяина (R1R1, R1r2, r1R2 и r1r2) и 9 комбинаций генов паразита (А1А1А2А2, А1А1А2а2, А1А1а2а2, А1а1А2А2, А1а1А2а2, а1а1А2А2, а1а1А2а2, а1а1а2а2, А1а2а2а2). В системе из трех аллельных генов хозяина и соответствующих им несцепленных генов паразита возможны 10 комбинаций у хозяина и 27 - у паразита. Кодоминантность (фенотипическое проявление обеих аллелей в гетерозиготе) генов устойчивости накладывает некоторые ограничения на использование квадратных сеток для анализа результатов взаимоотношений между паразитом и хозяином. Допустим, мы имеем гетерозиготное растение, имеющее два аллельных кодоминантных гена устойчивости R1/R2. Ген R1 взаимодействует с генами, находящимися в одном локусе паразита (А1А1, А1а1 и а1а1), а ген R2 - с геном а2а2, находящимся в другом локусе (отсутствует аллель А2). В F2 гетерозигота даст расщепление на R1R1, R1R2 и R2R2 в отношении 1:2:1. Однако, если у тестирующих штаммов паразита отсутствует аллель А2, все они вирулентны для растений, имеющих ген R2. Поэтому ген R2 не выявляется , его свойства придавать устойчивость не используются и он ведет себя в расщепляющемся потомстве как рецессивный аллель восприимчивости, как показано на схеме (Person,Mayo,1974): Реальная ситуация 1/2 Наблюдаемая ситуация Относительные частоты 1/4 1/4 Генотипы хозяина в F2 R1R1 R1R2 R2R2 3/4 1/4 R- rr Культуры паразита : А1- а2а2 а1а1 а2а2 - - + А- - + + + + аа + + Таким образом, фактически дигенное расщепление хозяина фенотипически выражается как моногенное с типичными для квадратных сеток (см.табл. 19) отношениями. Аналогичная ситуация потери фенотипического выражения гена устойчивости в отсутствии тестирующего его доминантного аллеля авирулентности у паразита будет наблюдаться даже при независимом наследовании генов устойчивости. Например, сорт льна Бизон поражается всеми североамериканскими расами ржавчины и использовался Флором в гибридологических анализах, как не имеющий вертикальных генов универсально восприимчивый контроль, однако в Австралии у сорта Бизон был идентифицирован ген устойчивости к некоторым расам, названный L9. Повидимому все североамериканские расы имеют комплементарный ему рецессивный аллель. Гораздо реже, чем для генов устойчивости, обнаруживается сцепление между генами вирулентности. Тесное сцепление описано для генов aL8 и аМ и группы генов аР (а-Р, а-Р1, а-Р2, а-Р3) вирулентности Melampsora lini. Наконец, третий вывод из параллельного изучения генетики устойчивости и вирулентности - наличие взаимодействий между партнерами не на геномном, а на генном уровне. В связи с этим встает вопрос о необходимости изучения генетики партнеров только во взаимодействии, т.е. о межорганизменной генетике (Loegering, 1978). Возникновение межорганизменной генетики как отдельной дисциплины сделало возможным связать биохимические исследования факторов устойчивости растений и вирулентности паразитов с генетическими, т.е. перейти к анализу молекулярно-генетических механизмов устойчивости. ЧАСТЬ II. БИОХИМИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ РАСТЕНИЙ И ПАРАЗИТОВ Орудия нападения паразитов на растения и способы защиты растений от паразитов могут быть специфичными или неспецифичными, или в терминах Вандерпланка вертикальными или горизонтальными. Поскольку в процессе взаимоотношений хозяин и патоген вступают в более или менее тесные взаимоотношения друг с другом, можно говорить о хозяине и паразите, как о системе взаимодействующих организмов или патосистеме (Робинсон). Тогда взаимодействия, основанные на образовании паразитом специфических метаболитов, вызывающих ответную химическую реакцию только у определенных генотипов растений, можно назвать вертикальной патосистемой, а взаимоотношения, обусловленные факторами, присущими паразитам, независимо от их филогенетической или тканевой специализации c одной стороны, и конституциональными (присутствовавшими до заражения) факторами устойчивости растений с другой стороны - горизонтальной патосистемой. Важнейшие компоненты горизонтальной и вертикальной патосистем приведены на рис. 9. ГЛАВА IY ГОРИЗОНТАЛЬНАЯ ПАТОСИСТЕМА ФАКТОРЫ АТАКИ ПАРАЗИТОВ Для паразитов из разных групп присущи как сходные, так и различающиеся этапы патогенеза и, соответственно, орудия нападения на хозяина: прорастание на поверхности растения (г) формирование инфекционных структур (г) механическое пробивание покровов растения (г, п) выделение ферментов-деполимераз и химическое разрушение покровов растения (г,б) пассивное попадание в клетки через ранки (г,б,в) формирование гаусториев (г) выделение вивотоксинов (г,б) выделение фитогормонов (г,б) распространение паразита по растению (г.б.в) формирование потомства и его освобождение (г,б,в) ( г - грибы, б - бактерии, в - вирусы, п - переносчики грибов, бактерий и вирусов). Как видно из приведенной схемы наиболее разнообразны химические и структурные факторы патогенности грибов. Бактерии, обладая богатым набором необходимых для паразитирования метаболитов, только в редких случаях образуют специальные морфологические структуры, связанные с патогенезом (например, бактероиды - инфекционные нити из кооперации потерявших клеточные стенки клубеньковых бактерий). Вирусы обладают только ферментами, необходимыми для самовоспроизводства, поэтому их внедрение пассивное (у большинства - с помощью членистоногих переносчиков). Внедрение паразитов в растения Внедрение через раны Это наиболее пассивный способ внедрения. Инфекционую грибную гифу к ранам привлекают метаболиты, выделяющиеся в окружающую среду. Так у опухолеобразующей бактерии Agrobacterium tumefaciens, заражающей растения только через ранки, экспрессия vir-генов (от англ.virulence), которые необходимы для протекания морфологических и метаболических изменений, связанных с заражением растений, происходит под воздействием ацетосирингона и других фенолов, синтез которых индуцируется у растений механическим повреждением и которые диффунидируют из ран в окружающую среду. Фенольные соединения, в частности флавоноиды, индуцируют формирование гаусториев даже у цветковых растений-паразитов. Поскольку наличие раневой поверхности стимулирует синтез раневой перидермы, которая во-первых, заделывает механические бреши, и во-вторых, препятствует выделению химических атрактантов, заражение раневыми паразитами эффективно только сразу после ранения. Так процент успешных заражений кукурузы антракнозом (возбудитель Colletotrichum graminicola) в момент нанесения ранки составил около 70%, через 1 час - 22%, а через 6 часов - менее 5% (Muimba-Konakolonga, Bergstrom,1990). Поэтому наиболее эффективно заражение растений паразитами, которые передаются насекомымифитофагами. Например, жуки-короеды, несущие на поверхности тела (в том числе и на ротовом аппарате) споры возбудителя голландской болезни вязов Ophiostoma ulmi питаются цветками ильмовых пород и заносят споры в ранки, сделанные при питании. Клетки возбудителя бактериального ожога семечковых Erwinia amylovora разносятся на теле пчел и других опылителей и попадают в ранки, сделанные этими сосущими насекомыми. Внедрение через устьица Это - более сложный способ внедрения, ибо необходимо во-первых, найти устьице, а во вторых, образовать специальные инфекционные структуры до и после внедрения. Поиск устьиц. Зооспоровые грибы привлекают к устьицам химические соединения, образующиеся при фотосинтезе и укорачивающие период подвижности зооспор, и вещества, выделяющиеся из открытых устьиц и привлекающие зооспоры. Поэтому в темноте зооспоры возбудителя ложной мучнистой росы хмеля Pseudoperonospora humuli долго плавают на смоченной поверхности листа и останавливаются в случайных местах, а на свету подвижное состояние укорачивается и зооспоры останавливаются у устьиц. Клетки фитопатогенных бактерий из родов Pseudomonas и Xanthomonas, равномерно распределенные на поверхности листа, через некоторое время собираются в районе устьиц под влиянием химических выделений. Проростки спор ржавчинных грибов ориентируются на поверхности листа в соответствии с кристаллической структурой кутикулярного воска. Поэтому на листьях однодольных растений они всегда растут перпендикулярно длинной оси листа, а на листьях двудольных - перпендикулярно сочленениям эпидермальных клеток (рис. 10). Апрессорий формируется над участком листа или силиконовой пленки, возвышающимся на высоту 0,5 мкм (такова высота устьичных губ). Таким образом, сигнал к морфодифференцировке дает механический контакт с кутикулярным ребром на поверхности субстрата. Формирование инфекционных структур. Ростковая трубка ржавчинного гриба над устьицей образует апрессорий, который прорастает гифой, растущей вертикально вниз в подустьичное пространство. Там образуется расширение - подустьичное вздутие, от которого в направление окружающих клеток вырастают инфекционные гифы, внедряющиеся непосредственно в клетки (рис. 11). Морфогенез протекает в зараженных растениях, но отдельные его этапы можно индуцировать in vitro выращиванием на коллодиевых мембранах, циклическими мононулеотидами, горомоном созревания растений - этиленом и др. Сейчас выделено несколько генов, регулирующих морфогенез,- INF (от infection) или PIG (in planta induced genes)-генов. Стратегия их идентификации заключается в том, что выделяют фракции инфекционной (m)РНК из проростков, имеющих разную степень дифференцировки - ростковых трубок, апрессориев, подустичных вздутий и т.д (это легче сделать регуляцией морфогенеза in vitro) и с помощью молекулярной гибридизации отделяют гены, экспрессия которых связана с тем или иным этапом морфогенеза. Первым белком, связанным с дифференцировкой, оказался кальмодулин - белок, регулирующий организацию цитоскелета. Действительно, микротрубочки и микрофиламенты, ориентированные в растущей гифе параллельно ее длинной оси, в апрессории ориентируются параллельно поверхности листа. Продукт гена INF24 связан с формированием апрессориев. Он начинает экспрессироваться через 3-4 часа после прорастания споры и продолжает до 10 час (начала формирования подустьичного вздутия). По своей структуре этот белок относится к ДНК-связывающим белкам - он имеет участок взаимодействующий с ДНК, и регулирующий экспрессию генов. Другие INF-гены начинают экспрессироваться позже. Их белки оказались гомологичными некоторым белкам, идентифицированным у позвоночных (цитокератину человека, фактору узнавания клеточной поверхности фибробластами цыпленка). Локализованный в мембране гаусторий белок PIG1, окзазался гомологичным гену дрожжевой пермеазы - фермента, осуществляющего транспорт аминокислот через мембрану. Внедрение через неповрежденную поверхность растения Может осуществляться механическим или химическим способами или их сочетанием. Для механического внедрения необходимо образование апрессория, в наружной оболочке которого откладывается меланин. Первые белки, синтезирующиеся при формировании апресория - кальмодулин и MPG1-белок, представляющий собой гидрофобин. Он имеет вид палочек, размером 5 nm, и необходим для прикрепления. Белки cap20 и cap22 - гликопротеины, связанные с клеточной стенкой апрессориев. Один из них нужен для формирования гаустория, другой - для его функционирования. Кроме того, в апрссориях экспрессируются гены биосинтеза меланина. Мутанты, у которых повреждены эти гены, имеют белые (alb) или розовые (rsy) апрессории и не способны заражать растения (хотя некоторые могут заражать через пораненную поверхность). При активном прободении поверхности необходимо преодолеть барьер в виде кутикулы, покрывающий большинство органов растений. Кутикула представляет собой нерастворимый полимер - кутин, погруженный в гидрофобный комплекс - воск, состоящий из неполярных С20-С32 алифатических углеводроов, жирных кислот, спиртов и их эфиров, которые экстрагируются органическими растворителями. Нерастворимая фракция кутин представляет собой полимер С16-С18 жирных кислот (диоксипальмитиновой, оксиолеиновой), соединенных эфирными связями со спиртами. Разрушение кутинового барьера осуществляется ферментом кутиназой, которая катализирует гидролиз эфирных связей (обладает эстеразной активностью). По своей структуре кутиназа - гликопротеин, способный освобождаться в окружающую среду и имеющий высокую степень гомологии у разных фитопатогенных грибов. Однако кутиназы разных видов грибов отличаются по оптимуму pН; по-видимому, это связано с особенностями кутина различных органов растения и органотропной специализацией паразитов. Так у обитающих на листьях грибов Cochliobolus heterostrophus, Botrytis cinerea, Venturia inaеqualis оптимум pН близок к нейтральному, а у поражающих стебли Fusarium solani f.sp.pisi (телеоморфа Nectria haematococca)и Rhizoctonia solani, - в щелочной области (9-9,5). Аlternaria brassicola и Colletotrichum lindemutianum, поражающие как стебли, так и листья, имели оптимум pН в слабокислой и щелочной областях. Кутиназа - индуцибельный фермент, который экспрессируется гидролизатом кутина и репрессируется глюкозой. У гриба F.solani небольшая концентрация кутиназы образуется конститутивно (вследствие наличия неиндуцибельного гена со слабым промотором). При контакте с кутином этот фермент вызывает разрушение нескольких молекул кутина и появление мономеров, индуцирующих экспрессию кутиназного гена, обладающего мощным промотором и продуцирующего активную кутиназу. О ее роли в патогенезе свидетельствуют следующие экспериментальные данные: 1/. Мутанты F. solani pisi, дефектные по продукции кутиназы, теряют патогенность к гороху (табл. 22). 2/. Раневой паразит авокадо гриб Mycosphaerella sp., не способный заражать неповрежденные плоды авокадо, стал продуцировать кутиназу и заражать неповрежденные плоды после трансформации кутиназным геном из F.solani pisi. Таблица 22. Роль кутиназы в патогенезе Fusarium solani f.sp.pisi Изоляты Активность Процент инфекции гипокотилей кутиназы Интактных пораненых Т-8 2610000 90 90 Т-3 12500 7 83 Проникновение паразитов в растительные клетки Проникновение в клетку возможно только после преодоления барьера клеточной стенки, которая подобно прочному каркасу поддерживает протопласт клетки, защищая его от механических и осмотических повреждений. Основной компонент клеточной оболочки - углеводы. В стенке растений обнаружено 9 моносахаридов: 3 гексозы (D-глюкоза, D-галактоза и D-манноза), 2 пентозы (Lарабиноза и D-ксилоза), 2 уроновые кислоты (D-глюкуроновая и Dгатактуроновая) и 2 дезоксигексозы (L-рамноза и L-фукоза). Они формируют различные полимеры друг с другом, а также с пептидами (гликопротеины). В клеточной стенке клена белокорого (явора) процентное содержание различных полимеров следующее: целлюлоза- микрофибриллы из линейных полимеров глюкозы (β1-4 глюканов), соединенных друг с другом по всей длине водородными связями 23%; рамногалактуронан - линейный полимер метилированной полигалактуроновой кислоты (α1-4 полигалактуронан), изредка чередующейся с рамнозой, - 16%; галактан - разветвленный (α1-4,β1-6) полимер галактозы - 9%; арабинан - разветвленный (α1-5,1-3) полимер арабинозы - 9%; ксилоглюкан - α1-4 глюкан с разветвлениями из ксилозы, галактозы и фукозы - 19%; ксилан - α1-4 ксилан с ответвлениями арабинозы и глюкуроновой кислоты 5%; гликопротеин - пептид с высоким содержанием аминокислоты оксипролина, соединенный через оксипролины с цепочками из 4-х молекул арабинозы - 19%. Эти полимеры соединены друг с другом ковалентными или водородными связями, образуя сложную сеть, из которой сложены первичная стенка растущей клетки, вторичная (более жесткая) стенка, определяющая форму клетки, и срединная пластинка - межклеточный цемент, склеивающие отдельные клетки в ткани, Таким образом, углеводы клеточной стенки определяют не только форму клетки, но и форму всего органа, а, в конечном счете, и всего растения. Исторически по способности экстрагироваться различными растворителями полимеры клеточной стенки разделяют на целлюлозу (линейные фибриллы βглюкана), гемицеллюлозу (разветвленные полимеры ксилана, ксилоглюкана, арабинана и др.) и пектин -(рамногалактуронан). Целлюлозные балки, погруженные в гемицеллюлозный матрикс, делают клеточную стенку растений подобной железобетонной конструкции. Веточки гемицеллюлозных молекул одними концами соединяются с целлюлозой, а другими - с пектином, обеспечивая единую систему (рис. 12). Из рамногалактуронана (пектина) построена и срединная пластинка. Во вторичной стенке откладывается также трехмерный полимер фенольных спиртов - лигнин, речь о котором будет ниже. Ферментами, разрушающими целлюлозу (целлюлазы), гемицеллюлозу (ксиланазы) и пектин (пектиназы), обладают многие фитопатогенные грибы и бактерии. Активные целлюлазы имеют древоразрушающие грибы; у паразитов травянистых растений наиболее активны пектиназы, а компоненты эктотрофной микоризы не способны разрушать ни целлюлозу, ни пектин. Пектолитические ферменты паразитов появляются в зараженном растении первыми. Разрушая пектин, они а/ разрывают связи между отдельными молекулами целлюлозы, нарушают композицию клеточной стенки и обеспечивают доступ к протопласту; б/ при сильном воздействии на стенку (у некротрофов) вызывают гибель протопластов вследствие осмотических эффектов (клетки, находящиеся в состоянии плазмолиза, не погибают); в/ разрушая пектин срединных пластинок, обеспечивают продвижение паразита внутри растения, а при сильном воздействии (при некротрофии) вызывают мацерацию и распад ткани. Пектиназы грибов и бактерий имеют различные механизмы воздействия на молекулу пектина и разную субстратную специфичность. 1. Пектин-метил эстеразы (ПМЭ) - деметилирует полигалактуронид с образованием полигалактуроновой кислоты (рис. 13). Свободные карбоксильные группы обычно в растении соединяются с двухвалентными металлами (Са2+), образуя соли - пектаты. В сосудах ксилемы, пораженных сосудистыми инфекциями, пектаты кальция поглощают воду и образуют набухающие гели - эмболы, препятствующие ксилемному току и являющиеся одной из причин инфекционного увядания растений. 2. Полигалактуроназы (ПГ). Вызывают распад полигалактуронида вследствие гидролиза глюкозидных связей между мономерами (рис. 13). По месту действия фермента разделяют на эндоПГ, осуществляющую разрывы по всей молекуле пектина и отщепляющая олигогалактурониды разной длины, и экзоПГ, которая отщепляет димеры от нередуцированных концов пектинового полимера. 3. Пектатлиаза (ПЛ). Катализирует трансэлиминативный распад пектина на олигогалактурониды; в отличие от действия ПГ, в данном случае образуются продукты с двойными связями. Ее вариант пектинлиаза (ПНЛ) отличается субстратной специфичностью к высоко метилированному пектину. Дальнейший распад молекулы пектина осуществляется с помощью других ферментов по схеме (Collmer,1986): Ферменты (аббревиатура, символ гена) Пектат лиаза (ПЛ; pel) Экзо-поли-альфа-D-галактуронидаза (ЭкзоПГ;peh) Олигогалактуронид лиаза (ОГЛ; oge) гексозо- Интермедиаты Полиналактуронат Дигалактуронаты 4-дезокси-L-трео-5- диулозо уронат (ДТН) Кетодезоксиуронат изомераза (КДУИ; kduI) 3-дезокси-D-глицеро- 2,5- гексодиулозонат (ДГГ) Кетодезоксиуронат дегидрогеназа (КДУД;kduD) 2-кето-3-дезокси-D-глюканат (КДГ) Большинство фитопатогенных грибов и бактерий продуцируют несколько пектолитических ферментов, каждый из которых может кодироваться семейством генов и существовать в нескольких изоформах, различающихся оптимумом pН, температуры и другими свойствами. Например, бактерия Erwinia chrysanthemi продуцирует несколько изоформ ПЛ с ИЭТ (изоэлектрическими точками) от 4,5 до 10 и экзоПГ с ИЭТ 8,5. Это создает гибкую систему воздействия на клеточную стенку растений, при которой в зависимости от pН, композиции и других свойств клеточных стенок в разных органах и тканях растения паразит использует те или иные формы пентиназ. Субстратная специфичность пектиназ может обусловливать возрастную и тканевую специализацию патогенов. Показано, например, что всходы фасоли, в клеточных стенках которых пектиновые вещества метилированы, более восприимчивы к ризоктониозу, чем зрелые растения, у которых пектин содержится главным образом в форме пектата кальция. ПГ фасоли активно деградирует эстерифицированный пектин, но не пектаты, чем и обусловлена устойчивость взрослых растений. Регуляция синтеза пектиназ осуществляется по принципам субстратной индукции и катаболитной репрессии. Синтез ПЛ у эрвиний индуцируется препаратом клеточных стенок растений, очищенным полигалактуронидом и продуктами его деградации (особенно активный индуктор - дигалактуронид). Согласно предложенной модели (Colmer,1986) ПЛ и экзоПГ в низком уровне продуцируются без индукции, освобождая димеры. Если условия среды оптимальны для ПЛ (высокий уровень pН, наличие бивалентных катионов), то накапливаются ненасыщенные дигалактурониды, в иных условиях под действием экзоПЛ накапливаются насыщенные. Димеры индуцируют высокий уровень экспрессии ферментов. В присутствии энергетически более выгодного катаболита (глюкозы, например) пектиназы не образуются. Исключение из этой схемы составляет фермент ПНЛ, который у фитопатогенных бактерий индуцируется не пектином, а агентами, повреждающими ДНК (УФ-лучами и др.). Экспорт пектиназ из клетки у большинства фитопатогенных организмов осуществляется вследствие наличия в их молекулах участков, обеспечивающих перенос через мембрану и отщепляемых в процессе переноса клеточными протеазами. У E.chrysanthemi экспорт ПЛ осуществляется в два этапа: сначала фермент секретируется через внутреннюю мембрану в периплазменную область, как описано выше, затем с помощью продукта гена out переносится через наружную мембрану (клеточную стенку). Клонирование пектиназных генов у фитопатогенных бактерий и некоторых грибов (Aspergillus, Fusarium) позволило не только установить их структуру и особенности экспрессии, но и перенести их в непатогенные виды и формы микроорганизмов. Во многих лабораториях некоторые pel-гены эрвиний были перенесены в кишечную палочку, которая после этого приобретала способность не только мацерировать срезы клубней картофеля, но заражать всходы, вызывая типичные симптомы бактериальной болезни “черная ножка” и накапливаться в зараженных растениях. При этом, как симптомы болезни, так и размножение бактерий в восприимчивых к бактериозу сортах картофеля были более интенсивными, чем в устойчивых. Таким образом, пектатлиазы - истинные факторы патогенности фитопатогенных бактерий из рода Erwinia. Стабилизация инфекции и распространение паразитов по растению Для распространения в растении, перехода из зараженной клетки в незараженные, паразиту необходимо: 1/ подавить защитные свойства не отдельной клетки, а ткани; 2/ изменить метаболизм растения в нужную для паразита сторону; 3/ обеспечить ближний и дальний транспорт в растении. Подавление защитного потенциала растения Гидролитические ферменты, разрушающие клеточную оболочку, для этой цели не годятся, так как, будучи высокомолекулярными соединениями, они не способны мигрировать по растению. Эти ферменты - оружие ближнего боя. Роль веществ, мигрирующих от места инфекции по растению и создающих плацдармы для дальнейшей его оккупации паразитом, выполняют вивотоксины. Это название, предложенное американскими фитопатологами Даймондом и Ваггонером, возникло вследствие методической дискуссии о критериях фитотоксинов микробного происхождения. В первых исследованиях токсических метаболитов грибов растения подвергали воздействию фильтрата жидкой питательной среды, в которой культивировали исследуемый вид гриба. Если обработка фильтратом вызывала такие же симптомы болезни, как и заражение грибом (увядание, некрозы и т.п.), то считалось, что в культуральную жидкость выделяются фитотоксины, которые можно очистить и исследовать. Однако, при длительном росте на искусственной питательной среде происходит автолиз отдельных клеток мицелия и освобождение в среду веществ, которые в норме в растение не освобождаются. Подобные методы изучения привели к ошибкам в установлении химической природы фитотоксинов. Поэтому было предложено в качестве критериев токсина учитывать, во-первых, воспроизводство данным химическим соединением симптомов болезни и, вовторых, обнаружение его не только в колбе (in vitro), но и в зараженном данным патогеном растении (in vivo). Вивотоксины неспецифичны, они вызывают повреждения не только хозяина данного паразита, но и видов растений, находящихся за пределами его пищевой специализации. Поэтому вивотоксины относят к факторам неспецифической (горизонтальной) патосистемы. По химической природе вивотоксины разделяют на несколько групп (рис. 14): 1. Органические кислоты, например, щавелевая кислота возбудителя белой гнили Sclerotinia sclerotiorum. 2. Циклические ароматические соединения (кумарины, азотсодержащие алкалоиды и др.). Таковы альтернариевая кислота (продуцент - Alternaria solani), фузариевая кислота (Fusarium oxysporum) и др. 3. Циклические пептиды, состоящие из нескольких аминокислот, замкнутых в кольцо - фазеолотоксин (продуцент Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola), тентоксин A.tenuis (syn.A.alternata) и др. 4. Гликопептиды, такие как токсины Clavibacter michiganense (возбудитель бактериального рака томатов) и Phoma tracheophylla (возбудитель мальсекко цитрусовых). 5. Полисахариды (токсин бактерий Xanthomonas campestris). 6. Полипептиды, например, цератоульмин - 13 kDa токсин возбудителя голландской болезни ильмов Ophiostoma ulmi. По механизму действия выделяют две основные группы токсинов: 1. Ингибиторы определенных ферментов растений. Табтоксин - токсин P.syringae pv.tabaci - дипептид, соединенный с βлактамовым кольцом. В зараженном растении протеазы отщепляют активную часть токсина - табтоксинин-бетта-лактам - ингибитор фермента глютаматсинтетазы. В результате снижения активности фермента накапливается его предшественник аммоний, вызывающий разобщение фосфорилирования, ингибирование фотосинтеза и фотодыхания. Это нарушения обмена проявляются как системный хлороз и задержка роста. Фазеолотоксин - циклический трипептид P.savastanoi pv.phaseolicola. В растении протеазы отщепляют активное начало фазеотоксин орнитидин специфический ингибитор фермента орнитинкарбамоилтрансферазы, которая катализирует конверсию орнитина в цитруллин и аргинин. В зараженных растениях содержание орнитина увеличивается в 100 раз. Коронатин - токсин многих патоваров P.syringae, в частности, возбудителя ожога листьев овса P.syringae pv.coronafaciens. Он вызывает пожелтение листьев табака, ингибирует рост корней пшеницы, повышает активность амилазы и гипертрофию клубней картофеля. По своей структуре коронатин схож с растительным гормоном жасмоновой кислотой (рис. 14), перепродукция которой вызывает сходные симптомы у растений. Вероятно, коронатин замещает жасмоновую кислоту, о роли которой речь будет идти ниже (гл.5). Тентоксин - токсин гриба Alternaria tenuis (=A.alternata). Циклический тетрапептид, вызывающий хлороз, вследствие связывания с сопрягающим фактором (CF1) и ингибирования фотосинтетического фосфорилирования. 2. Мембранноактивные вещества Очень многие токсины, такие как фузариевая кислота (F.oxysporum), токсины бактерий из рода Clavibacter, токсины многих патоваров P.syringae (коронатин, сирингомицины), токсины фитопатогенных грибов из родов Rhinchosporium, Cephalosporium, Fusicoccus, Cercospora, Phoma и другие обладают сильным мембранотропным эффектом. Они индуцируют потерю метаболитов из клеток и их некрозы, влияют на трансмембранный перенос ионов и открывают устьица, вызывая увядание растений. Роль токсинов в патогенезе разнообразна и до конца не расшифрована. Для многих паразитов установлены выделение токсинов в зараженное растение и их миграция по растению, опережающая миграцию самих возбудителей. Поэтому такие системные симптомы болезней, как увядание и хлороз могут быть обусловлены миграцией токсинов из точки заражения. Значение токсинов в патогенезе показано с помощью мутантов, лишенных способности их продуцировать (tox.-) У фитопатогенных бактерий получены нетоксигенные штаммы с помощью транспозонового мутагенеза (генетическая трансформация клетки мобильным генетическим элементом - транспозоном, который, внедряясь в какой либо участок ДНК, вызывает мутации находящихся там генов). Как правило, такие мутанты вызывают более слабые симптомы болезни и накапливаются в зараженных растениях в значительно меньшей концентрации. У возбудителя голландской болезни ильмов Ophiostoma ulmi штаммы, не продуцирующие цератоульмин, не только не патогенны, но имеют измененные морфолого-культуральные признаки и медленно растут in vitro. Влияние токсина на морфогенез продуцента обусловлен тем, что цератоульмин относится к семейству гидрофобинов - гидрофобных белков, имеющих морфогенетические функции. Таким образом, у многих фитопатогенов вивотоксины имеют узко специфичные сайты действия (определенные ферменты); их неспецифичность обусловлена тем, что эти сайты имеются у большинства растений и часто являются ключевыми в метаболизме растений. Некоторые токсины (например, цератоульмин) бифункциональны и наряду с токсичным для растения действиям несут иные функции, которые возможно первичны. Изменения метаболизма зараженных клеток и тканей Синтез важнейших метаболитов растений, направления их потоков и, следовательно, морфогенетические процессы регулируются фитогормонами, которые разделяют на несколько групп веществ, сходных по химической природе и морфогенетическому действию (рис. 15). Важнейшие фитогормоны ауксины (вызывают образование и рост корней, деление клеток и др. процессы), цитокинины (вызывают дифференциацию и рост надземной массы, задерживают старение клеток, открывают устьица), гиббереллины (вызывают растяжение клеток, индуцируют цветение), абсцизовая кислота (вызывает торможение роста и деления клеток, закрывает устьица, повышает устойчивость к стрессам, способствует аккумуляции запасных продуктов в покоящихся органах), этилен (вызывает созревание плодов, способствует осеннему опадению листьев: утолщает стебли и укорачивает междоузлия). Как видно, многие из описанных событий, регулируемых фитогормонами, характерны для больных растений, особенно пораженных биотрофами, которые изменяют потоки метаболитов в направление инфекции, задерживают старение клеток, индуцируя образование “зеленых островков”, стимулируют деление и растяжение клеток растений и образование опухолей, пролифераций и т.п. Гиббереллин вообще был впервые выделен из гриба Gibberella fujikuroi, вызывающего израстание риса (болезнь ваканае). Ржавчинные и мучнисторосяные грибы выделяют в растение цитокинины и ауксины. Разрастание корней (кила) крестоцветных возникает под влиянием цитокининов, выделяемых возбудителем. Локальное выделение цитокининов грибами Exobasidium и Taphrina, бактерией Corynebacterium fasciens приводит к потере апикального роста и израстанию пораженных органов. Регулирование гормонообразования наиболее подробно исследовано у галлообразующих фитопатогенных бактерий. Pseudonomas savastanoi pv.savastanoi вызывает галлы на оливе и олеандре вследствие выделения в пораженные растения ауксина - индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Синтез ИУК из триптофана протекает в два этапа, катализируемые ферментами триптофанмонооксигеназой и индолацетамид гидролазой (рис. 16). Гены, кодирующие эти ферменты (iaam и iaah соответственно) находятся у изолятов из олеандра на плазмиде plAA, а у изолятов из маслины могут быть и в “хромосоме”. Изоляты из олеандра могут заражать обоих хозяев, а изоляты из оливы - только маслины. Мутанты, лишенные plAA плазмиды, не могут формировать опухоли, мутанты с суперпродукцией ИУК индуцируют образование более крупных опухолей. У возбудителей корончатых галлов Agrobacterium tumefaciens плазмидная ТДНК интегрируется в геном зараженной клетки растения. Т-ДНК имеет гены tms-1и tms-2, аналогичные генам iaam и iaah P.savastanoi pv.savastanoi, продукты которых контролируют конверсию триптофана в ИУК, а также ген ipt, контролирующий синтез фермента изопентилтрансферазы, необходимого для образования изопентил-АМФ - ключевого интермедиата на пути образования двух цитокининов - транс-рибозилзеатина и транс-зеатина. Продукция ИУК и цитокининов вызывает быстрые клеточные деления и неопластический рост ткани. Родственный вид бактерии А.rhizogenes вызывает “бородатость” корней зараженных растений. В ее плазмиде локализованы онкогены, названные rol (root locus) гены. Каждый из них (rol A,B,C,D) трансформирует клетку в корневую. rolB и rolC участвуют в освобождении ауксинов и цитокининов из неактивных комплексов (например, rolC контролирует фермент беттаглюкозидазу, отщепляющий цитокинин из неактивного глюкозида). Гормональную роль выполняют и многие вивотоксины. Например, токсин возбудителя рака и увядания персика и миндаля Fusicoccum amygdaly фузикокцин обладает функциями ауксина и цитокинина. Главный эффект фузикокцина заключается в воздействии на трансмембранный перенос веществ, регулируемый обменом ионов водорода и калия, и, вследствие этого, в повышении водопроницаемости замыкающих клеток устьиц, изменении их формы и открывании устьиц. Фузикокцин индуцирует растяжение ткани, прерывание периода покоя у семян. Другой вивотоксин гельминтоспораль (продукт гриба Bipolaris sorokiniana, возбудителя темно-бурой пятнистости пшеницы) вызывает, подобно гиббереллину, разрастание риса, некрозы у овса и пшеницы, стимулирует образование фермента α-амилазы. Таким образом, между вивотоксинами и фитогормонами нет жесткого разделения: токсическое или гормональное действие того или иного соединения определяется его концентрацией, видом растения, его возрастом и органом, который подвергается воздействию. Транспорт по растению Грибы и бактерии в большинстве случаев распространяются в растении локально на небольшие расстояния от места инфекции по межклетникам. Ксилемные инфекции грибов и бактерий (трахеомикозы и трахеобактериозы) распространяются по всему растению с ксилемным током. У живущих в ксилеме грибов из рода Verticillium при распространении по сосудам происходит чередование мицелиального и дрожжеподобного роста (мицелиально-дрожжевой диморфизм). Находясь в сосудах, гриб размножается почкованием (артроспорами), которые легко увлекаются ксилемным током. При достижении перфорированных перегородок в сосудах, споры прорастают в них гифами, в которых образуются пектолитические ферменты, растворяющие углеводы перегородки и открывающие дальнейший путь дрожжеподобным спорам. Специфические проблемы стоят при передвижении в растении вирусов. После репродукции в первично зараженной клетке происходит заражение всего растения вследствие перемещения вирусов из клетки в клетку (ближний транспорт) и по флоэме (дальний транспорт). Ближний транспорт осуществляется через плазмодесмы, которые представляют собой мембранные тяжи между клетками с микроканалами внутри. Опыты с молекулами декстрана показали, что через плазмодесмы могут проходить только очень мелкие молекулы размером около 1 kD. Однако вирусная нуклеиновая кислота кодирует специальный транспортный белок (ТБ), который содействует переходу через плазмодесмы. Первый такой белок был открыт у ВТМ. Он имеет молекулярную массу 30 kD и кодируется геном, расположенным ближе к 3’ концу вирусной РНК (рис. 5). Этот белок связывается с очищенной вирусной РНК in vitro и in planta и открывает плазмодесмы, позволяя проходить через них крупным молекулам. У табака, в геном которого генноинженерными методами был встроен ген 30 kD белка, размер молекул, проходящих через плазмодесмы увеличился с 850 D до 10kD и более. Гены, кодирующие синтез транспортных белков, обнаружены и у других вирусов. Таким образом, движение через плазмодесмы осуществляется в форме нуклеопротеида - транспортного белка, соединенного с вирусной РНК. Несколько молекул ТБ связываются с вирусной молекулой РНК и этот комплекс движется по элементам цитоскелета: в цитоплазме по микротрубочкам, вблизи плазмодесм - по филаментам актина, пронизывающим плазмодесмы (рис. 17). Скорость движения вируса гравировки табака (из группы потивирусов) составляет 1 клетка за 2 часа. Дальний транспорт осуществляется флоэмным током, поэтому скорость и направления тока оказывают решающее влияние на распространение вирусов по растению. Давно было показано, что после заражения одного листочка томата ВТМ сначала инфицируется весь зараженный лист, затем - стебель ниже листа и корни, затем - верхушка и после этого - все растение. Движение по флоэме осуществляется как в форме целых частиц, так и в форме нуклеопротеидов, в которых вирусная РНК соединена с белком. ФАКТОРЫ УСТОЙЧИВОСТИ Факторы неспецифической устойчивости в горизонтальной патосистеме Гойман (1954) разделил на аксению и истинную устойчивость. Аксения - это устойчивость, проявляющаяся до контакта с клетками растения, и, следовательно, препятствующая заражению. Истинная устойчивость проявляется после контакта с клеточным протопластом и обеспечивает замедление развития и (или) снижение продуктивности паразита. Понять различия между аксенией и истинной устойчивостью можно на таком примере: из трех злаков - ржи, пшеницы и кукурузы первый сильно поражается спорыньей, второй - поражается очень слабо, а третий - совсем не поражается, то есть первый - восприимчив, а остальные - устойчивы. Однако при искусственном заражении цветков конидиями паразита пшеница поражается почти также сильно, как и рожь, а кукуруза остается непораженной. Разница между рожью и пшеницей заключается в том, что первая, как ветроопыляемое растение, имеет открытые для попадания спор паразита цветки, а вторая, будучи самоопылителем, имеет закрытое цветение. Таким образом, эти злаки различаются не устойчивостью клеток, а шансами достигнуть восприимчивых клеток, т.е. факторами аксении. В отличие от них кукуруза имеет истинную устойчивость протопласта. Как видно из приведенного примера, факторы аксении по большей части - анатомо-морфологические, в то время как факторы истинной устойчивости чаще имеют физиолого-биохимическую природу. Анатомо-морфологические факторы устойчивости Габитус растений. Сорта картофеля, имеющие раскидистую ботву, менее поражаются фитофторозом, чем сорта с плотными кустами, хотя при искусственном заражении листьев в лаборатории никакой связи между габитусом куста и поражаемостью нет. Различия объясняются тем, что капли, необходимые для заражения, на листьях раскидистых сортов быстрее высыхают, чем у сортов с плотным кустами. Короткостебельные сорта пшеницы подвержены сильному поражению грибами, вызывающими пятнистости листьев, споры которых распространяются водяными брызгами (септориоз, ринхоспориоз др.), ибо расстояние между листьями (длина междоузлий) у таких сортов уменьшено. Сорта с опущенными вниз листьями, покрытыми к тому же густым восковым налетом, менее подвержены поражению ржавчиной, мучнистой росой, пятнистостями листьев, чем сорта с горизонтально расположенными или приподнятыми в верх листьями, ибо инфекционные капли в первом случае скатываются с листьев. Б.Г.Рейтер предлагает поэтому оценивать каплеудерживающую способность листьев как один из показателей устойчивости пшеницы. Опушенность листьев. Сорта малины с опушенными листьями меньше подвержены вирусным болезням, чем сорта с гладкими листьями. Это обусловлено затрудненными условиями для питания тлей-переносчиков вирусов. Строение и расположение устьиц. Сорта мандарина более устойчивы к поражению возбудителем бактериального рака Xanthomonas citri, чем грейпфрута. Различия обусловлены тем, что наружные стенки устьиц мандарина снабжены выступами, препятствующими проникновению в подустичную щель капель жидкости с находящимся в них клетками бактерий. У восприимчивых сортов грейпфрута таких выступов нет. Виды и сорта растений с более редким расположением устьиц на листьях, слабее поражаются грибами, гифы которых внедряются через устьца (например, дикариотичные стадии возбудителей злаковых ржавчин). Анатомические особенности внутренних тканей растения. Как показали Э.Э.Гешеле и Л.Т.Бабаянц (1970) восприимчивые к стеблевой ржавчине сорта пшеницы имеют развитую хлоренхиму, распространяющуюся широкими тяжами под эпидермисом, в то время как у устойчивых сортов хлоренхимная ткань имеет вид островков, разделенных группам склеренхимных, недоступных для колонизации, клеток. Регуляция онтогенеза и репарации повреждений Возбудители многих болезней, таких как твердая головня пшеницы, корневые гнили всходов и др., поражают растения только на ранних этапах их развития; другие - возбудители фитофтороза картофеля, вертициллезного вилта хлопчатника и др., наоборот, стареющие ткани, в которых отток и распад углеводов преобладает над фотосинтезом. Поэтому сорта, у которых быстро протекают ранние фазы онтогенеза, слабо поражаются болезнями первой группы, а сорта, у которых замедлено наступление старения, относительно устойчивы к болезням второй группы (М.С.Дунин,1946). На этом основаны также агротехнические приемы защиты растений с помощью регуляции скорости протекания отдельных фаз онтогенеза (высев озимых злаков в ранние сроки, а яровых - в поздние для получения дружных, быстро растущих всходов, задержка старения азотными удобрениями др.). Многие паразиты растений могут внедряться в ткани только через ранки (раневые паразиты). Скорость суберинизации раневых поверхностей коррелирует с устойчивостью к подобным паразитам. Поэтому помещения, предназначенные для длительного хранения овощей и картофеля, снабжены устройствами, обеспечивающими продув воздуха с определенной температурой и влажностью через слой хранящейся продукции (активное вентилирование), ибо образование суберина требует больших энергетических затрат. Устойчивость к биотрофным паразитам с гаусториальным питанием может быть обусловлена скоростью образования папиллы - каллезной пробки, заделывающей брешь в клеточной стенке. Прочная папилла, содержащая кремний, обеспечивает устойчивость сортов ячменя с геном неспецифической устойчивости ml0 к мучнистой росе. Пищевая ценность зараженных органов и тканей Хотя растения представляют для паразитов, прежде всего, питательный субстрат, пищевые достоинства, по-видимому, не являются решающими в поражаемости тех или иных видов и сортов. Поскольку отмершие растения или их части заселяются микроорганизмам, неспособными заражать те же растения в живом состоянии, устойчивость растений обусловлена не содержанием тех или иных питательных веществ, а антибиотическими свойствами живой ткани. Однако, в некоторых случаях именно пищевые достоинства обусловливают степень восприимчивости растений к тем или иным болезням. Для доказательства связи содержания какого-либо пищевого компонента в растении с поражаемостью, предложено несколько специальных тестов (Strange, Smith,1978): 1/ повышение скорости роста на минимальной среде с добавкой экстракта из восприимчивого растения; 2/ демонстрация того, что экстракты из восприимчивых хозяев эффективны при более высоких разведениях, чем экстракты из устойчивых; 3/ изоляция и идентификация стимулирующих рост веществ из экстрактов; 4/ демонстрация того, что в восприимчивых растениях концентрация стимулирующего вещества выше, чем в устойчивых; 5/ обнаружение специфичности стимулирующего вещества для данного паразита в отличие от непаразитов (паразитов других растений); 6/ демонстрация пищевого лимита по данному веществу в относительно устойчивых видах, сортах или тканях; 7/ определение способа действия стимулирующего вещества. Большинство тестов оказались выполненными для установления связи между содержанием в растениях азотсодержащего соединения холина и его эфира бетаина и поражаемостью Fusarium graminearum. Сильное поражение цветков злаков обусловлено высоким содержанием холина и бетаина в пыльниках. Биохимичеcкие факторы устойчивости Химические факторы, с помощью которых растения защищают себя от болезней, многообразны по химическому составу, условиям образования и механизмам токсичности. Для их номенклатуры и классификации большую роль сыграли два исследования: В 1928 г. зоолог Б.П.Токин обнаружил токсичность для Protozoa летучих соединений из гомогенатов лука и чеснока. Токсические летучие соединения из растений он назвал фитонцидами.В 1941 г. немецкий фитопатолог К.Мюллер обнаружил, что в ответ на заражение картофеля авирулентной расой Phytophthora infestans в ткани клубня накапливаются токсические вещества, названные им фитоалексинами. Используя эти термины, Л.В.Метлицкий и О.Л.Озерецковская (1975) предложили все (а не только летучие) антибиотические вещества растений, образующиеся конститутивно, независимо от заражения, называть фитонцидами, а соединения, синтез которых индуцируется заражением - фитоалексинами. Предлагались и более сложные системы классификации. Например, Дж.Ингхэм (1973) наряду с конституционными и индуцированными соединениями выделил еще полуконституционные, которые присутствуют в незараженном растении, но при заражении их синтез усиливается, и полуиндуцируемые, которые возникают при различных видах стресса (заражении, механическом повреждении и др.) путем распада более сложных соединений, а не синтеза из менее сложных. Затем, однако, в 1994 г. группа исследователей (Г.ВанЭттен, Дж.Мансфилд и др.) предложили вернуться к двум группам растительных антибиотиков, которые они назвали фитоантиципинами и фитоалексинами. Первые “низкомолекулярные антимикробные вещества, присутствующие в растении до заражения или продуцируемые после заражения из предшественников”, вторые - “низкомолекулярные антимикробные вещества, которые синтезируются и аккумулируются в растении после экспозиции с паразитом”. Синтез фитоалексинов определяется взаимодействием генопродуктов растения и паразита, то есть относится к специфической патосистеме будет рассмотрен позже. Фитоантиципины - разнородная группа веществ, которая включает в себя соединения, присутствующие в интактных клетках, и соединения, возникающие только при повреждении клеток. Кроме того, наряду с низкомолекулярными соединениями имеются и высокомолекулярные, например, белки, обладающие выраженными антибиотическими свойствами. Разделение антимикробных веществ растений на фитоантиципины и фитоалексины условно, как условно большинство биологических классификаций. Например у всходов Arabidopsis cинтез антимикробного белка тионина находится под контролем двух генов, один из которых (Thi2.2) конституционен, а экспрессия второго (Thi2.1) индуцируется заражением. Некоторые вещества в одних видах растений конститутивны, т.е. являются фитоантиципинами, а в других – индуцируются заражением (фитоалексины). Поскольку в растении действует весь комплекс защитных веществ, приведенное выше деление сделано лишь в учебных целях. Химическая классификация фитоантиципинов Фенолы. К фенолам относят циклические соединения, содержащие ароматическое кольцо с фенильным гидроксилом или его замещенными радикалами (кислотным, альдегидным и проч.). Многие растительные фенолы помимо фенила (С6) содержат пропановый радикал (С3) и названы фенилпропаноидами. Синтез фенолов осуществляется двумя путями (рис 18): конденсацией молекул уксусной кислоты (ацетатный путь) и в результате метаболизма фосфорилированных сахаров (глюкозо-6-фосфата) через шикимовую кислоту и ароматические аминокислоты (шикиматный путь). Многие сложные растительные фенолы, содержащие два фенольных кольца (флавоноиды), образуются соединением колец, синтезированных по ацетатному и шикиматному путям. Исследование растительных фенолов хорошо иллюстрируют условность деления антибиотических веществ на конституционные и индуцибельные. Фенолы – нормальные метаболиты растений, ибо входят в состав пигментов, регуляторов роста, структурных элементов клеточных стенок. В то же время фенолы – стрессовые метаболиты, синтез которых резко возрастает при поранении или заражении. Поэтому основные ферменты, участвующие в синтезе и превращениях фенолов, и регуляция активности ферментов будут рассмотрены при описании вертикальной патосистемы, а в данном разделе познакомимся лишь с их влиянием на инфекционный процесс. Оксилительно-восстановительная реакция превращения фенолов в общем виде описывается следующим образом: полифенолоксидаза ½ О2 + дифенол ↔ хинон + Н2О хинонредуктаза Отсюда вытекают основные механизмы антимикробного действия фенолов: 1/. Инактивация белков вследствие соединения хинонов с SH-, NH2 группами и формированием замещенных продуктов. 2/. Неспецифическое окислительное действие хинонов. Будучи активными окислителями, хиноны являются акцепторами электронов у многих соединений. 3/. Влияние на трансмембранный транспорт веществ. Некоторые замещенные фенолы служат проводниками протонов в мембранах и вследствие этого действуют как разобщающие агенты. 4/. Регуляция ростовых процессов. Промежуточные соединения в метаболизме фенолов могут быть нетоксичными, но в низких концентрациях влиять на метаболизм фитогормонов. Многие фенолы, являясь ингибиторами ИУКоксидазы, способствуют накоплению ИУК. А как было сказано выше, фитогормоны оказывают существенное влияние на паразито-хозяйские взаимоотношения. 5/. Создание химических барьеров. Продукты окисления фенольных спиртов, конденсированные в результате свободно-радикальных реакций, образуют аморфный 3-мерный полимер лигнин (рис. 19), откладывающийся в клеточных стенках (обычно во вторичных стенках и стенках мертвых клеток). Защитное действие лигнина многообразно. Он ковалентно связывается с углеводными полимерами растительной клеточной стенки и защищает их от атаки грибными деполимеразами; препятствует диффузии в клетки растений метаболитов патогенных организмов; обладает прямой токсичностью для микроорганизмов; может лигнифицировать внутрирастительные гифы грибов. Терпеноиды. К терпеноидам относят соединения, синтезируемые из уксусной кислоты путем конденсации ее молекул. Первый продукт конденсации – изопрен – содержит 5 атомов углерода (С5, рис. 20, 1). В построении терпеноидов участвуют 2 группы ферментов – полимеразы, соединяющие молекулы изопрена в цепочку, и циклазы, осуществляющие преобразование цепочек в замкнутые кольца. Конденсация двух молекул изопрена дает группу соединений, названных монотерпенами (С10 , рис 20, 2). Эти низкомолекулярные моноциклические летучие вещества часто придают растениям специфические запахи. Конденсация трех молекул изопрена приводит к образованию сесквитерпенов (С15). Многие бициклические сесквитерпены обладают высокой токсичностью и являются важными факторами устойчивости растений (рис. 20, 3). 4 молекулы изопрена составляют дитерпены (С20) – основные компоненты смол древесных растений. Многие дитерпены горькие на вкус (например, горький фактор огурца). 6 молекул изопрена составляют основу большой группы тритерпенов (С30). К ним относятся пентациклические тритерпеноиды (5 шестичленных циклов) и стероиды, ядро которых состоит из трех шестичленных циклов и одного пятичленного. Фитостерины (рис. 21) – необходимый компонент растительных мембран, а эргостерин - мембран многих грибов. Токсичность многих тритерпеноидов обусловлена их способностью связываться с стеринами мембран; в результате чего образуются поры в мембранах и происходит потеря клеточного содержимого в окружающую среду (лизис). В мембранах эритроцитов тритерпеноиды соединяются с холестерином, вызывая вытекание гемоглобина (гемолиз эритроцитов). Минимальная концентрация тритерпеноида, вызывающая окрашивание гемоглобином кровяной плазмы (надосадочной жидкости, полученной после осаждения клеточных элементов крови), называется гемолитическом индексом и является показателем токсичности. Наконец соединение восьми молекул изопрена дает многочисленный класс тетратерпеноидов (С40). Их линейные молекулы (рис. 22) образуют большую группу растительных пигментов каротиноидов, которые окрашивают цветки, плоды, корнеплоды, осенние листья растений. Белки, аминокислоты. Факторами устойчивости растений к патогенам могут быть семейства низкомолекулярных, основных, богатых цистеином белков, включающих растительные дефензины, белки, осуществляющие трансмембранный транспорт липидов, белки, подавляющие синтез белка, чужеродными рибосомами на стадии элонгациии и тионины, накапливающиеся в семенах и проростках многих растений. Их антимикробное действие продемонстрировано многими опытами. Они обнаружены в семенах, листьях, цветках и клубнях. Большинство этих белков накапливаются в клеточных стенках или даже на поверхности семян, осуществляя функции первой линии обороны. В семенах некоторых бобовых обнаружена необычная аминокислота lканаванин, содержание которой может достигать 2-3 % сухого веса семян. Будучи антиметаболитом аргинина, она высокотоксична и защищает семена от повреждения грибами и насекомыми. Стратегия устойчивости Растения обладают не только химическим разнообразием защитных соединений, но и разнообразными стратегиями их применения. Используя военную терминологию, можно сказать, что растения имеют глубоко эшелонированную оборону с гибким управлением, способным создавать в нужном месте и в нужное время разнообразные защитные барьеры на пути продвижения паразита. Фитонциды Как уже было сказано, фитонцидами Б.П.Токин обозначил летучие вещества растений, убивающие микроорганизмы. В дальнейшем этим термином стали называть вообще все антимикробные вещества, присутствующие в незараженных растениях. Это привело к большой путанице, ибо для исследования фитонцидности растительных тканей, вслед за Б.П.Токиным, их предварительно мацерировали. При разрушении клеток приходят в соприкосновение субстраты и ферменты, находившиеся в интактной ткани в разных компартментах, и возникают новые химические вещества, которые при биотрофном паразитизме вообще отсутствуют, а при некротрофном также могут не возникать вследствие инактивации ферментов токсинами паразита. Поэтому в термин «фитонциды» мы будем вкладывать первоначальный смысл, данный Б.П.Токиным. Известный ботаник Б.М.Козо-Полянский назвал фитонциды «первой линией обороны», ибо они токсичным облаком окружают растения. Так в экстрактах летучих веществ из корней акации с помощью газовой хроматографии было обнаружено 270 органических соединений, многие из которых подавляли рост мицелия и прорастание зооспор паразита корней Phytophthora cinnamomi. В основном, это низкомолекулярные соединения – органические кислоты, альдегиды, монотерпены, простые фенолы. Антимикробные эксудаты листьев образуют защитные пленки на поверхности. Реализация многих антимикробных веществ на поверхность листа происходит из листовых волосков, служащих депо для фенолов и других соединений. Антимикробные вещества растительных покровов Многие органы растений, клубни, луковицы, стволы древесных пород покрыты слоем мертвых клеток. Отмирание клеток, как и их механическое повреждение, приводит к разрушению внутриклеточных мембран и совмещению химических соединений, разобщенных в живой клетке мембранам. В результате этого протекают химические реакции и накапливаются высокотоксичные соединения. Их накопление в живых клетках могло бы привести к их повреждениям, но в мертвых клетках они играют роль химического барьера на пути повреждения паразитов. Например, желтая окраска чешуй лука обусловлена находящимся в вакуолях флавоновым пигментом кверцитрином, который представляет собой сложный фенол квертецин, соединенный гликозидной связью с моносахаридом рамнозой. В отмирающих кроющих чешуях луковицы вследствие разрушения вакуолей происходит серия химических реакций: сначала фермент глюкозидаза отщепляет сахарный остаток, затем фенолоксидазы расщепляют квертецин до низкомолекулярных водорастворимых монофенолов фенолов – протокатеховой кислоты и о-катехола (рис. 23), которые высоко токсичны для микроорганизмов. Диффундируя на поверхность в инфекционную каплю, они убивают споры фитопатогенных грибов. Поэтому окрашенные сорта лука устойчивы к грибам, вызывающим гнили луковиц. Луковицы с поврежденными кроющими чешуями поражаются независимо от наличия окраски, ибо в живых клетках простые фенолы не накапливаются. В мертвых клетках коры многих деревьев присутствует токсичный для микроорганизмов дифенол пиносильвин (рис. 24), в клетках коры ильмов – фактор устойчивости к голландской болезни cесквитерпен мазонон (рис. 20, 3). Антимикробные вещества живых клеток Большинство токсических веществ находится в живых клетках в форме гликозидов, которые, во-первых, менее токсичных, чем их агликоны и, поэтому не опасны для клеточного метаболизма, и, во-вторых, водорастворимы и поэтому являются транспортной формой токсинов. Обычно они находятся в вакуолях и отделены тонопластом от других компонентов клетки, что также защищает ее от повреждающего действия. При повреждении клеточных мембран содержимое вакуолей выливается в клетку и гликозиды входят в контакт с ферментами гликозидазами, находящимися в других мембранных пузырьках лизосомах, или ковалентно связанными с компонентами клеточной стенки. В результате химических реакций освобождаются высоко токсичные агликоны, убивающие клетку и находящихся в ней паразитов. Такова генеральная стратегия защиты от заражения и иных стрессов. Частный случай такой защиты – рассмотренное выше освобождение агликонов в естественно отмирающих кроющих клетках. Классифкация гликозидов основывается на химическом строении агликонов. Фенольные гликозиды. Выше описаны реакции превращения фенольного гликозида кверцитрина в кроющих чешуях окрашенных луковиц. У различных видов злаков (ржи, пшеницы, кукурузы) содержится семейство глюкозидов бензоксазинов, агликон которых содержит наряду с фенолом азотсодержащий цикл (рис. 25). В поврежденных клетках освобождаются агликоны бензоксазолиноны, токсичные для ржавчинных грибов, возбудителей снежной плесени, тлей и других насекомых. По-видимому, эти соединения являются важным фактором неспецифической устойчивости. Например, корреляция между их содержанием в листьях инбредных линий кукурузы и поражаемостью этих линий листовой тлей составила –0,72 (Long et al.,1977). Цианогенные гликозиды. Многие растения (сорго, лядвенец, просо, лен и др.) содержат цианогенные гликозиды (дурринин, линамарин, лотаустролин), которые образуются в процессе прорастания семян из аминокислот (тирозина и др.) по схеме, приведенной на рис. Ферменты, осуществляющие поэтапное превращение аминокислоты в цианогенный глюкозид, находятся на внутриклеточных мембранах в виде комплекса, эффективно канализующего поток углерода из l-тирозина в гликозид. При повреждении мембран сначала β-гликозидаза отщепляет глюкозу, а затем под действием оксинитрилазы выщепляется синильная кислота (рис. 26). Гликозиды алифатических соединений. В луковицах тюльпанов накапливается гликозид тюлипозид, который после отщепления сахара замыкается в лактонный цикл, очень токсичный вследствие высокой реакционной способности (связывается по месту двойной связи с SH-группами белков). Реакция образования лактона – важный фактор устойчивости тюльпанов к Botrytis cinerea (рис. 27). Терпеноидные гликозиды и гликоалкалоиды. Тритерпеноиды и стероиды образуют с сахарами гликозиды, мылящиеся в воде, и названные сапонинами (от латинского sapo – мыло). У большинства сапонинов олигосахаридная цепь прикреплена к терпеноидному ядру в положении С-3, хотя у многих имеется дополнительная связь с глюкозой в положениях С-26 или С-28 сапонины очень ядовиты, так как связываются с стеринами в мембранах (имеют высокий гемолитический индекс). Накапливающийся в корешках овса тритерпеноидный гликозид авенацин (рис. 28), является фактором устойчивости к корневой гнили, вызываемой грибом Gаeumannomyces graminis. Стероидные гликозиды пасленовых имеют в своем составе азотсодержащий гетероцикл и названы гликоалкалоидами. Синтез глкоалкалоидов картофеля соланина и чаконина (рис. 29) индуцируется освещением, поэтому они накапливаются в листьях, ягодах (обусловливают их горький вкус) и озелененных на свету клубнях, которые становятся ядовитыми, но хорошо хранятся, не повреждаясь гнилями. Соланин и чаконин подавляют рост фитопатогенных грибов in vitro и является фактором возрастной устойчивости картофеля (табл. 23) Таблица 23. Роль гликоалкалоидов в возрастной устойчивости картофеля к Alternaria solani Время от появления Содержание Размер пятна от A.solani всходов (сутки) гликоалкалодов (мкг/г (см) сырого веса) 30 1570 0,1 70 1020 2,3 90 540 3,1 120 260 3,0 Гликоалкалоид томатов томатин (рис. 29) накапливается в вакуолях листьев и зеленых плодов томатов. Он высоко токсичен для Cladosporium fulvum и других грибов (вызывает потерю электролитов через мембраны). Гликоалкалоид дикого картофеля Solanum demissum демиссин является репелентом для колорадского жука. Тиогликозиды. До сих пор рассматривались соединения, связь которых с сахаром осуществлялась через кислород. У растений из семейств крестоцветные и каперцовые накапливаются соединения, агликон которых связан с сахаром через атом серы. Их называют горчичными маслами, тиогликозидами или гликозинолятами (рис.30). Депо гликозинолятов – вакуоль. При повреждении тонопласта они приходят в контакт с специфическими ферментами, которые отщепляют сахар по схеме, показанной на рис. 30. В результате образуется продукт, содержащий изородановую группу R-N=C=S - летучее, высокотоксичное соединение, действующее на слизистые оболочки и имеющее высокий антимикробный эффект. Его слезоточивое действие ощущается, например, при натирании корня хрена. Резюмируя сказанное, видно, что система клеточной защиты, основанной на освобождении токсических веществ из гликозидов высокоэффективна и универсальна. Однако, многие фтопатогеные организмы в процессе коэволюции с растенями выработали механизмы, нейтрализующие эту систему. Такие механизмы можно свести к следующим: 1. Мягкое, не повреждающее мембраны воздействиие на клетки растений. Характерно для биотрофных паразитов. Например, внутриклеточный паразит крестоцветных Plasmodiophora brassicae, возбудитель килы находится в живых клетках с неповрежденными мембранами, поэтому его присутстве не вызывает появления изороданидов. В процессе роста опухоли (килы) покровные ткани растрескиваются, и ранки заселяются почвообитающими гнилостными микроорганизмами. Последние, будучи некротрофами, разрушают зараженные клетки, вызывая образование токсичных агликонов, но к этому времени плазмодии возбудителя килы преобразуются в споры, имеющие толстые оболочки и устойчивые к токсинам. 2. Изменение чувствительного к токсину сайта. У гриба Stemphilium loti,вызывающего пятнистость листьев цианогенного лядвенца высокий вклад в дыхание приходится на альтернативный, нечувствительный к цианиду путь. 3. Модификация токсических веществ до менее токсичных. Этот механизм патогенности широко распространен в мире фитопатогенов и будет рассмотрен в гл. 8 Коэволюция с растениями-хозяевами привела к тому, что некоторые химические факторы иммунитета вместо репеллентов (отпугивающих) превратились в аттрактанты (привлекающие паразита вещества). Так близкие по химической структуре стероидные гликоалкалоиды соланин и демиссин оказывают противоположное действие на колорадского жука: первый привлекает, второй отпугивает. Запах горчичных масел, характерный для крестоцветных растений, служит капустной белянке сигналом при поиске мест для откладки яиц, т.е. репеллент для большинства насекомых стал аттрактантом для белянки; ее гусеницы едят даже фильтровальную бумагу, смоченную горчичными маслами. Белки - ингибиторы вирусов Белки - ингибиторы вирусов представляют собой особую группу растительных антибиотических веществ.Описание этих ингибиторов и механизмов их действия заслуживает специального раздела. Процесс инфицирования растения вирусом может быть разделен на две фазы – на стационарную фазу и фазу репликации (см. стр. ). События, происходящие во время стационарной фазы, включают в себя: - первоначальное механическое повреждение поверхности листа в месте внедрения; - проникновение вируса в клетку; - отделение оболочки вириона от вирусной нуклеиновой кислоты (депротеинизация). Фаза репликации характеризуется: - синтезом вирусных нуклеиновых кислот и белков; - сборкой вириона; - транспортом вновь синтезированных вирусных частиц в другие клетки, в другие части растения. Понятия "ингибитор стационарной фазы в жизненном цикле вируса" и "ингибитор репликации вируса" не имеют четко обозначенных различий из-за того, что депротеинизация инокулюма перекрывается во времени с началом синтеза вирусного белка и нуклеиновых кислот. Принято считать, что вещество является ингибитором репликации, если оно способно блокировать инфекцию при обработке растений спустя 5-8 часов после заражения вирусом. Будем использовать это, в некоторой степени, искусственное определение при обсуждении механизмов действия антивирусных белков - AVP (antiviral proteins). Обычно при анализе антивирусной активности того или иного ингибитора его смешивают с вирусной суспензией, инокулируют такой смесью листья сверхчувствительного растения-хозяина и, в дальнейшем, подсчитывают количество возникших инфекционных пятен. Уменьшение количества инфекционных пятен означает, что имеет место блокирование стационарной фазы развития вирусной инфекции. Однако, количество инфекционных пятен может также снижаться, если репликация вируса ингибируется до такой степени, что видимые пятна не образуются, поэтому данный тест не позволяет достаточно точно отделить воздействие ингибитора на стационарную фазу вирусной инфекции от его воздействия на фазу репликации. Наиболее репрезентативными тестами, дающими возможность судить о воздействии ингибитора на репликацию вируса являются следующие: - определение средних размеров инфекционных пятен; - тестирование действия ингибиторов на протопластах; - анализ накопления вирусов в системно инфицируемых тканях; - обработка растений ингибитором спустя несколько часов после инокуляции вирусом. Все известные в настоящее время антивирусные белки можно разделить на эндогенные (синтезируемые конститутивно) растительные антивирусные белки -EAVP (endogenous antiviral proteins) и белки-ингибиторы, синтез которых индуцируется в ответ на инфекцию - IAVP (induced antiviral proteins). Оба типа белков-ингибиторов имеют много сходных физико-химических и биологических характеристик, таких как: - устойчивость к изменениям рН и термостабильность; - способность осаждаться высокими концентрациями сульфата аммония; - активность при очень низких концентрациях; - широкий спектр антивирусного действия; - влияние содержания аминогрупп на биологическую активность. В данном разделе рассмотрены только конституционные (эндогенные) антивирусные белки, в то время как свойства индуцируемых антивирусных белков будут проанализированы в главе 6 «Иммунный ответ». Эндогенные противовирусные белки (EAVP) - это постоянно продуцируемые растением, а не индуцируемые в нем стрессом ингибиторные белки, которые, будучи экстрагированными из ткани растений-хозяев, могут блокировать развитие вирусной инфекции в обработанных ими растениях. Некоторые растения могут содержать более одного EAVP. Так, экстракты из листьев перца, герани и дурмана содержат высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты , обладающие антивирусной активностью. Известно, по крайней мере, 4 различных механизма защитного действия EAVP: 1) агрегация ингибитора с вирионом; 2) ингибирование стационарной фазы вирусной инфекции; 3) индукция системной устойчивости к вирусу; 4) ингибирование репликации путем блокирования белкового синтеза. Некоторые EAVP полифункциональны, т. е. обладают более чем одним типом биологической активности, что, в некоторых случаях осложняет изучение механизмов их антивирусного действия. Разберем каждый из вышеперечисленных типов антивирусной активности. Агрегация. Это - чисто физическое явление, зависящее от ионной силы внутри инфицированной клетки, концентрации ингибитора и вирионов. EAVP из Phytolacca esculenta и P.americana, PAP-I и PAP-II, могут агрегировать с вирусными частицами, образовывая нерастворимый осадок. Однако, агрегация вирионов, по-видимому, - не единственный механизм противовирусного действия этих ингибиторов; возможно они также индуцируют устойчивость растения-хозяина. Ингибирование стационарной фазы инфекционного процесса. Как было сказано выше, особенностью воздействия ингибиторных белков на стационарную стадию развития вирусной инфекции является снижение количества инфекционных пятен на обработанных этими ингибиторами листьях. Типичными представителями ингибиторов стационарной стадии являются EAVP, выделенные из Datura stramonium и Dianthus caryophyllus. Обработка растений этими ингибиторами приводит к уменьшению количества инфекционных пятен, размер же инфекционных пятен при этом не изменяется. EAVP из D. stramonium и D. caryophyllus не влияют также на титр вируса в системно инфицированном растении. Экспериментально установленные в ряде опытов соотношения между логарифмом количества инфекционных пятен на листьях и логарифмом концентрации вируса в листовой ткани свидетельствуют о том, что на поверхности листа имеется определенное число сайтов, потенциально способных развиваться в инфекционное пятно. Другими словами, число рецепторов, способных взаимодействовать с вирусными частицами, ограничено, и они расположены в определенных точках листа. Предварительная обработка поверхности листа гомологичным белком вирусной оболочки приводит к снижению числа инфекционных пятен при заражении. Это можно объяснить конкуренцией между белком оболочки вируса и интактными вирусными частицами за взаимодействие с рецепторами. Причем взаимодействие это носит высоко специфический характер, так как при обработке гетерологичным вирусным белком такого рода конкуренция не наблюдается. Вполне возможно, что гипотетические рецепторы могут являться точками приложения эндогенных антивирусных белков-ингибиторов. Повидимому, разные рецепторы имеют разную степень сродства к EAVP, так как обработка листьев одного и того же растения-хозяина индуцирует разную степень устойчивости по отношению к разным вирусам. Аналогично этому разная степень устойчивости наблюдается и при обработке ингибитором разных растений-хозяев одного и того же вируса. Важную роль в связывании EAVP с рецепторами растения-хозяина, вероятно, играют аминогруппы. Наличие этих радикалов, по-видимому, позволяет ингибитору связываться с рецептором и блокировать, таким образом, вирус-специфические сайты на поверхности листа. Снижение химическим путем содержания аминогрупп в молекулах ингибитора приводит к снижению его антивирусной активности. С другой стороны, показано, что аминогруппы необходимы для успешного заражения растений табака вирусом табачной мозаики. Таким образом, есть основания предполагать, что именно аминогруппы в молекулах антивирусных белков являются детерминантами, ответственными за конкурентное связывание с растительными рецепторами. Для некоторых растений (таких, например, как Chenopodium amaraunticolor или Physalis floridana) характерна восприимчивость ко многим вирусам, различающимся по структуре и биологии. По-видимому, у этих растений имеются различные рецепторы, специфичные для каждого из вирусов. Индукция системной устойчивости. Процесс возникновения индуцированной устойчивости в растительных системах может быть разбит на три последовательные стадии: 1) восприятие растением, биотического или абиотического стресса, 2) возникновение системного сигнала, как одна из реакций на стресс на клеточном уровне, 3) индуцирование этим сигналом в тканях нового физиологического состояния, которое защищает ткани от последующего воздействия того же самого или, иногда, других стрессов. Было обнаружено, что некоторые растительные экстракты при испытании на тестерных растениях индуцируют системную устойчивость к вирусам и показано, что индуктор устойчивости имеет белковую природу. Из растительной ткани, ставшей устойчивой в результате стрессовых воздействий и реализации системного сигнала, вызванного данным индуктором, могут быть выделены белки, обладающие свойством подавлять развитие вирусной инфекции. Белковые ингибиторы вируса - VIA (virus inhibitory agents). VIA ингибируют вирусную инфекцию при инокуляции в смеси с вирусом. Они также могут индуцировать системную устойчивость при обработке растений перед инокуляцией вирусом. Молекулярные веса VIA колеблются от 13,5 kDa до 15 kDa. Синтез VIA в растительных тканях и связанная с этим системная устойчивость полностью блокируются, если в эти ткани сразу после обработки индуктором вводится актиномицин D. Как известно, антибиотик актиномицин D является ингибитором белкового синтеза. Индукция VIA частично блокируется актиномицином D при использовании его в течение 8 часов после обработки листьев индуцирующим экстрактом. Однако снижения концентрации VIA или понижения уровня системной устойчивости не происходит если актиномицин D применяется через 24 часа после обработки индуктором. Эти экспериментальные данные свидетельствует о том, что: 1) уровень накопления VIA в растениях коррелирует с развитием системной устойчивости, 2) белковый синтез, связанный с обоими процессами, завершается через 24 часа после индукции. Примерами VIA могут быть эндогенные белковые ингибиторы из вытяжек Capsicum frutescens и Chenopodium ambrosoides, которые индуцируют системную устойчивость к вирусу верхних листьев растений при обработке ими нижних листьев до инокуляции вирусом. Инактивация рибосом. Белки, ингибирующие рибосомы (RIP - ribosome inhibitory proteins), являются антивирусными, так как они ингибируют белковый синтез, блокируя реализацию последних стадий внутриклеточного развития вируса. RIP специфически инактивируют рибосомы, в результате чего синтез белка блокируется на стадии элонгации. Имеется значительная гомология первичной структуры у RIP, выделенных из разных источников. Это позволяет сделать вывод о том, что ингибирующая активность данных пептидов в определенной степени коррелирует с первичной структурой их активных сайтов, ответственных за связывание с рибосомой. Первоначально предполагалось, что RIP неактивны на гомологичных рибосомах. Однако низкая активность рибосом фитолакки американской в экспериментах по внеклеточной трансляции привела к открытию того, что рибосомы фитолакки фактически инактивируются RIP фитолакки (РАР-1) в процессе их выделения. Другие растительные рибосомы также блокируются под действием своих собственных RIP в аналогичных условиях. Следует, однако, заметить, что рибосомы фитолакки все-таки достаточно устойчивы к добавлению собственного RIP (РАР-1) и гораздо более чувствительны к действию RIP, выделенных из других растений. В то же время тритин, пшеничный RIP, не инактивируют рибосомы из пшеницы, так что выделенные пшеничные рибосомы сохраняют высокую активность. Накопившиеся к настоящему времени экспериментальные данные позволяют сделать вывод о том, что RIP имеют специфическую активность по отношению к рибосомам, выделенным из разных видов растений. По- видимому, рибосомы имеют некие структурные особенности, которые могут узнаваться или не узнаваться различными RIP. Механизмы функционирования этих белков, однако, не так просты: имеются данные о том, что PAP-S (RIP из семян фитолакки американской) ингибирует рост клеток моркови в жидкой культуре, в то же время он в тех же концентрациях стимулирует рост клеток риса. RIP локализованы на внешней стороне клеточной стенки и считаются "суицидальными" белками, которые высвобождаются при повреждении или разрушении клетки. После высвобождения RIP блокируют белковый синтез в клетке, предотвращая, таким образом, дальнейшее развитие инфекции. Временной интервал антивирусной активности довольно узок, поэтому антивирусная активность большинства RIP тестируется путем инокуляции растений смесью этих белков с вирусным препаратом или препаратом вирусных РНК. Обработка растений RIP через некоторое время после инокуляции не предотвращает развитие вирусной инфекции. Так, защитный эффект не обнаруживается если RIP фитолакки американской (РАР-1) применяют через 30-50 минут после инокуляции протопластов табака ВТМ. Следовательно, RIP активны только на очень ранних стадиях жизненного цикла вируса. Известно, что рибосомы хозяина могут связывать вирусную РНК почти сразу после того, как РНК-вирус теряет оболочку. Возможно, что трансляционный комплекс "вирусная РНК - рибосома" уже невосприимчив к действию RIP, и в течение того времени, пока этот комплекс существует, RIP являются неактивными. ГЛАВА 5. ВЕРТИКАЛЬНАЯ ПАТОСИСТЕМА: ГЕНЫ АВИРУЛЕНТНОСТИ И ИХ ПРОДУКТЫ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДАННЫХ Из схемы «ген на ген» Флора, изображенной в виде квадратной сетки (табл. 19), следует, что только при наличии у партнеров двух взаимодействующих доминантных генов наступает реакция устойчивости или несовместимости, в то время как при любых других сочетаниях этих генов будет наблюдаться реакция восприимчивости (совместимости). Комбинацию двух генов, приводящую к несовместимости, называют дефинитивной, а остальные комбинации – недефинитивными. Дефиниция - значит определение. Такое обозначение подчеркивает определяющую роль во взаимоотношениях несовместимости, так как последняя во флоровских взаимоотношениях хозяина и паразита возникает при наличии доминантных аллелей взаимодействующих генов, т.е. аллелей, несущих информацию о функционально значимых генопродуктах. Наличие «плюс» функций у генов устойчивости и авирулентности вытекает из теории, ибо если в геномах хозяина и паразита имеется только одна пара дефинитивных генов (например, R3/A3 в приведенной ниже схеме), то несмотря на наличие многих недифинитивных пар генов будет развиваться реакция несовместимости: гены растения: R1 r2 R3 r4 гены паразита: a1 A2 A3 а4 «Плюс» функции генов авирулентности и устойчивости подтверждены многими экспериментами. Флор (1960) получил после облучения рентгеновыми лучами спор авирулентной к сортам льна Кото и Леоне расы 1 ржавчинного гриба Melampsora lini, мутантны, вирулентные к сорту Кото. После самооплодотворения мутантных культур была проверена вирулентность 191 дикариотической культуры М1. Все они, как и родительский мутант, оказались вирулентными к сорту Кото, но 12 культур были также вирулентными и для сорта Леоне. Результаты наблюдений интерпретированы следующим образом. Раса 1 гетерозиготна (правильнее – гетероаллельна, ибо клетки ржавчинных грибов содержат по два гаплоидных ядра, гетероаллельность которых фенотипически не отличима от гетерозиготности) по авирулентности к сорту Кото и гомозиготна по авирулентности к сорту Леоне. Поскольку вирулентность рецессивна, эта раса авирулентна к обоим сортам. Гены авирулентности к сортам Кото и Леоне сцеплены. В результате облучения Хлучами в ядре, несущем ген авирулентности к сорту Кото, произошла делеция, которая захватила оба сцепленных гена авирулентности (к сортам Кото и Леоне). Споры стали гетерозиготными по делеции и, вследствие наличия рецессивного гена вирулентности к сорту Кото во втором (неповрежденом) ядре дикариона, вирулентными к этому сорту. После инбридинга возникли три типа дикариотических клеток: 1/ гомозиготы по гену вирулентности к Кото (вирулентны для Кото и авирулентны для Леоне); 2/ гетерозиготы по делеции (также вирулентны для Кото и авирулентны для Леоне); 3/ гомозиготы по делеции (вследствие отсутствия доминантных аллелей генов авирулентности вирулентны для обоих сортов). Из этих данных можно сделать вывод, что ген вирулентности – неактивный аллель гена авирулентности, фенотипически не отличимый от делеции. Свидетельства функциональной важности продуктов генов устойчивости также получены при специально спланированных для этих целей скрещиваниях линий пшеницы, имеющих гены устойчивости к стеблевой ржавчине Puccinia graminis (Loegering, Sears, 1981). Дителосомные линии, у которых отсутствовало хромосомное плечо, несущее ген устойчивости, поражались расами гриба, имеющими дефинитивные к этим генам аллели авирулентности. Таким образом, отсутствие локуса устойчивости проявляется как «аллель восприимчивости». На этом основании сделано заключение, что аллель «чувствительности» эуплоидов может иметь нефункциональную последовательность ДНК (нонсенс-мутацию) или, если она функционально значима, то ее генопродукт не взаимодействует с генопродуктом дефинитивного аллеля паразита (миссенс-мутация). Еще одно свидетельство в пользу «плюс» функций генов устойчивости – температуро-чувствительные (ts) гены, продукты которых функционально активны при оптимальной для данного организма (пермиссивной) температуре, но теряют активность при повышенной (рестриктивной) температуре, вследствие конформационных изменений белка. У злаков такие гены впервые наблюдали при круглогодичном выращивании растений в теплице. Было замечено, что некоторые сорта при заражении одними и теми же расами ржавчинных грибов устойчивы зимой, но поражаются летом, когда температура в теплицах повышена. Например, ген устойчивости пшеницы к стеблевой ржавчине Sr6 контролирует реакцию устойчивости (0;) на заражение авирулентными расами при 200 и реакцию восприимчивости (3 – 4) при 260. Среди ts-генов устойчивости наиболее исследован ген N дикого табака Nicotiana glutinosa. При заражении листьев этого табака ВТМ в пермиссивных условиях (250) образуются небольшие некротические пятна, число которых пропорционально концентрации вирусных частиц в инокулюме реакция сверхчувствительности (СВЧ). В клетках листа, прилегающих к некротизированным, имеются частицы ВТМ, которые не могут распространяться по листу (заблокированы в зоне некроза). Если зараженное растение поместить в условия рестриктивной температуры (350), то произойдет распространение вируса из мест заражения в окружающие клетки (системное заражение растения). При возврате в пермиссивные условия все участки, в которые успели распространиться вирусные частицы, некротизуются, так что все растение может погибнуть. Поскольку в пермиссивных условиях синтезируется нормальный функционально-активный белок, а в рестриктивных – дефектный, то для протекания СВЧ-реакции (несовместимости) необходим активный продукт гена устойчивости, несущий «плюс» функции. Дефект в белке приводит к реакции восприимчивости. Из генетических данных следует, что взаимодействие продуктов генов устойчивости и авирулентности приводит к несовместимости, в то время как потеря или изменение одним из партнеров (или обоими) дефинитивного гена изменяет реакцию на совместимую. Наиболее простая биохимическая интерпретация этих данных заключается в предположении, что какие-то структуры растения-хозяина, синтезируемые под контролем генов вертикальной устойчивости, узнают структуры или метаболиты паразита, контролируемые комплементарными генами авирулентности, как чужие, и запускают защитные реакции. Отсутствие у хозяина узнающей структуры (рецептора) вследствие изменения или потери гена устойчивости, или отсутствие у паразита метаболита, связываемого рецептором, вследствие потери или изменения гена авирулентности, приводят к тому, что паразит перестает узнаваться хозяином, как чужой, и защитные реакции не включатся (или включатся слишком поздно), и отношения между партнерами становятся совместимыми (рис. 31). В процессе формирования гаустория (см. стр.) углеводы клеточной стенки паразитического гриба входят в непосредственный контакт с плазмалеммой растения. По предположению американского биохимика П. Альберсхейма (1975) при наличии комплементарности в строении углеводных цепочек клеточной стенки гриба и третичной структуры белка плазмалеммы происходит узнавание паразита и включается сигнал к защитным реакциям. Таким образом, доминантные аллели генов устойчивости контролируют синтез рецепторного белка на мембране хозяина, а доминантные аллели генов вирулентности – синтез ферментов глюкозил-трансфераз, соединяющих в определенном порядке моносахариды и строящих углеводные цепочки в клеточных стенках гриба. Тот факт, что комплементарные гены паразита и хозяина имеют разную степень связи с взаимодействующими продуктами (ген устойчивости – непосредственную, а ген авирулентности – опосредованную, через трансферазы), не должен накладывать ограничения на данную гипотезу. Как было отмечено выше, гены устойчивости и авирулентности различаются и по организации на хромосомах: первые часто образуют серии аллелей, вторые, как правило, не сцеплены. Известны и обратные случаи: у Melampsora lini обнаружено тесное сцепление двух генов, дающих дефинитивную реакцию с генами льна, картируемыми в двух несцепленных локусах (Statler, 1979). Казалось бы, подобные гипотезы легко поддаются проверке. Необходимо выделить препараты клеточных стенок у вирулентной и авирулентной к какомулибо сорту растения рас паразита и показать различия в индукции ими защитных реакций. Например, базидиоспоры возбудителя ржавчины Uromyces vignae проращивали на голодном агаре, собирали эксудаты проростков и обрабатывали ими устойчивые и восприимчивые cорта вигны. Результаты опыта показаны в табл. 24. Таблица 24. Среднее число некротических клеток мезофилла линий вигны, обработанных эксудатами проростков спор Uromyces vignae и водой (Chen, Heath, 1990) Сорта вигны Эксудаты проростков рас CPR-1 (A) Dixon Cream (R) California Blackeye (S) Вода CPR-2 (V) 296,1 40,0 26,5 21,0 32,0 23,3 А- авирулентная и V – вирулентная расы; R – устойчивый и S – восприимчивый сорта. Как видно из таблицы, несовместимый ответ на обработку (СВЧ-реакция) возникает только в листьях сорта, имеющего доминантный аллель гена устойчивости в ответ на эксудат расы, имеющий доминантный аллель гена авирулентности. В остальных случаях, в соответствием с правилом Флора, реакция на эксудат не отличается от реакции на обработку водой. Чаще, однако, специфичность метаболитов паразита устанавливают не по числу некротизированных клеток, а по накоплению в зоне заражения химических факторов устойчивости фитоалексинов (ФА). После демонстрации специфичности необходимо провести фракционирование препарата выделить специфический индуктор (или, по общепринятой терминологии Н. Кина – элиситор), пометить его радиоактивным изотопом и обработать листья устойчивого растения или (что лучше) полученные из его клеток протопласты. После фракционирования белков плазмалеммы – по радиоактивной метке выделить белок, связывающийся с элиситором и показать, что в восприимчивом сорте такого белка нет, или, если есть, он имеет значительно более низкую константу связывания с элиситором. Секвенировать рецепторный белок и по его структуре синтезровать комплементарную цепочку ДНК (кДНК) и использовать ее как гибридизационную пробу для выделения гена устойчивости из генома растения. К настоящему времени известно множество элиситоров, однако только некоторые из них имеются в виде высоко очищенных препаратов (Табл. 25). Сырые препараты элиситоров таят в себе много опасностей: 1/ в неочищенном экстракте могут содержаться различные элиситоры, действующие синергически, причем они могут быть близкими по структуре, что затрудняет очистку индивидуального препарата; 2/ при экстракции может образоваться комплекс элиситора с иным веществом; 3/ элиситор может быть активным только в присутствии некоего кофактора, который теряется при очистке; 4/ выход элиситора может зависеть от условий культивирования, возраста культуры и других факторов. Кроме того, экспериментаторы из разных стран столкнулись с трудностями и иного порядка. Во-первых, индукцию защитных реакций вызывал не один какой-либо метаболит паразита, а многие метаболиты, локализованные в разных частях клетки (мембране, стенке, периплазме, цитозоле) и относящиеся к разным классам химических соединений (углеводам, белкам, жирным кислотам и др.). Во-вторых, элиситорные соединения обнаружены как у авирулентных, так и у вирулентных рас и даже у сапротрофных грибов (приведенный выше пример – счастливое исключение). В-третьих, эти элиситоры вызывали защитные реакции, как у устойчивых, так и у восприимчивых сортов растений, в том числе у сортов и видов, не имеющих генов ВУ к данному паразиту. Были предложены модели, в которых специфические или внутриклеточные неспецифические элиситоры образуются или освобождаются в окружающую среду только in planta под воздействием метаболитов растения-хозяина (Метлицкий и др., 1973). Если это так, то при изучении элиситорных соединений, образующихся у паразита in vitro, действие специфических элиситоров будет замаскировано неспецифическими (Keen,1991). Однако, подобные гипотезы также плохо поддавались проверке. Т.о. можно выделить несколько групп элиситоров. Во-первых, это биогенные элиситоры, выделенные из патогенов (или сред, в которых они росли) или из растений (эндогенные элиситоры), и абиогенные, не имеющие отношения к патогенезу. Биогенные или биотические элиситоры, в свою очередь, можно разделить на неспецифические специфические (рис. 32). Результаты описанных выше исследований привели многих биохимиков, занимающихся изучением механизмов фитоиммунитета, к представлениям о том, что индукция паразитом защитных реакций и их протекание в растении неспецифичны, а гены устойчивости и авирулентности недифинитивны. Специфична же супрессия (подавление) защитных реакций паразитом и отзывчивость хозяина на супрессор. Флоровская диаллельная схема взаимодействий хозяина и паразита (квадратная сетка) оказалась перевернутой (рис. 33). У некоторых грибов подобные схемы получили экспериментальное подтверждение и специфические супрессоры были идентифицированы. По-видимому, у разных партнеров и в разных ситуациях могут оперировать обе схемы взаимодействия: 1/ неспецифическая индукция защитных реакций и их специфическая супрессия паразитом; 2/ специфическая индукция защитных реакций и ее потеря вследствие мутаций гена авирулентности. Гены, под контролем которых образуются специфические элиситоры, называют генами авирулентности (avr-гены); гены, контролирующие синтез специфических супрессоров будем называть генами вирулентности (vir-гены). Этапы взаимодействий паразитов с растениями следующие: выделение элиситора – взаимодействие его с клеточными рецепторами – трансдукция сигнала в геном – активизация генов иммунного ответа – накопление токсических и барьерных соединений (стрессовых метаболитов) – супрессия разных этапов протекания стрессового метаболизма от рецепции элиситоров до детоксикации антимикробных веществ. Рассмотрим последовательно эти этапы и участвующие в них соединения. АБИОГЕННЫЕ ЭЛИСИТОРЫ К числу абиогенных элиситоров относятся вещества, не участвующие в процессах патогенеза, но вызывающие защитные ответы растений, как правило, в относительно невысоких концентрациях. К их числу относятся ионы тяжелых металлов, ингибиторы определенных звеньев метаболизма, металлосодержащих ферментов и тиоловых групп, некоторые антибиотики, фенольные соединения и хиноны, УФ-лучи, ряд фунгицидов (например, бордоская жидкость, хлорокись меди, цинеб, каптан и др.). Ионы тяжелых металлов по их способности вызывать образование ФА картофеля располагаются в следующем порядке: Hg2+> Cu2+ > Fe3+> Ni3+ > Co2+ Наибольшей индуцирующей активностью обладали соли ртути и меди, возможно, поэтому эти вещества входят в состав ряда фунгицидов. Однако индуцирующая ФА активность химикатов составляет лишь треть от уровня индукции ФА, вызываемой спорами несовместимых рас грибов. Одна из возможностей, объясняющих абиотическую индукцию, состоит в том, что абиотические элиситоры в той или иной мере активируют эндогидролазы растительных тканей - эндонуклеазы, эндопептидазы, эндогликаназы и другие ферменты, ответственные за деградацию биополимеров, которые осуществляют функции хранения, передачи и реализации информации. А это, в конечном итоге, индуцирует защитные ответы растительной ткани. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ БИОГЕННЫЕ ЭЛИСИТОРЫ Неспецифические элиситоры вызывают защитные реакции растений, независимо от устойчивости вида растения или вирулентности патогена. Ими могут быт полисахариды, белки, полипептиды, гликопротеины, липидсодержащие соединения или вещества иной природы (табл. 25). Полисахариды Наиболее исследованы полисахаридные элиситоры из клеточных стенок грибов. Известно, что грибы могут быть разделены на несколько групп по типам структурных полисахаридов, присутствующих в их клеточных стенках (Феофилова, 1983). Наиболее известны два типа полисахаридов клеточных стенок, обладающих элиситорными функциями: β-1,3-глюканы и хитины (хитозаны). Настоящие грибы содержат в клеточной стенке хитин и глюкан. В клеточных стенках оомицетов содержится 25% частично кристаллизованной целлюлозы (β-1,4-глюкана) и основной нецеллюлозный компонент β-1,3глюкан. Наиболее исследован элиситор, выделенный из клеточных стенок и культуральной жидкости Phytophthora megasperma f. sp. glycinea, который индуцирует ФА сои глициоллин (Ayers et al.,1976). Элиситор представляет собой гептаглюкозид, 5 глюкозных остатков которого связаны в линейную цепь β-1,6-связями, тогда как 2 боковых остатка присоединены β-1,3-связями. При неполном кислотном гидролизе клеточных стенок гриба были получены 300 аналогов элиситора, из которых только один оказался активным. Он индуцировал глициоллин при концентрации 10 нМ на семядолю, тогда как остальные не проявляли активности даже при 200 мкМ. Активный гептаглюкозид отличался от неактивных лишь положением, в котором 2 боковых остатка глюкозы присоединялись к основе, состоящей из 5 остатков глюкозы (рис. 34). Таблица 25. Высокоочищенные биотические элиситоры грибов, индуцирующие устойчивость высших растений (Kogel, Beiβman,1995) Соединение Патоген Гептагликозил Олигосахарид Phytоphthora megasperma var. sojae: mw Fusarium solani f. Пизатин- горох sp.pisi/phaseoli: mw Puccinia graminis Лигнин- злаки var. tritici: mw β-1,4-глюкозамин Гликопротеин Индуцирование: Источник Растение Глицеоллин-соя Sharp et al. (1984) Hadwiger and Beckman (1980) Kogel et al. (1988) Гликопротеин Phytophthora Фуранокумарины Scheel and megasperma: mw - сельдерей Parker (1990) Пептид Cladosportium fulvum: IWF Ришитин Томаты Schottens-Toma and De Wit (1988) Белок Phytophthora cryptogea: cf НекрозыТоматы Ricci et al. (1989) Эпоксистеариновая Кислота Puccinia graminis Лигнин – злаки var. tritici: урединиоспоры Phytophthora Ришитин, infestans: mw Любимин Картофель То же То же Арахидоновая Кислота Kogel (1985) Bostock et al. (1981) Эйкозапентаеновая То же Кислота mw- клеточные стенки мицелия; IWF- межклеточная жидкость; cf-культуральный фильтрат. Гептаглюкозид не обладал видовой специфичностью, поскольку он индуцировал не только образование глициоллина в сое, но и ришитина в картофеле, фазеоллина в фасоли, капсидиола в перце. Кроме ФА гептаглюкозид индуцировал также в сое синтез белков, богатых гидроксипролином, образование этилена, а также защищал табак от вирусной инфекции. В плазматической мембране сои существуют центры специфического связывания гептаглюкозида. Связывание происходит при насыщениях более низких, чем это требуется для образования ФА (10-10 - 10-9 М ), а также характеризуется обратимостью, что свидетельствует о нековалентном связывании элиситора с рецептором. Сайты связывания инактивировались при обработке протеолитическими ферментами, что подтверждает их белковую или гликопротеиновую природу. Способность различных гептаглюкозидов связываться с рецептором коррелирует с их способностью к образованию глицеоллина. Н.Кин с соавторами (1983) изолировали глюкоманнан из клеточных стенок P. мegasperma с помощью β-1,3-глюканазы. Глюкоманнан оказался в 10 раз более активен, чем вышеописанный гептаглюкозид. В культуральном фильтрате и клеточных стенках Colletotrichum lindemuthianum обнаружен элиситoр, оказавшийся 3- и 4-связанным глюканом. Он индуцировал накопление фазеоллина и оксифазеоллина в бобах. В культуральных фильтратах и экстрактах различных видов Colletotrichum также присутствовали полисахаридные элиситоры. Наиболее очищенные фракции содержали глюканы со связями β-1,3- и β-1,4. По всей видимости, структура этих глюканов отличалась от глюкана из P. megasperma. Позднее из С. lindemuthianum был выделен галактоглюкоманнан, обладающий элиситорными свойствами. Он содержал 10 % галактозы, 38 % глюкозы и 45 % маннозы. Показано (Чалова и др.1976), что компоненты клеточных стенок Phytophthora infestans являются элиситорами образования ришитина в картофеле. Так, фракция высокомолекулярных глюканов, которая содержала β1,3-β-1,6-связанную глюкозу, стимулировала накопление ФА в тканях картофеля, Однако ФА-индуцирующая способность глюканового элиситора значительно уступала по активности другому элиситору P.infestans арахидоновой кислоте. К второй группе полисахаридных элиситоров относятся аминосахара, входящие в состав клеточных стенок грибов,- β-1,4-связанный полимер ацетилглюкозамина - хитин и его деацетилированное производное - хитозан. Хитин - нерастворимый полиаминосахарид, состоящий из неразветвленной цепи β-1,4-связанных остатков N-ацетил-D-глюкозамина. В клеточных стенках грибов хитин связан ковалентными и ионными связями с другими полисахаридами, пигментами и белками, что и придает ему особую устойчивость к литическим ферментам. В высших растениях хитин и хитозан или отсутствуют, или находятся в минорных количествах, однако ферменты, способные расщеплять их цепи, представлены чрезвычайно широко. Например, различные формы хитозана расщепляются липазой, целлюлазой, протеазой и гемицеллюлазами. Конституционно хитиназы в растениях представлены в малых количествах, но их уровень резко повышается под действием биотических и абиотических стрессов. Хитозан и продукты его гидролиза обладают антигрибной активностью. Установлено, что олигомеры хитина и хитозана способны связываться с ДНК, препятствуя тем самым образованию РНК. Помимо антигрибной активности хитин и хитозан обладают элиситорными свойствами. Так, препараты хитозана являются эффективными элиситорами ФА пизатина в горохе. Этот элиситор защищал ткани гороха от заражения фузариозом, если применялся до или даже во время инфицирования. Японские авторы показали, что N-ацетилхитоолигосахариды ( в наибольшей степени гепта- и октамеры ) индуцировали образование ФА в суспензионной культуре клеток риса. Эти олигомеры вызвали также быструю и краткосрочную деполяризацию мембран при субнаномолярных концентрациях. Деацетилированные хитоолигосахариды оказались полностью неактивными. Молекулярные механизмы действия ацетилированных и неацетилированных хитиновых производных могут различаться принципиально. В первом случае, вероятно, имеет место высокоспецифическое связывание с мембранными рецепторами лектиновой природы, тогда как фрагменты хитозана, очевидно, действуют за счет электростатического взаимодействия положительно заряженных молекул элиситора с отрицательно заряженными компонентами мембран или молекулами ДНК. Все сказанное выше дает основание полагать, что растения способны использовать для распознавания патогенов полисахариды клеточных стенок широкого набора грибов. Полипептиды и гликопротеины Первым элиситором ФА, оказавшимся полипептидом с м.м.8 кDа, был мониликолин А, изолированный австралийскими фитопатологами Круикшанком и Перрин в 1968 из возбудителя плодовой гнили косточковых пород гриба Monilia fructicola. Мониликолин А индуцировал образование фазеоллина в фасоли при концентрации 10-8 М. Этот элиситор оказался специфичным только для фасоли и не вызывал образование пизатина в горохе или вайероновой кислоты в конских бобах. Поскольку фасоль не является хозяином для M.fructicola, то физиологическая роль мониликолина А в устойчивости этого растения была поставлена под сомнение. Примером элиситоров пептидной природы являются элиситины. Это семейство гидрофильных белков с м.м.10 кDа, которые выделяются всеми до сих пор исследованными видами Phytophthora и Phytium . Все элиситины имеют высокую степень гомологии. Наиболее четко элиситины ведут себя как элиситоры при обработке табака. Они вызывают некроз растительных тканей, образование ФА, активных форм кислорода, а также системную приобретенную устойчивость. Изоляты Phytophthopa parasitica, не поражающие табак, продуцируют кислый элиситин, названный паразитицеином. Патогенные изоляты табака не продуцируют этот пептид, что может свидетельствовать о негативной связи продуцирования паразитицеина со специфической патогенностью возбудителя фитофтороза к табаку. Однако пока не доказано, что гены, кодирующие различные пептиды грибов рода Phytophthora, могут быть аллелями генов авирулентности. Р.cryptogena и P. capsici продуцируют два близко родственных элиситина: криптогеин и капсицеин соответственно. Каждый из них состоит из 98 аминокислотных остатков. Обработка этими пептидами защищает табак от штаммов P.nicotiаnae, не продуцирующих элиситины. Криптогеин вызывает некрозы на табаке в концентрации 1 мкг на растение, тогда как капсицеин в 50 раз менее активен. Оба пептида имеют идентичную повторность аминокислот во внутренней области и различаются в части карбокси- и аминотерминальных областей. Элиситины возбудителя фитофтороза картофеля P.infestans находятся под контролем INF-генов, которые экспрессируются в зараженных растениях и в мицелии (но не спорах), растущем на искусственной среде. Элиситорная активность культуральных фильтратов различных штаммов Fusarium solani, по-видимому, также зависит от присутствия белкового компонента, поскольку она частично терялась под действием протеолитического фермента проназы и полностью блокировалась при добавлении ингибитора синтеза белка циклогексимида в среду роста. Такую же природу имел высокомолекулярный индуцирующий фактор из культурального фильтрата Botrytis cinerea, стимулирующий накопление в ткани фасоли фазеоллина. Вместе с тем на индуцирующую активность этих препаратов не оказывали действия обработки, которые должны были бы денатурировать большую часть белка ( нагревание, экстремальное значение рН, органические растворители, детергенты и другие воздействия ). Это ставит под сомнение важность нативной конформации белка для экспрессии элиситорной активности. Многие элиситоры фитопатогенов являются гликопротеинами (ГП ). Так, из клеточных стенок P. megasperma был выделен ГП, обладающий способностью индуцировать образование ФА глициоллина в семядолях сои. Однако концентрация ГП, требующаяся для индуцирования, была значительно больше, чем у описанных выше β-1,3-глюкана и глюкоманнана. Активность ГП полностью подавлялась под действием ингибитора углеводов периодата, тогда как обработка проназой не затрагивала индуцирующей активности. Поэтому возможно, что для проявления элиситорной способности необходима углеводная, а не белковая часть молекулы. Элиситорная активность культурального фильтрата P. infestans связана с фракцией, имеющей м.м. 10 кDа и, вероятно, представляющей собой ГП, не обладающий расоспецифическим действием. Под влиянием β-1,3-глюканазы индуцирующая активность элиситора не только не подавлялась, но даже усиливалась, что, возможно, объясняется удалением маскирующих групп, ковалентно связанных с элиситором посредством β-1,3-связей. Липидсодержащие элиситоры Особую группу элиситоров представляют метаболиты, содержащие в своем составе липидный компонент. Липидам вообще принадлежит исключительно важная роль в процессах адаптации всего живого. Е.М. Кребс отмечал, что липидная стратегия биохимической адаптации выработалась еще на первых этапах жизни на Земле. Адаптационные функции липидов присущи всему органическому миру от прокариот до эукариот, причем особое значение придается липидам клеточных мембран. Считается, что компенсаторные изменения в составе жирных кислот фосфолипидов мембран должны либо элиминировать, либо ослаблять нарушения жидкокристаллической структуры мембран. При включении ненасыщенных жирных кислот в плазмалемму падает вязкость и возрастает текучесть, при этом увеличивается латеральное движение белков и тем самым возрастает экспонируемость рецепторов мембран. Общей реакцией организма на стресс является изменение степени ненасыщенности жирнокислотного состава липидов. Изменение степени ненасыщенности жирных кислот поддерживает мембранную проницаемость и вязкость независимо от окружающей среды. Поэтому десатуразы, повышающие ненасыщенность жирных кислот, могут считаться антистрессовыми ферментами. Наиболее хорошо исследованы липидсодержащие элиситоры P. infestans. Из мицелия этого гриба был выделен липогликопротеидный комплекс, активность которого в несколько раз превосходила активность глюканов клеточных стенок этого гриба (Чалова и др., 1977; Метлицкий и др.,1978). За индуцирующую активность комплекса ответственен липидный компонент, составляющий 60 % всего комплекса. Активным началом комплекса оказались две полиненасыщенные жирные кислоты: 5,8,11,14 -эйкозатетраеновая (арахидоновая -АК) кислота и 5,8,11,14,17- эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) (Озерецковская и др.,1987). Эти полиеновые жирные кислоты индуцировали защитные реакции у картофеля. Исключительно важным свойством АК и ЭПК являлась их способность индуцировать в картофеле системную, продолжительную болезнеустойчивость (Озерецковская и др.1986). АК и ЭПК найдены как в составе всех кислых липидов P.infestans, так и в неомыляемых липидах (церамидаминоэтилфосфонате и инозитолфосфоцерамиде). Для проявления элиситорной активности необходимо присутствие в липиде свободной карбоксильной группы. Замещение этой группы на спиртовую сильно снижало и ндуцирующую активность. Метиловые эфиры АК и ЭПК вызывали накопление ФА только после небольшого лагпериода. Оптимальной для элиситорной активности оказалась длина цепи в 20 атомов углерода. Все насыщенные и ненасыщенные кислоты С-16 и С-18 рядов активностью не обладали. Определяющее значение для биологической активности имело положение и число двойных связей. Наибольшую индуцирующую активность проявляли кислоты, имеющие положение двойных связей Δ 5,8,11. Способность к индуцированию ФА зависела от класса липидов, в которых присутствовала АК. Так, относительные активности располагались в следующем порядке: лизофосфатидилхолин : фосфатидилхолин : моноарахидонилглицерин : диарахидонилглицерин : триарахидонилглицерин = 140 : 95 : 100 : 20 : 1. АК и ЭПК, содержащиеся в грибе, участвуют во взаимодействии паразита и хозяина (Richer , Bostock,1982). Авторы инфицировали картофель суспензией спор возбудителя фитофтороза, содержащего радиоактивную АК. Последняя быстро освобождалась из спор патогена и накапливалась в нескольких рядах клеток, прилегающих к месту инфекции, но не далее, чем 1 см от места ее нанесения. В отличие от углеводсодержащих элиситоров клеточных стенок, АК не взаимодействует с рецепторными сайтами на плазмалемме, а депонируется в мембранах растительных клеток, замещая там свойственные растениям линолевую и линоленовую кислоты Дальнейшие превращения АК в растительной ткани будут изложены в разделе «Системная приобретенная устойчивость». ЭНДОГЕННЫЕ, РАСТИТЕЛЬНЫЕ ИЛИ ВТОРИЧНЫЕ ЭЛИСИТОРЫ В середине 70-х годов нашего века американскими биохимиками Альберсхеймом и Валент обнаружен новый класс регуляторных молекул, представляющий собой олигосахариды клеточных стенок растений и грибов. Эти соединения оказались способн0ыми контролировать защитные функции растений, а также процессы их роста и дифференцировки. Олигосахариды с регуляторной активностью получили тривиальное название олигосахаринов (ОС). ОС, образовавшиеся из клеточных стенок грибов (β-1,3-глюканы, хитин и хитозан, о которых уже шла речь в предыдущей главе) являются по отношению к растениям экзогенными (микробными), тогда как ОС из клеточных стенок растений носят название эндогенных, конституционных или вторичных. Хотя ОС богаты сахарными остатками, они могут содержать и неуглеводные компоненты: фенолы, пептиды или ацильные группы Открытию ОС в большой мере способствовало использование в работе культуры клеточных стенок явора (Acer pseudoplatanum). Клетки явора однородны и имеют лишь первичную клеточную стенку. Важно и то, что клетки выделяют в культуральную среду полисахариды структурно родственные полисахаридам матрикса клеточных стенок, а это существенно упрощает их исследование. Отправной точкой открытия Альберсхеймом ОС послужил выше уже упомянутый факт, что полисахаридные фрагменты клеточных стенок P. megasperma способны индуцировать ФА сои. Этот факт, а также сложное строение полисахаридов матрикса клеточных стенок заставили пересмотреть ранее существовавшие взгляды о том, что клеточные стенки несут только лишь механические функции поддержания формы и структуры организма. Углеводы клеточной стенки состоят из структурной части - целлюлозы и полисахаридов матрикса. Именно структура матрикса и оказалась неожиданно сложной. С давних пор полисахариды матрикса разделяют по растворимости на пектиновые вещества и гемицеллюлозы (см. стр. ). В пектиновые вещества матрикса погружены микрофибриллы целлюлозы. Пектины также входят в состав срединной пластинки, обеспечивающей связь между клетками и целостность растительной ткани. Пектиновые вещества первичных клеточных стенок двудольных состоят из гомогалактуронана, рамногалактуронана I и рамногалакуронана II. Гомогалакуронан содержит неразветвленные цепи, состоящие примерно из 25 остатков галактуроновой кислоты, связанной α-( 1-4)-глюкозидными связями. В рамногалакуронан I и II входят бо0лее 13 мономеров, соединенных 20 различными способами, включая α и β-связи. Гемицеллюлозы двудольных растений состоят из нескольких групп полисахаридов: ксилоглюканов, арабиногалактанов и глюкоуроноарабиноксиланов, получивших свое название от преобладающего моносахарида. Функционально гемицеллюлозы определяют как класс сильно разветвленных полисахаридов, образующих поперечные нековалентные связи с целлюлозными микрофибриллами. Предполагается, что динамичная природа поперечных связей ксилоглюкана является главным фактором, контролирующим растяжение клеточной стенки и тем самым рост растительной клетки. Поэтому ксилоглюкан считается опорной структурой первичных клеточных стенок растений. ОС обладают уникальными свойствами: многочисленные гидроксильные группы и кислородные атомы, гидрофильные участки, характерные для глюкозидных остатков, которые создают условия для существование стереохимических групп, обеспечивают ОС идеальные возможности для точного взаимодействия с сайтами на молекулах белков (лектин-лигандные взаимодействия). Так, присутствие или отсутствие одного мономера или изменение положения бокового дисахарида полярно меняет регуляторные свойства молекулы Естественно, что только для укрепления клеточной стенки столь сложная структура не нужна. Образование ОС in vivo происходит в результате деградации полисахаридов клеточных стенок, а не в процессе синтеза из мелких мономеров. Под действием стрессовых агентов, включая поражение фитопатогенами и поранение, происходит усиленный распад клеточных стенок и высвобождение ОС. Предполагается, что ОС, связываясь со специфическими рецепторными сайтами, обеспечивают выживаемость растений, индуцируя в них образование ФА, PR-белков - ингибиторов протеиназ, образование лигнина и другие защитные ответы. ОС регулируют также растяжение клеток растений, стимулированное ростовыми гормонами, контролируют процессы морфогенеза и ризогенеза, вызывают быстрые изменения в ионных потоках и проницаемости плазматических мембран, индуцируют in vitro фосфорилирование белков. Высвобождение ОС происходит не только в стрессовых условиях, но и конституционно, где они регулируют физиологические процессы в норме. Существует мнение, что такие плейротропные гормоны как ауксины и гиббереллины в действительности являются активаторами ферментов, которые, в свою очередь, высвобождают из клеточных стенок более специфические медиаторы - ОС. Многие ОС активны в концентрациях на 2-3 порядка более низких ( 10-9 10-8 М ), чем известные к настоящему времени фитогормоны. Интересен синергизм гептаглюкозида из Phytophthora megasperma и эндогенного элиситора из клеточных стенок сои. Концентрации каждого из них, которые были слишком малы, чтобы вызвать ощутимые количества глициоллина, при их совместном действии обладали высокой индуцирующей активностью. Открытие ОС позволило объяснить элиситорные свойства некоторых карбогидраз. Так, ФА хлопчатника индуцировались пектатлиазой и полигалактуроназой из культурального фильтрата Verticillium dahliаe. В культуральной жидкости Rhizopus stoloniferum обнаружен элиситор ФА клещевины - касбена, оказавшийся полигалакуроназой. Erwinia carotovora продуцирует эндополигалактуроназу, которая индуцирует образование глициоллина в сое. Инактивация ферментов сопровождалась потерей ФАиндуцирующей активности. По-видимому, карбогидразы расщепляют полисахариды клеточных стенок, образуя активные ОС, индуцирующие защитные эффекты. Предполагается (Albersheim et al.,1992; Тарчевский, 1992), что ОС являются хранилищами регуляторных молекул. К настоящему времени известны несколько основных групп ОС: это уже упомянутые экзогенные (микробные) ОС клеточных стенок грибов (β-глюканы, хитины и хитозаны), а также растительные эндогенные ОС: олигогалактурониды и ксилоглюканы. Однако уже сейчас становится ясным, что группа ОС не ограничивается только этими структурами. Существует основания причислить к числу ОС целлобиозные олигомеры, а также олигомеры ксилана, арабиноксилана, а возможно, и некоторых других структур. Олигогалактуроновые (пектиновые) олигомеры Биоактивные олигогалактурониды могут быть извлечены из клеточных стенок растений автоклавированием, а также химическим и ферментативным гидролизом. Олигогалактурониды, полученные путем гидролиза из клеточных стенок как двудольных, так и однодольных растений, оказались сходными по структуре, хотя содержание пектиновых веществ в первичной клеточной стенке двудольных составляет примерно 35 %, тогда как у однодольных только 9%. К настоящему времени обнаружено, что олигогалактурониды индуцируют синтез ФА: глициоллина у сои, фазеоллина у фасоли, касбена у клещевины, а также ФА у ряда других растений. Степень полимеризации у наиболее активных элиситоров составляет 12 галакуроновых остатков для ФА сои, 9 - для фасоли и 13 - для клещевины. Оптимальная степень полимеризации (9-15), необходимая для элиситорных молекул, по-видимому, способствует приобретению олигогалакуронидами стабильной конформации, обеспечивающей определенное пространственное положение заряженных группировок. Наряду с ФА активируются и ферменты, участвующие в их биогенезе. Поскольку пектиновые ОС имеют относительно мало требований к структуре и действуют в относительно более высоких концентрациях, чем другие ОС, предполагается, что они могут функционировать без специфических рецепторов, возможно, изменяя физиологические свойства мембран. Пектиновые ОС индуцируют изоформы пероксидазы, катализирующей последние стадии образования лигнина. Олигогалактурониды вызывают также образование активных форм кислорода, причем окислительный взрыв, индуцируемый ими, по своей эффективности сравним с защитной продукцией активного кислорода, вызывающего локальное воспаление в клетках животных. Серия олигомеров со степенью полимеризации от 2 до 20 также обладала способностью индуцировать ингибиторы протеиназ. Причем восстановление редуцирующего конца как насыщенных, так и ненасыщенных ди- и тригалактуронидов полностью разрушало их активность. Для способности галактуронидов индуцировать образование ингибиторов протеиназ требуется интактное полуацетальное кольцо и свободный карбоксил при шестом атоме углерода (С-6). Актиность уменьшалась, но не исчезала полностью при изменении стериоизомерии гидроксильной группы в положении С-3 или при образовании двойной связи при С-5. Активные пектиновые фрагменты были получены при действии на полигалакуроновую кислоту как полигалактуроназы, так и пектатлиазы. Возможно, что деполимеразы клеточных стенок, продуцируемые разными патогенами, образуют различные по деградации продукты, отличающиеся по способности продуцировать различные защитные ответы. Большинство защитных реакций все же индуцировалась олигоуронидами со степенью полимеризации больше 9. Известно, что олигоурониды именно такого размера способны образовывать межмолекулярные комплексы (egg-boxструктуры) с Са2+ в качестве связывающего иона. Предполагается, что действие олигоуронидов на поверхности клеток растения коррелирует с индукцией ими защитных механизмов. Это тем более вероятно, что существует сходство между структурными требованиями для олигогалактуронидов, индуцирующих краткосрочные ответы в плазматической мембране и вызывающих более продолжительные ростовые ответы. Последнее позволяет предполагать, что в результате воздействия этих олигомеров на мебраны генерируются вторичные мессенджеры, вызывающие долгосрочные ответы. Способность олигогалактуронидов вызвать быстрые краткосрочные изменения в потоках К+ и Са2+, деполяризацию мембраны, защелачивание среды подтверждает их действие на мембранном уровне. Олигогалактурониды, индуцирующие синтез протеиназ в листьях томатов, одновременно усиливают фосфорилирование белков плазматической мембраны. Индукция фосфорилирования зависит от структуры и размера олигомера. Активными оказались только олигомеры со степенью полимеризации 13 и более, а также положением ОН-группы таким же, как у полигалактуроновой кислоты. Такими же параметрами характеризовались олигомеры, индуцирующие ингибиторы протеиназ. Таким образом, фосфорилирование показало такую же олигомерную специфичность, как и индукция защитных и ростовых эффектов. Гемицеллюлозные олигомеры Главный представитель гемицеллюлоз - ксилоглюкан. Его основа – цепь, в которой β-1,4-D-глюкозные единицв в положении 6 замещены на α-D-ксилозу (рис. 35). Около половины α-D-ксилозных остатков в ксилоглюкане двудольных растений связаны с β-D-галактозой или с α-L-фукоза -β-1,2-галактозой в положении С-2. Ксилоглюкановые цепи связывают водородными связями смежные микрофибриллы целлюлозы, ограничивая тем самым клеточное растяжение. Эндо-β-1,4-глюканаза расщепляет β-1,4-связь только тех остатков β-Dглюкозы, которые не замещены остатками α-D-ксилозы, α-D-ксилозы- β-Dгалактозы или α-D-ксилозы-β-D-галактозы - α-L-фукозы. Как правило, каждый четвертый остаток в главной цепи ксилоглюкана не является точкой разветвления, поэтому олигосахаридные продукты, полученные при ферментолизе, содержат целлотетраозную основу Наиболее исследованным эффектом нонасахарида (XG-9) и пентасахарида (XG-5) ксилоглюкана является вызываемое ими ингибирование роста, индуцируемое гербицидом 2,4-D. Такими свойствами обладают только ксилоглюкановые олигомеры, содержащие в своем составе фукозу и проявляющие активность в концентрациях 10-9 - 10-8 М. Ксилоглюкановые олигомеры, не содержащие фукозы, антиауксиновой активностью не обладали. Таким образом, концевой фукозид является решающим для ростингибирующей активности. Недавно обнаруженная в растениях α-фукозидаза отрывает остаток фукозы от активного фукозосодержащего ксилоглюканового ОС, превращая его тем самым в неактивный. Таким образом, растения способны преобразовывать биологические сигналы, а информация, которую они несут, не хранится больше, чем это необходимо. Представление о биологической активности ксилоглюкановых олигомеров долгое время ограничивалось лишь их воздействием на процессы роста и морфогенеза растений. Однако в последнее время появились данные об иммунорегулирующей роли этих фрагментов. Удалось установить, что XG-9 и XG-5 обладают иммуностиумирующими свойствами, повышая устойчивость проростков пшеницы к Fusarium culmorum и индуцируя ФА у семядолей сои (Pavlova et al., 1992). В исследованиях Е. А. Переход с соавторами (1997) установлено, что при гидролизе ксилоглюкана целлюлазой на начальных этапах ферментолиза возникают фрагменты, проявляющие на клубнях картофеля элиситорную активность. Однако, по мере углубления гидролиза, ксилоглюкан расщеплялся до олигомеров со степенью полимеризации меньше 12, которые не только не обладали элиситерной активностью, но напротив, усиливали симптомы проявления болезни, демонстрируя тем самым иммуносупрессорные свойства. Эффект проявлялся при чрезвычайно низких концентрациях - 1-10 пг/мл. Полученные данные, а также анализ процессов патогенеза, допускают возможность того, что элиситорной активностью обладают ОС, генерирующиеся на ранних этапах ферментативного расщепления. Позднее, когда деполимеразы начинают глубокое разрушение клеточных стенок, образуются небольшие по величине молекулы, подавляющие защитные ответы растительной ткани и облегчающие распространение паразита. Иммуносупрессорным действием обладали два индивидуальных ксилоглюкановых олигомера, содержащие в своем составе фукозильный остаток: трисахарид (XG-3) и пентасахарид (XG-5). Оба ОС проявляли наибольшую супрессорную активность на картофеле в концентрации 10-8 М. В то же время тетрасахарид (пентасахарид, лишенный терминального остатка фукозы) оказался биологически инертным. Полученные данные позволяют полагать, что терминальный фукозильный остаток необходим не только для антиауксинового действия ксилоглюкановых ОС, но и для их иммуносупрессорной активности. Трисахарид оказался минимальной структурной единицей, определяющей иммуносупрессорную активность. Интересно, что замена ксилозы в молекуле XG-3 на другие структурные элементы изменяла супрессорную активность на противоположную ей - элиситорную. Таким образом, олигомеры, содержащие в своем составе часть структуры ксилоглюкана - α-L-фукоза- β-1,2-Д-галактоза, в зависимости от структуры третьего сахарного остатка, могут обладать либо супрессорной, либо элиситорной активностью. Фукозильный остаток в составе ксилоглюкановых олигомеров играет исключительно важную роль во взаимоотношениях картофеля и возбудителя фитофтороза. Олигомеры, лишенные терминального фукозидного остатка, становятся биологически неактивными, теряя как элиситорные, так и супрессорные свойства. Подобная зависимость биологической активности от структуры в сочетании с чрезвычайно низкими активными концентрациями предполагает наличие высокоспецифического сайта у картофеля, взаимодействие с которым реализует ту или иную биологическую активность Поскольку меченные ксилоглюкановые ОС с трудом проникают в протопласт, наиболее вероятной представляется их рецепция на плазматической мемебране. . Регуляция образования олигосахаринов в растении Образование олигосахаридных фрагментов, обладающих супрессорными функциями, вызывает особый интерес, поскольку все известные к настоящему времени эндогенные ОС либо стимулировали защитные функции растений, либо не влияли на них. Об ОС, подавляющих иммунный статус растений, ранее не сообщалось. Таким образом, эндогенным ОС присуща значительно более широкая активность в процессах патогенеза, чем это предполагалось ранее, заключающаяся не столько в стимулировании, сколько в регулировании иммунных ответов растительной ткани. В плане вышесказанного особую актуальность приобретает задержка ферментативной деградации полисахаридов на этапе образования элиситорных олигомеров. Оказалось, что в растениях имеются белки, специфически ингибирующие активность деполимераз клеточных стенок. Предложена модель (Cervone et al.,1989), согласно которой ингибиторы деполимераз клеточных стенок растений могут регулировать их устойчивость к болезням, способствуя образованию элиситорно-активных молекул. Из экстрактов клеточных стенок фасоли был выделен ингибитор полигалакуроназ (polygalacturonase ingibiting protein - PGIP), имеющий сродство к эндополигалакуроназам Colletothrichum lindemuthianum, Fusarium moniliforme и Aspergillus niger. Отмечено, что PGIP, как правило, действует на полигалактуроназу грибов, не поражающих данное растение, из которого он был выделен, и значительно слабее ингибирует полигалактуроназу патогенов. Е.В. Глинка и М.А. Проценко (1996) частично очистили препарат PGIP из клеточных стенок картофеля. Препарат ингибировал полигалакуроназу из Verticillium dahliаe и Aspergillus alluacianum, но не влиял на фермент специфических паразитов картофеля P. infestans и Rhizoctonia solani.Таким образом, PGIP скорее играет роль в видовом иммунитете и в меньшей мере в сортовой устойчивости. PGIP обнаружен в клеточных стенках многих двудольных и некоторых однодольных растений, как зараженных, так и здоровых. Этот ингибитор присутствует практически во всех тканях и органах растений, в основном локализуясь в апопласте. PGIP является гликопротеином, богатым лейцином. Он термостабилен и устойчив к действию протеаз. В присутствии PGIP количество элиситорных олигомеров стабильно возрастает в течение 24 часов и только спустя 48 часов фермент гидролизовал субстрат до меньших, элиситорно-неактивных фрагментов. В отсутствии ингибитора уже через 15 минут гидролиза происходила деполимеризация молекул полигалактуроновой кислоты до уровня неактивных олигомеров. Ингибиторы полигалакуроназ были обнаружены в инфицированных фруктах, луке, сладком перце, капусте. В корнях сахарной свеклы присутствует белок, ингибирующий пектатлиазу Rhizoctonia solani и Phoma betae. В ответ на инфицирование, поранение и обработку салициловой кислотой возрастает мРНК PGIP, причем его уровень увеличивался преимущественно в клетках, непосредственно прилегающих к месту повреждения. Эти данные свидетельствуют о том, что синтез PGIP являются составной частью механизма активной защиты растений. Однако в большинстве случаев уровни PGIP в устойчивых и восприимчивых растениях оказались близкими, поэтому его нельзя рассматривать как специфическую детерминанту устойчивости или восприимчивости. По-видимому, растения обладают механизмами, регулирующими активности деполимераз, деградирующих полисахариды клеточных стенок. Последнее способствует накоплению элиситорно-активных молекул и предотвращает образование олигомеров либо неактивных, либо обладающих иммуносупрессорными свойствами. В свою очередь, патогены обладают способностью секретировать протеины, которые эффективно ингибируют ферменты хозяина и для которых полисахариды клеточных стенок растений служат субстратом. Таким образом, не только растения способны синтезировать белки-ингибиторы ферментов патогена, но и патогены обладают подобным механизмом регуляции растительных деполимераз, не позволяющим последним разрушать клеточные стенки микроорганизмов, выщепляя из них элиситорные олигомеры. Итак, олигомеры, образующиеся при деградации полисахаридов клеточных стенок, обладают четко выраженными регуляторными функциями. Высказанные положения являются хорошей иллюстрацией к концепции, развиваемой И.А. Тарчевским (1992 г.), об использовании клетками информационного потока катаболитов в качестве сигнальных молекул, воздействующих на различные стадии анаболизма. С точки зрения И.А. Тарчевского, мало вероятно, чтобы в процессе эволюции не были использованы богатейшие возможности катаболитического информационного потока, несущего разнообразную биохимическую информацию. ГЕНЫ АВИРУЛЕНТНОСТИ И СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭЛИСИТОРЫ Противоречия между данными генетических и биохимических исследований, по вопросу о том, что является специфичным – индукция защитных реакций или их супрессия, были разрешены методами молекулярной биологии. Для получения ответа на поставленные выше вопросы используют две методологии. 1. Получение мутаций гена, определяющего специфичность, и изучение реакции растения на заражение мутантными штаммами. Зондами для идентификации генов специфичности могут быть измененные последовательности ДНК или мобильные элементы генома (транспозоны). У большинства фитопатогенных вирусов геном содержит всего несколько цистронов, поэтому доступен для полного секвенирования (определения последовательности оснований в нуклеиновой кислоте). Поэтому для идентификации avr-генов можно использовать искусственно полученные мутанты или даже природные варианты вирусов с измененной вирулентностью. У клеточных организмов для идентификации avr-генов используют транспозоновый мутагенез. Транспозоны (tn) или инсерционные последовательности (is) представляют собой участки ДНК с повторяющимися последовательностями оснований на концах. Благодаря такой структуре они могут встраиваться в разных участках цепочки ДНК, при этом ген, в который внедрился транспозон, может быть полностью или частично инактивирован. Среди трансформированных транспозоном отбирают по реакции на заражение клетки с измененной вирулентностью, выделяют из них ДНК и гибридизацией с транспозоном (зондом) определяют участок ДНК, ответственный за вирулентность. 2. Трансформация гена вирулентности из одних штаммов в другие. Для ее проведения необходимо: 1/ с помощью ферментов, разрезающих молекулу ДНК (рестриктаз) разбить геном паразита на отдельные фрагменты; 2/ клонировать их в модельном организме (кишечной палочке), создав библиотеку генов; 3/ соединить их с вектором, в который встроен маркерный ген (резистентности к антибиотику, прототрофности), необходимый для отбора трансформированных клеток; 4/ обработать вектором протопласты донорного штамма и по маркерному гену отобрать трансформированные клетки; 5/ по изменению реакции растения на заражение отобрать клон, в который встроен участок ДНК, отвечающий за специфическую патогенность (табл. 26). Если специфичность обусловлена индукцией устойчивости (специфическая индукция), то реакция сорта А на заражение трансформированной расой b изменится с восприимчивой на устойчивую, а сорт В сохранит реакцию восприимчивости (1-й вариант). Если же специфичность обусловлена супрессией устойчивости, то, наоборот, реакция сорта В изменится с устойчивости на восприимчивость, а сорт А останется восприимчивым (2-й вариант). Таблица 26. Возможные изменения реакции растения на заражение патогеном после его трансформации геном специфической патогенности _____________________________________________________________________ Cорта растения А Штаммы В реакция на заражение паразита а R (I) S (C b S (С) R (I) b + фрагмент а 1-й вариант R R 2-й вариант S S Сложность данной методики обусловлена отбором среди большого числа фрагментов ДНК из библиотеки генов фрагмента, связанного с специфической вирулентностью. Вопрос можно сформулировать так: сколько трансформантов надо проверить на растении, чтобы с высокой степенью вероятности среди них был обнаружен искомый? Число трансформантов устанавливают с помощью следующего уравнения: N = ln (1-P) / ln (1-f), где P – вероятность присутствия гена, а f – часть генома, представленная в одном клоне. Например, если размер генома бактерий из рода Erwinia составляет 4,5 х 106 пар нуклеотидов (пн), а средний размер клонированных фрагментов – около 15 тысяч пар (тпн), то с вероятностью Р = 0,99 искомый ген может быть обнаружен в одном из 1500 трансформантов (Буканов и др., 1985). Следовательно, необходимо по маркерному гену отобрать 1500 клонов, в которые встроен вектор, и каждым клоном индивидуально заразить растениехозяина, чтобы отобрать клон с измененной вирулентностью. Для облегчения работы рекомендуют: а/ использовать крупнощепящие рестриктазы, разбивающие молекулу ДНК на большие фрагменты; б/ в качестве вектора использовать конструкции, способные нести крупные фрагменты ДНК (космиды, ДНК фага λ). Рассмотрим результаты использования описанных выше других методов для анализа avr-генов и специфических элиситоров у разных паразитов. Вирусы Методологию поиска avr-генов у фитопатогенных вирусов удобно рассмотреть на примере вируса табачной мозаики (ВТМ). Среди видов рода Nicotiana (табак) имеются восприимчивые (культурный табак N.tabacum) и устойчивые (N.sylvestris, N.glutinosa). Вирулентные к устойчивым видам штаммы ВТМ найдены в природных популяциях вируса и получены искусственно, причем их взаимоотношения с видами табака удовлетворяют правилам “ген-на ген” (табл. 27). Таблица 27. Взаимоотношения штаммов ВТМ с видами рода Nicotiana Штаммы ВТМ Виды табака* N.tabacum (n) N.sylvestris (N’) N.glutinosa (N) • u1 S R R u2 S S R ob S S S в скобках – аллели гена вертикальной устойчивости табака Геном ВТМ содержит всего 6400 нуклеотидов и состоит из нескольких цистронов (рис.6): к 5’ концу примыкает ген РНК-полимеразы размером 126 kDa и вспомогательный белок, необходимый для репликации РНК, размером 183 kDa. Это – ранние белки, появляющиеся в зараженной клетке в первую очередь. Ближе к 3’ концу расположен ген, кодирующий транспортный белок, необходимый для миграции вирусной РНК по растению (стр.), размером 30 kDa, и, наконец, ген капсидного белка (17,5 kDa). Весь геном секвенирован. Мутанты, вирулентные для N.sylvestris (преодолевают действие гена N’) встречаются в природе и в большом числе возникают после мутагенной обработки. Для того, чтобы установить, с изменениями в каких генах связана вирулентность, у нескольких десятков таких мутантов был секвенирован геном. Оказалось, что все мутанты имели изменения в капсидном гене (17,5 kDa белок), причем обнаружены две горячие точки, в которых замены нуклеотидов встречаются очень часто. Замена только одного азотистого основания (цитозина на урацил и соответственно аминокислоты серина на фенилаланин) в положении 157 приводит к изменению вирулентности. Следовательно, специфическим элиситором, который узнает ген устойчивости N’, является белок оболочки, причем именно белок, а не РНК, ибо в условиях отсутствия экспрессии гена капсидного белка отсутствует и индукция реакции сверхчувствительности. Мутанты, вирулентные к N.glutinosa, встречаются очень редко. Их изучение показало, что специфическим элиситором для гена N является белок РНК-полимераза. Кроме табака от ВТМ сильно страдают томаты, у устойчивых сортов которых описано 2 гена устойчивости Tm1 и Tm2. Мутации, вирулентные к сортам, имеющим ген Tm1, картируются в гене 30kDa транспортного белка. Таким образом, все белки ВТМ, образующиеся в зараженной клетке, разобраны на элиситоры. Интересно, что один и тот же элиситор (капсидный белок Х-вируса картофеля с треонином в положении 121) индуцирует СВЧ-реакцию у картофеля, имеющего ген устойчивости Rx, и у вида Gomphrena globosa, относящегося к иному, чем картофель, ботаническому семейству, Следовательно, два ранее считавшиеся принципиально разных типа устойчивости сортовой и видовой (по терминологии Н.И.Вавилова) иммунитет, индуцируются одним и тем же вирусным элиситором. Бактерии Avr-гены Первой работой, в которой удалось клонировать avr-гены, было исследование бактерии Pseudomonas savastanoi pv. glycinea, поражающей сою (Staskawicz et al., 1984). Расы бактерии и сорта сои взаимодействуют по правилу «ген-на ген». Из библиотеки генов расы 6 был изолирован фрагмент (pPg6L3), который при проверке 600-700 трансформированных клонов вызывал изменение реакции листьев сои на заражение. Введение этого фрагмента в другие расы бактерии изменяло их вирулентность, как показано в табл. 28. Таблица 28. Реакция сортов сои на заражение природными и трансформированными расами P.savastanoi pv.glycinea (Keen, Staskawicz, 1984) Расы Реакция сортов сои P.savastanoi pv.glycinea Акме Чиппева Фламбеу Харди Харсой Норчф Пикинг 1 дикий тип S R S R R R S 1 + pPg6L3 R R S R R R R 4 дикий тип S S S S S S S 4+ pPg6L3 R R S S R S R 5 дикий тип R R R S S R S 5 + pPg6L3 R R R S R R R 6 дикий тип R R S S R S R Как показано в таблице, фрагмент pPg6L3 ни в одном случае не меняет реакцию на заражение растений с несовместимости на совместимость. Следовательно, находящийся на этом фрагменте ген индуцирует не восприимчивость, а устойчивость, т.е. является avr-геном. Изменение реакции восприимчивости на реакцию устойчивости наблюдается только у сортов, которые устойчивы к донору фрагмента – расе 6 (сорта Акме, Чиппева, Харсой, Пикинг), что свидетельствует о сортоспецифичности элиситора расы 6. Введение в фрагмент pPg6L3 транспозона Tn5, приводящее к инактивации гена, вызывало потерю способности к индукции несовместимости; следовательно ген специфичности в активной форме индуцирует устойчивость, потеря активной формы делает растение восприимчивым. Таким образом, впервые экспериментально были подтверждены гипотезы, основанные на теории “ген-на ген”. Использование транспозона как гибридизационного зонда показало, что за авирулентностью отвечает участок ДНК размером около 1,4 тнп. Разработанные методы были использованы при изучении десятков фитопатогенных бактерий, подтвердив приведенные выше результаты. Так раса 2 паразита перца Xanthomonas vesicatoria авирулентна к сортам, имеющим ген устойчивости Bs 1, однако часто возникают спонтанные мутанты с разной степенью вирулентности. У них в avr-локусе обнаружена инсерция (вставка) размером около 1,2 тнп, названная IS 476. Если эта вставка находится в регуляторной части гена, то мутант имеет слабую вирулентность, его внедрение в структурную область приводит к высокой вирулентности. Это еще одно экспериментальное подтверждение гипотезы Флора о том, что делеция или мутация гена авирулентности фенотипически выражается как вирулентность, причем показана возможная природа переходных между высокой устойчивостью и полной восприимчивостью реакций на заражение, описанных при многих болезнях. Другой возможный механизм приобретения вирулентности – делетирование (вырезание) в процессе репликаций повторяющихся последовательностей, обнаруженных во внутренних областях многих avr-генов. Ген Avr-Bs1 из X. vesicatoria был трансформирован в другие ксантомонады, которые после этого стали вызывать реакцию сверхчувствительности у видов растений, к которым эти бактерии были вирулентны (растениям-хозяевам). Таким образом продукт одного и того же гена вызывал СВЧ у устойчивых сортов растения-хозяина и у растений, не являющихся хозяевами данной бактерии. Следовательно в отношении к бактериям, как и к вирусам, нет принципиальной разницы между сортовым и видовым иммунитетом. Клонирование avr-генов, показало, что гомологичные последовательности имеются в геноме разных видов бактерий. Например, штаммы P.s. pv. glycinea имеют области высокой гомологии к гену avrD из P.s. pv. tomato. Гомология по белку составила 86%, по рамке считывания - 98%. Следовательно гомологичные гены есть у большинства бактерий, но вследствие точковых мутаций их продукты перестали индуцировать СВЧ реакцию у своих хозяев (как avrD не индуцирует несовместимость у томатов), т.е. являются рецессивными (неактивными) аллелями. Ген avrD кодирует белок, с молекулярной массой 34 kDa. В его структуре отсутствуют участки, необходимые для трансмембранного переноса из клетки в окружающую среду (лидерный пептид и гидрофобный домен), т.е. это внутриклеточный белок. Поскольку avrD представляет собой первую из пяти тандемно расположенных рамок считывания, возможно, его продукт является ферментом, важным для вторичного метаболизма. Элиситорную активность, обусловленную геном avrD, удалось обнаружить только после его трансформации в геном кишечной палочки Esherichia coli, которая стала выделять в среду роста метаболит, вызывающий реакцию СВЧ у сортов сои, имеющих ген устойчивости Rpg4. Скрещивание сортов сои с геном Rpg4 без него дало в F2 расщепление на устойчивые и восприимчивые в отношении 3 : 1, причем все устойчивые сегреганты (и только они) давали некрозы при инфильтрации в межклеточное пространство листьев элиситора из трансформированных геном Rpg4 клеток E. coli. Элиситором оказался низкомолекулярный С-глюколизированный липид сиринголид, а продукт гена avrD – фермент, катализирующий синтез сиринголидов вследствие конденсации ксилозы с β-оксидеканоидной кислотой. Сиринголиды (рис. 36) относятся к семейству сигнальных молекул, таких как индукторы споруляции и антибиотикообразования актиномицетов бутанолиды, жасмоновая кислота в клетках растений (см. ниже) и др. В среде роста фитопатогенных бактерий, содержащих ген avrD, его содержание во много раз ниже, чем в среде роста трансформированной E.coli, но резко возрастает в зараженных растениях. Таким образом, получено экспериментальное подтверждение двух гипотез, обсуждавшихся ранее,- об опосредованном участии генов авирулентности во взаимодействиях паразита и хозяина (ферментативном «изготовлении» низкомолекулярных внеклеточных элиситоров); и об освобождении элиситоров только in planta под влиянием метаболитов растения. Почти все исследованные avr гены также кодируют внутриклеточные белки, не выделяющиеся наружу. Продукт гена avrRxv X vesicatoria гомологичен фактору вирулентности бактерии Yersinia pseudotuberculosum youp J, вызывающей кишечные инфекции. Транспорт этого фактора через бактериальную мембрану осуществляется специальной генетической системой (см. ниже). Исключение составляет ген avr10 Xanthomonas oryzae, комплементарный гену устойчивости риса Ха-10. Его продукт – белок, гомологичный гену phoS E.coli, - периплазматическому белку, связывающему фосфаты. Этот белок имеет гидрофобный домен, способен переноситься через мембрану и может быть непосредственным элиситором. Hrp-гены Вторая группа генов, регулирующих взаимоотношения фитопатогенных бактерий с растениями, названа hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity) генами. Как видно из определения, мутанты по этим генам теряют способность индуцировать СВЧ реакцию в растениях, не являющихся хозяевами данной бактерии, и быть патогенными для своих хозяев. hrp-гены у всех изученных бактерий из родов Erwinia, Pseudomonas и Xanthomonas тесно сцеплены, образуя кластеры (группы) из нескольких генов. Для экспрессии кластера из шести hrp-генов Burkholderia solanacearum необходима активность еще одного гена hrpSc, продукт которого гомологичен 2-компонентному регуляторному белку прокариот. Продукты многих hrp-генов бактерий – богатые глицином термостабильные белки харпины. Они индуцируют СВЧ-реакцию у нехозяев. Продукт гена hrpA1 X. vesicatoria – белок наружной мембраны, гена hrpB6 – АТФ-за, необходимая для транспорта белков из клетки. Продукты некоторых hrp-генов гомологичны секреторным белкам факторов вирулентности патогенных для человека бактерий Yersinia, Shigella, Salmonella, а эти факторы, в свою очередь, гомологичны продуктам некоторых avr-генов (см. выше). Два hrp-гена P.syringae pv. syringae кодируют белки, имеющие высокую степень гомологии с глюкозилтрансферазой E.coli – ферментом, участвующем в построении углеводных полимеров клеточной стенки. Харпины, по-видимому, осуществляют перенос специфических элиситоров бактерий внутрь растительных клеток (рис. 37). Как и avr, hrp гены экспрессируются in planta, но не на богатой питательной среде. По-видимому, их индуктором является голодание, т.к. на минимальной среде они экспрессируются, хотя и не так активно, как в растениях. Грибы Крупный геном мицелиальных грибов и трудности их генетической трансформации осложняют молекулярно-генетические манипуляции с их генами авирулентности. Поэтому генов авирулентности у грибов клонировано гораздо меньше, чем у бактерий. Первый исследованный avr-ген выделен из генома возбудителя оливковой плесени томатов Cladosporium (Fulva) fulvum. Этот гриб заражает листья восприимчивых сортов томата через устьица, развивается в межклетном пространстве, не формируя гаусторий и не заражая клеток, и питается клеточными эксудатами. В устойчивых сортах томата развитие гриба вызывает СВЧ-реакцию, причем взаимоотношения между сортами и расами соответствует схеме «ген-на ген». Голландский фитопатолог П. Де Вит в межклеточной жидкости томатов, зараженных расой А9 C.fulvum, обнаружил белок, отсутствующий как в фильтрате гриба, растущего на искусственной питательной среде, так и в незараженных листьях томата. Инфильтрация межклетной жидкости, содержащей этот белок в листьях разных сортов томата вызывала СВЧ-реакцию только у сортов, несовместимых с расой А9 (имеющих ген Cf9), то есть этот белок обладал свойствами расоспецифического элиситора. Он содержит 28 аминокислот, причем 6 из них – цистеин. После его секвенирования на основании генетического кода был синтезирован комплементарный полинуклеотид, использованный как проба для выделения из генома гриба гена авирулентности Avr9 методом гибридизации ДНК. Первичный продукт гена avr9 содержит 63 аминокислоты и состоит из сигнального пептида, необходимого для транспорта через мембрану (23 аминокислоты), и внеклеточного белка из 40 аминокислот. Этот белок подвержен посттрансляционным модификациям: сначала грибная протеаза готовит интермедиат из 32 – 34 аминокислот, затем растительная (уже вне грибной гифы) готовит 28-аминокислотный пептид - элиситор. Он имеет бочкообразную структуру из трех антипараллельных нитей, образующих βструктуру, и соединенных двумя петлями и тремя дисульфидными мостиками, которые связывают все 6 цистеинов в цистеиновый узелок. У животных белки, содержащие цистеиновые узелки, служат сигнальными молекулами. В Avr-9 белке такой узелок возможно повышает стабильность молекулы элиситора в апопласте листа обеспечивает взаимодействие с R-белком. Трансформация гена Avr9 в вирулентные для сортов томата, имеющих ген Cf9, расы делает их авирулентными; разрывы последовательностей гена Avr9 наоборот, восстанавливают вирулентность. Ген avr9 экспрессируется in vitro и in planta только при низкой концентрации азота. Он не экспрессируется в конидиях и гифах, находящихся на поверхности листа. Значительная экспрессия происходит после внедрения гриба в устьица и очень сильная – в межклеточном пространстве, прочем около сосудов больше, чем в мезофилле. Структура элиситора имеет сходство с регуляторным белком метаболизма азота у грибов Neurospora crassa и Aspergillus nidulans. Повидимому, этот ген участвует в поступлении азота в мицелий из субстрата или индуцирует освобождение и перераспределение азота в растении. Повышенная экспрессия avr9 в районе сосудов возможно связана с тем, что его продукт интерферирует с транспортом питательных веществ в растении. Ген avr9 фланкирован (окружен по бокам) прямыми повторами, по которым может проходить рекомбинация, сопровождаемая вырезанием (делетированием) гена (рис. 38,2). Поэтому часто встречаются вирулентные расы, в геноме которых этот ген отсутствует. Второй ген авирулентности, изолированный у C.fulvum той же группой исследователей, avr4. Его изучение также было начато с выделения белкового элиситора из апопластной жидкости сорта томата, имеющего ген устойчивости Cf4 и инфильтрированного спорами авирулентной расы. Этот белок оказался более крупным, поэтому была определена последовательность только Nконцевых аминокислот, что оказалось достаточным для конструирования полинуклеотида, использованного в качестве пробы для изоляции гена avr4. Его продукт – pro-белок из 135 аминокислот с N-концевым сигнальным пептидом. Как и предыдущий белок, он подвергается в ходе созревания процессингу грибными и растительными протеазами, но имеет два отличия: 1/ не имеет гомологий в компьютерном банке белков и 2/ у вирулентных рас ген avr4 не делетирован, однако имеет точковые мутации, приводящие к замене одного цистеина в положениях 64, 70 или 109 на тирозин (замена кодона TGT на кодон TGA). Аналогичная методика выделения белков из межклеточной жидкости зараженных растений была применена группой американского фитопатолога У. Кногге для изучения генов авирулентности возбудителя пятнистости листьев ячменя Rhinchosporium secalis. Этот гриб экскретрует in planta семейство мелких белков, названных NIP (necrosis inducing proteins), неспецифически токсичных для однодольных и двудольных растений, вследствие стимуляции Н+ - зависимой АТФ-азы плазмалеммы. Один из этих белков – NIP1 оказался расоспецифическим элиситором для сортов ячменя, имеющих ген устойчивости Rrs-1. Мутация, приводящая к замене одной аминокислоты в этом белке, устраняет несовместимую реакцию устойчивого сорта, но снижает патогенность даже при заражении восприимчивых сортов. Таким образом белок NIP1 наряду с специфической авирулентностью играет роль фактора неспецифической патогенности. Изучение аминокислотных последовательностей мутантов и искусственно синтезированных олигопептидов показало, что детерминанты токсичности и индукции СВЧ находятся на разных концах молекулы. Повидимому в растительной клетке содержатся разные рецепторы для этих детерминант. Как вытекает из изложенного выше материала, специфические элиситоры представлены, в основном молекулами двух типов: белками и коньюгатами углеводов. Первые имеют структуры, обеспечивающие прохождение через мембраны, и отщепляемые грибными протеазами в процессе созревания элиситора. Находясь вне протопласта, они играют роль во взаимоотношениях с окружающей средой (продукт avr10 Xanthomonas oryzae участвует в связывании фосфатов, avr9 Cladosporium fulvum – в поступлении азота, NIP Rhinchosporium secalis – в патогенности). У вирусов в роли специфических элиситоров выступают внутриклеточные белки, как ферментные, так и структурные. Вторые представляют собой компоненты клеточных оболочек или сигнальные молекулы, участвующие в регуляции жизненного цикла или также необходимые для взаимодействия с окружающей средой. Их транспорт из клетки обеспечивает специальные белковые молекулы – харпины. Таким образом, в процессе коэволюции у растений возникли рецепторные молекулы, настроенные на узнавание соединений паразитов, находящихся на их поверхности или экскретируемых в окружающую среду. У эукариотных грибов выбор таких соединений достаточно велик и последующие исследования покажут, насколько разнообразны по химическому составу функциям их специфические элиситоры. У прокариот выбор менее широк, подавляющее большинство исследованных элиситоров низкомолекулярные поверхностные гликолипиды. Совсем узок выбор элиситоров у вирусов, - как показано выше, все их белки разобраны на элиситоры. Поскольку все элиситорные молекулы функционально небезразличны для паразитов, их модификации, снижающие узнавание рецепторами, или полная потеря элиситора сказываются на жизнеспособности вирулентных рас. А это, в свою очередь, может иметь большое эпидемиологическое значение. Есть много данных о том, что расширение вирулентности сопровождается снижением агрессивности и жизнеспособности в условиях сапротрофного роста. В эпидемиологии есть даже понятие «цена вирулентности» (Leonard, 1977). Если последовательности, узнаваемые рецептором, находятся на участке молекулы элиситора, функционально не необходимом, то цена вирулентности не будет высокой и вирулентные мутанты смогут быстро накапливаться и поражать устойчивые сорта. Если же вариация молекулы элиситора драматически скажется на выполнении им первоначальных функций, то вирулентные расы вообще не смогут существовать. Например, известно много природных и искусственно полученных мутантов ВТМ, вирулентных для Nicotiana sylvestris, но практически нет мутантов, вирулентных для N.glutinosa. По-видимому, модификации белка оболочки вируса значительно слабее сказываются на жизнеспособности вируса, чем модификации молекулы фермента, необходимого для репликации РНК. Между этими крайностями имеется много промежуточных случаев. Так, у рас Cladosporium fulvum, вирулентных для сортов томатов с геном Cf9, ген avr9 делетирован. Следовательно, его продукт не обязателен для существования, по крайней мере, в зараженных растениях томатов. Однако, поскольку ген Cf9 введен во многие сорта томатов, которые длительное время сохраняют устойчивость (вирулентные расы встречаются редко), можно предположить, что отсутствие этого гена снижает приспособленность гриба (возможно, он необходим для межсезонного существования вне растений в бедной азотом среде). ГЛАВА 6. ВЕРТИКАЛЬНАЯ ПАТОСИСТЕМА: ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ И ИХ ПРОДУКТЫ; ТРАНСДУКЦИЯ СИГНАЛА ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДАМИ КЛАССИЧЕСКОЙ ГЕНЕТИКИ Исследования генов устойчивости методам классической генетики привели к следующим положениям: 1/. Гены устойчивости неслучайно расположены на хромосомах. Анализ большого числа публикаций по картированию генов устойчивости растений к фитопатогенам, проведенный аргентинским генетиком Э. Фавре, показал сильное отклонение их распределения от Пуассоновского. Широко распространены три типа расположения генов устойчивости: одиночное диаллельное (один локус с двумя аллелями, контролирующими устойчивость и восприимчивость, причем устойчивость, как правило, доминантна); одиночное мультиаллельное (один локус с множеством кодоминатных аллелей, контролирующих устойчивость к разным расам патогена) и сцепленное, когда большое число ди- или мультиаллельных локусов сцеплены и образуют блок фенотипически сходных генов, определяющих устойчивость к одной или нескольким болезням Вот некоторые примеры этого: У льна обнаружено около 30 кодоминантных генов устойчивости к расам ржавчины Melampsora lini, расположенных в пяти локусах: в локусе L картировано 13 аллельных генов, в сложном локусе М – 7 тесно сцепленных генов, в локусе Р – 5, в локусе N – 3, в локусе К – 1 ген. Гены H, M, R и T, контролирующие устойчивость пшеницы к головне, находятся в одной группе сцепления и рекомбинируют с частотой 15 – 37%. На коротком плече V-й хромосомы ячменя находится изофенический блок из пяти локусов, определяющих устойчивость к мучнистой росе; в одном из локусов – Mla – картировано около 20 кодоминантных аллелей. Устойчивость к расам 1, 3, 7, 8 и 10 возбудителя мучнистой росы клевера контролируют аллельные или тесно сцепленные гены. Устойчивость кукурузы к расам возбудителя северной ржавчины Puccinia sorgi контролируют 5 локусов. Два из них – Rp1 и Rp5 тесно сцеплены, причем в локусе Rp1 картировано 14 аллельных и тесно сцепленных генов. Гены устойчивости томатов к кладоспориозу (возбудитель – гриб Cladosporium fulvum), образуют несколько групп сцепления. Тесно сцеплены гены Сf1, Cf4 и Cf9, расположенные на коротком плече хромосомы 1, а также Cf2 и Cf5 на коротком плече хромосомы 6. Последние, вероятно, аллельны, так как не рекомбинируют у гибридного потомства. Ген устойчивости риса к бактерии Xanthomonas oryzae Xa21 входит в мультигенное семейство, состоящее по крайней мере из восьми членов, которые картруются в одном локусе на хромосоме 11. Возникновение кластеров сцепленных генов, функционально и, вероятно, структурно сходных, обусловлено внутри или межмолекулярными обменам участков ДНК, имеющих прямые (a b c d – a’ b’ c’ d’) или инвертированные (a b c d – d’ c’ b’ a’) повторяющиеся последовательности (эктопической рекомбинацией), приводящими, в частности, к неравному кроссинговеру (рис 38). 2/. Гены устойчивости могут быть полифункциональными, придавая устойчивость к нескольким патогенам. Например гены устойчивости ржи к возбудителям стеблевой, бурой и желтой ржавчины расположены на очень коротком сегменте хромосомы IR. Возможно это один ген. 3/. Они мутируют с высокой частотой. Например, после облучения γ-лучами выявлено 2,3% устойчивых к мучнистой росе мутантов ячменя (в контроле – 0,7%), 2,7% устойчивых к ржавчине мутантов льна, 0,1% устойчивых к пирикулярозу мутантов риса. 4/. По-видимому, продукты генов устойчивости несут по крайней мере две функции: рецепторов, узнающих элиситоры патогенов, и медиаторов, передающих сигнал на геном. С помощью мутагенеза эти функции иногда удается разделить. Так получены серии мутантов кукурузы и Arabidopsis thaliana, в незараженных тканях которых формируются такие же некрозы и протекают такие же внутриклеточные процессы, как и при несовместимых инфекциях. Мутации в сайте узнавания могут снижать специфичность рецепции, а мутации в сайте активации - вызывать конституционную активизацию иммунного ответа. Например, в описанном выше локусе Rp1, контролирующем устойчивость кукурузы к ржавчине, картировано много аллельных или тесно сцепленных генов. Некоторые аллели нестабильны и продуцируют вследствие неравного кроссинговера восприимчивые мутанты. Отдельные мутации в локусе Rp1 вызывают спонтанные некрозы; мутантные растения теряют расовую специфичность и реагируют СВЧ -реакцией на заражение любой расой патогена. Также локус mlo ячменя придает неспецифическую устойчивость ко всем расам возбудителя мучнистой росы Erysiphe graminis f. sp. hordei, а при низкой температуре вызывает образование некротических пятен без заражения. Томаты, гомозиготные по рецессивному гену ne, образуют некротические пятна без заражения, но только при наличии в геноме гена устойчивости к грибу Cladosporium fulvum Cf2. ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ Молекулярное исследование флоровских генов устойчивости – несравненно более трудная задача, чем исследование генов авирулентности. Продукты генов устойчивости, – гипотетические рецепторы, не извесны и не могут служить молекулярным маркерами, подобно белку – специфическому элиситору гриба Cladosporium fulvum, продукту гена avr9. Огромный размер генома высших растений делает невозможным выделение гена устойчивости такими методами, как тотальная проверка клонов из библиотеки генов. Поскольку не известно, увеличивается ли экспрессия R-генов при заражении, к их изучению неприменимы методы, связанные с выделением фазово-специфичных фракций mРНК. Поэтому к клонированию R-генов и изучению структуры их продуктов ученые шли более сорока лет, и появившиеся к середине 90-х годов ХХ в. первые сообщения на эту тему вызвали большой интерес. Для изоляции генов устойчивости из разных растений были применены следующие методы и их сочетания: 1/ использование видов растений, имеющих небольшой размер геномов, таких как лен и особенно арабдопсис (размер генома Araidopsis составляет 1 х 108 пар оснований, Linum – 7 х 108 пар, Triticum – 1,7 x 1010); 2/ маркирование генов устойчивости перекрывающимися сегментами разрезанной рестрикционными ферментами (рестриктазами) ДНК (RLFP-локусами) в расщепляющемся потомстве F2; 3/ маркирование локусов устойчивости транспозонным мутагенезом; 4/ использование радиоактивно меченого специфического элиситора как маркера для выделения рецептора и реконструкции кодирующего гена по структуре его продукта. Продукты исследованных R-генов (R-белки) имеют в своем составе несколько структур (рис. 39): 1/. Крупный С-концевой участок. Содержит большое число повторяющихся последовательностей с высоким содержанием аминокислоты лейцина (leucine rich repeads, LRR). Каждый повтор состоит из 23 – 24 аминокислот. Эта структура, повторяемая во многих белках эукариот, осуществляет белковые взаимодействия, т.е. служит рецептором, связывающимся с лигандом – белковым элиситором патогена. LRR-структура имеет большие возможности для генетических реорганизаций вследствие точковых мутаций, делеций, инверсий, вызванных, в частности, описанными выше случаями эктопической рекомбинации, что приводит к изменениям рецепторных свойств молекулы. Экспериментально показано, что мутации, меняющие реакцию на заражение авирулентными расами патогенов, картированы в этой структуре. LRR-область белков Cf9, Cf4, Cf2 и Cf5 томатов имеют сайты, к которым через глюкозильные связи присоединены углеводы, вследствие чего R-белки, обусловливающие устойчивость к C.fulvum, - гликопротеины, и их углеводные остатки также могут обеспечивать связывание лигандов. 2/. Область, обеспечивающая связывание с нуклеотидами (Nucleotide Binded Sites, NBS), состоит из трех доменов: киназы1а - петли, связывающей фосфат (P-петли); киназы2, связывающей ион металла, необходимого для реакции переноса фосфата; и киназы3а, аргинин которой обеспечивает взаимодействие с пуриновым основанием АТФ. NBS – сигнальная область, связывающаяся с АТФ и ГТФ, вследствие чего она может активировать киназы или сигнальные Gбелки. 3/. Область лейциновой «застежки» (Leucine Zipper Region, LZ). Способствует формированию спирализованных структур, обеспечивающих димеризацию или специфическое взаимодействие с другими белками. R-белки, находящиеся в интактной клетке в виде мономеров, при заражении могут с участием LZ-области формировать гомодимеры или олигомеры, взаимодействующие с элиситором, или, наоборот, при заражении происходит диссоциация ранее имевшихся олигомеров. Возможна также гетеродимеризация R-белка с другими белками. 4/. Область гомологии с цитоплазматическим доменом Toll-белка дрозофилы и рецептором интерлейкина-1 млекопитающих, названная TIR (Toll/Interleukin-1 Resistance). Рецепторный белок Toll контролирует дорзо-вентральную поляризацию эмбрионов дрозофилы, а также играет роль в ядерной локализации фактора Dif (dorsal related immunity factor), который активирует защитные свойства жирового тела. Интерлейкин-1 – один из важнейших цитокинов (межклеточных передатчиков сигналов), активирующих иммунные клетки млекопитающих, благодаря взаимодействию с находящимися на поверхности клеток рецепторами. Связывание обоих рецепторных белков сопровождается активизацией серин/треониновых киназ. Возможно, TIR-область растительных R-белков несет сходные функции. 5/. Отчетливыми сигнальными свойствами обладают серин/треониновая протеинкназа (РК), обнаруженная у некоторых R-белков. Она является фактором активации транскрипции и одновременно активатором других сигнальных путей. В зависимости от комбинации этих областей в молекуле R-белки можно разделить на несколько групп (табл. 29). R-белки, отнесенные в первую группу, имеют внеклеточный LRRгликопротеин, заякоренный в мембране С-концом молекулы. Как вытекает из описанного выше, эти белки могут быть рецепторами, связывающими элиситор (мембранная локализация LRR-области), но неспособны выполнять функции передачи сигнала. Возможно эти белки ассоциированы с мембранными протеинкиназами или же их короткий цитоплазматический N-концевой домен сам может взаимодействовать с протеинкиназой. Таблица 29. Группировка R-белков растений, основанная на их строении Области Группа 1 Группа 2 Группа 3 группа 4 группа 5 белка LRR + + + + NBS + + LZ + TIR + PK + + Примеры Cf2,Cf4,Cf5 Pto (томат Xa-21 (рис RPS2 (Ara- N (N. R-белков ,Cf9 (томат – Р. – X. oryzae bidopsis – Sylvestris – – С.fulvum) savastanoi pv. oryzae) P. ВТМ); savastanoi L6, M (лен pv.tomato); – M.lini); RPM1(Ara- RPPS bidopsis – (Arabidop- P.s. pv. sis (Pero- maculicola) nospora l2 (томат – parasitica) pv.tomato) F.oxysporum f. sp. lycopersici) Mi-1 (томат – галловая нематода) Продукт гена Pto, напротив, являясь внутриклеточной серин/ треониновой протеинкиназой, неспособен к выполнению рецепторных функций, т.е. постулированная двухдоменная структура R-белков у томата как бы разделена между белками – факторами устойчивости к двум паразитам. Однако трансформация дрожжевого генома генами Pto и AvrPto показала, что их продукты после автофосфорилирования Pto-белка могут непосредственно взаимодействовать. Для изучение эффекта суперпродукции Pto-белка кодирующий ген был трансформирован в геном томата. В результате такой манипуляции палисадные клетки мезофилла некротизировались с аккумуляцией салициловой кислоты, PR-белков, отложением каллозы, лигнификацией клеточных стенок, т.е. метаболическими измененииями характерными для СВЧ. Растения стали устойчивым к вирулентным расам Pseudomonas savastanoi pv. tomato, Xanthomonas vesicatoria и Cladosporium fulvum, т.е. приобрели неспецифическую устойчивость. Таким образом, перепродукция внутриклеточной протеинкиназы – фактор трансформации специфической устойчивости в неспецифическую. С геном Pto сцеплен ген Prf. Его продукт имеет области LRR, NBS и ZIP (как белки группы 4), а также длинную область с двумя прямыми повторами, негомологичную известным белкам. Возможно действие в клетке белков Pto и Prf скоординировано. R-белок риса Xa-21 имеет все необходимое для соответствия описанной выше модели (рис. 39). Наружу выдвинута рецепторная LRR-область, а внутри клетки находится участок, имеющий структуру серин/треониновой протеинкназы и способный к внутриклеточной трандукции сигнала. R-белки из групп 4 и 5 имеют рецепторные области и сайты трансдукции сигнала, но внутриклеточная локализация этих белков не соответствует ранее высказанным гипотезам о мембранном расположении рецепторов. Для вирусов, белки которых синтезируются внутри хозяйских клеток, эндоцитная локализация R-генов (в частности, продукта N-гена) естественна. Бактериальные элиситоры могут проходить внутрь растительной клетки с помощью харпинов (рис. 37). Механизмы взаимодействия большинства грибных элиситоров с внутриклеточными рецепторами не ясны. Например, элиситорные avr-белки Cladosporium fulvum связываются с клетками и протопластами, как устойчивых, так и восприимчивых линий томата. Следовательно, у томата имеется неспецифический элиситор, связывающий внеклеточные белки патогена без индукции СВЧ. Полагают (Joosten, de Wit, 1999), что активизация клеточного сигнала происходит после взаимодействия элиситора с гетеродимером, состоящим из R-белка и неспецифического рецептора или, что более вероятно, из R-белка и протеинкиназы (с плазматической мембраной связаны несколько типов киназ). Общая схема взаимодействия продуктов Avr и R-генов представлена на рис. 39 и 40. Из представленного выше материала можно сделать несколько важных выводов. 1. Гипотетическая структура R-белков, предложенная на основании изучения феноменологии взаимоотношений растений и паразитов (модель Альберсхейма и др.) оказалась частным случаем, и не соответствует большинству исследованных белков. 2. Большинство исследованных R-белков составлены комбинацией нескольких сходных блоков; их структура не отражает таксономических связей как между растениями, так и между паразитами. Гомологичные R-белки описаны у растений, принадлежащих к разных порядкам; они придают специфическую устойчивость к вирусам, бактериям, грибам, нематодам. Это говорит о том, что, во-первых, они возникли давно, до расхождения растений по современным таксонам, и, во-вторых, они первично выполняли не защитные, а иные внутриклеточные функции. Показано, например, что внеклеточный LRRучасток белка Ха-21 риса подобен продуктам генов erecta и clavata арабидопсиса, которые определяют форму и размеры цветков. Белок Pto томата гомологичен цитоплазматическому домену продукта гена гаметофитной несовместимости капусты SRK. Экспрессия другого гена из семейства S-генов самонесовместимости капусты, SFR2, также кодирующий синтез рецепторной протеинкиназы, резко усиливается при поранении и инфильтрации фитопатогенных или сапротрофных бактерий, т.е. наряду с предотвращением самоопыления имеет и функции защиты от инфекции. 3. На молекулярном уровне подтверждены данные о кластерном расположении генов устойчивости. Каждый исследованный ген (Cf, М, N, Pto, Xa-21 и др.) представляет собой сложный локус, кодирующий несколько структурно сходных или идентичных белков. Такая структура возникла, по-видимому, вследствие описанных выше (рис 38) явлений рекомбинации (неравного кроссинговера и др.), обусловленных наличием внутри или по краям генов прямых и обратных повторов. Например, локусы Cf4 и Cf9 томата состоят из тандемно дуплицированных генов, однако, наряду с функционально активными последовательностями (Cf4 и Cf5) имеются гомологичные им, но не вызывающие СВЧ гены, названные Hcr (homologues Cladosporium resistance). Опыты с транспозонным мутагенезом показали, что инактивация некоторых Hcr-генов приводит к потере устойчивости по отношению к отдельным штаммам C.fulvum, которые, следовательно, продуцируют в растении специфичные для Hcr-продуктов белки. Рекомбинация в локусе устойчивости кукурузы к ржавчине Rp1 сопровождается появлением новых устойчивых фенотипов. Большую роль в увеличении генетического разнообразия семейств генов устойчивости могут играть разрывы кодирующей части ДНК, вызванные внедрением мобильных элементов. Например, в локусе риса Ха21 идентфицированы транспозоны Truncator и Retrofit, способные вызывать разрывы генов и образование самостоятельных рамок считывания. Белок Xa21 (группа 3, табл. 29) сочетает свойства R-белков томата из групп 1 (мембранный рецептор) и 2 (протеинкиназа). Возможно, возникновение генов Cf9 и Pto обусловлено разрывом предшественника, подобного гену Ха21. Наконец, причинами образования семейств генов могут быть дупликации с последующим возникновением структурных и даже функциональных различий. Так, повидимому, возникло семейство Pto генов томата, включающее FEN-гены, которые определяют чувствительность к инсектициду фентиону, а не устойчивость к бактерии. Подобно множественным генам иммуноглобулинов у млекопитающих, такая структура способна быстро реагировать на возникновение новых вирулентных видов и рас паразитов. ТРАНСДУКЦИЯ СИГНАЛА Клетки многоклеточного организма способны поддерживать свой гомеостаз, благодаря свойству избирательно узнавать внеклеточные вещества. Это могут быть элиситоры и гормоны, медиаторы клеточного метаболизма, белки и пептиды, а также низкомолекулярные метаболиты, Процесс узнавания осуществляется с помощью, так называемых, «сигнальных систем», которые определяют реакцию клеток на различные химические и физические воздействия. Сигнальные системы растений в настоящее время подлежат интенсивному изучению. В России приоритетные исследования в этом направлении принадлежит школе академика РАН И.А.Тарчевского. Установлено, что патогенные микроорганизмы или их элиситоры индуцируют в растительной клетке каскад ответных защитных реакций задолго до того, как устойчивость или восприимчивость проявляется в полной мере. Более того, сигнальные системы определяют раннее течение ответных реакций растений, приводящих либо к совместимому, либо несовместимому взаимодействию с инфекцией. Задачей таких систем является передача и умножение сигнала, исходящего от патогена или его элиситора. Сигнальные системы, функционирующие внутри клетки, начинаются с контакта патогена или его элиситора с рецептором, чаще всего находящимся на цитоплазматической мембране, и завершаются защитным ответом растительной клетки. Большинство элиситоров связываются с внешним участком рецепторов, локализующихся на плазмалемме, что вызывает автофосфорилирование и изменение конформации рецепторов. После этого остаток фосфорной кислоты передается на внутренний участок рецептора, активируя ассоциированный с рецептором фермент. Как показано в предыдущем разделе, многие R-белки не связаны с мембраной, позтому специфические элиситоры могут войти в контакт с ними только с помощью каких-либо механизмов (hrp-белков бактерий, как компоненты вирусных частиц). Для рецепции элиситоров, по-видимому, необходима предвартельная димеризация или гетеромеризация LRR-области R-белка. На рис. 40 показана вероятная схема рецепции. Рецептор, вне зависимости от природы связывающегося с ним эффектора, имеет общий план строения: участок, расположенный вне клетки, внутримембранный участок и участок, погруженный в цитоплазму. Внешний и внутренний участки рецептора являются вариабельными, его срединная часть константной. Внешний N-конец рецептора специфичен к элиситору, тогда как внутренний С-конец - к ассоциированному с рецептором ферменту. Последнее и определяет, с какой из сигнальных систем будет осуществляться взаимодействие. На пути распространения сигналов функционируют десятки различных протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз, которые регулируют степень фосфорилирования белков и тем самым их активность. В организмах вообще широко распространено избирательное фосфорилирование в белках свободных боковых ОН-групп остатков серина, треонина или тирозина. Оно и осуществляется протеинкиназами, использующими АТФ в качестве доноров фосфата. В зависимости от вида белка его функциональная активность в результате фосфорилирования либо повышается, либо понижается. Активность протеинкиназ, в свою очередь, регулируется с помощью универсальных внутриклеточных мессенджеров (переносчиков). Фосфорилирование белков обратимо, поскольку в цитозоле присутствуют многочисленные фосфопротеинфосфатазы, которые отщепляют фосфат от фосфорилированного фермента (белка), в результате чего его активность возвращается к первоначальному уровню. Особую роль в сигнальных системах играет регулирование фосфорилированием-дефосфорилированием ядерных факторов регуляции транскрипции, которые взаимодействуют с промоторными участками генов, разрешающими или запрещающими их экспрессию. Предполагается, что факторы регуляции транскрипции имеют несколько мест фосфорилирования у остатков аминокислот, способных присоединять ортофосфат под действием « своих» видов протеикиназ, что и определяет специфику активации факторов транскрипции. Необходимым условием активации факторов регуляции транскрипции является их полимеризация и связывание с ДНК в олигомерной форме. В Rбелках для этой цели служит область LZ. Переход в мономерные формы зависит от процессов дефосфорилирования. К числу основных сигнальнных систем, известных к настоящему времени относятся: циклоаденилатная, Са+2-фосфоинозитольная, липоксигеназная, НАДФН-оксидазная (супероксидсинтазная), NО-синтазная. Кроме перечисленных существует еще МАР-киназная система (mitogen aktivated protein kinase), регулирующая деление клеток, и фосфатидилкислотная, которая начинается с освобождения из состава фосфолипидов фосфатидной кислоты, способной активировать протеинкиназу. В циклоаденилатной, МАР-киназной, Са+2-фосфоинозитольной, липоксигеназной и фосфатидилкислотной системах роль промежуточного звена между цитоплазматической частью рецептора и первым активируемым ферментом играет комплекс G-белков. G-белки Многие из известных на сегодняшний день вторичных мессенджеров действуют при посредстве ключевых молекул особого класса, называемых Gбелками, которые и направляют поток сигналов от рецептора внутрь клетки. Эти, принимающие участие в передаче сигналов белки, регулируются гуаниловыми нуклеотидами, откуда и их название G-белки. Команды элиситоров, гормонов и других эффекторов передаются различными рецепторами путем стимуляции того или иного G-белка. С начала 80-х годов обнаружено более 100 рецепторов, передающих сигналы через G-белки. Идентифицирован ряд эффекторов, зависящих от этих белков. G-белки, принимающие участие в трансмембранной передаче сигналов, располагаются на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Их молекулы состоят из 3 субъединиц - полипептидных цепей, называемых от большей к меньшей α,β и γ. Во всех выделенных к настоящему времени Gбелках α-субъединица специфична, тогда как β и γ могут не различаться. В состоянии покоя α,β и γ субъединицы образуют комплекс, в котором α-субъединица связана с гуанозиндифосфатом (ГДФ). После того как элиситор или другой первичный эффектор присоединяется к рецептору, конформация последнего изменяется и он связывается с G-белком. В результате связывания α-субъединица освобождает ГДФ. Освободившееся место сразу же занимает гунозинтрифосфат ( ГТФ ), концентрация которого в клетке достаточно высока.. В результате связывания с ГТФ α-субъединица активируется. Связавшаяся с ГТФ α-субъединица, отделяется от β и γ субъединиц и путем диффузии перемещается по внутренней поверхности цитоплазматической мембраны, пока не свяжется с эффектором, к примеру аденилатциклазой, Через несколько секунд α-субъединица гидролизует ГТФ до ГДФ, инактивируется, отъединяется от эффектора и вновь связывается со свободными β и γ - субъединицами. Таким образом, G-белки служат переключателями или таймерами, определяющими, когда и как долго сигнальные пути бывают включены или выключены. Включение происходит, когда связанная с ГТФ α-субъединица присоединяется в эффектору, а выключение, когда ГТФ гидролизуется до ГДФ. Таким образом, продолжительность «включенного» или « выключенного» состояния определяется скоростью гидролиза ГТФ. G-белки обладают также способностью усиливать сигналы. Так, одна α-субъединица, связываясь с молекулой аденилатциклазы, может стимулировать синтез многих молекул циклического аденозинмонофосфата, прежде чем истечет время « включенного» состояния и ГТФ превратится в ГДФ. Таким образом, клеточная мембрана представляет собой как бы панель переключения для множества разнообразных сигналов, поступающих извне. На ней происходит оценка их относительной силы, суммирование и передача сигналов вторичным мессенджерам, специфика которых уже определяет ответ клетки на изменение внешней среды. Циклоаденилатная сигнальная система Многие химические медиаторы действуют путем активирования аденилатциклазы, в результате чего из аденозинтрифосфата (АТФ) образуется циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) (рис. 41). При этом два реакционноспособных концевых фосфата АТФ легко гидролизуются, а энергия, высвобождающаяся при гидролизе одной или обеих высокоэнергетических фосфатных групп, может использоваться для биосинтетических процессов, протекающих с затратой энергии. цАМФ регулирует внутриклеточные процессы у многих исследованных органзмов. Под действием внешнего стимула концентрация цАМФ может в течение несколько секунд увеличиваться в десятки раз. Аденилатциклаза, с помощью которой синтезируется цАМФ, связана с цитоплазматической мембраной. Под действием фосфодиэстеразы цАМФ расщепляется до аденозин-5,-монофосфата. Включение аденилатциклазной сигнальной системы осуществляется в результате взаимодействия элиситора с рецептором и активацией аденилатциклазы. Повышенное содержание цАМФ приводит к активации цАМФ-зависимых протеинкиназ и, как следствие, к фосфорилированию различных белков, в том числе и факторов регуляции транскрипции и экспрессии защитных генов. Установлено, что с функционированием циклоаденилатной сигнальной системы связана индукция устойчивости многих растений. В растениях обнаружена низкая концентрация цАМФ, что порождает сомнения в ее функционировании. Однако использование ингибиторов фосфодиэстеразы, превращающей цАМФ в нециклическую форму, показало, что малая концентрация цАМФ вызвана ее интенсивным превращением в неактивную форму. Са-фосфоинозитольная сигнальная система В эукариотах основные виды фосфолипидов, такие как фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозитол могут быть в 4-х местах гидролизованы фосфолипазами, обладающими А1,А2, С и D активностью (рис. 42). Для настоящего раздела наиболее интересна фосфолипаза С, которая специфична для фосфоинозитидов. В ряде случае установлено, что на самых ранних стадиях СВЧ- ответа активируется именно фосфолипаза С, тогда как другие фосфолипазы начинают действовать лишь спустя несколько часов. Фосфатидилинозитол под действием киназы превращается в фосфатидилинозитолдифосфат (рис. 42). Последний под влиянием фосфолипазы С разлагается на растворимый инозитолтрифосфат ( IP3) и мембраносвязанный диацилглицерин (DAG). DAG активирует протеинкиназу С и далее через каскад фосфорилирования белков приводит к экспрессии защитных генов. В свою очередь IP3 открывает кальциевые каналы цитоплазматической сети и тонопласта, в которых концентрация Са+2 на три порядка превосходит цитоплазматическую. В результате Са+2 выходит в цитозоль, где активирует различные Са+2-зависимые ферменты, в том числе Са+2-зависимую протеинкиназу. Каналы открываются лишь на короткое время и вошедший в цитозоль кальций или быстро откачивается оттуда, или связывается внутриклеточными молекулами. Ион кальция, подобно цАМФ, является важным внутриклеточным регулятором и служит вторичным посредником для некоторых внеклеточных сигнальных систем. Второй возможностью регулирования содержания Са+2 служит Са+2связывающий белок кальмодулин, который обнаружен во всех до сих пор изученных клетках животных и растений. Этот вездесущий внутриклеточный рецептор ионов кальция, участвует в большинстве регуляторных процессов в эукариотических клетках. У растений имеется много изоформ кальмодулина, одни из которых активируют, тогда как другие ингибируют Са+2-кальмодулинзависимую реакцию. Концентрация той или иной изоформы кальмодулина может активировать или ингибировать ферменты различных сигнальных систем, Интенсивность экспрессии разных изоформ кальмодулина может быть различной, что определяется включением той или иной сигнальной системы. Так, например, разница в степени активации аденилатциклазы и фосфодиэстеразы зависит от концентрации комплекса Са+2-кальмодулин. Ионы Са+2 и кальмодулина влияют на степень фосфорилирования различных белков. Са+2-кальмодулин может активировать и протеинкиназы, и фосфопротеинфосфатазы. Са+2-зависимые протеинкиназы способны фосфорилировать и тем самым активировать белковый фактор регуляции транскрипции и экспрессию защитных генов. Липоксигеназная сигнальная система Для клеток растений (в отличие от животных) характерно высокое содержание ненасыщенных жирных кислот С-18 ряда (линолевой и линоленовой), которые окисляются липоксигеназой (ЛОГ). В литературе для описания всех оксигенированных продуктов липоксигеназного пути окисления жирных кислот растений используются два названия: октадеканоиды и оксилипины. Поскольку не все продукты липоксигеназного окисления в растениях являются С18-соединениями, исследователи, работающие в области липоксигеназного метаболизма, чаще используют термин оксилипины (Тарчевский, Гречкин, 1998 ) Ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав фосфолипидов мембран, освобождаются с помощью фосфолипазы А2 (рис. 43), которая активируется многими элиситорами, фитогормонами, а также биогенными и абиогенными стрессорами. Здесь главная роль принадлежит линолевой и особенно линоленовой кислотам, которые являются субстратами ЛОГ, присоединяющей молекулярный кислород по местам, находящимся вблизи двойных связей. В результате происходит образование гидропероксильных производных. По названию ЛОГ и получила наименование одна из важнейших сигнальных систем растительных клеток – липоксигеназная. Обнаружено, что субстратами ЛОГ могут быть не только свободные, но и находящиеся в составе триглицеридов ненасыщенные жирные кислоты, в результате чего ускоряется течение липоксигеназного сигнального пути. Под влиянием различных эффекторов происходит активация ЛОГ, причем наиболее активно реагирует на стрессы 13-ЛОГ, присоединяющая кислород по 13 углеродному атому (рис. 44). Важную роль в липоксигеназном метаболизме играют также 9-ЛОГ и гидропероксидлиазы растений, которые катализируют превращение 9-гидропероксилиноленовой кислоты в С9углеродные соединения - нонадиенали. К числу физиологически активных соединений, образующихся при помощи гидропероксидлиазы, относится травматиновая кислота и травматин. Они способны индуцировать деление клеток и образование каллуса в местах механического повреждения. При действии гидропероксидлиазы из 13гидропероксилиноленовой кислоты уже через 15 секунд после механического поврежедения листа образуются С6-альдегиды - гексинали. Алленоксидсинтаза (ранее называемая гидропероксидегидразой) - один из наиболее важных ферментов гидроперекисей жирных кислот. Этот фермент дегидратирует гидроперекиси с образованием окисей аллена. Последний, наряду с гидролизом, претерпевает циклизацию с образованием 12оксофитодиеновой кислоты. В результате восстановления двойной связи в цикле и β-окисления это соединение превращается в жасмоновую кислоту (ЖАК) и ее метиловый эфир (Ме-ЖАК). Биотические и абиотические стрессоры вызывают сильную активацию липоксигеназного пути. При этом повышается содержание, как свободных жирных кислот, так и их производных. Причина повышения содержания оксилипидов заключается в активации ферментов различными стрессорами, особенно катализирующими начальные этапы липоксигеназного метаболизма: фосфолипаз и ЛОГ. Различные стрессоры и связанные с их действием сигнальные молекулы могут вызвать экспрессию генов ЛОГ (особенно 13-ЛОГ). К их числу относятся многие патогены и элиситоры, системин, хитозан, олигогалактурониды, салициловая кислота (СК), жасмонаты, абсцизовая кислота, механические повреждения, водный стресс, высокая температура, ультрафиолетовый свет. Многие гидроперокси- и гидроксипроизводные линолевой и линоленовой кислот обладают высокой фунгицидной активностью. Первичную химическую защиту раневой поверхности растений обеспечивают гексинали, которые являются активными антимикробными агентами. Нонадиенали таже обладают бактерицидными и фунгицидными свойствами. Особая роль в устойчивости растений играет ЖАК. Взаимодействие карбоксильной группы ЖАК с аминокислотами приводит к синтезу различных конъюгатов. Жасмонаты часто рассматриваются как стрессовые фитогормоны. Ме-ЖАК является высокоактивным сигнальным соединением, которое во многих случаях опосредует действие того или иного стрессора. Пары Ме-ЖАК модулируют активность ферментов липоксигеназного пути, активируют 13-, но не 9-гидропероксидлиазу, что приводит к усилению продукции бактерицидных и фунгицидных гексиналей. Иными словами Ме-ЖАК может не только активировать липоксигеназную систему, но и изменять направленность ее функционирования. Освобождающиеся под действием фосфолипазы А2 свободные ненасыщенные жирные кислоты могут самостоятельно активировать протеинкиназы или же с помощью ЛОГ присоединять кислород и превращаться в гидроперокси-производные. Последние в ходе лиазных, пероксигеназных, аленоксидциклазных реакций образуют токсические для микроорганизмов (гексинали и нонадиенали) и нелетучие (гидрокси- и эпоксипроизводные) соединения, а также циклические фитодиеновую и жасмоновую кислоты, которые могут вызвать при участии протеинкиназ экспрессию защитных генов. В настоящее время имеется достаточно информации, чтобы считать липоксигеназный путь превращения мембранных липидов самостоятельной сигнальной системой. НАДФН-оксидазная (супероксидсинтазная) сигнальная система Среди факторов внешней среды, воздействующих на организм, особое внимание принадлежит так называемому окислительному взрыву. Повышенная концентрация активных форм кислорода (АФК) регистрируется в клетках животных и человека при ряде важнейших воздействий: радиации, пестицидов, многих лекарственных препаратов, промышленных отходов, при ишемии, канцерогенезе, катаракте, диабете и, наконец, при попадании бактерии внутрь фагосомы иммунной клетки. Окислительный взрыв наиболее яркая составляющая инфекционного процесса. Генерирование активированных форм кислорода - один из факторов защиты, применяемых клетками иммунной системы теплокровных в борьбе с инфекцией. Предполагается, что Свободно-радикальные процессы грают важную роль среди механизмов старения и апоптоза (запрограммированной гибели клеток). К числу основных форм активированного кислорода принадлежат супероксидный анион (О2-), гидроксильный радикал (. ОН) и перекись водорода (Н2О2). Супероксидный анион представляет собой свободный радикал и образуется при одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода: О2 + е- → О2Супероксид образуется при взаимодействии молекул кислорода с НАДФН-оксидазной системой, а также с восстановленными флавинами, хинонами, тиолами, и в ходе реакции, катализируемой флавин-содержащим ферментом ксантиноксидазой. Супероксид-радикал и образующиеся из него другие формы активированного кислорода, вызывают перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот, окисление SН-групп, разрушение триптофановых остатков в белках, повреждение ДНК, деполимеризацию кислых полисахаридов и другие реакции. Самым сильным окислителем, вызывающим разрушение биополимеров клетки, является гидроксильный радикал. Он превосходит супероксид-анион по окислительной активности, но уступает ему в стабильности (время жизни гидроксильного радикала всего лишь 10-9 секунд, тогда как супероксиданиона 10-3 секунды). Гидроксильный радикал образуется при взаимодействии супероксида с перекисью водорода: О2- + Н2О2 + Н+→ О2 + Н2О + .ОН Перенесение второго электрона на молекулярный кислород приводит к образованию третьего инградиента АФК - перекиси водорода: О2 + 2е-→ О 22- О2 + 2Н+ + 2е → Н2О2 Однако, в большинстве случаев Н2О2 возникает при взаимодействии супероксидных радкалов между собой (реакции дисмутации): 2Н+ + 2О- → Н2О2 + О2 Перекись водорода вызывает окисление SН-групп в белках, перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот, однако скорость этих реакций относительно невелика, и главная опасность перекиси водорода для клетки заключается в ее способности генерировать гидроксильный радикал. АФК способны взаимопревращаться. Их часто рассматривают в комплексе. Открытие противоинфекционной функции АФК у животных заставило ученых искать аналогии в мире растений. В России данное направление служит предметом исследования А.А. Аверьянова. В нормально функционирующей растительной клетке существует баланс между активацией и дезактивацией кислорода, поэтому количество его активных форм остается на безопасном уровне. Однако структурные и функциональные нарушения растительных тканей, как правило, ведут к активации кислорода. Существующий в норме баланс между образованием и уничтожением АФК может нарушаться при самых разнообразных патологических состояниях растений. Поскольку активация кислорода является одним из самых ранних ответов растительной клетки, не исключено, что именно АФК принадлежит важная роль в подавлении развития патогенов. Так, при СВЧ-реакции происходит выход фенолов из вакуолей и их ферментативное окисление. А так как этот процесс сопровождается генерацией активированного кислорода в токсических концентрациях, возможно, что именно он служит причиной гибели и хозяина, и внедрившегося в него патогена. Установлено, что генерация супероксид-аниона в устойчивом хозяине локализована именно вокруг внедрившихся гиф. Следовательно, в ответ на инокуляцию в устойчивом, а не в восприимчивом растении усиливается активация кислорода в нужном месте и в нужное время, причем эта активация носит системный характер. Если ранее роль АФК рассматривали только как источник высокотоксичных, хотя и коротко живущих соединений, которые ингибирующим образом воздействуют на паразита, то к настоящему времени вырисовывается еще одна не менее существенная функция АФК - их участие в супероксидсинтазной сигнальной системе. Предполагается, что при окислении молекулярным кислородом НАДФН, локализованного в цитоплазматической мембране, образуется радикал супероксид анион, который в результате реакции, катализируемой супероксиддисмутазой, превращается в перекись водорода. Предполагается, что супероксид анион и перекись водорода являются вторичными мессенджерами в супероксидсинтазной сигнальной системе. Перекись водорода вызывает активацию факторов регуляции транскрипции и, как следствие, экспрессию защитных генов. Исключительно важную роль в этой сигнальной системе играет салициловая кислота (СК), концентрация которой многократно повышается не только в местах инфицирования, но и в тканях, удаленных от места инфекции. Поскольку СК связывает каталазу, разлагающую перекись водорода, то количество последней еще более возрастает, Имеются данные о существовании протеинкиназ, непосредственно активируемых салицилатами, что может объяснить экспрессию защитных генов как СК, так и перекисью водорода. NО-синтазная сигнальная система Оксид азота или нитроксид (NО) образуется из L-аргинина с помощью NО-синтазы. Субстратами этой реакции являются аргинин. НАДФН и молекулярный кислород. Продуктами – NО, цитруллин и НАДФ. L-аргинин + НАДФН + О2 → цитруллин + NО + НАДФ+ Радикал NО является важнейшим нейромедиатором, интермедиатом иммунной системы и регулятором сердечно-сосудистой системы человека. В животном организме NО работает как передатчик нервных импульсов в перефирической и центральной нервной системе. Как уже упоминалось, одним из наиболее быстрых защитных ответов растений на инвазию патогенами служит окислительный взрыв, который приводит к образованию АФК. Продуктом окислительного взрыва является супероксидный радкал, который один не может приводить клетки к СВЧгибели, поскольку имеет слишком короткое время жизни. Перекись водорода, в которую затем превращается супероксид, токсична только в относительно высоких концентрациях и поэтому также вряд ли может быть причиной СВЧ. Отсюда становится ясным, что в растительных клетках наряду с АФК должен существовать некий сопутствующий фактор, усиливающий их действие. Так, в макрофагах млекопитающих с АФК сотрудничает оксид азота, убивающий бактериальные клетки. Предполагается, что и в растениях наряду с АФК действует NО, вызывая транскрипционную активацию защитных генов и реакцию СВЧ. Это тем более вероятно, что у растений обнаружена Сазависимая NО-синтаза, локализованная в цитозольной фракции. Взаимодействие АФК и NО является синергическим, поскольку в СВЧреакции количество оксида азота возрастает в десятки раз. Ингибиторы синтеза NО уменьшали СВЧ-ответ в листьях арабидопсиса, инфицированного Pseudomonas siringae и тем самым способствовали распространению болезни. Наоборот, обработка суспензии клеток сои Nа-нитропруссидом, который не вызывает СВЧ-ответа, но является донором NО, приводит к СВЧ-реакции. NО-синтаза активируется только в устойчивых, но не в восприимчивых листьях табака в ответ на ВТМ. В этих же листьях обнаруживается большое количество NО. Инъекция в листья табака NО-синтазы животных, ее субстрата и кофакторов приводит к транскрипции защитного гена PR-1. Оксид азота синергически взаимодействует с эндогенным фактором, зависящим от cалициловой кислоты (СК). Накопление СК в инфицированной ткани инактивирует каталазу и тем самым увеличивает количество перекиси водорода, который усиливает окислительный взрыв, а последний, в свою очередь, увеличивает синтез СК. Возможно, поэтому СК называют «сигнальным усилителем». NО реагирует с супероксидом кислорода, образуя пероксинитрил (ОNОО) - чрезвычайно токсическое соединение, ингибирующее патогенов. В дальнейшем из пероксинитрила образуется гидроксильный радкал, который еще более увеличивает токсичность. В результате повышения концентрации NО активируется гуанилатциклаза, катализирующая превращение ГТФ в цГМФ. Установлено, что цГМФ активирует протеинкиназу или непосредственно, или с помощью более длинного сигнального пути, включающего циклическую форму аденозиндифосфатрибозы ( цАДФРибоза ). Последняя открывает Са-каналы внутриклеточных Са-депо, в результате чего повышается концентрация кальция в цитозоле, активируются Са-зависимые протеинкиназы, фосфорилируется белковый фактор регуляции транскрипции и начинается синтез защитных белков. Заключение На рис. 45 приводится суммарная схема всех перечисленных сигнальных систем растительной клетки, составленная И.А. Тарчевским и В.М. Черновым (1998). Предполагается, что отдельные сигнальные системы могут функционировать как независимо, так и интегрированно друг с другом, Имеется достаточное количество фактов о возможности активации или наоборот, инактивации одних сигнальных систем вторичными мессенджерами других. Интеграция возможна для большинства сигнальных систем, кроме NО-системы, которая не только не стимулирует, но наоборот, подавляет другие системы. Контакт патогена с растением приводит к возникновению не одного, а нескольких потоков первичных сигналов, причем, по-видимому, преобладание той или иной сигнальной системы зависит от структуры рецептора. Как показано выше, у арабидопсиса обнаружены два типа R-белков: LRR-NB-LZ (группа 4 в табл. 29) и LRR-NB-TIR (группа 5). Гены, относящеся к группе 4, передают сигнал на ген NDR1, который контролирует мелкий мембранный белок. Гены из группы 5 передают сигнал на ген EDS1, продукт которого гомологичен липазе. Мутации гена EDS1 не влияют на сигнальный путь, связанный с дериватами липооксигеназы и жасмоновой кислотой, но вызывают ингибирование пути, связанного с синтезом салициловой кислоты и фенилпопаноидов (Falk et al., 1999). Таким образом, структура TIR в R-белках существенна для индукции синтеза фенолов. Кроме того, чем продолжительнее взаимодействие растения и патогена, тем более расширяется набор сигнальных систем. Это может приводить к одновременному функционированию большого числа сигнальных систем клеток. По мнению И.А. Тарчевского, именно этим можно объяснить феномен неспецифического суммарного ответа растений на инфицирование различными патогенами или их элиситорами. Не всегда фактор регуляции транскрипции может активироваться только одним видом сигнальной системы, для этого необходимо участие нескольких сигнальных систем. Возможно, что каждая из этих систем определяет фосфорилирование своего остатка аминокислоты фактора регуляции транскрипции, что в совокупности приводит к экспрессии нескольких защитных генов. Таким образом, в клетках растений существует скоординированная сигнальная цепь, в которой одни сигнальные системы могут активировать или, наоборот, ин’активировать другие. Одной из особенностей сигнальных систем является не только передача сигнала на генетический аппарат, но и его значительное усиление. Это особенно хорошо иллюстрируется на примере циклоаденилатной системы, где работает схема сцепленных шестеренок, в результате чего предыдущее звено сигнальной системы не превращается в последующее, но активирует его, многократно усиливая сигнал. Таким образом, взаимодействие одной сигнальной молекулы с рецептором может приводить к миллиону молекул, определяющих ответную реакцию клеток. Все известные к настоящему времени сигнальные системы можно разделить на эволюционно более ранние и поздние (Тарчевский, 1998). Так, циклоаденилатная и Са-фосфоинозитольная сигнальные системы являются эволюционно более старыми, так как не используют для своего функционирования молекулярный кислород. Наоборот, для липоксигеназной, супероксидсинтазной и NО-синтазной систем кислород необходим. Вполне вероятно, что усилия исследователей, работающих в области трансдукции сигнала в растениях, приведут к открытию как новых сигнальных систем, так и их взаимодействия. ГЛАВА 7. ИММУННЫЙ ОТВЕТ После взаимодействия вторичных мессенжеров с геномом зараженной клетки происходит изменение его активности: зкспрессия некоторых генов оказывается подавленной, других – резко активизированной. В результате в клетке накапливаются новые продукты (стрессовые метаболиты), причем многие из них оказываются токсичными для патогенов. Об этих продуктах и будет идти речь в настоящей главе. ФИТОАЛЕКСИНЫ Честь открытия фитоалексинов (ФА) принадлежит немецким фитопатологам Мюллеру и Боргеру (1940). Согласно их определению, ФА являются антибиотиками растительного происхождения, которые синтезируются в растениях de novo в ответ на микробную инфекцию и участвуют в механизмах болезнеустойчивости растений. Иное определение ФА дает американский фитопатолог Дж.Kуч (1995), который полагает, что ФА - это низкомолекулярные антимикробные вещества, которые накапливаются в растениях в ответ на инфекцию или стресс. Быстрота и количество их накопления в растении определяется освобождением их (или их близких предшественников) из коньюгатов или синтезом de novo, также как и деградацией ферментами растений и микроорганизмов. Долгое время ФА рассматривались как главный механизм устойчивости растений. Однако в настоящий период помимо ФА в растениях обнаружены и другие защитные ингредиенты: такие как PR-белки, ингибиторы протеиназ, активные формы кислорода, богатые оксипролином гликопротеины, механические барьеры на пути инфекции и другие иммунные ответы. Это, конечно, не означает, что ФА утеряли свою значимость, однако их уже следует рассматривать на фоне мультикомпонентного ответа растительной клетки, Работы Mюллера по меньшей мере совершили переворот в фитопатологии. Он установил, что устойчивость картофеля к Phytophthora infestans основывается на образовании растением фунгитоксических соединений. В восприимчивой комбинации хозяина и паразита образование этих соединений было подавлено. Токсические соединения при устойчивом взаимодействии образуются вскоре после инфицирования. Предварительное заражение картофеля несовместимой расой гриба предохраняло растение от последующего заражения совместимой расой. В своих классических исследованиях, на основе которых и было предсказано существование ФА, Мюллер наносил на поверхность среза клубня картофеля суспензию спор несовместимой расы возбудителя фитофтороза в виде креста. Через сутки всю поверхность среза инфицировали совместимой расой того же патогена. Спустя несколько дней на поверхности среза появлялся мицелий гриба кроме участков ткани, предварительно инфицированных несовместимой расой, где развивалась реакция СВЧ. Внешне это выглядело как черный крест некротизированной ткани на белом фоне мицелия гриба. В защищенных тканях ингибировалось не только развитие совместимой расы фитофторы, но и возбудителя фузариоза, а также некоторых других патогенов. В конце пятидесятых годов ХХ в. Mюллер разработал классический метод получения и оценки ФА. В семенные впадины бобов вместо удаленных семян помещали инфекционные капли, содержащие взвесь спор патогена (или непатогена ). Через определенный период времени в инфекционные капли (диффузаты) из тканей растений выделялось фунгитоксическое вещество, которое не образовывалось, если семенные впадины содержали воду. На основании этих опытов ФА были определены как соединения, образующиеся в результате взаимодействия двух метаболических систем хозяина и паразита и ингибирующие развитие последнего. Преимущество данного методического приема заключается в том, что используется неповрежденная ткань, т.е. в каплю не попадают метаболиты, образующиеся при механическом поранении клеток, и отсутствует кутикула, препятствующая взаимному обмену метаболитами между прорастающими спорами паразита и клетками растения. Метод, предложенный Мюллером, вскоре принес ощутимые результаты. В 1960 -1962 годах австралийцы Круикшанк и Перрин изолировали из инфекционных капель гороха ФА, названный пизатином, и идентифицировали его структуру. Вслед за этим был охарактеризован фазеоллин из фасоли, капсидиол из перца (суспензию спор гриба помещали в половинки разрезанных плодов) и другие ФА Идентификация ФА дала толчок для исследования их биосинтеза, деградации, а также участия в устойчивости растений. Удалось установить антигрибное и антибактериальное действие ФА. Список элиситоров, которые способны вызвать образование ФА, весьма велик. Так, более 200 соединений, микроорганизмов и физиологических стрессов могут вызывать накопление пизатина в горохе, фазеоллина и киевитона в фасоли, глициоллина в сое. Возможно, что эти соединения вызывают временное нарушение метаболизма растений, что химически выражается как возникновение сигналов тревоги. Такие сигналы могут инициировать каскад событий, приводящих к синтезу и накоплению ФА. К настоящему времени охарактеризовано около 350 ФА из 30 семейств растений. Их большая часть принадлежит к семейству бобовых (около 130 ФА) Основное число ФА изолировано из двудольных растений, но охарактеризованы и некоторые ФА однодольных: такие как ФА риса, кукурузы, сорго, ячменя, овса, пшеницы, лука и лилий, ФА изолированы из листьев, стеблей, корней и плодов растений, хотя они не всегда представлены во всех органах. ФА являются липофильными соединениями, локализованными вокруг места инфекции. Из-за разнообразия их структуры (рис. 46, 47) трудно судить о единых механизмах их антимикробной активности. Фенилпропаноидные ФА приурочены к растениям семейства бобовых, пасленовых, вьюнковых, зонтичных и злаковых. Известна некоторая структурная специфичность ФА, отражающая таксономическое положение их продуцентов. Так, изофлавоноидные ФА, в основном, сосредоточены в растениях семейства Бобовых, но их нет у Пасленовых, и наоборот, сесквитерпеноидные ФА присущи Пасленовым, но не обнаруживаются у Бобовых. Что касается распределения структур ФА внутри семейств, то норсесквитерпеноидный спирт ришитин обнаружен в картофеле и табаке, но не в перцах, тогда как сесквитерпеноидный ФА капсидиол присутствует в табаке и перцах, но не в картофеле. Образование ФА тесно связано с реакцией СВЧ, поэтому, координируя реакцию СВЧ с целью контроля за болезнями, можно управлять и образованием ФА. Мертвые (некротизированные) клетки, образующиеся в результате реакции СВЧ, несут особую функциональную роль в явлении устойчивости, поскольку они являются резервуарами для накопления ФА. Сами по себе мертвые клетки вряд ли могут остановить развитие патогена, но они являются местом складирования или вместилища ФА. Поэтому, чтобы судить о защитной роли ФА в качестве антигрибного барьера на пути распространения инфекции, надо рассчитывать их количество не на единицу веса инфицированной ткани, где присутствуют как живые, так и погибшие клетки, а на их концентрацию в некротизированных клетках. В таких клетках ФА накапливаются в чрезвычайно высоких антигрибных концентрациях, которые вряд ли могут выдержать живые растительные клетки (Чаленко и др. 1984). Что заставляет перемещаться ФА из живых клеток, где они или их близкие предшественники образуются, в мёртвые, некротизированные, где они накапливаются, не известно. Возможно, накопление ФА в некротизированных клетках определяется еще и тем, что системы деградации ФА в таких клетках подавлены. Иными словами присутствие ФА в мертвых клетках как бы саморегулируется, поскольку ФА в некрозе инактивируют систему их собственной деградации, тем самым, способствуя их накоплению Большую роль в антигрибной активности ФА играет пренилирование. Так, потеря фунгитоксичности в результате гидроксилирования указывает на то, что неполярная боковая цепь играет важную роль в проявлении активности некоторых изофлавоноидных и сесквитерпеноидных ФА. По-видимому, пренилирование происходит на конечных этапах биосинтеза ФА. Главные пути биосинтеза, с помощью которых образуются предшественники ФА всех растений - это шикиматный, ацетатно-малонатный и ацетатно-мевалонантный (рис. 48). Биогенез ФА часто связан с активацией фермента на ключевом этапе биосинтеза. Этот фермент может регулировать ранние этапы биосинтеза, но может участвовать и в конечных этапах. Примером является биосинтез сесквитерпеноидных ФА картофеля. Оксиметилглютарил Со А редуктаза является регуляторным ферментом ранних этапов ацетатномевалонатного пути. Активность этого фермента возрастает, как в механически пораненных, так и в инфицированных клубнях. Но изофермент, образующийся в ответ на разрезание, отличается от соответствующего фермента, возникающего в ответ на инфекцию. В последнем случае возрастает также сесквитерпенциклазная активность, которая катализирует превращение фарнезилпирофосфата в циклический предшественник сесквитерпеноидных ФА. Одновременно уменьшается скваленсинтазная активность, которая приводит к образованию тритерпеноидных стеринов и стероидных гликоалкалоидов. Оба фермента функционируют на этапе разветвления ацетатно-мевалонатного пути. Предшественники некоторых ФА могут образовываться при комбинации от одного до трех биогенетических путей, что представляет дополнительные возможности для регуляции. Например, для синтеза предшественника фазеоллина необходимо участие нескольких путей биогенеза (шикиматного, малонатного). В основном регуляция осуществляется на транскрипционном уровне, поэтому, как видно из представленных в табл.30 данных, ингибиторы транскрипциии (актиномицин) и трансляции (бластицидин) подавляют образование фитоалексина и, соответственно, устойчивость к развитию патогена в зараженных тканях. Таблица 30. Влияние антибиотиков на рост гиф Phytophthora megasperma и накоплениие фитоалексина глицеоллина в ткани сои (Yoshikawa. 1979) Сорт сои / обработка Длина внутритка- Глицеоллин (мкг/мл невых гиф (мкм) сырого веса ткани) ______________________________________________________________ Харосой-63, устойчив Контроль (вода) 36 1252 Актномицин D (100 мкг/мл) >1500 74 Бластицидин (0,5 мкг/мл) >1500 101 Харасой, восприимчив контроль (вода) >1500 138 Однако при синтезе ФА также имеют место и некоторые элементы посттрансляционного контроля. Kуч (1995) полагает, что образование ФА не всегда связано с их синтезом de novo, а их накопление иногда происходит при гидролизе коньюгатов. Так, в сое в больших количествах конституционно присутствует изофлавоноидный коньюгат даидцеин, являющимся близким предшественником глициоллина. При несовместимой комбинации сои с возбудителем фитофтороза коньюгат даидцеина быстро гидролизуется, в результате чего накапливается глициоллин, и развитие гриба прекращается. В совместимой комбинации гидролиз задерживается, и низкий уровень глициоллина отмечается уже после прохождения фронта инфекции. Подобные данные были получены и для ФА медикарпина и маакиаина в нуте. Быстрота гидролиза зависела от концентрации элиситора: при его низком содержании гидролиза гликозида почти не происходило, в то время как высокие дозы элиситора приводили к образованию глициоллина. Таким образом, согласно мнению Kуча, птерокарпановые ФА могут не только синтезироваться de novo, но и образовываться из коньюгатов в результате их гидролиза. Показателем токсичности химических соединений для грибов служит ЭД50 (концентрация химиката, тормозящая рост колонии на 50%). ЭД50 ФА для грибов колеблется от 10-3 до 10-5 M. Таким образом, ФА являются достаточно слабыми антигрибными агентами. Доказательств их передвижения в растениях не существует. Однако скорость накопления ФА и их локализация в месте инфекции способствует поддержанию в растении токсичной для грибов концентрации. Исход взаимоотношений растения и паразита зависит от двух факторов: от количества образовавшегося ФА и от чувствительности к нему патогена. Степень участия ФА в явлениях устойчивости растений определяется на основании многих тестов: антимикробная активность, измеренная в опытах in vitro, скорость их синтеза, локализация в местах развития патогенов, присутствие соединений, которые влияют на антимикробную активность, а также детоксикация ФА ферментами гриба и растения. ФА играют роль в видовом и сортовом иммунитете (хозяйской и нехозяйской устойчивости). Роль ФА в видовом иммунитете наглядно представлена на табл. 31. Таблица 31. Образование ФА пизатина в листьях гороха, зараженных двумя видами возбудителей мучнистой росы (Oku et al.,1975) Виды грибов Начало образования Максимальная ЭД50 (часы после заражения) концентрация (мкг/мл) Erysiphe graminis E.pisi 15 48 >2000 78 40 530 Как видно, синтез пизатина в ответ на заражение паразитом злаков E.graminis начинается значительно раньше, чем в ответ на поражение «собственным» патогеном E.pisi, пизатин достигает в 25 раз более высокой концентрации и в 13 раз более токсичен. То есть концентрация пизатина в горохе, зараженном E.graminis, в 50 раз выше летальной для патогена дозы, а в горохе, зараженном E.pisi, - в 7 раз ниже. Связь ФА сортовым иммунитетом показана на табл.32. Таблица 32. Концентрация ФА ришитина и любимина (мкг/мл), накапливающихся в ответ на заражение клубней картофеля совместимой (0) и несовместимой (1.2.3.4) расами Phytophthora infesatns (Озерецковская, 1973) Сорта картофеля / Гены устойчивости Уральский / R3R4 Раса 0 1.2.3.4 Красноуфимский / R2R3 0 1.2.3.4 Эпока / R3R4 0 1.2.3.4 Cтоловый-19 / R4 0 Ришитин 49 41 2 4 47 66 2 3 63 51 3 3 44 35 4 5 23 33 4 2 52 45 10 5 42 50 7 6 23 40 9 7 1.2.3.4 Веселовский / R2 0 1.2.3.4 Лава / R3R4 0 1.2.3.4 Вулкан / R1R3 0 1.2.3.4 Камераз / R1 0 1.2.3.4 Олев / R1R4 Любимин 0 25 37 1.2.3.4 5 3 Как видно, при заражении всех исследованных сортов авирулентной расой ФА картофеля ришитин и любимин накапливались в концентрациях, на порядок более высоких, чем при заражении вирулентной расой. В некоторых случаях вещества, присутствующие в инфекционной зоне, могут влиять на чувствительность гриба к ФА. Например, включение полярных липидов из гороха в среду роста для некоторых грибов уменьшало их чувствительность к пизатину, маакиаину и фазеоллину. Коммерческий фосфатидилхолин также уменьшал чувствительность к пизатину некоторых грибов. Таким образом, эффективность ФА как защитных веществ, зависит от присутствия в среде соединений, влияющих на антигрибную активность По своей антигрибной активности могут заметно различаться и стериоизомеры ФА. Птерокарпановые ФА имеют как (+), так и (-) стериоизомерию. Большинство бобовых растений накапливает (-) формы за исключением гороха, который образует (+) пизатин, и Sophora japonica, которая продуцирует как (+), так и (-) маакиаин. Антигрибная активность маакиаина и пизатина к некоторым грибам стериоспецифична. Некоторые патогены, изолированные из люцерны и красного клевера, в большей мере ингибируются (+) маакиаином, чем (-) маакиаином. Различия в чувствительности, возможно, зависят от неспособности патогена деградировать (+) изомер. Эти результаты перспективны в плане создания растений, продуцирующих один и тот же ФА с различной стерической конфигурацией. Хотя большинство растений продуцируют ФА по классической схеме, существуют виды (огурцы, дыни и арбузы), образование ФА в которых не установлено, хотя есть все основания предполагать их присутствие. Предполагается, что одной из возможностей использования ФА для контроля за болезнями является трансформирование в растение генов βглюконазы и хитиназы, которые не только будут разрушать покровы патогенов, но и продуцировать олигомеры, обладающие элиситорной активностью, вызвающие образование ФА. Другой возможностью является трансформирование в растение генов неродственных ФА. Примером могут быть ФА из моркови, которая невосприимчива ко многим патогенам бобов. Трансформирование в бобы генов синтеза ФА моркови предохраняло их от многих бобовых патогенов. Сложность, правда, заключается в том, что для трансформации ФА из одного растения в другое необходимо вводить в него не один, а группу генов, ответственных за синтез ФА. PR-БЕЛКИ PR-белки (pathgenesis-related proteins) или белки, связанные с патогенезом, были впервые обнаружены вирусологами в листьях сорта табака, который реагировал реакцией СВЧ на заражение ВТМ. Позднее различные PRбелки были обнаружены и во многих других видах растений, но белки табака исследованы наиболее полно. В связи с этим настоящий раздел посвящен именно PR-белкам табака и принятой для них номенклатуры. Термин белки, связанные с патогенезом, означает группу белков, которые индуцируются в растении в ответ на грибные, бактериальные, вирусные, вироидные болезни, а также некоторые химикаты. Первые исследования привели к выводу, что все PR-белки обладают определенными общими свойствами: они растворимы только при низких значениях рН (рН-3), присутствуют в экстрацеллюларной жидкости и высоко устойчивы к деградации протеолитическими ферментами. Казалось бы, это логично, поскольку экстрацеллюлярная жидкость вокруг некротической зоны имеет низкое значение рН и высокую протеолитическую активность, поэтому обладающие соответствующими свойствами белки должны хорошо адаптироваться к этим условиям. Позднее однако оказалось, что некоторые PRбелки (например, томатов и картофеля) оказались не кислыми, а основными, к тому же разрушающимися протеолитическими ферментами. Затем у табака был обнаружен второй набор PR-белков, которые были локализованы не в межклеточной жидкости, а в вакуолях, и конституционно экспрессировались в корнях. Основные белки индуцируются в листьях при обработке этиленом и в результате поранения, тогда как кислые в этих условиях не экспрессируются. Все PR-белки табака разделяют на 5 групп. Каждый кислый экстрацеллюлярный белок обозначается цифрами от 1 до 5, а также различными буквами “a”, “b”, “c” и т.д. Нумерация основывается на относительной мобильности при электрофорезе в неденатурирующей гелевой системе. Различные белки, обозначенные одним и тем же номером (например, PR-1a, PR-1b и PR-1c), серологически родственны, имеют близкую молекулярную массу и обладают частичным сходством в аминокислотной последовательности. PR-1 тип белков Среди белков, накапливающихся в листьях табака в ответ на ВТМ, найдены PR-1a, PR-1b и PR-1c кислые формы, которые имеют сходную молекулярную массу и аминокислотную последовательность, а также серологическую близость. Кроме табака эти белки в ответ на инфицирование были обнаружены еще в коровьем горохе, картофеле, кукурузе, ячмене и томатах. Подобное широкое распространение белков типа PR-1, как в однодольных, так и в двудольных видах растений подтверждает, их важную роль в ответах растений на стресс. Другую группу составляют основные PR-подобные белки. По аминокислотной последовательности они на 65% похожи на выше упомянутые кислые белки табака. По аналогии с кислыми PR-белками основные белки содержат гидрофобный N- терминальный участок, состоящий из 30 аминокислот, который, возможно, функционирует как сигнальный полипептид для прохождения вещества через мембраны. Геном табака может содержать свыше 6 генов, соответствующих основным PR-белкам. Накопление PR-белков при инфицировании патогенами, вызывающими некроз и приобретение растением устойчивости к последующему заражению, позволили исследователям считать, что PR-белки группы 1 участвуют в системной приобретенной устойчивости. Однако это предположение до сих пор является спекулятивным, поскольку их роль в защите против различных типов инфекций пока остается невыясненной. PR-2 тип белков: β-1,3-глюканазы β-1,3-глюканазы способны разрушать клеточные стенки некоторых грибов, а также выщеплять из них фрагменты, обладающие иммунорегулирующими свойствами. Первоначально были обнаружены 3 кислых экстрацеллюларных белка, обозначенных соответственно PR-2а, R-2b и PR-2c. Затем были идентифицированы еще 2 дополнительных кислых белка, которые, также как и первые, оказались β-1,3-глюканазами. Кроме кислых глюканаз идентифицирована основная глюканаза, которая вместе с глюканазой PR-2с обладает в 50-250 раз большей активностью деградации ламинарина (β-1,3-глюкан – запасной углевод оомицетов), чем все остальные глюканазы. Основная глюканаза накапливается в вакуолях и конституционно экспрессируется до значительных количеств в корнях, нижних листьях и цветках неинфицированных растений табака, но не обнаруживается в верхних листьях. В библиотеке кДНК из табака идентифицированы 3 участка последовательностей, соответствующих основным глюканазам, и 5 зон, кодирующих кислые глюканазы. Предполагается, что β-1,3-глюканазы играют роль в процессах, ведущих к СВЧ-ответу растительной ткани. PR-3 тип белков: хитиназы групп I и II К хитиназам группы I относятся две основные эндохитиназы Х-32 и Х34. К хитиназам группы II - две кислые экстрацеллюларные, протеазоустойчивые хитиназы 3a и 3b. Эти ферменты способны гидролизовать полимеры хитина. Основные хитиназы имеют в 5 раз большую специфическую активность, чем кислые; им принадлежит примерно 70 % всей хитиназной активности в инфицированных тканях. Помимо этого, основные хитиназы обладают дополнительной лизоцимной активностью и способны гидролизовать бактериальный пептидоглюкан. Основные хитиназы накапливаются в высокой концентрации в корнях табака. И основные, и кислые хитиназы содержат гидрофобный N-терминальный участок, который служит для переноса фермента через мембраны эндоплазматического ретикулюма. Основные хитиназы в отличие от кислых , содержат лишних 50 остатков цистеина в N-терминальной части зрелого фермента. Геном табака содержит от 2 до 4 генов кислых и основных хитиназ. В растениях хитиназа и β-1,3-глюканаза экспрессируются при патогенной инфекции, поранении или обработке элиситорами, причем их экспрессия, как правило, коррелирует с устойчивостью. Поэтому полагают, что PR-белки 2 и 3-й групп участвуют в индуцированной устойчивости растений. Особенно эффективно ингибируют рост патогенов сочетание хитиназ и β-1,3-глюканаз. PR-4 тип белков Функции 4-го класса PR-белков наименее ясны. Этот класс содержит кислые белки, индуцируемые ВТМ в табаке. Они были названы p1, p2, S1 и S2. Серологически сходные белки накапливаются в апопластной жидкости томатов, зараженных Cladosporium fulvum. Изолированы клоны кДНК, соответствующие кислым PR-4 белкам табака. PR-5 тип белков: тауматиноподобные белки К этой группе относятся два белка табака, которые отсутствуют в незараженных растениях. Их молекулярная масса без гидрофобного Nтерминального участка, который, возможно, служит сигнальным пептидом, ориентировочно составляет 24 кDа. Исследование аминокислотной последовательности белков группы PR-5 обнаружило их сходство с сладкими на вкус белками тауматинами из африканского кустарника Taumatococcus daniellii, а также с α-амилаза-трипсиновым ингибитором кукурузы. Геном табака содержит 2 гена белка PR-5. Тауматин-подобные белки имеют большое сходство с осмотином. Осмотин накапливается в культуре клеток табака, адаптированного к осмотическому стрессу. Он был также обнаружен в корнях интактного табака.Но ни осмотин, ни PR-5 белок не имеют сладкого вкуса, присущего тауматину. Сходство PR-5 белков с бифункциональным α-амилазопротеиназным ингибитором кукурузы ( 60 % идентичности аминокислотной последовательности ) делает вероятным предположение о функции этих белков в индуцированной устойчивости против широкого круга патогенов и вредителей, возможно, состоящей в ингибировании их пищеварительных ферментов. Использование методов изоляции PR-белков в табаке привело к обнаружению многочисленных белков в других видах растений, которые условно также можно относить к белкам, связанным с патогенезом. Это ингибиторы репликации вирусов, белки генов, кодирующих раневые реакции картофеля, ингибиторы протеиназ, тионины, структурные белки клеточной стенки, ферменты ароматического биосинтеза, пероксидазы, супроксиддисмутазы и др. В настоящее время сложно ответить, можно ли относить все эти белки к PR-белкам только по одному признаку, что они индуцируются в ответ на стрессы. Для некоторых вышеописанных белков известны функции, и тем самым можно понять ту специфическую роль, которую играет тот или иной белок в процессах патогенеза. Так, индуцированные заражением пероксидазы участвуют в биосинтезах лигнина и суберина, препятствующих распространению патогенов и повреждениям, которое они вызывают. Подобным же образом ясна роль ингибиторов протеиназ, препятствующих питанию патогенов. Глюканазы и хитиназы способны разрушать клеточные стенки грибов, а возможно, и бактерий. Однако для многих групп PR-белков функции еще далеко не установлены. Некоторые белки, которые специфически индуцируются патогенами в одном органе, могут конституционно экспрессироваться в тканях других растений или даже в других органах того же растения или всегда, или в определенный период развития. Вряд ли можно не согласиться с положением. что исследование функции PR-белков в растениях, является одним из наиболее сложных, неясных, а порой и противоречивых разделов фитопатологии. Некоторые дополнительные представления о PR- белках можно получить из раздела «Системная приобретенная устойчивость растений». АНТИВИРУСНЫЕ БЕЛКИ В разделе 4-ой главы, посвященному факторам устойчивости растений, были рассмотрены ингибиторы белковой природы, которые являются конституционными метаболитами растений, - эндогенные антивирусные белки (EAVP), описаны их основные характеристики и механизмы действия. Однако, в инфицированных растениях обнаруживаются антивирусные белки, синтез которых индуцируется в ответ на инфекцию, и которые отсутствуют в тканях здоровых растений до заражения. Их называют идуцированными антивирусными белками (IAVP). В отличие от EAVP, которые оказывают влияние на ранние фазы жизненного цикла вируса, и с которыми индуцированные белки-ингибиторы имеют много общих характеристик, IAVP являются ингибиторами поздних стадий вирусной инфекции. Это следует из того факта, что обработка растений IAVP вызывает значительное снижение вирусного титра в растении. Кроме того, эффективность IAVP сохраняется даже при их применении через много часов после инокуляции вирусом. Поскольку IAVP в растениях присутствуют в тканях, обладающих системной устойчивостью, они рассматриваются многими исследователями как возможные кандидаты на роль сигнальных молекул при развитии системной приобретенной устойчивости растений к вирусам. Однако низкий уровень экспрессии генов, кодирующих эти белки, значительно затрудняет выделение последних из растительных тканей в виде очищенных препаратов с целью дальнейшего изучения. Тем не менее, к настоящему времени проведены довольно подробные исследования нескольких IAVP. Ингибитор вирусной репликации Ингибитор вирусной репликации (IVR – inhibitor of viral replication) из растений табака состоит из двух биологически активных белков - 26 kDa и 57 kDa, которые являются, соответственно, мономером и димером. IVR может быть выделен из инфицированных ВТМ протопластов и тканевых экстрактов сверхчувствительных сортов табака. Этот высокоактивный IVR накапливается в тканях в очень низких концентрациях, 10 нг/г ткани. Столь низкое содержание IVR в растениях, по-видимому, является причиной того, что транскрипты IVR не обнаруживаются в соответствующих тканевых экстрактах. IVR неспецифичен в смысле своей антивирусной активности, потому что он ингибирует репликацию нескольких различных вирусов, кроме индуцирующего его ВТМ. IVR может подавлять размножение вирусов в протопластах при применении не позже, чем через 18 часов, а в листовых дисках - не позже, чем через 5 часов после инокуляции. IVR может также быть обнаружен В неинокулированной дистальной листовой ткани IVR обнаруживают уже через 30-36 часов после инокуляции вирусом, хотя в верхних листьях он обнаруживается на 7-14 день после инокуляции. IVR может быть выделен как из инфицированных вирусом так и из неинокулированных тканей пораженного растения и, по-видимому, его образование является одной из защитных реакций растения-хозяина, направленных на локализацию вирусной инфекции. IVR - типичный ингибитор вирусной репликации, потому что: 1) он может понижать концентрацию вирусных частиц в тканях системноинфицируемых растений-хозяевах; 2) он эффективен при применении от 5 и более часов после инокуляции вирусом и даже может быть эффективен спустя 18 часов после инокуляции. Ингибиторы из «зеленых островков» На листьях, инфицированных некоторыми вирусами, развиваются светлые и темно-зеленые участки - классический симптом вирусной мозаики. Клетки "зеленых островков" обычно содержат меньше вируса по сравнению со светло-зелеными участками листа и выглядят неинфицированными цитологически или физиологически. «Зеленые островки» проявляют системную устойчивость к последующей реинфекции тем же самым или близкородственными системными вирусами. безвирусной природы «зеленых островков» пока не найдено. Не исключено, что в поддержание низкой концентрации вируса в зеленых островках вовлечены IAVP, присутствующие в системно инфицированных тканях. Обнаруженные в «зеленых островках» индуцированные антивирусные белки, ответственные за подавление вирусной инфекции, принято называть ингибиторами из «зеленых островков» - IGI (inhibitors from green islands). Они имеют много сходных черт с другими IAVP. Например, IGI, выделенный из «зеленых островков» табака, инфицированного вирусом огуречной мозаики, очень похож на IVR из табака. Он, также как IVR табака, имеет две активные фракции близких молекулярных весов, воздействует на репликацию вируса и реагирует с антисывороткой к IVR. IGI, выделенные из «зеленых островков» разных растений, отличаются серологически. Интересно, что IGI табака может ингибировать размножение ВТМ в протопластах и листовых дисках, обработанных этим ингибитором после их инокуляции вирусом, но ткани «зеленых островков», из которых IGI был выделен, остаются восприимчивыми к некрозообразующему штамму ВТМ. Антивирусные факторы Термином антивирусные факторы - AVF (antiviral factors) обозначают биологически активные антивирусные белки, активность которых связана с наличием в растениях табака N-гена сверхчувствительности. Один из таких AVF представляет собой фосфорилированный гликопротеин с молекулярной массой 22 kDa, который существует в растении в форме предшественника, preAVF. Его процессинг индуцируется вирусной инфекцией, возможно, в ответ на появление в клетках двуцепочечной РНК (dsРНК) - репликативной формы вирусной РНК. Подобно IVR табака, AVF индуцируются только вирусной инфекцией, ингибируют репликацию вирусов и могут играть роль в развитии системной приобретенной устойчивости. AVF обнаруживается после системной инфекции, даже при очень низкой степени заражения. По-видимому, уровень накопления AVF может определять, будет ли вирусная инфекция локализованной или станет системной. AVF, подобно IVR, являются мощными ингибиторами и экспрессируются в очень малых количествах, что затрудняет выделение и дальнейший анализ этих белков. Так же как в случае IVR, m-РНК, соответствующую AVF-транскриптам, не удается обнаружить в инфицированных вирусом растениях. Интересно, что AVF имеют много общих характеристик с интерферонами, включая температурную и кислотную стабильность, гликозилирование, широкий антивирусный спектр, стимулирование синтеза олигоаденилатов. В частности, AVF из растений табака стимулирует олигоаденилатсинтазу, а олигонуклеотиды могут активировать AVF. Показано, что в некоторых случаях человеческие интерфероны способны ингибировать размножение растительных вирусов. Кроме того установлено, что индуцированные человеческими интерферонами олигоаденилаты, также как и синтетические 2'-5'-олигоаденилаты, ингибируют размножение ВТМ в растениях табака. ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ Ингибиторы протеиназ представляют особую группу белков растений, объединяемой общей способностью образовывать с протеиназами стехиометрические комплексы, что приводит к конкурентному ингибированию каталитической активности (Мосолов, Валуева,1993). Ингибиторы протеиназ присутствуют в растениях различных таксономических групп. Их особенно много в семенах и других запасающих органах растений, где их содержание может составлять до 5-10 % водорастворимых белков. Почти все ингибиторы протеиназ из растений представляют собой пептиды или небольшие белки, совсем не содержащие углеводов. Предполагается, что ингибиторы протеиназ устойчивы к действию самих протеиназ, хотя имеются и исключения из этого правила. Наиболее хорошо исследованы ингибиторы протеиназ злаковых и пасленовых. Из представителей семейства пасленовых наибольшее многообразие форм ингибиторов описано у картофеля. В клубнях этого растения обнаружены ингибиторы, подавляющие активность сериновых, цистеиновых, аспартильных протеиназ и карбопептидаз. Ингибиторы сериновых протеназ на основе общности свойств принято делить на следующие группы родственных белков: семейство ингибитора картофеля I, семейство ингибитора картофеля II, ингибиторы протеназ семейства Куница (первый кристаллический ингибитор трипсина, выделенный из сои М. Куницем в 19451946 гг) Наибольшее число работ посвящено изучению сериновых протеиназ семейства картофельных ингибиторов I и II, для которых характерно наличие олигомерной структуры (ингибитор картофеля I состоит из 4-5 субъединиц, ингибитор II является гетеродимером). Подавляющее большинство белковых ингибиторов сериновых протеиназ действуют по, так называемому, субстратноподобному механизму, суть которого состоит в том, что ингибитор выступает как высокоспецифический субстрат фермента, подвергающийся медленному ограниченному протеолизу. Первичная структура ингибитора I из картофеля сходна с игибиторами из ряда других растений. Поэтому всех их относят к одному семейству картофельного ингибитора хемотрипсина I, хотя и не все они выделены из картофеля. Представители этого семейства ингибиторов широко распространены в растениях различных таксономических групп. Ингибиторы сериновых протеиназ сосредоточены в центральной вакуоли. Предполагается, что при перемещении ингибиторов из цитоплазмы в центральную вакуоль происходит их превращения в активные формы в результате ограниченного протеолиза. Так, ингибиторы I и II образуются в результате посттрансляционного ограниченного протеолиза, который осуществляется соответствующими протеиназами. В клубнях картофеля присутствуют и низкомолекулярные ингибиторы протеиназ. Возможно, что некоторые из них являются продуктами ограниченного протеолиза высокомолекулярных ингибиторов, тогда как другие могут быть непосредственным результатом трансляции. Многие ингибиторы протеиназ из растений характеризуются «двуглавостью», то есть каждая молекула такого ингибитора может одновременно связывать две молекулы одной и той же или различных протеиназ по двум реактивным центрам. В растениях существует большое число ингибиторов протеиназ, что дает дополнительные возможности для их регулирования. 1) Ингибиторы протеиназ могут различаться по субстратной специфичности. 2) Ингибиторы существуют в различных изоформах. 3) Олигомеры ингибиторов протеиназ могут диссоциировать и объединяться в различных комбинациях, причем свойства ингибитора будут зависеть от того, какие олигомеры и в каком сочетании объединяются. Обычно рассматриваются три главные функции ингибиторов протеиназ: 1) Ингибиторы протеиназ как запасные белки растений. 2) Ингибиторы протеиназ как регуляторы белков или ферментов самого растения 3) Ингибиторы протеиназ как составная часть защитной системы растений. Естественно, что для нас наибольший интерес представляет защитная функция ингибиторов протеиназ, поэтому остальные функции будут рассмотрены кратко. 1. Выше уже упоминалось, что особенно высокое содержание ингибиторов протеиназ находится в запасающих органах растений - семенах и клубнях, при этом ингибиторы синтезируются на той же стадии развития, что и запасные белки. При прорастании зерна активность ингибиторов снижается и постепенно исчезает. При прорастании клубней картофеля содержание ингибиторов уменьшается до того времени, пока растение не начнет образовывать новые клубни, в которых вновь накапливается ингибитор 2. Возможно, что главной функцией ингибиторов протеолитических ферментов, является их участие в регуляции собственных протеиназ растений. В большинстве случаев на эндогенные протеиназы растений действуют ингибиторы цистеиновых протеиназ, а не ингибиторы трипсина и хемотрипсина, влияющие на протеиназы микроорганизмов. Имеются указания, что цистеиновая протеиназа, содержащаяся в прорастающих семенах, не только деградирует их белок зеин, но и разрушает ингибитор эндогенной сериновой протеиназы. В белковых телах семян гречихи одновременно присутствуют все элементы протеолиза, то есть ингибитор и субстрат. Ингибиторы протеаз могут предохранять растения от неконтролируемого протеолиза. Находясь в цитоплазме, они способны защищать белки растительных клеток в случае повреждения внутриклеточных структур и освобождения протеиназ. 3. Ингибиторы протеиназ могут выполнять важную защитную роль в растениях, пораженных микроорганизмами. Так, многие белки-ингибиторы трипсина и хемотрипсина способны подавлять сериновые протеиназы микроорганизмов. Например, в клубнях картофеля присутствует ингибитор 1, способный подавлять хемотрипсиновую протеиназу, а ингибитор 11 ( двуглавый ) подавляет так трипсин, так и хемотрипсин. Оба ингибитора активно подавляют субтилизин и протеиназы грибов рода Aspergillus. Показано действие ингибиторов I и II из картофеля на протеиназы, секретируемые в культуральную жидкость Fusarium solani и F. sambuzinum. Подавление протеолитической активности может приводить к нарушению способности патогенов поглощать растительные белки, и, соответственно, к подавлению их роста и развития. Ингибиторы трипсина и хемотрипсина непосредственно подавляли рост в культуре некоторых фитопатогенных грибов. В ряде случаев установлена взаимосвязь между устойчивостью растений к болезням и содержанием у них ингибиторов протеиназ. Такая корреляция имела место между устойчивостью пшеницы к твердой головне и люпина и сои к фузариозу. При прорастании семян бобовых ингибиторы протеиназ быстро диффундируют в окружающий раствор. Возможно, что ингибиторы протеназ могут принимать участие в предохранении семян от инфекции на ранних стадиях прорастания. В клубнях картофеля существуют два главных запасных белка. Это пататин, составляющий около 40% всех водорастворимых белков клубней и ингибитор протеиназ II (около 10 %). Пататин обладает липидацилгидролазной активностью, которая может быть связана с защитой картофеля от фитопатогенов. При поранении клубней картофеля образование патотина в листьях и стеблях прекращается, а системная индукция ингибитора II начинается. Из семян ячменя был выделен «двуглавый» ингибитор, который содержал независимо действующие центры связывания субтилизина и αамилазы. Позднее аналогичные бифункциональные ингибиторы были выделены из семян пшеницы, ржи и тритикале. Установлена аминокислотная последовательность для двух ингибиторов эндогенной α-амилазы и субтилизита из пшеницы и ячменя. Молекула бифункционального ингибитора содержит два остатка метионина. Для того чтобы оценить положение остатка, входящего в состав реакционного центра, ингибитор был подвергнут ограниченному протеолизу стафилококковой протеиназой. В результате полностью исчезала активность ингибитора α-амилазы, тогда как активность по отношению к субтилизину сохранялась. Предполагается, что бифункциональные ингибиторы могут играть существенную роль, как в предотвращении прорастания зерна, так и в защите растений от фитопатогенов. В покоящемся зерне ячменя бифункциональный ингибитор локализован в эндосперме. В процессе прорастания зерна происходит транспорт ингибитора из эндоспрема в проросток. По-видимому, бифункциональный ингибитор α-амилазы и субтилизина, с одной стороны, тормозит прорастание зерна при неблагоприятных условиях, а с другой подавляет активность протеиназ патогенных микроорганизмов. Существенный вклад в исследование роли ингибиторов протеиназ был внесен работами американского биохимика Райана. Было установлено, что простое механическое поранение картофеля или томатов вызывает быстрое накопление ингибиторов протеиназ по всему растению. Накопление ингибиторов протеиназ наблюдалось в томатах после инфицирования Phytophthora infestans . Синтез ингибиторов протеназ происходил после обработки табака препаратом клеточных стенок P.parasitica. Ответная реакция растений объяснялась образованием в месте повреждения специфического раневого гормона, обозначавшегося как PIIF (proteinase inhibitor –inducing factor). PIIF был идентифицирован как растворимый, обогащенный остатками уроновой кислоты пектиновый полисахарид с молекулярной массой около 5 кDа. Минимальным фрагментом, который требовался для активности PIIF, оказалась 4-α-D-галактуронозил- D-галакуроновая кислота. Для проявления активности ингибиторов требуется интактное гемиацетальное кольцо и свободная карбоксильная группа при С-6. PIIF образуется в результате ферментативной деградации клеточной стенки и относится к числу «эндогенных элиситоров», о которых ранее уже шла речь. Под воздействием PIIF содержание ингибиторов I и II в листьях пасленовых могло достигать до 2 % от общего количества вновь синтезированных белков. Образовавшиеся ингибиторы были локализованы в вакуолях. Способность к образованию PIIF под влиянием повреждения была обнаружена у 10 из 23 исследованных видов растений. Больше всего PIIF накапливалось в люцерне, затем - в табаке, томатах, картофеле, землянике, огурцах, тыкве, клевере, конских бобах и винограде. Обнаруженное сходство в индукции PIIF в растениях из разных семейств указывает на единые принципы механизмов защиты у разных растений. Кроме PIIF образование ингибиторов протеиназ могло быть вызвано пектином цитрусовых, олигоуронидами со степенью полимеризации от 2 до 20, а также растворимыми производными хитина и хитозана. Ингибиторы протеиназ в ряде случаев могут индуцироваться под воздействием абсцизовой кислоты. Райан предложил гипотетическую схему распространения сигнала индукции биосинтеза ингибитора протеиназ в ответ на поранение насекомыми и фитопатогенами (рис. 49). Первый путь, связанный с механическими поранениями, наносимыми насекомыми, индуцируется полипептдом системином, который быстро транспортируется по всему растению, взаимодействуя со специфическими рецепторами. Второй путь связан с заражением патогенами и предполагает индукцию олигоуронидами, которые освобождаются из клеточных стенок растений и взаимодействуют с другими специфическими рецепторами. Излишне говорить, что предложенная схема двух путей индукции ингибиторов протеиназ является гипотетической. Однако в ее пользу свидетельствует тот факт, что специфический ингибитор липоксигеназы подавляет синтез ингибиторов протеиназ, образующихся в ответ на поранение, но не оказывает влияния на накопление ингибиторов под действием олигоуронидов. Роль ингибиторов протеиназ в процессах патогенеза следует рассматривать очень широко, поскольку они могут регулировать активность ферментов, участвующих в защите: как ингибировать ненужные протеиназы, так и активизировать протеиназы, которые до этого были связаны и, наоборот, связывать протеиназы, которые могли разложить вновь синтезируемые белки. ФЕНИЛПРОПАНОИДЫ И ЛИГНИН Фенилпропаноидные соединения представляют собой широкий спектр структурных циклических веществ, обладающих разнообразными физиологическими функциями. Они образуются в результате дезаминирования аминокислоты фенилаланина с помощью фермента фенилаланин-аммиак лиазы (ФАЛ). Простые фенилпропаноиды имеют основную структуру С6-С3 углеродный скелет фенилаланина (рис. 50). Они образуются из коричной кислоты в результате реакций гидроксилирования, метилирования и дегидрирования (р- кумаровая, кофейная, феруловая , синаповая кислоты ), а также простые кумарины (умбеллиферон, псорален). Свободные кислоты редко накапливаются в растительных клетках до высоких уровней: обычно они коньюгированы с сахарами (например, коньюгат салициловой кислоты с глюкозой), углеводами клеточных стенок (эфиры феруловой кислоты) или органическими кислотами (эфиры синаповой, хлорогеновой кислот). салициловая, бензойная и р-оксибензойная кислоты не являются истинными фенилпропаноидами, поскольку они лишены трикарбоновой цепи, которая свойственна коричной и р-кумаровой кислотам. Многие стресс-индуцированные фенилпропаноиды обладают С15 флавоноидным скелетом, который синтезируется через халконсинтазу, конденсирующую р-кумарил-СоА и три молекулы малонил- СоА. Таким образом, халконсинтаза соединяет два фенольных кольца, одно из которых синтезировано через шикимовую кислоту, а второе – через уксусную (эти два пути синтеза фенолов описаны в гл.4 (стр. ). В большинстве семейств растений начальным продуктом халконсинтазы является тетраоксихалкон, который далее превращается в другие флавоноидные классы: такие как флавоны, флаваноны, флаванолы, антоцианы и 3-деоксантоцианидины. У растений семейства бобовых, которые обладают халкон редуктазой, также как и халкон синтазой, может образовываться тригидроксихалкон. У ряда видов, включая сосну, виноград и арахис конденсация р-кумарол-СоА или СоА коричной кислоты с тремя молекулами малонил-СоА может привести к образованию стильбенов (под действием стильбенсинтазы). У бобовых изофлавонсинтаза модифицирует изофлавоноидный углеродный скелет, в результате чего накапливается ряд простых изофлавоноидов - куместаны, изофлаваны и птерокарпаны. Между фенилпропаноидами могут существовать структурные различия, определяемые гидроксилированием, гликозидированием, алкилированием, пренилированием, сульфатацией и метилированием. По мере того как совершенствуется техника молекулярной биологии, а также очистки многих ферментов и использования радиоактивной метки выясняются и этапы превращения фенилпропаноидов. Рис. 54 суммирует типы фенилпропаноидов, индуцируемых в растении различными биотическими и абиотическими стрессами, и ферменты, участвующие в их превращениях. Многие стресс-индуцируемые фенилпропаноиды классифицированы как ФА. Они включают птерокарпаны (глициоллин), изофлаваны, пренилированные изофлавоноиды (киевитон), стильбены, псоралены, кумарины, 3деоксиантоцианидины, флавононолы (кверцетин, камферол) и ауроны. Уровень этих соединений возрастет вокруг места инфекции до концентраций, которые являются токсическими для патогенов в опытах in vitro. Количество салициловой кислоты увеличивается в ответ на инфекцию, облучение УФрадиацией и повышенную концентрацию озона в воздухе у табака, огурцов и арабидопсиса. Однако помимо антимикробного действия, свойственного салициловой кислоте, последняя является элементом сигнальной системы, которая приводит к системной приобретенной устойчивости. Обладают ли таким же свойством и другие фенолы - неизвестно. Многие фенилпропаноидные соединения индуцируются в ответ на поранение или повреждение насекомыми. Например, куместрол и кумарин токсичны по отношению к насекомым, вызывая эстрогенные и антикоагулянтные эффекты. Индукция в ответ на поранение хлорогеновой кислоты, а также алкилферулятных и фенольных эфиров, связывающих клеточные стенки, во-первых, могут действовать как токсические соединения, а во-вторых, могут служить предшественниками лигнина или других механических барьеров. Совершенствование современной биохимической техники позволило открыть новые ферменты фенилпропаноидного биогенеза. Так были открыты сульфтрансферазы, каждая из которых катализирует сульфатацию специфического флавоноидного гидроксила. Установлено также, что в тканях растений присутствуют высокоспецифические изофлавоноидные пренилизотрансферазы. Хотя связь фенилпропаноидов со стрессовыми факторами была установлена давно, долгое время оставалось неясным, в каких именно клетках они синтезируются. Было только лишь известно, что фенилпропаноиднные ФА накапливаются около места инфицирования. Установлено, что под действием УФ-лучей антоцианы и другие флавоноиды накапливаются в верхних эпидермальных клетках растений. Однако не было ясно, синтезируются ли эти соединения в клетках, в которых накапливаются, или транспортируются туда из прилегающих клеток. Используя гибридизационную и иммунолокационную технику, удалось показать, что флавоноиды, белки халкон синтазы, а также транскрипты халкон синтазы, ФАЛ и 4-кумаран : СоА лигазы накапливаются в эпидермальных клетках, подвергшихся действию УФ-лучей. Фуранокумариновые ФА, белки и мРНК ФАЛ и 4-кумаран : СоА лигазы накапливаются в клетках вокруг места инфекции листьев петрушки, инфицированных непатогенным для петрушки видом Phytophthora megasperma. Субклеточные сайты фенилпропаноидного биосинтеза до сих пор служат предметом дискуссий. Многие фенилпропаноиды аккумулируются в вакуолях, обычно в виде глюкозидов или коньюгатов. Последние затем могут быть вовлечены в транспорт, через тонопласт. Некоторые из основных ферментов фенилпропаноидного пути биосинтеза описаны как цитоплазматические (растворимые), но имеются серьезные доказательства, что они связаны с мембранными структурами. Предполагается, что некоторые растворимые ферменты образуют на поверхности мембран «метаболоны» или метаболитические кластеры. Интермедиаты фенилпропаноидного обмена быстро передвигаются от фермента к ферменту, транспортируются внутрь мембран и попадают в вакуоль. Вышеописанная модель относится к простым фенилпропаноидам, тогда как пренилтрансферазы, которые участвуют в синтезе пренилированных птерокарпанов и фуранокумаринов, связаны с мембранами пластид. Во многих видах растений, особенно в бобовых, такие ключевые ферменты как ФAЛ или халкон синтаза кодируются семейством генов. До сих пор неясно, является ли это кодирование отражением различных форм ферментов в метаболитических компартментах или в стрессовых ситуациях необходимо столь большое количество фенилпропаноидов, которое может обеспечить лишь семейство генов. ФАЛ является тетрамерным ферментом. Поэтому экспрессия многих генов в комбинации с возможной посттрансляционной модификацией может приводить к образованию гетеротетрамерных форм, которые будут по-разному реагировать на различные стимулы. Изоэнзимные формы существуют и у халкон синтазы. Поскольку защита растений мультикомпонентна по своей природе, нелегко определить, какое именно соединение и в какой концентрации может защитить растение. К несчастью, растения, которые исследуются в качестве моделей ФА-ответа, такие как соя, люцерна, зеленые бобы и петрушка, не являются идеальными объектами для классического и мутационного картирования, тогда как арабидопсис, удобный для генетических исследований, не образует флавоноиды и фуранокумарины, характерные для упомянутых видов. Первой прямой демонстрацией потенциальной значимости ФА в защите растений была интродукция в табак из винограда гена стильбенсинтазы. Чужой продукт гена оказался способным переключать субстрат халконсинтазы на синтез стильбеновых ФА - ресвератролов, в результате чего растение приобрело устойчивость к Botrytis cinerea. Имеются данные, согласно которым индивидуальные ФА не могут играть существенную роль в защите. Так, исследование мутанта арабидопсиса, дефицитного по ФА, показало, что его индольный ФА камалехин не нужен для устойчивости к авирулентному штамму Pseudomonas syringae. Однако тот же камалехин может задерживать рост вирулентного патогена. Анализ трансгенных растений табака с уменьшенным уровнем фенольных соединений показал, что скорость развития Phytophthora parasitica в них значительно выше. У этих растений превращение триптофана в триптомин приводило к уменьшению фенилаланинового пула, снижению уровня хлорогеновой кислоты, связанных фенолов и, как следствие, возрастанию поражаемости фитофторой. Лигнин Лигнин является комплексом полимеров, формирующихся из смеси простых фенилпропаноидов. Он образуется при вторичном утолщении клеточных стенок, в результате чего межклеточное пространство импрегнируется этим фенольным полимером. Лигнинофикация представляет собой ферментативную дегидрогенизацию и последующую радиальную конденсацию кумарилового, кониферилового и синапового спиртов. Соотношение этих строительных блоков различается у различных растительных видов. Лигнин ковалентно связан с целлюлозой и гемицеллюлозами, а также с гликопротенами клеточных стенок, возможно, с гидроксипролинбогатыми белками. Неполностью сформированный лигнин, вероятно, играет роль в ограничении роста гриба. Локальные лигниновые вкрапления иногда встречаются в протоплазме на ранних стадиях грибной инфекции с несовместимыми паразитами. Интересно, что лигнин, индуцированный инфекцией, часто отличается по составу от лигнина здоровых тканей. Быстрое накопление предшественников лигнина часто сопровождается локальным возрастанием de novo ФАЛ, пероксидазы и перекиси водорода, которые принимают участие в синтезе и конденсации составляющих лигнина. Обработка растительных тканей ингибитором ФАЛ подавляет образование лигнина и способствует проникновению инфекции в ткани растений. Возрастание локальной лигнинофикации является одним из механизмов, ограничивающих распространение вирусов по тканям растений. Установлено, что в реакцию СВЧ листьев табака, пораженного мозаичным вирусом, помимо ФАЛ и пероксидазы вовлекается также 4-гидроксилаза коричной кислоты, СоА лигазы, О-метилтрансферазы, которые резко возрастают вокруг зоны некроза. ГЛИКОПРОТЕИНЫ, БОГАТЫЕ ОКСИПРОЛИНОМ Белки, связанные с первичной клеточной стенкой растений, как правило, являются гликопротеинами. Они или ковалентно соединены с клеточной стенкой, или находятся в ней в растворенном состоянии. Часть из них являются ферментами, другие выполняют структурные функции. Большинство гликопротенов клеточных стенок обогащены оксипролином. Оксипролин- богатые белки (ОБГ) являются линейными молекулами, обогащенными основными аминокислотами. Высокий уровень этих аминокислот превращает клеточную стенку в поликатионный барьер, который связывает отрицательно заряженные частицы или клетки, подобные бактериальным. Все роксипролин-богатые гликопротеины имеют общие структурные особенности. 1) Высокое содержание оксипролина, β-оксиаминокислого серина, треонина и либо глицина, либо аланина. 2) Содержание арабинозы и галактозы в равных соотношениях. 3) Помимо арабинозы и галактозы могут присутствовать и другие сахара и аминокислоты. Клетки растений секретируют по крайней мере три класса гликопротеинов, содержащих большое количество оксипролина: экстенсины, арабиногалактановые белки и лектины. Экстенсин секретируется как растворимый белок со слабыми поперечными связями в клеточных стенках через изодитирозиновые мостики, формируя в конечном счете нерастворимый клеточный компонент. Две трети растворимой формы экстенсина составляют углеводы и одну треть - белки. Молекулярная масса экстенсина из моркови равняется 86 кDа и примерно 36 кDа освобождается при дегликозилировании. Поперечные связи экстенсина, очевидно, возникают при участии специфической пероксидазы. Экстенсин имеет необычный аминокислотный состав, он содержит 41 мол % оксипролина, 12 мол % серина, 10 мол % лизина, 8 мол % тирозина и 0-11 мол % гистидина. Недостаток кислых аминокислот и большое содержание лизина и гистидина определяют основную изоэлектрическую точку в пределах 10-12. Экстенсин из клеточных стенок может быть превращен в растворимый гликопротен с помощью пролилгидроксилазы и оксипролил арабинозилтрансферазы. Оба фермента локализуются в аппарате Гольджи. Три и тетраaрабинозидные боковые цепи в большинстве связаны с остатками оксипролина. В противоположность экстенсину арабиногалактановые белки являются растворимыми оксипролинсодержащими гликопротеинами, локализованными как внеклеточно, так и в цитоплазме. Большую часть аминокислот арабиногалактановых белков составляют оксипролин, серин, аланин и глицин. Арабинозные и арабиногалактановые цепи с высокой степенью полимеризации, также как и разветвленное углеводное ядро β-D-галактопиранозильного остатка связаны с оксипролином. Арабинозид и гликуроновые кислоты кроме того прикреплены к ядру. Гидроксилирование пролина и транспорт арабинозида на оксипролин, очевидно, имеют место так же, как и в случае экстенсина И, наконец, третьим классом ОБГ являются лектины растений семейства пасленовых, которые локализуются как внутри, так и внеклеточно. Эти белки содержат 50-60 % оксипролина, серина, глицина и цистеина, которые являются преобладающими аминокислотами. Арабинозные остатки связаны с оксипролином, галактозильные - с серином. ОБГ из картофеля агглютинирует авирулентные, но не вирулентные штаммы возбудителя бактериального вилта Pseudomonas solanacearum. Они были названы агглютининами, чтобы отличить их от структурно подобных лектинов, которые обладают только низкой гемааглютинирующей активностью. Агглютинины являются растворимыми соединениями клеточных стенок, которые содержат до 61% углеводов. Углеводная часть состоит главным образом из арабинозы и небольшого количества галактозы, глюкозы и глюкозамина. Молекулярная масса составляет 91 кDа и уменьшается при дегликозилировании до 56 кDа. Пока трудно судить, играют ли агглютинины роль во взаимоотношениях растения и паразита. Несколько фактов свидетельствуют о защитной роли ОБГ в устойчивости растений. 1) Существует четкая корреляция между накоплением ОБГ в клеточных стенках дыни и ее устойчивостью к Gloeosporium lagenarium. Анализ нескольких систем растение-патоген показал, что обогащение клеточных стенок HRGP происходит у ряда растений при заражении грибами, бактериями и вирусами. 2) Уровень оксипролина (маркера ОБГ) увеличивается в клеточных стенках гораздо быстрее при заражении устойчивых, а не восприимчивых сортов. 3) Искусственное повышение или, наоборот, супрессия уровня ОБГ приводит к соответствующему индуцированию или ингибированию устойчивости. 4) Обработка микробными и эндогенными элиситорами тканей растений стимулировала в них образование ОБГ. Механизмы, участвующие в биосинтезе ОБГ пока еще не совсем ясны. Предполагается, что в этом процессе участвует этилен, поскольку элиситоры стимулируют его образование. Кроме того, этилен сам по себе может индуцировать образование ОБГ. В клеточных стенках дыни содержание ОБГ возрастает в несколько раз в ответ на G.lagenarium, что сопровождается резким повышением продуцирования этилена в растении. Элиситоры из этого гриба или из клеточных стенок дыни вызывали такую же реакцию. Обработка проростков дыни этиленом перед инфицированием увеличивала как содержание ОБГ, так и устойчивость, тогда как ингибирование ОБГ увеличивало колонизацию патогеном. Специфическое ингибирование биосинтеза этилена в инфицированных или обработанных элиситором тканях растений подавляло отложение в стенках оксипролина. Предшественник этилена аминоциклопропанкарбоновая кислота стимулировала ОБГ в тканях необработанных растений, а также восстанавливало образование ОБГ в тканях, обработанных ингибитором. Элиситор из Phytophthora megasperma стимулировал синтез этилена и ОБГ в гипокотилях соевых бобов. Повышенное содержание оксипролина имело место также при несовместимом, а не совместимом взаимодействии огурца с Cladosporium cucumerinum.Наоборот, концентрация оксипролина в клеточных стенках пшеницы возрастала после инокуляции совместимой линией Erysiphe graminis. Накопление ГБГ и их мРНК в инфицированных тканях и культуре клеток имело место у фасоли, пораженной Colletotrichum lindemutianum. При этом наблюдалась временная активация пролилгидроксилазы и арабинозилтрансферазы. Арабинозилтрансфераза связана с комплексом Гольджи, тогда как пролилгидроксилаза сосредоточена в эндоплазматическом ретикулуме. Очевидно, что повышение уровня ОБГ в клеточных стенках инфицированных тканей сильно изменяет их свойства. Как полимеры, ОБГ укрепляют клеточную поверхность, а в качестве поликатионов изменяют ее заряд. Гены ОБГ моркови, томатов и фасоли были клонированы и секвинированы. Во всех трех случаях гены имели значительную гомологию друг с другом и содержали характерную повторяющую последовательность, кодирующую пентапептид Сер-Про4. Образование ОБГ кодируется семейством генов, которые по-разному регулируются в пораненных и инфицированных растениях. Количество и скорость накопления мРНК для ОБГ в гипокотилях фасоли, инфицированных несовместимой расой C. lindemuthianum, оказалось значительно большим, чем при совместимом взаимодействии. Показано также, что мРНК для ОБГ накапливалось и в неинфицированной ткани, находящейся на расстоянии от места заражения, что свидетельствовало о системном характере их образования Итак, клеточная стенка растений содержит гликопротеины, многие из которых обладают ферментативной активностью. Некоторые из них, особенно пероксидазы и гликозилгидролазы, могут выполнять важную роль в защитных реакциях растений против фитопатогенов. Так, специфическая пероксидаза участвует в биосинтезе лигнина и в формировании изодитирозиновых мостиков экстенсина, а также мостиков, в которых клеточные стенки связываются феруловой кислотой. Гликозил гидролазы, как общий компонент клеточных стенок растений, могут быть ответственны за освобождение олигосахаринов из клеточных стенок растений или грибов. СИСТЕМНАЯ ПРИОБРЕТЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ Описанные выше химические процессы и соединения связаны с локальной устойчивостью растений, иоперируют непосредственно в месте заражения. Однако еще 100 лет тому назад исследователи знали, что растение, пережившее инфекцию, становится устойчивым к последующему заражению. В 1933 году американский фитопатолог Честер, обобщив около 200 публикаций, описал явление, которое он назвал физиологическим приобретенным иммунитетом. В то время ученые считали, что иммунитет растений аналогичен иммунному ответу млекопитающих. По крайней мере три различных процесса относили тогда к категории приобретенного иммунитета: перекрестную защиту от вирусов (устойчивость к высокопатогенному штамму вируса растений, зараженных слабопатогенным штаммом родственного вируса), микробный антагонизм или биоконтроль и приобретенную устойчивость. Впервые понятие системной приобретенной устойчивости (systemic acquired resistance - SAR), также как термин локальной приобретенной устойчивости (localized acquired resistance LAR) было введено немецким ученым Россом в 1961 году на основании исследования табака, инфицированного ВТМ. Системная приобретенная устойчивость развивалась в тканях инфицированного растения, свободных от заражения, тогда как локальная - непосредственно в месте инфицирования. Начиная с середины 70-х годов, больших успехов в индуцировании SAR добилась школа, возглавляемая американским фитопатологом Дж. Kучем. Объектом работы этих исследователей были растения семейства тыквенных. Для индукции устойчивости использовали непатогенов этих растений, непатогенные штаммы патогенов, сами патогены и, наконец, продукты метаболизма паразита и хозяина. Оказалось, что огурцы могли быть системно защищены от возбудителя антракноза с помощью инокуляции грибом их первого настоящего листа. Тот же результат был получен на дынях и арбузах, которые удавалось системно защитить от грибных, бактериальных и вирусных болезней предварительным локальным инфицированием первых настоящих листьев. Такие опыты были проведены не только в теплицах, но и на полях. Механическое поранение листьев, также как их повреждение сухим льдом и некоторыми химикатами не вызывало защиты. Неспецифическая устойчивость, индуцируемая либо возбудителем антракноза, либо вирусом некроза табака, защищала растения по крайней мере против 13 видов патогенов, включая облигатные и факультативные паразитические грибы, вирусы и бактерии, вызывающие локальные и системные инфекции. SAR коррелировала с системным накопление межклеточной кислой пероксидазы и хитиназы, ингибиторов протеиназ, лигнина и отложением каллозы, т.е. факторами иммунного ответа. Системная устойчивость появлялась через 48-72 часа после заражения листа-индуктора, затем достигала своего максимума, причем этот период совпадал с появлением симптомов на листе-индукторе. Установлено, что системная устойчивость транспортируется по растению снизу вверх. Так, привой дыни или арбуза на подвой огурца, содержащего лист-индуктор, индуцировал устойчивость в привое. Термическая обработка флоэмы черешка листа-индуктора блокировала сигнальный транспорт устойчивости. Чрезвычайно интересным представляется обстоятельство, что устойчивость передается растениям - регенерантам через культуру тканей. Однако наше понимание биохимических механизмов, связанных с SAR, мало прогрессировало до открытия PR-белков, коррелирующих с распространением SAR. Их обнаружение помогло найти маркеры SAR, которые предшествовали бы биохимическим ответам. С этой целью были изолированы кДНК, которые образуются в свободных от инфекции тканях зараженных растений. Таким образом, используя систему табак - ВТМ, были обнаружены мРНК по крайней мере 9 семейств генов, которые постоянно индуцируются в незараженных листьях зараженных растений. Они получили название семейства SAR- генов. Начало экспрессии SAR- генов составляет примерно 6 часов после заражения и соответствует периоду, когда устойчивость может быть определена фенотипически. Более того, абиотические агенты, которые индуцируют устойчивость, такие как салициловая или 2,6дихлоризоникотиновая кислоты, вызывают экспрессию того же спектра SARгенов и примерно с той же интенсивностью. Таким образом, экспрессия SARгенов коррелирует с состоянием устойчивости. Некоторые SAR- гены, очевидно, играют активную роль в устойчивости. Так, оказалось, что ряд кодируемых кДНК белков или имели непосредственную антимикробную активность, или обладали ферментативными свойствами, приводящими к созданию антимикробных белков. К их числу относятся классы SAR- генов, кодирующие β-1,3-глюканазы и хитиназы. Другой класс SAR- генов, кодирующих богатую цистеином группу белков, называемых тауматинами. Тауматин -подобные белки известны как антигрибные продукты, активность которых определяется их способностью нарушать мембранную целостность, что является основанием для названия этого класса перматины. Одна из групп SAR- генов - PR-1 белки, функция которых пока неясна, однако известно, что они широко распространены у покрытосемянных растений. PR-1 белки из табака и томатов подавляют in vitro рост Phytophthora infestans. Дальнейшее подтверждение участия SAR- генов в устойчивости следует из опытов с трансгенными растениями. Табак и капуста, несущие ген хитиназы из бобов, оказались защищенными от Rhizoctonia solani. Высокий уровень экспрессии PR-1 в трансгенных растениях табака приводил к снижению заболеваемости Perenospora tabacina и Phytophthora nicotiana. Таким образом, некоторые SAR- гены кодируют белки, обладающие антимикробной активностью, и экспрессия этих генов в растениях обеспечивает возрастание SAR. Хотя экспрессия генов SAR особенно хорошо изучена на табаке, у других видов растений в ответ на атаку патогенов также индуцируется активность SAR-генов. Иногда, как, например, в Arabidopsis, эти гены относятся к семейству генов, обнаруженных в табаке. В других случаях, к примеру, в огурцах, SAR- гены отличаются от генов табака. Возможно, что разные таксономические группы растений могут иметь собственную сеть SAR- генов, которые возникают в ответ на эволюционный прессинг специфических патогенов. Основной вопрос, который интересует сейчас всех исследователей - это каким образом индуцируется устойчивость в тканях растений, находящихся на расстоянии от места инфекции. Предполагается, что в растениях существуют некие мобильные молекулы, которые могут активировать механизм устойчивости в клетках, удаленных от места инфекции. Существование подобных мобильных сигналов было предсказано Россом. Предложено несколько критериев, которым должны удовлетворять соединения, претендующие на роль межклеточных системных сигнальных молекул. Последние должны синтезироваться в растении, передвигаться по нему, количественно возрастать после повреждения растительной ткани и индуцировать защитные механизмы. Существуют по крайней мере два параллельные пути передачи межклеточных сигналов. Первый из них связан с молекулами, сигнализирующими о поранении растительной ткани, независимо от того, является ли это поранение механическим или вызвано вредителем. Второй тип сигнальных молекул специфичен только для патогенной инфекции бактериальной, грибной или вирусной. Сигнальной молекулой второго типа является салициловая кислота (СК). Подобное деление в значительной мере условно, поскольку некоторые из раневых сигнальных молекул индуцируют защитные механизмы, локализующие распространение инфекции, тогда как сигналы, вызываемые инфекцией, могут стимулировать процессы раневой репарации. Кандидатами на роль системных сигналов служат СК и некоторые ее производные, жасмоновая кислота (ЖАК) и ее метиловый эфир (Ме-ЖАК), системин и этилен, а также возможно, некоторые олигосахарины и абсцизовая кислота (рис. 51). Поскольку СК является одной из наиболее вероятных претендентов на роль сигнальных молекул, связанных с патогенной инфекцией, именно о ней и пойдет в дальнейшем речь. Салициловая кислота Предполагается, что в высших растениях существуют два возможных пути биосинтеза СК (рис. 52). В обоих случаях СК синтезируется из транскоричной кислоты либо через о-кумаровую кислоту, либо через бензойную кислоту. По первому пути транс-коричная кислота вначале превращается в оксикоричную, а потом в СК. Такой путь образует связующее звено между патогенной индукцией фенилпропаноидного биосинтеза и SAR- сигнальной индукцией. По другому пути транс-коричная кислота окисляется в бензойную, а затем гидроксилируется по орто-положению в СК. Конечным этапом синтеза второго пути является превращение бензойной кислоты в СК с помощью кислой бензоил 2-гидроксилазы с возможным участием цитохрома Р-450. Установлено, что активность кислой бензоил 2-гидроксилазы в инфицированных тканях возрастает примерно в 10 раз, и это возрастание блокируется ингибиторами белкового синтеза. СК была давно известна в медицине как терапевтическое средство, но лишь недавно стало ясно, что она является активным ингредиентом и для синтезирующих ее растений. Из всех испытанных производных бензойной кислоты только СК, ее ацетильное производное (аспирин) и 2,6дигидробензойная кислота были способны индуцировать в табаке устойчивость к вирусу некроза табака и PR- белки. Устойчивость к различным патогенам индуцируется не только у табака, но и у томатов, огурцов, картофеля, сои и некоторых других растений. Роль СК в устойчивости растений представляется достаточно сложной и противоречивой, она зависит от многих обстоятельств (концентрации СК, интервала между обработкой и инфицированием и других факторов), а иногда переходит в свою противоположность - восприимчивость к болезни. СК хорошо соответствует требованиям к системным сигнальным молекулам: она легко распространяется по сосудам флоэмы, поскольку ее физические свойства близки к идеальным для дистанционного транспорта по ситовидным трубкам, системно возрастает в десятки раз под влиянием патогенов и способна индуцировать у растений некоторые защитные механизмы. В растениях СК присутствует не только в свободной форме, но и в виде гликозидов, хотя по флоэме транспортируется только свободная форма. Предполагается, что гликозид - СК является неактивной запасающей формой, которая может быстро высвобождать СК на участке развивающейся инфекции. Чрезвычайно интересно, что СК накапливается в растительных тканях только в ответ на инфицирование, но не возрастает в механически пораненных тканях. Наиболее убедительные доказательства участия СК в качестве сигнала SAR получены из опытов с трансгенным табаком, в геном которого встроен ген nahG из бактерии Pseudomonas putida, кодирующий синтез салицилат гидроксилазы. Этот фермент катализирует превращение СК в катехол, который не является SAR- индуктором. Растения, экспрессирующие ген nahG, не накапливают СК в ответ на инфекцию патогенами и не способны индуцировать SAR в ответ на вирусные, бактериальные или грибные инфекции. Эти опыты прямо свидетельствуют об участии СК в SAR- сигнализации, но из них остается неясным, является ли СК дистанционным, продолжительным системным сигналом, передвигающимся по флоэме, или какие-то иные сигналы индуцируют ее синтез в отдалении от инфицированного листа. В других опытах СК и кислая пероксидаза (как маркер SAR-гена в огурцах) были измерены в различных тканях огурца после удаления листаиндуктора, инокулированного Pseudomonas syringae. Оказалось, что удаление индукционного листа через 4-8 часов после инокуляции (перед накоплением СК), не предотвращало системной индукции СК и экспрессии генов SAR. Эти опыты свидетельствуют о наличии системных сигналов, отличных от СК. В 1991 году Чен и Клессинг выделили из тканей табака белок, с которым связывается СК. Этот белок связывал только СК и ее аналоги, способные индуцировать устойчивость и экспрессию PR- генов. СК- связывающий белок оказался каталазой, активность которой блокировалась после связывания с СК. Отсюда возникло предположение, что в результате блокирования каталазной активности накапливается перекись водорода, которая либо сама по себе, либо через другие формы активного кислорода активирует экспрессию защитных генов, действуя как внутриклеточный мессенджер. Вероятно, ингибирование каталазы перекрывает основной канал расходной части перекиси водорода, вызывая ее накопление. Это приводит не только к интоксикации патогена, но и к СВЧ, укреплению клеточных стенок в результате сшивок белков и углеводов, производимых при участии пероксидазы, образованию ингибиторов протеиназ и т.д. Предполагается, что образующихся в клетке активных форм кислорода недостаточно, для того чтобы вызвать реакцию СВЧ. Как показано выше (стр. ) активные формы кислорода действуют синергически с оксидом азота. СК принимает активное участие в системе трансдукции, вызываемой активными формами кислорода и оксидом азота. На этом основании СК даже заслужила название «системного усилителя» этого каскада реакций. Дальнейшие исследования показали, что СК способна связываться не только с каталазой, но и с некоторыми другими Fe- содержащими ферментами: аскорбатпероксидазой, аконитазой, липоксигеназой. Еще один СК- связывающий белок найден в листьях табака. Он обратимо связывался с СК и имел к ней сродство в 150 раз более высокое, чем сродство к каталазе. Интересные данные были получены при исследовании нового синтетического элиситора защитных реакций растений бензотиадиазола, который является функциональным аналогом СК. Так же как и СК, это вещество способно ингибировать каталазу и аскорбатпероксидазу и даже в большей степени, чем СК, индуцирует экспрессию защитных генов (генов кислых PR-1, PR-2 и PR-3). С тех пор как было установлено участие СК в системной сигнальной индукции PR- белков и SAR, оптимистический настрой успел смениться чувством легкого разочарования. 1) Прежде всего, оказалось, что с помощью СК удается индуцировать SAR совсем не у всех растений, а иногда кратковременный период устойчивости сменяется восприимчивостью к болезни. 2) Эксперименты, проведенные с трансгенными растениями, однозначно показали, что СК не является единственной сигнальной молекулой SAR, однако ее присутствие необходимо как для передачи сигнала, так и для индуцирования устойчивости. 3) Новые надежды в понимании роли СК возникли, когда было обнаружено, что рецептором СК является каталаза, а накапливающаяся в результате блокирования каталазы перекись водорода индуцирует защитные реакции клеток. Однако оказалось, что СК связывает не только каталазу, но и некоторые другие Fе- содержащие ферменты. Связывать каталазу и, как следствие, индуцировать SAR и PR-белки кроме СК способны также 2,6-дихлоризоникотиновая кислота, бензотиадиазол и янтарная кислота. 4) СК обладает способностью связываться с каталазой лишь некоторых видов растений или их органов. Все вышесказанное отнюдь не отрицает участие СК в SAR и индуцировании защитных ответов, лишь ставит под сомнение универсальность ее действия. Возможно, что характер SAR может различаться у разных растений, находящихся в условиях различных стрессов. По прежнему очевидной остается активная роль СК в трансдукции сигнала от внешнего лиганда до экспрессии защитных ответов, хотя нельзя забывать, что параллельно с участием СК могут функционировать и иные пути трансдукции таких сигналов. Жасмоновая кислота и ее метиловый эфир После СК жасмоновая кислота (ЖАК) и ее метиловый эфир ( Ме-ЖАК) являются наиболее реальными претендентами на участие в SAR. Однако до сих пор не установлено, являются ли они системными сигнальными молекулами либо внутриклеточными мессенджерами, а возможно, сочетают в себе обе функции. В настоящем разделе изложены данные об участии жасмонатов в явлении SAR. Схема биогенеза жасмонатов представлена в разделе «Трансдукция cигнала» (стр. ). Интенсивные исследования последних лет существенно продвинули наши представления о физиологической роли и механизмах действия жасмонатов. Полученные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что жасмонаты могут опосредовать протекание химических реакций, связанных со стрессоустойчивостью растений. Значительно меньше известно об их роли в индуцировании устойчивости растений к фитопатогенам. Содержание ЖАК и Ме-ЖАК увеличивается после механического поранения растительных тканей, а также после обработки элиситорами суспензионной культуры клеток различных видов растений. Экзогенный жасмонат приводит к синтезу целого набора, так называемых «жасмонат-индуцируемых белков», обладающих видовой специфичностью. Среди них имеются ингибиторы протеиназ I и II, ингибитор трипсина, тионин, напин, круцеферин, некоторые запасные белки, фенилаланин-аммонийлиаза, халкон синтаза, липоксигеназа. Предшественники жасмонатов (например, 12-оксофитодиеновая кислота) проявляют даже большую активность в индуцировании белков, чем сами жасмонаты. Для многих растений продемонстрировано индуцирование специфических полипептидов и белков под действием ЖАК, но лишь для некоторых из них выявлена функциональная активность. К настоящему времени определились две функции ЖАК-индуцируемых белков: это запасные белки, а также белки, участвующие в защите растительных тканей от болезней и стрессов (ингибиторы протеиназ и тионины). Тионины являются функциональными аналогами ингибиторов протеиназ. Это низкомолекулярные полипептиды, имеющие около 45 аминокислотных остатков, обогащенные SH-группами. Тионины локализованы в клеточных стенках растений. Они токсичны для грибов и бактерий и, по-видимому, участвуют в защитных реакциях растений против фитопатогенов, поэтому некоторые сведения о них даны в гл. 4 при описании фитоантципинов. Высказано предположение, что жасмонаты являются интегральной частью системы передачи сигнала, регулирующего в растениях индукцию защитных генов (Gudlach et al.,1992). Считается, что жасмонаты могут действовать на этапе между элиситорно-рецепторным комплексом и экспрессий генов, кодирующих образование ферментов и белков, необходимых для защитных ответов. Можно представить две возможности участия жасмонатов в индуцировании защитных генов: ЖАК и Ме-ЖАК могут сами являться элиситорами, индуцирующим образование в растениях защитных соединений; жасмонаты, не индуцируя или слабо индуцируя реакции устойчивости, способны усиливать действие элиситоров. Экзогенный Ме-ЖАК в концентрации 10-6- 10-5 М даже в отсутствии элиситоров индуцирует в суспензионной культуре клеток различных растений синтез вторичных метаболитов. Жасмонат и его предшественик 12оксофитодиеновая кислота индуцировали различные ФА в культурах клеток более 30 видов растений. Вместе с тем у других видов растений экзогенно добавленный жасмонат не вызывал синтеза вторичных защитных метаболитов. Так, в суспензионной культуре петрушки Ме-ЖАК индуцировал лишь следы кумарина. Однако прединкубация суспензионной культуры с Ме-ЖАК повышала ее чувствительность к низким концентрациям биогенных элиситоров, приводя к усилению секреции кумарина, отложению фенолов в клеточных стенках и продукции активированного кислорода. Хотя Ме-ЖАК самостоятельно не индуцировал образование ришитина в картофеле, его присутствие усиливало ришитинобразующую активность низких концентраций арахидоновой кислоты и увеличивало некрозообразование клубней картофеля (Ильинская и др., 1997). По-видимому, возможен синергизм действия Ме-ЖАК и арахидоновой кислоты, либо Ме-ЖАК усиливает трансдукцию сигнала от элиситора к экспрессии защитных генов. Недавно в листьях картофеля было обнаружено производное ЖАК – 12-(5-β-Д-глюкопиранозил)-жасмонат. Это соединение является эндогенным фактором клубнеобразования картофеля. Агликоновая часть гликозида получила название тубероновой кислоты (рис. 53). Уровень эндогенного жасмоната быстро возрастает в пораненных тканях растений. А поскольку ЖАК способен транспортироваться по флоэме, предполагают, что именно жасмонаты могут быть межклеточными посыльными, осуществляющими передачу информации к неповрежденным клеткам. Для индуцирования высокого уровня ингибиторов протеиназ достаточно менее 1 nL Ме-ЖАК. Обработка листьев томатов предшественниками ЖАК (линоленовой и гидрооксипероксилиноленовой кислотами) индуцировали ингибиторы протеиназ. Структурно близкие соединения, которые тем не менее не являются предшественниками ЖАК, не индуцировали накопление ингибиторов протеиназ. Эти результаты, наряду с присутствием ЖАК во флоэме, подтверждают, что производные липидов могут выступать в качестве системным сигналов в растениях. Ме-ЖАК участвует в передаче раневого сигнала через атмосферу, поскольку является летучим соединением при комнатной температуре.. Неповрежденные растения томатов при выращивании в камере, содержащей летучую фракцию Ме-ЖАК, накапливали ингибиторы протеиназ в таких же количествах, как это имело место при поранении. Газообразный Ме-Жак, который конституционно выделяется растением полыни, индуцировал накопление ингибиторов протеиназ в листьях томатов, находящихся в той же камере. Ме-Жак оказывал системный эффект и на взаимодействие картофеля и возбудителя фитофтороза. Так, если диски клубней картофеля инкубировали в камере, атмосфера которой была насыщена Ме-ЖАК, в них индуцировались такие же защитные ответы, как и при локальном применении жасмонатов (Ильинская и др., 1997). Летучесть Ме-Жак наряду с ее биологической активностью позволяет предположить, что он, подобно этилену, может осуществлять аллелопатическое взаимодействие между растениями или их органами. Наряду с ингибиторами протеиназ жасмонаты способны активировать ряд ферментов: фенилаланин-аммиаклиазу, халконсинтазу, оксиметилглютарилСоА-редуктазу и др. Жасмонаты являются активными элиситорами липоксигеназы в растительных тканях. Так, быструю экспрессию липоксигеназы наблюдали в сое в результате поранения или обработки жасмонатами. В дисках клубней картофеля, обработанных Ме-ЖАК, возрастала как сама липоксигеназа, так и ее мРНК. Более того, Ме-ЖАК приводил к возрастанию транскриптов липоксигеназы даже в анаэробных условиях, при которых механическое поранение не индуцировало активности этого фермента. Одной из предполагаемых функций липоксигеназ в растениях является их участие в защитном ответе растительных тканей на патогенную атаку. Ингибиторы липоксигеназ подавляют фитофтороустойчивость клубней картофеля, способствуя тем самым распространению инфекции. Интересно, что Ме-ЖАК полностью снимал отрицательное действие ингибитора липоксигеназы, при этом развитие фитофтороза в тканях клубня картофеля оказалось даже ниже, чем в контрольном варианте . Системин Системин является единственным пептидом, обладающим гормоноподобным действием в растениях. Он был обнаружен в лаборатории Райана в 1992, а в следующем году была определена его структура. До открытия системина единственными молекулами в растениях, участвующих в клеточной коммуникации, были небелковые соединения относительно низкого молекулярного веса. Полипептид системин состоит из 18 аминокислотных остатков. Он был изолирован из листьев томатов сначала в виде высокомолекулярного предшественника, содержащего 200 аминокислот и названного просистемином. Синтез системина индуцируется либо механическим поранением, либо повреждением насекомыми. Пока системин обнаружен только в надземных органах (но не в корнях) томатов и картофеля. Соответственно поранение любой надземной части этих растений вызывает индукцию системина. Экзогенный системин в чрезвычайно низкой концентрации (40 фмолей) индуцирует у томатов экспрессию ингибиторов сериновых протеиназ, идентичных тем, которые образуются в ответ на поранение или повреждение грызущими насекомыми. Предполагается, что ингибиторы являются индуцибельными защитными соединениями, препятствующими легкой усвояемости белков насекомыми. Используя меченый системин, удалось установить, что этот полипептид в течение 30 минут распространяется по всему листу от точки его нанесения. Через 3 часа его уже удавалось обнаружить во флоэмных эксудатах срезанных листьев томатов. Последнее доказывает, что системин может системно передвигаться по флоэме. Поранение одного листа томатов индуцирует транскрипцию мРНК системина по всему растению. Правда, это не исключает возможность того, что накопление системина в разных частях растений может быть следствием неких иных раневых сигналов. Полагают, что системин связывается с мембранным рецептором и тем самым активирует липазу, освобождающую линоленовую кислоту. Последняя служит источником жасмонатов, которые и могут индуцировать системин. Не исключено также, что могут существовать и другие сигналы, индуцирующие системное накопление системина. Все еще неизвестно, индуцирует ли системин СВЧ или его накопление объясняется только поранением. Неясно также, каковы взаимоотношения между системином, СК, жасмоновой кислотой и этиленом. Трудно судить, является ли повышение уровня системина по всему растению результатом его транспорта из пораненного участка ткани или же некий неизвестный сигнал индуцирует накопление системина на расстоянии, что и приводит к системной активации генов ингибиторов протеиназ. Однако тем не менее нельзя исключить, что быстрая индукция системина при поранении, его способность передвигаться по флоэме и индуцировать защитные белки делает последний одним из возможных кандидатов на трансдукцию SAR . Олигогалактурониды Олигогалактурониды иногда рассматриваются как сигнальные молекулы, которые регулируют системный ответ растительных тканей. Эти пектиновые фрагменты клеточных стенок растений как бы повторяют эффект поранения, системно индуцируя ингибиторы протеиназ у томатов. Ингибиторы протеиназ могут быть индуцированы столь малыми по размеру молекулами, как димеры галактуроновой кислоты. Вместе с тем оказалось, что олигогалактурониды со степенью полимеризации больше 6 не способны транспортироваться по тканям, в которые они были введены. Однако поскольку малые олигомеры галактуроновой кислоты были мобильны в растениях, олигогалактурониды нельзя совсем исключать из числа возможных системных сигналов. Правда, столь малые мобильные фрагменты пектиновых веществ не были найдены в листьях растений, но они могут присутствовать в созревающих плодах и опадающих листьях. Было бы интересно определить, индуцирует ли поранение локальную индукцию полигалактуроназ, которые освобождают олигогалактурониды, индуцирующие системные сигналы. Локальное образование олигогалактуронидов весьма возможно, поскольку многие грибные и бактериальные патогены обладают набором пектолитических ферментов. Таким образом, возможность того, что пектиновые фрагменты в ряде случаев могут быть триггером системных ответов не должна быть проигнорирована. Возможно, что молекулы олигосахаринов разной химической природы и степени полимеризации могут иметь различную способность транспортироваться по тканям и индуцировать защитные ответы. Этилен Этилен является газообразным растительным гормоном, который регулирует многие физиологические процессы . Интерес к участию этилена в SAR определяется тем , что заражение растений патогенной флорой часто сопровождается выделением этилена. Продуцирование этилена оказывалось особенно высоким за несколько часов до появления реакции СВЧ и было пропорционально ее интенсивности. Установлено, что элиситоры из клеточных стенок растений и грибов повышают выход этилена как из тканей растений, так и из их суспензионных культур. Этилен индуцирует несколько PR-белков. Так, при обработке табака этафоном ( вещество, освобождающее этилен ) индуцировались транскрипты основных и некоторых кислых изоформ PR-белков 1-й, 2-й 3-й и 5-й групп. У ряда растений этилен индуцировал основную хитиназу и β-1,3-глюканазу. Этилен активирует фенилаланин-аммиаклиазу и пероксидазу , тем самым, участвует в укреплении клеточных стенок растений (в процессе лигнификации). В тканях, обработанных этиленом, накапливаются белки, богатые оксипролином, которые участвуют в поперечном связывании клеточных стенок. Однако все структурные изменения, индуцируемые этиленом, ограничиваются зоной, прилегающей к инфекции или поранению. До сих пор существует сомнение, достаточна ли доза этилена, образующегося при реакции СВЧ или поранении, для индукции системной устойчивости. Тем не менее, имеется ряд положений, подтверждающих роль этилена в качестве сигнальной молекулы SAR: - этилен быстро диффундирует из зоны инфекции; - синтез этилена возрастает при поражении патогенами; - этилен индуцирует некоторые PR-белки, играющие защитную роль. Таким образом, функция этилена в SAR до сих пор остается неясной. Абсцизовая кислота Абсцизовая кислота может играть роль системного сигнала в индукции ингибиторов протеиназ в пораненных тканях растений. Дефицитные по абсцизовой кислоте томаты и картофель лишены этой способности. Обработка абсцизовой кислотой одного листа приводила к ее накоплению в другом необработанном листе, что свидетельствует о флоэмной или ксилемной мобильности этого вещества. Локальное повреждение листа вызывает накопление абсцизовой кислоты и индукцию ингибиторов протеиназ. Не исключено однако, что через рану могут транслоцироваться другие сигналы, которые и вызывают накопление абсцизовой кислоты. Это подтверждают данные Райана, который наблюдал, что абсцизовая кислота не индуцирует накопление ингибиторов протеиназ у растений томатов. Таким образом, роль абсцизовой кислоты в индукции защиты растений к патогенам до сих пор остается сомнительной. Арахидоновая кислота и эйкозаноиды Арахидоновая кислота (АК), входящая в состав мембранных и запасных липидов, является незаменимой жирной кислотой для человека и животных. АК и в меньшей степени эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) представляют собой предшественники биологически активных эйкозаноидов. Окисление АК с помощью циклооксигеназы приводит к образованию универсальных гормонов животных - простагландинов, тромбоксанов и простациклинов, тогда как под действием липоксигеназы образуются лейкотриены, а также ряд активных гидроперокси- и гидрооксипроизводнных. Эйкозаноиды участвуют в реализации многих физиологических эффектов, оказывая опосредующее влияние на функции ферментов, гормонов и медиаторов у человека и животных. Простагландины регулируют систему циклических нуклеотидов, определяющих протекание десятков метаболических процессов. АК входит в состав диацилглицерина, играющего одну из основных ролей в системе фосфоинозитола, передающего сигнальную информацию с поверхности клетки. Хотя большинство эйкозаноидов обусловливают межклеточные контакты, некоторые из них могут действовать как вторичные мессенджеры. В здоровых тканях покрытосемянных растений АК и ЭПК не обнаружены. Считается, что высшие растения в ходе эволюции утратили жирные кислоты С-20 ряда, используя в качестве эквивалента кислоты С-18 ряда - линолевую и линоленовую. Утратив АК и ЭПК, растения, тем не менее, сохранили способность к окислительным превращениям этих кислот. Можно полагать, что отсутствие АК и ЭПК не только не ослабило растения, но даже дало им определенные преимущества в борьбе с патогенной микрофлорой, содержащей в своем составе кислоты С-20 ряда. Не исключено, что растения приобрели способность использовать продукты окисления АК и ЭПК в качестве элементов распознавания системных сигналов, оповещающих растения о грозящей опасности. Удалось показать (Ильинская, Озерецковская и др.,1987, 1989), что системной фитофтороустойчивости картофеля можно добиться, обрабатывая растения малыми концентрациями (10-8 - 10-7 М) АК. При этих концентрациях АК не вызывала некротизации растительных клеток и образования ФА. Однако все ткани клубней, обработанные с поверхности АК, приобретали системную фитофтороустойчивость. Состояние устойчивости постепенно распространялось от обработанной поверхности клубня к центру, и сохранялось в течение нескольких месяцев. Затем устойчивость постепенно уменьшалась в порядке, обратном тому, в котором она развивалась. Индуцирующее действие элиситора сильнее всего оказывало влияние на способность патогена формировать споры: процесс спорообразования подавлялся полностью, тогда как рост мицелия - лишь наполовину. Обработка низкими концентрациями АК защищала клубни не только от возбудителя фитофтороза, но и от ряда других грибных и бактериальных болезней. Обработанные ткани также быстрее и интенсивнее реагировали на поранение В индуцированных АК клубнях картофеля возрастала активность пероксидазы, полифенолоксидазы, липоксигеназы, а также содержание фенольных соединений. Однако из всех 4 показателей только активность пероксидазы и липоксигеназы коррелировали с распространением системного индуцирующего эффекта по тканям картофеля. В системно индуцированных тканях возрастал объем агранулярного ретикулума, число митохондрий, количество лейкопластов с дифференцированной стромой. По-видимому, часть паренхимных клеток, ранее выполнявшая функции запасания крахмала, приобретала способность к активным биосинтетическим процессам, что и определяло повышенную устойчивость клубней к инфекции и поранению Таким образом, выделено несколько последовательных этапов развития системной продолжительной устойчивости клубней картофеля: 1) Период от нанесения элиситора до формирования системного сигнала. 2) Период распространения сигнала по тканям картофеля, длительность которого прямо пропорциональна удаленности ткани от места нанесения элиситора. 3) Период перестройки обмена и структуры растительной ткани, продолжающийся от получения системного сигнала растительной клеткой до наступления устойчивости. 4) Период системной индуцированной устойчивости, который в зависимости от обстоятельств может продолжаться от нескольких недель до нескольких месяцев и даже года. 5) Период постепенного выхода из состояния иммунизации, когда структуры тканей и все биохимические характеристики возвращаются к норме. Приведенные данные предполагают возникновение в индуцированных клубнях неких межклеточных сигналов, которые распространяются по всем тканям, последовательно превращая их в иммунизированные. Представляется возможным ориентировочно рассчитать скорость продвижения таких сигналов. Зная средний размер клубней и его клеток, удаленность каждого опытного слоя от поверхности обработки, а также время, в течение которого последний приобретает фитофтороустойчивость, можно определить, что скорость распространения системного сигнала по тканям клубня в среднем составляет О.2-0.25 мм или 2-3 клетки за час. Выше уже сообщалось, что в отличие от элиситоров другой природы АК не связывается с рецепторами, а депонируется в мембранах растительных клеток, замещая в них свойственные растению линолевую и линоленовую кислоты. Установлено, что 90% экзогенно добавленной АК уже через 2 часа обнаруживается в составе липидов картофеля, главным образом, в его фосфолипидах, тогда как 2-5 % АК сразу же после обработки подвергаются окислению. Поскольку АК не свойственна растениям вообще и картофелю в частности, ее включение в состав фосфатидилинозитдифосфата и образующегося из него диацилглицерина, может изменить их регуляторные свойства и инициировать тем самым механизм устойчивости. С другой стороны, фосфолипазы картофеля должны постепенно освобождать АК из состава фосфолипидов, восстанавливая гомеостаз клубня. Порционно высвобождаемая АК будет подвергаться окислительным превращениям под действием липоксигеназы. Установлено, что липоксигеназа картофеля способна превращать экзогенную АК в биологически активные продукты, близкие к эйкозаноидам, образуемым животными. Вопрос о том, могут ли продукты окисления АК и ЭПК претендовать на роль сигнальных молекул у растений, пока остается открытым. Однако некоторые простагландины в концентрации 10-10 - 10-7 М оказались способными индуцировать фитофтороустойчивость картофеля. Защитными системными свойствами в тех же концентрациях обладали и 5-оксиэйкозатетраеновая, 15оксиэйкозатетраеновая и 5-оксиэйкозапентаеновая кислоты, а также лейкотриен ЛТС4. Обработка тканей картофеля ингибиторами липоксигеназы блокировало индукцию защиты картофеля с помощью АК. Полученные результаты указывают на участие эйкозаноидов в индуцировании системной устойчивости картофеля. Особо следует подчеркнуть чрезвычайно низкие концентрации, в которых эти вещества проявляют биологическую активность. Помимо картофеля АК индуцирует системную устойчивость у томатов, сахарной свеклы, огурцов, кукурузы и некоторых других растений. Не исключено, что период индуцирования, в течение которого продуцируются сигналы системной устойчивости, будет определяться длительностью депонирования АК в липидах обработанных растений. Не химические сигналы Физиологи растений и фитопатологи, исследуя стрессовые сигналы растений, чаще всего имеют в виду воздействие определенных веществ. Это и неудивительно, поскольку химические соединения могут быть изолированы и охарактеризованы. Вместе с тем хорошо известно, что продолжительная дистанционная сигнальная информация у животных, передаваемая через мышечные волокна и нервные клетки, а также при освобождении гормонов, сопровождается электрическими сигналами. Известно, что нервные клетки с одного конца чувствительны к химическим или физическим стимулам, тогда как с другого - могут испускать химический сигнал-нейромедиатор, действующий на другие клетки. Стимуляция одного конца нервной клетки вызывает электрическое возбуждение (потенциал действия), которое быстро распространяется до другого конца, где и освобождается нейромедиатор. Текучесть возбудимых мембран, необходимая для генерации потенциала действия, основывается на ассиметрическом накоплении ионов на одной стороне мембраны. Подобная разность потенциалов может создаваться благодаря передвижению таких ионов как натрий, калий, кальций. Продолжительный дистанционный электрический сигнал может играть важную роль и в системных возбуждениях растительных тканей. Установлена индукция потенциала действия в ответ на поранение растительной ткани. Так, размельчение ткани листа томатов или их кратковременный ожог приводит к генерации потенциала действия, который распространяется по растению При поранении и локализованной инфекции происходят выход из клетки К+ и Cl- и вход Са2+. Эти физиологические изменения необходимы для генерации потенциала действия. Многие системные изменения, индуцируемые поранением, могут быть объяснены созданием в зоне поранения потенциала действия. Поэтому нельзя исключить, что именно потенциал действия и является транслокационным сигналом, ответственным за системную индукцию ингибиторов протеиназ в пораненных тканях томатов, а вовсе не те или иные соединения, перемещающиеся из зоны поранения. Потенциал действия хорошо коррелирует с системным накоплением ингибиторов протеиназ, индуцируемых олигогалактуронидами, которые деполяризуют клеточные мембраны. Системная индукция ингибиторов протеиназ блокировалась, если растительные ткани были обработаны ингибиторами мембранного ионного транспорта. Интересно, что одним из таких наиболее эффективных ингибиторов ионного транспорта оказалась СК. Убедительные доказательства участия потенциала действия в качестве системного сигнала приведены в опытах Уилдона с коллегами (1992). Авторы охлаждали черешок листа, блокируя тем самым передвижение из него метаболитов. Хотя такая обработка препятствовала оттоку, но она не сказывалась на системной генерации потенциала действия. Из этих опытов был сделан вывод, что системный сигнал, индуцированный поранением, является по своей природе скорее электрическим, чем химическим. Вместе с тем существует мнение, что потенциал действия недостаточно активен для системного накопления ингибиторов протеиназ и SAR. Таким образом, участие потенциала действия в SAR пока еще не ясно. Открытие все новых и новых участников системных сигналов SAR, по-видимому, является делом недалекого будущего. В частности, в лишенных ядер ситовидных трубках тыквы обнаружен белок, транспортирующий растительные мРНК. Возможно, по сосудам растений могут передвигаться различные молекулы долгоживущих мРНК. Но уже сейчас можно утверждать, что исследования в этом направлении будут стимулировать разработку новых технологий защиты растений от болезней и стрессов. Поддержание высокого иммунного статуса растений особенно актуально сейчас в виду неблагоприятной экологической обстановки, которая определяет создание иммунного дефицита не только у человека и животных, но и у растений. ГЛАВА 8 ГЕНЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ИХ ПРОДУКТЫ По аналогии с Avr-генами, продукты которых вызывают в зараженных растениях серию описанных выше защитных реакций, мы будем называть Virгенами гены, продукты которых обеспечивают защиту патогена от иммунного ответа растения-хозяна. Такая защита может быть обеспечена тремя способами: 1/. Потеря или изменение структуры узнаваемых рецепторами растения молекул - специфических элиситоров, вследствие чего внедрение паразита становится незамеченным, а его взаимоотношения с растением – совместимыми. В связи с этим рецессивные аллели генов авирулентности часто называют генами вирулентности. Поскольку, как было отмечено выше, в качестве элиситоров обычно выступают соединения или абсолютно необходимые паразиту, или, по крайней мере, повышающие его приспособленность, полная потеря элиситора не всегда возможна, а его модификации дают лишь временный эффект, вследствие высокой вариабельности структуры R-генов. 2/. Супрессия защитных реакций на претрансляционном уровне. Теоретически такая супрессия может быть обусловлена: а/ модификацией рецепторов растительной клетки, перестающих вследствие этого узнавать элиситоры; б/ ин’активацией ферментов, регулирующих этапы стрессового метаболизма (ФАЛ, фарнезилциклаза др.); в/ ингибированием этапов базового метаболизма клетки (энергетических цепей, мембранного транспорта и др.), вследствие чего клетка теряет способность к иммунным реакциям. Отсюда вытекает, что супрессоры могут быть слабо токсичными для клеток, не вызывающими видимого повреждающего эффекта, и высокотоксичными, вызывающими повреждения и гибель клеток растений. Первые названы импединами, вторые – патотоксинами. 3/. Химическая детоксикация токсичных для микроорганизмов продуктов стрессового метаболизма – фитоалексинов и фитоантиципинов, осуществляемая ферментами паразитов, которые модифицируют молекулы растительных антибиотиков. CУПРЕССОРЫ (ИМПЕДИНЫ) В противоположность токсинам некротрофных патогенов, которые разрушают растительную ткань, молекулы супрессоров лишь предотвращают проявление устойчивости, позволяя патогенам проникать в растение и существовать в нем. Такие вещества по предложению японских исследователей Oуши и Oку (1981) были названы импединами по аналогии с термином, заимствованным из медицины и обозначающим нетоксические вещества бактериального происхождения, способные подавлять противоинфекционные механизмы защиты. Согласно концепции совместимости, предложенной К. Оуши, предварительное заражение растения патогенным грибом делает его доступным для последующего инфицирования авирулентной расой того же гриба или даже непатогеном. Подобный тип предрасположенности изучался на широком наборе мучнисторосяных грибов. Было обнаружено, что 45 изолятов патогенов из 51 оказались способными инфицировать листья ячменя, не являющегося для них хозяином, если листья предварительно были зараженных совместимой расой патогена ячменя Erysiphe graminis f.sp.hordei. Этот эффект не ограничивался клетками, содержащими гаустории, но распространялся с помощью диффузии на соседние окружающие клетки. Действующее вещество было изолировано из апопластного пространства пораженных клеток и оказалось низкомолекулярным. Эти эксперименты стимулировали поиски супрессоров из других патосистем (табл. 33). Поскольку исследователи использовали различные методы, то неудивительно, что супрессоры не всегда были гомогенными по структуре и имели различные свойства. Супрессоры могут присутствовать как в тканях инфицированных растений, так и в клетках патогенов. Главная проблема выделения супрессора заключается в том, что, как правило, и супрессор, и элиситор присутствуют в одном и том же источнике: мицелии гриба, в культуральной или в апопластной жидкостях. При таких условиях супрессор может полностью или частично маскироваться высокой элиситорной активностью. Так, супрессор синтеза ФА гороха пизатина содержится вместе с элиситором в жидкости, в которой прорастали пикноспоры Mycosphaеrella pinodes. Элиситор и супрессор Phytophthora infestans присутствовали в мицелии и спорах гриба. Супрессор Аscochyta rabiai обнаружен вместе с элиситором в культуральном фильтрате гриба. Таблица 33. Грибные биотические супрессоры устойчивости высших растений (Beismann, Kogel, 1995) Источник Происхождение Химическая Расовая спе- Ссылка природа Нет данных Цифичность Нет Heath (1981) Белок Нет Да Ржавчина Фасоли Cladosporium fulvum / томаты Апопластная Жидкость Апопластная Жидкость Phytophthora Жидкость после прорастания спор/ мицелий Глюкан Культуральный Фильтрат Культуральный фильтрат Гликопротеин Нет Культуральный фильтрат Апопластная жидкость / жидкость после прорастания спор Гликопротеин Нет Infestans / картофель Ascochyta rabiei / нут Phytophthora megasperma / соя Mycosphaerella pinodes / горох Puccinia graminis / пшеница Гликопротеин Да Нет данных Нет Peever and Higgins (1989) Garas et al. (1979) Kessman and Barz (1986) Ziegler and Pontzen (1982) Yamamoto et al. (1986) Beiβmann et al. ( in press) Оптимальным потенциальным источником изолирования супрессора (также как и расоспецифического элиститора) является апопластная жидкость. Идеальным объектом для собирания апопластной жидкости является несовершенный гриб Cladosporium fulvum - возбудитель оливковой плесени томатов - по причинам, описанным выше (стр. ). Активные супрессоры белковой природы были получены из апопластной жидкости листьев томата, зараженных C.fulvum, и названы EPS1 и EPS2. Потеря этих белков вследствие инактивации кодирующих генов приводила к сильному снижению агрессивности. Апопластная жидкость, полученная из зараженных совместимыми штаммами ржавчинных грибов из фасоли, подсолнечника и пшеницы, увеличивала восприимчивость фасоли к возбудителю ржавчины коровьего гороха, который является авирулентным к фасоли. Апопластная жидкость из листьев томата, инфицированных C. fulvum, также как и из фасоли, пораженной ржавчиной, предотвращала образование некроза и каллозы в ответ на обработку неспецифическим элиситором из этого же гриба. Супрессор лигнификации был обнаружен в апопластной жидкости листьев пшеницы, зараженных стеблевой ржавчиной и отделен от элиситора с помощью гель-фильтрации. Для того чтобы выделить супрессор, отделенный от элиситора, следует соблюдать несколько условий. 1) Элиситор должен быть использован в определенной концентрации с тем, чтобы не маскировать супрессорную активность. 2) Следует определить оптимальный период обработки растений, как элиситором, так и супрессором. 3) Определение должно быть легким и быстрым, чтобы с его помощью можно было бы проанализировать много образцов. В настоящее время трудно определить структурную детерминанту супрессорной активности. Так, из двух совместимых рас Phytophthora megasperma была выделена инвертаза, которая ингибировала накопление глициоллина в семядолях сои. Она оказалась маннанопротеином, активной частью которого были углеводы. Cупрессор из Mycosphaerella pinodes был гликопептидом, активной частью которого оказался пептид, поскольку проназа и протеиназа разрушали супрессорную активность. Активной составляющей супрессора из межклеточного пространства листьев пшеницы, также как и жидкости после прорастания спор Puccinia graminis являлось низкомолекулярное соединение с м.м. меньше 5 кDа. Периодатное окисление, протеолитическая деградация, тепловая обработка, кислый гидролиз не влияли на активность супрессора, указывая на то, что ни углеводы, ни белки не являлись активной частью супрессора. Если большинство моделей элиситорного действия предполагает, что первичным сайтом элиситора является рецептор, локализованный на поверхности растения, то действие супрессора может быть многообразным. Предполагается, что супрессор может вмешиваться в связь между элиситором и соответствующим рецептором, прерывать сигнальную трансдукцию, ингибируя образование вторичных мессенджеров, подавлять активацию генов, а также ингибировать ферменты, ответственные за синтез защитных веществ. Например, в листьях гороха, обработанных смесью неспецифического элиситора и супрессором из Mycosphaerella pinodes, наблюдается задержка экспресии мРНК фенилаланиламмиак лиазы и халконсинтазы, по сравнению с листьями, обработанными только элиситором. Это свидетельствует о действии супрессора на претрансляционной стадии. Предполагается, что супрессор из апопластной жидкости C. fulvum, поражающего листья томатов, энзиматически расщепляет неспецифический элиситор того же гриба. Такой вывод сделан на основании того, что нагревание подавляет супрессорную активность. Активность β-глюканового супрессора из P. infestans, вероятно, зависит от взаимодействия элиситора и супрессора на рецепторном сайте. Если супрессор смешивали с микросомальной фракцией, в которой, как предполагается, находится рецептор, то некротизация клубней картофеля и образование ФА подавлялись. Специфичность действия супрессора из P. infestans, то есть его способность подавлять иммунный ответ картофеля на несовместимую расу патогена, оказалась свойственна только β- глюканам, выделенным из совместимых рас (Озерецковская и др., 1982). Наиболее убедительным свидетельством специфичности действия супрессора служили данные, полученные на сортах и расах картофеля, взаимоотношения которых взаимопротивоположны (сорта и гибриды картофеля с генами R1 и R4 и соответствующие расы паразита 1 и 4). Оказалось, что реакция сортов картофеля на заражение расами паразита была аналогичной реакции этих сортов на обработку выделенными из тех же рас глюканов, что является достаточно веским аргументом в пользу специфичности последних. О специфичности супрессора Mycosphaerella pinides на видовом уровне свидетельствует данные, представленные в табл. 34. Как видно, паразит груши Alternaria kikuchiana не поражает бобовых растений, однако, предварительная обработка листьев супрессором M.pinodes, делает восприимчивыми только те сорта, которые восприимчивы и к продуценту супрессора. Следовательно, в данном случае супрессор, - главный фактор, ограничивающий круг растенийхозяев. Таким образом, если взаимодействие супрессора с клетками растенияхозяина высоко специфично, то восприимчивость обработанной супрессором ткани становится неспецифичной т.е. проявляется не только к индуцирующему восприимчивость патогену, но и к видам, данное растений не поражающим (табл. 35). Таблица 34. Колонизация бобовых растений (в баллах) Mycosphaerella pinodes и Alternaria kekuchiana с предобработкой супрессором (F5) и без нее (Ouchi et al.,1982) ______________________________________________________________ Растения Степень формирования инфекционных гиф (в баллах) M.pinodes Pisum sativum 4 A.kikuchiana Без F5 C F5 0 4 Trifolium pratense 1 0 1 T.repens 0 0 0 Lotus corniculatus 0 0 0 Millettia japonica 2 0 1 Lespedezia buergeri 2 0 2 Vigna sinensis 0 0 0 Medicago sativa 1 0 1 Glycine max 0-1 0 0 Vicia faba 0 0 0 Arachis hypogaeca 0 0 0 На механически пораненных участках клубней картофеля образуется раневая перидерма, залегающая близко к поверхности поранения и имеющая высокие защитные свойства. Обработка дисков картофеля глюканамисупрессорами, выделенными из совместимых рас возбудителя фитофтороза, подавляет процесс раневой репарации, препятствуя паренхимным клеткам картофеля закладывать феллоген и возобновлять меристематическую активность (рис. 58). Однако подавление меристематической активности клеток под воздействием супрессора носило лишь временный характер. По прошествии нескольких дней поверхностно расположенные клетки, обработанные супрессором,.возобновляли меристематическую активность и начинали формировать перидермальные комплексы. В результате образуется аномальная многоярусная перидерма, в которой один перидермальный комплекс как бы нагромождался на второй. По-видимому, клетки, находящиеся на поверхности поранения, под влиянием супрессора лишь временно теряли способность распознавать раневые сигналы и возобновлять меристематическую активность. Клетки, расположенные в более глубоких слоях, куда супрессоры не проникали или проникали в малой степени, начинали делиться и формировать раневую перидерму. Как только действие супрессора прекращалось, поверхностные клетки также начинали делиться и формировать перидерму, что и приводило к образованию многоярусных комплексов. Таблица 35. Влияние глюканов-супрессоров, выделенных из совместимой и несовместимой к сорту картофеля Любимец рас Phytophthora infestans, на степень поражения клубней разными грибами (Медведева, 1985) _______________________________________________________________ Виды грибов Число покоричневевших клеток клубня (в % к обработке водой), предварительно обработанного глюканами совместимой расы несовместимой расы Phytophthora infestans 224 73 Colletotrichum atramentarium 224 125 Fusarium culmorum 138 61 Phoma exiqua 140 70 P.cupyrena 144 113 Botrytis cinerea 270 118 Cladosporium cucmerinum 155 95 Magnoporthe grisea 192 89 Alternaria alternata 154 92 _____________________________________________________________________ Обнаруженный факт позволяет предполагать, что под действием глюканов-супрессоров, выделенных из совместимых с определенным сортом картофеля рас паразита, происходит не необратимое подавление защитных реакций, а только их временная задержка. В свете сказанного можно полагать, что глюканы-супрессоры либо подавляют процесс образования раневого гормона, ответственного за раневую репарацию, либо изменяют к нему компенентность растительных клеток. ПАТОТОКСИНЫ Любые токсины паразитов, включая неспецифичные вивотоксины (стр. ), являются иммуносупрессорами, ибо, вызывая повреждения клеток растения, ингибируют их способность активно сопротивляться инфекции. Например, токсин возбудителя ранней пятнистости листьев картофеля Alternaria solani альтернариевая кислота вызывает деполяризацию мембран и супрессирует реакцию сверхчувствительности клубней устойчивых к фитофторозу сортов картофеля. В отличие от неспецифических вивотоксинов ниже будут рассмотрены токсины, повреждающие только определенные виды или даже сорта растений. Некоторые из них являются первичными факторами патогенности (без токсина организм не способен быть паразитом) и получили название «токсины, специфичные для хозяев», другие, как и вивотоксины, вторичные факторы, резко усиливающие патогенность на определенных видах или сортах (токсины, селективные для хозяев). Объединяющим эти группы соединений названием является термин «патотоксины». Продуценты патотоксинов и болезни, вызываемые ими История изучения патотоксинов полна драматических событий в судьбе нескольких важных сельскохозяйственных культур. В сороковых годах ХХ в. в США для создания новых сортов овса широко использовалась гибридизация с сортом Виктория, имеющем ген Pc-2, который придавал устойчивость ко всем североамериканским расам возбудителя корончатой ржавчины Puccinia coronata. Потомки этих гибридов заняли в разных штатах от 80 до 100% площадей под овсом. Вскоре новые сорта стали погибать от неизвестной болезни, вызывающей загнивание корневой шейки и побурение листьев. Возбудителем болезни оказался ранее неизвестный гриб, названный Helminthosporium victoriae (современное название анаморфы Bipolaris, а сумчатой стадии Cochliobolus victoriae). В среде его роста накапливался токсин, названный викторином, который вызывал повреждение только сортов овса, имеющих ген Pc-2. После снятия этих сортов с производства болезнь исчезла так же стремительно, как и возникла, а ее возбудитель, как и до массового распространения сорта Виктория, изредка встречается в почве в качестве сапротрофа или слабого паразита стареющих растений злаков. В 1970 г. в США возникла эпидемия южного гельминтоспориоза кукурузы, вызванная родственным грибом Bipolaris maydis (телеоморфа Cochliobolus heterostrophus). Эпидемия захватила в первую очередь сорта кукурузы, имеющие техасский тип цитоплазматической мужской стерильности (Т-цмс). Эти сорта не формируют жизнеспособной пыльцы и не способны к самоопылению, поэтому их семена всегда гибридные. Имея Т-цмс, можно получать высокоурожайные гетерозисные гибриды кукурузы, не прибегая к дорогостоящему приему механического обламывания мужских соцветий. Находящийся в митохондриях ген Т-цмс широко использовался в селекционных программах – его имели сорта, занимавшие около 85% всех посевов кукурузного пояса в США. Южный гельминтоспориоз кукурузы был хорошо известен фитопатологам, но, никогда не вызывал существенного урона. Эпидемию 1970 г. вызвала новая раса гриба (раса Т), которая в отличие от прежней расы 0 оказалась чрезвычайно токсичной для сортов, имеющих Т-цмс. Из среды роста Т-расы был изолирован токсин, повреждающий только клетки кукурузы, имеющей ген цмс. Производителям кукурузы в Америке пришлось отказаться от выращивания кукурузы с Т-цитоплазмой, после чего концентрация расы Т упала. После эпидемии в Америке Т-раса C.heterostrophus распространиласть по всему миру. Большой урон от нее несет кукуруза и в южных районах России. В 1971 г. в Америке был идентифицирован возбудитель опасной болезни сахарного тростника – глазковой пятнистости (темные пятна на листьях, окруженные светлым ореолом). Им оказался гриб Bipolaris (Неlminthosporium) sacchari, в культуральной жидкости которого также накапливался токсин, специфически повреждающий только восприимчивые сорта сахарного тростника. Если в Новом Свете большинство грибов, продуцирующих специфические для хозяина токсины, относятся к формальному роду Helminthosporium (хотя и не только к нему: подобными токсинами обладают Phyllosticta maydis на кукурузе и Periconia circinata на сорго), то в Японии патотоксины обнаружены у грибов из рода Alternaria. Эти грибы и их токсины вызывают образование черных пятен на восприимчивых сортах груши (A.kekuchiana), яблони (A.mali), земляники (A.fragariae), томата (A.lycopercici), тангарина (A.citri) и др. По морфологическим признакам все они относятся к одному морфологическому виду A.alternata, - широко распространенному в филлоплане многих видов растений. На живых растениях A.alternata питается листовыми эксудатами; на стареющих и ослабленных листьях – паразитирует, вызывая образование мелких черных пятен; после гибели листьев – заселяет растительные остатки. Полагают, что мутации отдельных генов приводят к продуцированию специфических для хозяина токсинов, превращая безобидный обитатель филлопланы в высоко патогенного паразита. Такие мутанты были выделены экспериментально из сапротрофного штамма A.alternata (табл. 36). Таблица 36. Мутанты A.alternata, продуцирующие токсины (Nishimura et al., 1982) Число пятен на 1 см2 листа Изоляты Продукция токсинов Груши (сорт Nijisseiki) Яблони (сорт Red Gold) 0-94 0,0 0,0 0-94-Р1 20,7 0,0 АК* 0-94-Р2 27,5 0,0 АК 0-94-Р33 12,6 0,0 АК 0-94-А3 0,6 13,8 АМ** 0-94-А19 0,6 10,3 АМ 0-94-А21 0,7 17,2 АМ • - АК – токсин A.kekuchiana, АМ - токсин A.mali Поэтому альтернариям, имеющим специфичные для хозяев токсины, присвоен статус патотипов (или специализированных форм) вида A.alternata. Для всех исследованным к настоящему времени патотоксинов характерны очень низкая токсическая концентрация по отношению к восприимчивым растениям и высокая селективность (табл. 37). Таблица 37. Патотоксины некоторых фитопатогенных грибов _____________________________________________________________________ Гриб Хозяин Токсин Летальная доза для Селективность чувствительного сорта _____________________________________________________________________ Cochliobolus victoriae овес C.caronum викторин кукуруза НС-токсин 0,3 нг/мл > 106 0,5 мкг/мл 101 Bipolaris sacchari сахарный HS-токсин 30 нг/мл > 106 тростник Alternaria alternata тангарин АС-токсин 30 нг/мл 104 груша АК-токсин 10 нг/мл > 104 яблоня АМ-токсин 2 нг/мл 106 f.sp.citri A.alternata f.sp. kekuchiana A.alternata f.sp.mali (нанесение на листья) 0,1 нг/мл 105 (погружение черешков) Химический состав По химическому строению патотоксины объединяют в несколько групп: Циклические пептиды, в которых аминокислоты соединены нематричным синтезом. Таковы викторин C.victoriae, НС-токсин C.carbonum, АМ-токсин A.alternata f.sp. mali (рис. 55). Все они содержат наряду с распространенными аминокислотами – необычные. Так группа циклических пентапептидов (викторины а, b, c) содержат 5,5-дихлорлейцин, трео-β-оксилизин, эритро-βокслейцин, α-амино-β-хлорариловую кислоту. Специфичность рецепции, повидимому, связана с остатком глиоксиловой кислоты. Тетрапептид НС-токсин наряду с пролином двумя аланинами имеет 2-амино-8-оксо-9,10 эпоксдеканоевую кислоту (АОЕ), которая, по-видимому, определяет токсичность пептида, ибо разрыв эпоксидного кольца приводит к потере токсичности. Сходную с НС-токсином структуру имеет ингибитор деацетилирования гистонов млекопитающих трапоксин, поэтому полагают, что аналогичное действие на гистоны Н-токсина приводит к подавлению экспрессии генов иммунного ответа. Из генома токсигенных штаммов C.carbonum клонирована область, в которой находятся необходимые для синтеза (соединение и циклизация аминокислот) токсина ферменты HTS-1 и HTS-2. АМ-токсин, представлен тремя формами, имеющими разную токсичность, и имеет вид циклического тетрапептида, содержащего L-аланин, дегидроаланин, изоформы L-аминовалериановой кислоты, замкнутых в кольцо лактонной связью и соединенных с p-метоксифенильной группой. Линейные поликетолы (рис. 55) образуют два гриба – Т-раса Cochliobolus maydis и Phyllosticta maydis, специфически патогенные для кукурузы с Т-цмс. Несколько гомологичных Т-токсинов различаются длиной цепи (от 39 до 41 атомов углерода). Синтез Т-токсина находится под контролем нескольких генов. Ген FKS1 (Tox1A) ответственен за синтез фермента поликетидсинтазы, который строит поликетидную цепочку, ген DEC1 (Tox1B) – декарбоксилазы, удаляющей терминальные карбоксилы. Эти гены находятся на разных хромосомах. РМ-токсины имеют более короткие цепи (33-35 атомов углерода). Для проявления токсичности важны общая длина цепи и наличие не менее 3-х окисленных групп (кластеры =О –ОН =О). Гликозидную структуру имеют HS-токсины Bipolaris sacchari - βгалактофуранозиды, у которых 2 молекулы галактозы соединены глюкоздными связями с сесквитерпеновым агликоном. Отщепление сахаров от агликона снимает токсичность, но не снимает способность защищать ткани от повреждения нативным токсином. Следовательно, сесквитерпеновая часть молекулы ответственна за токсичность, а галактофуранозидная – за связывание рецептором (специфичность). Токсины Alternaria alternata f. kekuchiana (AK), A.a. f. fragaria (AF) и A.A. f. citri (ACT) представляют собой замещенные 9-метилдекатриеновой кислоты (рис. 55). Сходство строения обусловливает перекрестную патогенность – все три токсина, как и их продуценты вызывают некрозы на листьях груши. Механизмы специфичности и токсичности Низкая летальная доза и высокая селективность указывают на рецепторный механизм специфичности (устойчивые растения не имеют сайта связывания токсина). Первые симптомы, наблюдаемые уже через несколько минут после обработки клеток чувствительных растений токсинами, выражаются в утечке метаболитов и электролитов, деполяризации мембранного потенциала, инвагинации мембран. Поэтому считают, что рецепторы патотоксинов расположены на мембранах. АК-, HS-, AF-, ACT-токсины связываются с цитоплазматической мембраной, Т-, РМ- и ACR-токсины – с мембраной митохондрий, АМ-токсин – с плазмалеммой и мембраной хлоропластов. Для поиска рецепторов культуру гриба выращивают на среде, содержащей радиоактивно меченую соль, и по радиоактивной метке определяют фракцию мембраны, с которой связался токсин. Для установления специфичности рецепции необходимо соблюдение нескольких условий: 1/ связывание должно быть генетически специфичным (с фракцией чувствительного, но не устойчивого растения); 2/ оно должно коррелировать с биологической активностью (химические модификации токсина, снижающие токсичность, уменьшают и афинность связывания); 3/ связывание должно быть лигандоспецифичным (немеченый токсин защищает от связывания меченного). Для некоторых токсинов эти условия были соблюдены, выделены растительные сайты связывания и исследованы механизмы токсичности. Меченый 125I викторин связывается с двумя белками овса 100 kD (Ркомпонент) и 15 kD (Н-компонент). Соединение с первым рецептором происходит только in planta и в комбинации с фракциями чувствительного сорта, со вторым – как в чувствительном, так и в устойчивом in planta и in vitro. Функционально оба белка являются формами фермента глициндекарбокислазы, принимающего участие в фотодыхании: О2 + рубиско → рибулозо-1,5-бисфосфат → фосфогликолиевая кислота → гликолиевая кислота. Последняя поступает в пероксисомы, где окисляется пероксидазой до глиоксиловой кислоты, которая конвертируется в глицин. В митохондриях глицин декарбоксилируется глициндекарбоксилазой и ацетилируется сериноксиметилтрансферазой до СО2, NH3, NAD+ и серина. Это – очень важный цикл в функционровании растительных клеток, ибо мутации по гену глициндекарбоксилазы, как правило, летальны. У человека мутации этого гена вызывают тяжелую болезнь гиперглицинемия. Собственно, ферментом является Р-белок, но в присутствии Н-белка его активность увеличивается в 10 000 раз. Т- и РМ-токсины вызывают повреждение мембран митохондрий кукурузы, имеющей цмс. В результате происходит потеря Са2+ и NAD+, разобщение окислительного фосфорилирования. Во внутренней мембране Т-митохондрий имеется белок с молекулярной массой 13 kD (URF13), отсутствующий в нормальных митохондриях. Он ответственен за мужскую стерильность и чувствительность к токсинам. По-видимому, в соединении с токсином белок URF13 полимеризуется и образует трансмембранные каналы, через которые происходит утечка электролитов. Контролирующий белок ген (T-urf13) клонирован и перенесен в модельные про- и эукариоты (кишечную палочку, дрожжи, дрозофилу, табак). Все трансгенные объекты стали чувствительными к Т-токсину. Устойчивость растений к токсинам обусловлена, главным образом, отсутствием рецепции. Однако известны случаи, когда устойчивость связана с деградацией токсина в растении. Так устойчивые к C.carbonum сорта кукурузы производят фермент НС-токсинредуктазу, разрушающий НС-токсин. Биологическая роль патотоксинов и экология продуцентов Патотоксины многих грибов являются первичными детерминантами их патогенных свойств. Это показано во многих опытах. После нанесения на лист овса сорта Виктория капли викторина, этот лист может быть заражен не только различными фитопатогенными грибами, в норме овес не поражающими, но даже условно патогенными видами. Гибриды между штаммам Cochliobolus victoria и C.carbonum расщеплялись на 4 класса: патогенные для овса, патогенные для кукурузы, патогенные для обеих культур и непатогенные, причем штаммы, относящиеся к первому классу, продуцировали викторин, ко второму – НС-токсин, к третьему – оба токсина, а к четвертому – токсинов не формировали. Таким образом, патотоксины полностью парализуют защитный потенциал растительных клеток, делают их беззащитными против нападения. Для понимания роли патотоксинов интересны исследования, проведенные с грушами, зараженными A.alternata f. kekuchiana (Nishimura et al., 1976). Авторы наблюдали два пика действия токсина (по потерям электролитов) в растениях: через 4 и через 9 час. после заражения. Первый пик вызван выделением АКтоксина прорастающими спорами. За 4 часа прорастания спора выделяет 10-6 мкг токсина; эта концентрация не убивает клетки, но ее достаточно для нарушения ряда функции (включая иммунный ответ) около 100 клеток в зоне внедрения. Таким образом, первый пик потери электролитов вызван прорастающими спорами и является решающим для заражения. Второй пик вызван токсином, выделяющимся из растущего в тканях мицелия. Значительно более высокая концентрация токсина убивает клетки, что проявляется в виде черных пятен вдоль жилок, появляющихся через 11-12 час. после заражения. Таким образом, биологические концентрации токсинов, “используемые” грибами для заражения, как раз достаточны для подавления защитного потенциала, но не являются летальными. Грибы – продуценты патотоксинов, вызвали несколько жестоких эпифитотий сельскохозяйственных культур. Однако, причина этих эпифитотий – селекционная деятельность человека, выражающаяся в придании растениям таких противоестественных свойств, как, например, мужская стерильность. В природных фитоценозах эти грибы не накапливаются и не имеют эпидемиологического потенциала вследствие двух обстоятельств. 1. Продуценты патотоксинов высоко патогенны, часто летальны для восприимчивых растений. Поскольку мутации, приводящие к устойчивости возникают часто, а давление отбора очень высокое, появление подобного паразита в растительной популяции быстро приведет к отмиранию чувствительных особей и накоплению устойчивых. 2. Штаммы, продуценты патотоксинов, имеют пониженную жизнеспособность и выдерживают конкуренцию с лишенными токсинов мутантами того же вида только при наличии восприимчивых растений. При устранении таковых из популяций, концентрация токсигенных штаммов быстро падает. Так было с видом C.victoria после прекращения выращивания сорта овса Виктория и его потомков и с расой Т C.heterostrophus после снятия с производства гибридов кукурузы с Т-цитоплазмой. У некоторых грибов отбор против токсигенных штаммов настолько велик, что даже на восприимчивых культурах они встречаются очень редко. Так в садах, где выращивали чувствительные к АК-токсину сорта груши, из 510 изолированных штаммов A.alternata только 11 штаммов (2%) продуцировали токсин (в популяциях, изолированных из резистентных сортов такие штаммы составляли 0,1%). Среди изолированных в посевах чувствительных сортов сорго штаммов Periconia circinata только 25% продуцировали токсин, причем в корнях сорго токсигенных штаммов было гораздо больше, чем в почве (34% против 13%). Снижение приспособленности токсигенных штаммов по сравнению с нетоксигенными может быть вызвано высокими энергетическими затратами на синтез токсина (в мицелии Т-расы C.heterostrophus содержание токсина составляет 3% cухого веса) или сцеплением с летальными генами (область Tox1 гена того же гриба сцеплена с реципрокной транслокацией). Иммуносупрессия, как биологическое свойство широко используется биотрофными паразитами растений. Некротрофы супрессируют защитный потенциал живой клетки грубым методом – ее умерщвлением. Так как биотрофы питаются содержимым живых клеток, им приходится применять более тонкие механизмы супрессии - импедины и патотоксины, которые супрессируют защитные свойства, будучи использованы паразитами в концентрациях ниже летальных. Поскольку супрессированные клетки частично или полностью «разоружены», они становятся легкой добычей не только биотрофа – продуцента супрессора, но и сопутствующих слабопатогенных видов, не способных заражать интактные растения. Например, как было сказано выше, супрессор Phytophthora infestans ингибирует формирование в картофельном клубне раневой пердермы, отделяющей поврежденную ткань от здоровой. Поэтому пораженные фитофторозом клубни становятся легкой добычей различных гнилостных микроорганизмов (грибов и бактерий). Партии картофеля, не пораженные фитофторозом, имеют гораздо более высокую лежкость, чем пораженные, несмотря на то, что сам гриб P.infestans в нормальных условиях хранения не вызывает гибели зараженных клубней и не переходит из них в здоровые. Фитопатологам хорошо известно комплексное заболевание льна «фузариоз по ржавчине», при котором ткани, окружающие пустулу ржавчины, вследствие супрессивного воздействия этого биотрофного паразита, становятся высоко восприимчивыми к фузариозу. Связь между индукцией и супрессией Исследования патотоксинов представляют интерес и для изучения связи между двумя фундаментальные свойствам паразитов – индукцией и супрессией защитных реакций, иными словами, связей между генами с «плюс» и « минус» функциями. Например, викторин токсичен лишь для сортов овса, имеющих ген устойчивости к корончатой ржавчине (возбудитель Puccinia coronata) Рс2. Гибридизационные тесты показали, что устойчивость к ржавчине (Pc2) и восприимчивость к Cochliobolus victoriae, т.е. чувствительность к викторину (ген Vb) контролируются одним локусом. Следовательно рассматриваемый ген овса по отношению к P.coronata имеет «плюс»- функции устойчивости (его рецессивный аллель обеспечивает восприимчивость), а вирулентность паразита имеет «минус»- функции, что соответствует схеме Флора «ген- на ген». По отношению к C.victoriae (и викторину) тот же ген имеет «плюс»-функции восприимчивости (рецессивный аллель придает устойчивость), а взаимоотношения хозяин – паразит представлены в виде инвертированной схемы «ген-на ген» (табл. 38) Таблица 38. Взаимоотношения овса с двумя грибными паразитами Гены овса Гены паразитов P.coronata A C.victoriae a Tox tox Pc2 (Vb) R S S R pc2 (vb) S S R R Эти противоречия оказываются примеримыми при изучении количественных соотношений между факторами вирулентности паразитов (викторином) и устойчивости овса (фитоалексином авенолюмином) (табл. 39). По отношению к неспецифическим элиситорам различий между изогенным линиям овса с геном Рс2 и без него не наблюдалось. Викторин в очень низких пикограммовых количествах у линии овса с геном Рс2 не вызывал ожога листьев, но индуцировал синтез авенолюмина, т.е. вел себя как специфический элиситор; в более высоких концентрациях викторин, наоборот, не индуцировал авеналюмина, но вызывал гибель клеток у сортов с тем же геном. По-видимому, это обусловлено тем, что для включения генов иммунного ответа необходимы живые клетки растения. Таблица 39. Индукция авенолюмина (в мкг/г сырой ткани) различными элиситорами (Mayama et al.,1986) Элиситоры Изогенные линии овса X-469 (Pc2 или Vb) X-424 (pc2 или vb) Вода Следы Эндогенный неспецифический элиситор 43 53 Миколаминарин (β-глюкан), 250 мкг/мл 38 34 Викторин, 10 пг/мл 86 Следы Следы Следы 10 нг/мл Следы Таким образом, один и тот же ген растения в ответ на низкую концентрацию одного и того же грибного метаболита (викторина) функционирует как ген устойчивости, а в ответ на более высокую концентрацию – как ген восприимчивости. Возможно, эти данные имеют более фундаментальное значение: одно и то же соединение паразита в разных концентрациях и в разных сортах хозяина может служить специфическим элиситором или специфическим супрессором. Помимо вышеописанного примера есть и другие, подтверждающие такое заключение. 1/. Специфические супрессоры Phytophthora infestans ослабляют защитные реакции в восприимчивых к продуценту сортах картофеля, но усиливают такие реакции в устойчивых сортах, т.е. в зависимости от генотипа хозяина они могут быть супрессорами или элиситорами. 2/. Avr- гены некоторых видов бактерий и vir-гены других видов или штаммов имеют гомологичные последовательности ДНК. 3/. Экспрессия гена avrD Pseudomonas savastanoi pv. tomato и, соответственно, элиситорная активность его продукта различна в разных штаммах видах бактерий. 4/. Продукты Hrp-генов бактерий необходимы для индукции свч-реакции в нехозяевах (элиситоры) и патогенности для хозяев (супрессоры). 5/. Белок NIP1 Rhinchosporium secalis одновременно является специфическим элиситором для растений, имеющих ген Rps1, и фактором неспецифической патогенности, т.е. супрессором (стр. ). Такую же двойственную функцию несет белок ESP2 Cladosporium fulvum, потеря которого не только снижает общую патогенность, но и делает восприимчивыми некоторые устойчивые линии томата, имеющие, следовательно, специфический для ESP2 рецептор. ФЕРМЕНТЫ, ДЕГРАДИРУЮЩИЕ АНТИМИКРОБНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ Еще одна группа генов, обеспечивающая вирулентность паразитов к определенным видам растений, контролирует синтез ферментов, которые детоксицируют фитоалексины и фитоантиципины. Однако обнаружение подобного фермента в мицелии или среде роста гриба еще не доказывает, что он является первичным фактором вирулентности. Необходимо показать, что такой фермент присутствует в зараженных растениях, что его нет у авирулентных штаммов, что инактивация кодирующего гена приводит к потере вирулентности, а его трансформация в другие виды грибов – к их способности деградировать антибиотик и даже приобретению вирулености к его продуценту. В некоторых случаях эти тесты были проведены. Деградация фитоантиципинов О структуре и механизмах токсичности многих фитоантиципинов речь шла в гл.4. Ниже будут рассмотрены некоторые пути их деградации фитопатогенами. Паразит тюльпана Botrytis tulipae препятствует замыканию агликона тюлипозида в кольцо; в результате образуется не высокотоксичный лактон, а гораздо менее токсичная кислота (рис. 60). Как было сказано выше, локализованный в корнях овса сапонин авенацин защищает от заражения возбудителем корневой гнили Gaeumannomyces graminis. Штаммы этого гриба, способные заражать овес (G.graminis var. avenae), имеют специфичный фермент β-глюкозид гидролазу - авенациназу, отщепляющую сахарные остатки, и переводящую авенацин в нерастворимую менее токсичную форму. Используя поликлональные антитела к очищенной авенациназе в качестве зонда, был клонирован кодирующий ген. Его трансформация в геном гриба Neurospora crassa сделала последний нечувствительным к авенацину. Инактивация гена транпозонным мутагенезом привела к потере способности деградировать авенацин и заражать овес, при сохранении патогенности к непродуцирующей авенацин пшенице. Стероидный гликоалкалоид томатов томатин гидролизуется томатиназой (β-глюкозидазой) штаммов Alternaria solani, выделенными из томатов, но не гидролизуется непатогенными штаммами. У другого паразита томата Septoria lycopersici клонирован ген томатиназы, однако его трансформация в геном Aspergillus nidulans не привела к повышению толерантности. Патогены сорго Gloeosporium sorghi и лядвенца Stemphylium loti имеют фермент цианид гидролазу, осуществляющий конверсию цианида в менее токсичный формамид (рис. 60) Деградация фенольных фитоалексинов Грибы могут модифицировать молекулу птерокарпана (а птерокарпановый скелет имеет большинство фенольных фитоалексинов) различными способами (рис. 61), включающим гидроксилирование колец, разрывы лактонных связей, окисление гидроксилов и др. Образующиеся соединения менее токсичны, чем исходные (табл. 40). Наиболее детально изучена деградация пизатина, благодаря исследованиям, проводимым в лаборатории американского ученого Г. ВанЭттена. Таблица 40. Токсичность фазеоллина и продукта его деградации грибом F.solani f.sp.phaseoli Виды грибов Процент ингибирования роста фазеоллином 1а-оксифазеоллоном Rhizoctonia solani 64 8 Asxochyta pinodes 77 7 Fusarium roseum 84 -4 Cochliobolus carbonum 45 0 Neurospora crassa 90 11 Rhizopus stoloniferum 94 -2 Было показано, что если паразита гороха Nectria hаematococca (анаморфа Fusarium solani f. sp. pisi) выращивать в жидкой питательной среде, содержащей пизатин, то после некоторого лаг-периода начинается рост мицелия, которой сопровождается снижением содержания пизатина в среде и накоплением его производного 3,6а-диокси-8,9 метилендиоксиптерокарпана (рис. 62). Следовательно, в присутствии пизатина в клетках гриба накапливается фермент, отщепляющий метильную группу от С-3 атома, причем lag-период свидетельствует о том, что образование фермента индуцируется пизатином. Среди большого числа природных штаммов N.hаematococca обнаружены как высоко патогенные для гороха, так и непатогенные, причем степень патогенности коррелирует со способностью деметилировать пизатин. При скрещивании патогенного и непатогенного штаммов, гибридные аскоспоры дают две группы штаммов - патогенные и непатогенные, причем только вторые обладали способностью деметилировать пизатин (рис. 63). Продукт деградации пизатина мало токсичен для грибов. Кроме того, он подвергается дальнейшему разрушению до летучих продуктов (CO2 и др.). Деградация пизатина осуществляется с помощью фермента пизатиндеметилазы, который представляет собой широко распространенный у различных организмов (у человека локализованный в печени) связанный с мембраной фермент цитохром Р-450 монооксигеназу. Для проявления его активности требуются цитохром Р-450 и НАДФ-цитохром Р-450 редуктаза. Экспрессиия фермента индуцируется пизатином и репрессируется глюкозой и аминокислотами, т.е. подвержена катаболитной репрессии. У N.haematococca обнаружено несколько генов, контролирующих синтез деметилазы. Ген Pda1 обеспечивает высокую активность фермента, Pda2 и Pda3 – низкую, Pda6 – промежуточную. Рецессивные аллели этих генов представляют собой делеции. Поскольку грибные хромосомы значительно короче хромосом высших эукариот, их можно разделить в электрическом поле, используя специальную методику (импульсный электрофорез). При разделении хромосом N.haematococca было обнаружено, что кроме хромосом, имеющихся у всех штаммов, присутствуют варьирующие в числе мелкие хромосомы (dispensale или В-хромосомы). Эти хромосомы необязательны для существования гриба, но именно на них расположены Pda-гены. Штаммы, потерявшие В-хромосомы, могут существовать лишь как сапротрофы. Ген Pda6 был клонирован и трансформирован в другие грибы – Cochliobolus hetestrophus (паразит кукурузы) и Aspergillus nidulans (сапротроф). Оба трансформанта пробрели способность разрушать пизатин in vitro, что свидетельствует об экспрессии гена, однако только первый наряду с этим стал заражать горох. Этот опыт свидетельствует не только о роли пизатиндеметилазы в патогенности, но и о различиях между базовой патогенностью и специфической вирулентностью. Фитопатогенный вид C.heterostrophus обладает базовой патогенностью, которая, по-видимому, обусловлена многими генами, поэтому приобретение только одного дополнительного гена достаточно для обеспечения его вирулентности к новому хозяину. Сапротроф A.nidulans не имеет базовой патогенности, поэтому ген вирулентности не может обеспечить способность к паразитизму. Наконец, этот опыт свидетельствует о фундаментальных различиях между про- и эукариотными паразитами. Как было показано (с. ), перенесение в геном кишечной палочки только одного гена пектатлиазы делало трансгенные штаммы патогенными для растений. По-видимому, у прокариот переход от сапротрофного существования к паразитическому значительно более простой, чем у эукариот, и обеспечивается всего несколькими генами. Этим объясняется практическое отсутствие бактерий – облигатных паразитов животных или растений и обнаружение штаммов некоторых бактерий, способных паразитировать на растениях и животных. Низшие эукариоты (грибы) для паразитического образа жизни должны иметь систему базовых генов, значительная часть фитопатогенных грибов представлена облигатными паразитами. Наконец у более высоко дифференцированных организмов – беспозвоночных животных и высших растений паразитизм почти всегда облигатный, расхождение между паразитами и не паразитами достигло необратимого уровня. Деградация терпеноидных фитоалексинов Возбудитель сухой гнили клубней картофеля Gibberella pulcaris (анаморфа Fusarium sambucinum) разлагает основные картофельные фитоалексины ришитин и любимин до менее токсичных метаболитов (рис. 64). Например, ришитин вначале превращается в метаболит 1, а затем в метаболит 2, в котором метиленовая двойная связь восстановлена. По мере деградации ришитина теряется его антигрибная активность. Способность штаммов к метаболизации фитоалексинов коррелирует с их патогенностью (табл. 41). Гибридологический анализ штаммов показал, что способность деградирость терпеноидные фитоалексины контролируется несколькими локусами, однако высокая патогенность для картофеля связана только с одним из них (Rim1). Таблица 41. Связь между деградацией любимина и патогенностью к клубням картофеля штаммов Gibberella pulcaris (Desjardius et al., 1989) Происхождение Число Толерантность к Любимин в штаммов штаммов Патогенность (в % любимину (рост культуральной от наиболее патов %% к контролю) жидкости (мкг) генного штамма ___________________________________________________________________ Картофель 8 87 0 55 Не картофель (почва, сосна, кукуруза, 12 33 54 5 кактус, гвоздика) ГЛАВА 9 ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты исследований механизмов патогенности и устойчивости при инфекционных болезнях растений важны прежде всего как фундаментальная основа построения высокоэффективных мероприятий по защите растений от болезней вредителей. Стратегию защиты растений эти исследования не изменили (да и не могли изменить), - как и в традиционной системе превалируют два направления: химическая защита и изменение генома с целью создания устойчивых к патогенам сортов. Однако, кардинально изменились как методические подходы, так и возможности этих направлений. ХИМИЧЕСКАЯ ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ Химическая защита растений традиционно была основана на применении пестицидов, токсичных для фитопатогенных организмов. Использование фунгицидов прошло в своей истории три этапа. Фунгициды первого и второго поколений (неорганические и органические контактные препараты) неспецифичны, обладают широким спектром действия и не повреждают растения лишь потому, что активно поглощаются грибными клетками, но не проникают в ткани растения через кутикулу. Эти особенности создают трудности в тактике химических обработок, ибо необходимо, во-первых, очень тщательно покрывать поверхность обрабатываемых растений (фунгицид действует только при контакте с паразитом), и, во-вторых, многократно повторять обработки. Фунгициды третьего поколения – системные органические препараты специфичны для отдельных групп грибов и не токсичны для растений. Они проникают в растения, распространяются системно в тканях и убивают паразита, находящегося не только на поверхности, но и внутри растения. Поэтому их применение гораздо удобнее, чем применение контактных фунгицидов. Однако, их сайт-специфичность (действие на отдельные структуры или звенья метаболизма) приводит к тому, что модификация чувствительного сайта, может привести к частичной или полной потери чувствительности. Поэтому длительное применение системных фунгицидов, как правило, приводит к потере их эффективности вследствие накопления резистентных штаммов паразитов. Четвертое поколение защищающих растения препаратов представляют собой вещества, направленные не на уничтожение фитопатогенов, а на cнижение их патогенности и повышение защитных свойств растения. Рассмотрим два (на самом деле их больше) направления подобных исследований. Препараты, влияющие на патогенность паразитов Выше (стр. ) был показано, что большое значение для внедрения многих фитопатогенных грибов имеет накопление меланина в клеточной стенке апрессория. Некоторые производные бензола ингибируют синтез меланина в грибной клетке и, тем самым, препятствуют внедрению патогена в растения. Среди таких веществ (антипенетрантов) наибольшее практическое применение имеет трициклазол, широко используемый в Японии и других странах для защиты риса от пирикуляриоза. Этот препарат не влияет на прорастание спор и линейный рост мицелия Magnaporthe grisea, но ингибирует синтез меланина, вследствие чего колонии приобретают светло-розовую окраску вместо темносерой. Некоторые препараты, влияющие на структуру и функции мембран, способны усиливать освобождение из мицелия гриба в среду роста элиситоров, усиливающих защитные свойства растений. Таким эффектом обладали инсектицид цидиал, фунгициды кетацин и хитозан, антибиотик полиоксин при воздействии на прорастающие споры Phytophthora infestans (М.Мустафа, Ю.Т.Дьяков, 1980). Препараты, вляющие на устойчивость растений Кратко рассмотрим следующие пути повышения устойчивости растений к болезням, индуцируемые химическими обработками. 1/. Повышение устойчивост клеточных стенок к атаке пектолитическими ферментами. Таким действием обладают, в частности, некоторые ауксины. 2/. Активизация фенольного метаболизма и оксилительных ферментов, усиление, в связи с этим, синтеза лигнина и повышение прочности клеточных стенок. Подобные процессы наблюдаются у пшеницы, обработанной гербицидом диаллатом, и у риса, обработанного дихлорпропаном. 3/. Индукция синтеза фитоалексинов. Такими свойствами в листьях пшеницы обладали антибиотик хлорамфеникол и гербицид симазин. Принципы защитного действия, описанные в пп 2 и 3, неперспективны, в связи с тем, что синтез защитных соединений – процесс, сопровождаемый высокими энергетическими затратами, а это может привести к снижению урожая. Кроме того, антигрибные растительные соединения – фитоалексины и фитоантиципины токсичны для животных и человека, их накопление в растениях может привести к отравлениям. Причем синтетические индукторы, в отличие от биогенных, ингибируют процессы естественного распада фитоалексинов в растительной ткани, из-за чего опасность токсического действия возрастает. 4/. Сенсибилизация растений, то есть воздействие, при котором защитные реакции протекают только в ответ на заражение. Такая реакция растенияхозяина наблюдается при обработке томатов и хлопчатника динтроанилиновыми гербицидами, пасленовых – фозетилом А1 и флудиоксанилом, томатов – ретардантами из группы гидразина, картофеля – низкими концентрациями неспецифических биогенных элиситоров из мицелия Phytophthora infestans. Это – весьма перспективный механизм защиты, ибо он имитирует в восприимчивых к паразиту растениях реакции, присущие устойчивым формам, поэтому остановимся на нем подробнее. В исследованиях, проведенных под руководством О.Л.Озерецковской, было показано, что обработка клубней картофеля биогенным элиситором из мицелия P.infestasns в высокой концентрации (100 мкг/мл) приводила к интенсивной, но кратковременной защитной реакции (некротизации, накоплению ФА). Обработка элиситорами в низких концентрациях (5 мкг/мл) не вызывала видимых симптомов и накопления стрессовых метаболитов, но сенсибилизовала клетки растения, которые становились устойчивыми к последующему заражению патогеном, причем устойчвость распространялась на все клетки клубня и сохранялась длительное время (до 3 мес). По-видимому, сенсибилизация заключается в подготовке клеток к быстрой реакции на последующее заражение (возрастает объем агранулярного эндоплазматического ретикулюма, число митохондрий, концентрация цАМФ). Авторы исследований постулировали правила, которые необходимо соблюдать, для индукции устойчивости растений к болезням: 1/ индуцирование устойчивости может быть достигнуто с помощью биогенных элиситоров, продуцируемых патогенами; 2/ элиситоры следует использовать в определенных концентрациях, в которых они не вызывают образования ФА в обработанной ткани; 3/ элиситоры должны быть отделены от супрессоров, подавляющих индукцию. Полевые опыты свидетельствуют о том, что обработка растений биогеными элиситорами высоко эффективна и лишена недостатков, присущих фунгицидам. Она характеризуется более высокой экологической безопасностью, так как основывается на активизации природных механизмов устойчивости; системностью и длительностью защитного действия; низкими концентрациями действующего начала; участием в проявлении устойчивости многих защитных систем, что снижает вероятность накопления резистентных форм паразитов; комплексным защитным эффектом против разных патогенных грибов, бактерий, нематод и, возможно, вирусов; отсутствием в урожает токсичных химических веществ; а, в некоторых случаях, и стимулированием ростовых процессов у растений; интенсификацией процессов раневой репарации. В 1997 г. швейцарской фирмой Сиба был выпущен первый коммерческий элиситор Bion (действующее начало – бензотиодиазол), который показал высокую эффективность против мучнистой росы пшеницы. СОЗДАНИЕ УСТОЙЧИВЫХ К БОЛЕЗНЯМ РАСТЕНИЙ МЕТОДАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ Повсеместное внедрение интенсивных технологий в растениеводство сопряжено с рядом негативных процессов, таких как загрязнение окружающей среды и сельскохозяйственной продукции ксенобиотиками, высокими экономическими и энергетическими издержками. Одним из альтернативных путей развития этой отрасли агрономического сектора производства может быть максимальное использование биологического потенциала сельскохозяйственных культур. Определенные надежды в этом плане связаны с генной инженерией – комплексом подходов и методов, позволяющих вносить изменения в конструкцию генома растений с целью направленного изменения их генетических свойств. В основе генной инженерии лежит технология, которая позволяет конструировать в лабораторных условиях генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных (гибридных) молекул (ДНК или РНК). Суть этой технологии заключается в том, что с помощью специфических ферментов - рестриктаз определенный участок ДНК «вырезается» и присоединяется (с помощью фермента лигазы) к другой молекуле ДНК (вектору), которая сохраняет способность к репликации при введении в клетку растения-реципиента. Эта технология в принципе позволяет выделять интересующий исследователя ген из любого организма и, при наличии подходящего вектора, переносить чужеродный ген в желаемое растение, добиваясь его экспрессии там. Применение технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот делает процесс получения новых форм растений более целенаправленным и значительно расширяет возможности манипуляции с геномом растений, сокращая при этом общие временные затраты на получение новых сортов сельскохозяйственных культур. Методы получения трансгенных растений Эффективные методы трансформации (включение чужеродного гена в наследственный аппарат растения-реципиента) существуют для большинства двудольных и некоторых однодольных растений, таких как рис, пшеница, кукуруза. Процесс трансформации осуществляется либо путем использования механизмов естественного обмена генетическим материалом в ходе взаимодействия с растением бактерий рода Agrobacterium, либо путем прямого введения рекомбинантных ДНК в клетки растений (см. рис. 61). Разработка векторных систем для переноса генов в растения началась с выяснения молекулярного механизма опухолеобразования у растений при заражении фитопатогенной бактерией Agrobacterium tumefaciens. Оказалось, что у этой бактерии имеется плазмида (внехромосомный самореплицирующийся генетический элемент), которая способна естественным путем проникать в клетки хозяина и встраивать определенный участок ДНК (Т-ДНК) в растительный геном. При этом в результате интеграции в геном растенияхозяина и экспрессии бактериальных плазмидных генов, существенным образом изменяется метаболизм клетки в сторону образования опухоли (рис. 62). Плазмида A. tumefaciens , вызывающая опухоли, была названа pTi-плазмидой (tumor inducing – индуцирующая опухоль). Эта бактерия способна заражать большинство двудольных растений. Генетический анализ позволил идентифицировать гены, контролирующие способность плазмиды индуцировать образование опухоли, а также гены, кодирующие синтез уникальных аминокислот опинов, в области Т-сегмента pTi-плазмиды. Процесс переноса и интеграции Т-ДНК в растение контролируется генами вирулентности (vir-генами) расположенными на pTiплазмиде за пределами сегмента Т-ДНК, существенной структурной особенностью которого является наличие прямых повторов по 25 пар нуклеотидов на обоих концах сегмента (рис. 63). Включение любого фрагмента ДНК между этими двумя последовательностями приводит к его физическому переносу в хромосому растения. Для достижения экспрессии интегрированного в растительный геном чужеродного гена разработаны векторные системы с использованием модифицированных штаммов агробактерий, которые позволяют вводить в геном практически любые гены, добиваться их экспрессии и регенерировать из трансформированных клеток целые растения. Плазмида pTi представляет собой уникальное явление. Есть основание предполагать, что она является природной химерой, поскольку несет два набора генов: один набор экспрессируется в растения, а другой – в бактериальной клетке. Регуляторные элементы генов, расположенных на сегменте Т-ДНК, предназначены для функционирования в растительной клетке, тогда как остальные гены pTi-плазмиды находятся под контролем бактериальных промоторов. Еще на начальных этапах исследований стало ясно, что манипуляции с целой pTi-плазмидой затруднены из-за отсутствия уникальных сайтов рестрикции в этой большой молекуле. Эта проблема решалась разными путями. Использование промежуточных векторов Суть данного подхода заключается в том, что вначале клонируется Т-ДНК в E. сoli с использованием плазмиды pBR322. Затем, фрагменты ДНК, содержащие целевой ген, встраивают в определенные места Т-ДНК, предварительно выделенной плазмиды и, полученные таким образом химерные плазмиды повторно клонируют в клетках кишечной палочки (рис. 64). Клонированные плазмиды вносят в клетки A.tumefaciens, имеющие плазмиду pTi дикого типа. В результате гомологичной рекомбинации происходит встраивание химерной Т-ДНК из промежуточного вектора в интактную pTiплазмиду дикого типа. Полученные клоны агробактерии, несущие рекомбинантную pTi-плазмиду с целевым геном, используют в опытах по трансформации растений. Использование бинарных векторов Как уже отмечалось, для внедрения pTi-плазмиды необходимы гены, расположенные в vir-области и прямые повторы, ограничивающие Т-ДНК. Оказалось, что для успешной трансформации эти две группы генетических элементов могут быть расположены на разных плазмидах одной и той же бактерии, т.е. в данном случае нет необходимости в гомологичной рекомбинации. В процессе усовершенствования векторных систем получены гибридные плазмиды, представляющие собой сложные конструкции. Созданные структуры значительно меньше по размерам в сравнении с pTi-плазмидой дикого типа, они удобнее для проведения генетических манипуляций. Из Т-ДНК удалены онкогены, отвечающие за опухолеобразование и препятствующие дифференцировке ткани, благодаря чему стала возможна регенерация растений из культуры зараженной ткани. При этом сохранены правый и левый концевые повторы, ограничивающие участок Т-ДНК, между которыми встраивается переносимый в растение целевой ген. Область pTi-плазмиды, отвечающая за вирулентность (vir-гены), также сохранена в трансформирующих плазмидах. В системах бинарных векторов эту функцию обеспечивает плазмида - помощник со встроенной в нее vir-областью. рRi-плазмиды Другой тип плазмид обнаружен у A. rhizogenes, они названы рRiплазмидами (root inducing) и вызывают у растений разрастание корешков. При заражении растений эти плазмиды включают несколько копий T-ДНК в состав растительного генома и способствуют синтезу опинов. Наличие Т-ДНК не оказывает вредного действия на растение-хозяина, что может оказаться причиной предпочтительного использования рRi-плазмид при конструировании трансгенных растений. Естественный спектр растений-хозяев для Agrobacterium ограничен семейством двудольных, поэтому, несмотря на прогресс в области генной инженерии, обусловленный применением этого подхода, необходимы более универсальные методы введения чужеродной генетической информации в растительные клетки. Одним из таких методов является метод биологической баллистики. Метод биологической баллистики Суть метода заключается в «обстреле» клеток растений-реципиентов с помощью специальной вакуумной пушки металлическими микрочастицами с напыленными на их поверхность ДНК вектора, несущего соответствующую конструкцию с целевым геном. Частицы металла (например, вольфрама) имеющие диаметр 0.6 – 1.2 мкм, обычно наносятся на пленку-подложку из целлофана и помещают в пушку напротив выходного отверстия. Суспензия клеток, каллус или незрелые зародыши однодольных помещаются под выходным отверстием пушки на расстоянии 10-15 см. После «выстрела» поток микрочастиц пронизывает клетки, часть из которых остается способной к регенерации. С помощью баллистического метода получены стабильные трансформанты кукурузы, риса, пшеницы, ячменя и других культур. Помимо решения проблемы трансформации однодольных, этот метод позволяет осуществлять прямой перенос ДНК в эмбриогенную пыльцу с последующим быстрым получением трансгенных дигаплоидных растений, пригодных для последующего использования в селекционной работе. Электропорация Другим методом, использующим физическое воздействие на растительные клетки для внедрения в них чужеродной ДНК, является электропорация. Метод основан на повышении проницаемости биологических мембран под действием электрических высоковольтных импульсов. В результате кратковременного воздействия на смесь растительных протопластов с трансформирующей ДНК (напряжение 250 – 300 В, в течение долей секунды) молекулы ДНК проникают в клетки через поры клеточной мембраны. Суспензию протопластов затем разбавляют и высевают на среду для регенерации. Трансформация растительных протопластов При обработке растительных протопластов химическими индукторами слияния на фоне высоких концентраций ионов кальция возможен захват молекул ДНК из раствора сливающимися клетками, в результате чего происходит трансформация протопластов. Несмотря на низкую эффективность трансформации по сравнению с вышеописанными методами данный подход имеет определенные преимущества. Это связано с тем, что метод не требует специальных механизмов для внедрения в клетку растения и интеграции в растительный геном. Чужеродный фрагмент ДНК стабильно включается в структуру ядерной ДНК и, при наличие соответствующих регуляторных областей, экспрессируется. Микроинъекции После решения чисто технической задачи фиксирования протопластов на стекле с помощью полилизина стало возможным введение препаратов чужеродных ДНК в клетки через микроиглы с внешним диаметром около 2 мкм. Эффективность трансформации при этом колеблется в пределах 10 – 20 %. Поскольку видовые ограничения для этого метода пока не известны, то его вполне можно считать универсальным. Гены-маркеры для отбора трансформантов Поскольку частота трансформации, как правило, невелика, то в гибридные плазмиды вводят гены-маркеры для удобства отбора трансформантов на селективных средах. В качестве маркерных используют гены устойчивости к антибиотикам из Esherichia coli (канамицину, хлорамфениколу и т.д.), к которым чувствительны растительные клетки. Помимо генов устойчивости в качестве маркерных генов используются также гены, кодирующие биосинтез фермента люциферазы, выделенного из бактерий рода Vibrio. В этом случае трансформанты выделяются на общем фоне способностью к свечению. Удобным маркером является также ген бактериальной β-глюкуронидазы, который позволяет идентифицировать трансформанты по специфическому окрашиванию селективных сред. Для экспрессии бактериальных генов-маркеров в клетки растений вводятся соответствующие сигнальные последовательности для начала и окончания процесса транскрипции этих генов. В качестве таких регуляторных элементов использовались следующие: - 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК); - промоторы опиновых генов pTi-плазмиды; - промотор гена малой субъединицы фермента рибулозодифосфаткарбоксилазы; - промотор гена белка, связывающего хлорофилл и др. Регенерация трансформантов Наиболее узким местом в технологии трансгеноза является регенерация целых растений из трансформантов. Регенерация легче происходит из многоклеточных структур. Наиболее распространенным методом является метод листовых дисков. Кружочки листовой ткани, высеченные стандартным пробойником, инкубируют в суспензии клеток агробактерий, в плазмиде которой имеется вставка с целевым геном. Затем кусочки переносятся на селективную среду регенерации, содержащую антибиотики, блокирующие рост агробактерии (карбеинциллин), а также антибиотики, ингибирующие рост нетрансформированных тканей (канамицин, неомицин, хлорамфеникол, метатрекстат). Селективная среда позволяет отобрать только те ткани листа, которые содержат маркерные гены, т.е. трансформированные Т-ДНК ткани. Наличие целевого гена далее проверяется с помощью генетического и молекулярного анализа. Помимо pTi- и pRi-плазмид в технологиях получения трансгенных растений используются также другие векторные и трансформационные системы. Векторы на основе генома вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) ВМЦК является одним из немногих ДНК-содержащих вирусов, геном которого используется для переноса чужеродных геном в растения. Относительно небольшие размеры кольцевой вирионной ДНК (8 тнп) позволяют легко манипулировать с ней in vitro как с обычной плазмидой и вводить ее в клетки растения путем механической инокуляции листьев. Поскольку инфекция ВМЦК распространяется по растению системно, то инокуляция небольшого участка листа приводит к быстрому распространению рекомбинантной ДНК по всему растению. Для этой ДНК характерна также высокая копийность (до 50 000 на клетку). Самым большим преимуществом генома ВМЦК является, однако, его промотор, который широко применяется в генно-инженерных конструкциях в силу своей высокой активности, отсутствия тканевой специфичности и способности индуцировать экспрессию чужеродных генов не только в крестоцветных, но и в растениях из других семейств. Челночные векторы на основе ДНК хлоропластов и митохондрий Геном хлоропластов представляет собой кольцевую ДНК, которая содержит какое-то количество генов, необходимых для функционирования самих хлоропластов и поддержания их структуры. В состав этих ДНК входят также гены рибосомальных и транспортных РНК. Размеры хлоропластной ДНК колеблются в пределах 120 – 180 тысяч пар оснований. Каждый хлоропласт содержит десятки копий кольцевых ДНК. Установлена полная нуклеотидная последовательность ДНК хлоропластов табака и риса. Существенным свойством хлоропластного генома является его способность к автономной репликации и транскрипции, что позволяет использовать хлоропластную ДНК для конструирования векторов. При комбинировании бактериальной плазмиды с фрагментом ДНК хлоропластов, который содержит регуляторные элементы для репликации и транскрипции в растительной клетке, можно получить универсальный вектор. Такие векторы называются челночными. Они отличаются способностью реплицироваться в бактериальных клетках, а также автономно реплицироваться и экспрессировать чужеродные гены в эукариотических клетках. Митохондриальная ДНК также представляет собой кольцевой дуплекс, длина которого может варьировать в пределах от 1 до 50 тысяч пар оснований. Она может использоваться для конструирования челночных векторов, так как имеет все необходимые регуляторные элементы для автономной репликации и транскрипции в растительной клетке. СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ВИРУСНЫМ БОЛЕЗНЯМ Устойчивость, обусловленная экспрессией в растении гена структурного белка оболочки вируса Перекрестная защита растений от вирусных инфекций Феномен перекрестной защиты от вирусов у растений впервые был описан более полувека назад. Суть его в простейшем виде представляет собой неспособность вирусного патогена заражать растения, предварительно инокулированные другим вирусом. При исследовании механизмов перекрестной устойчивости использовался весьма распространенный подход когда, получая мутанты, дефектные по тому или иному гену, изучали роль продуктов этих генов в данном процессе. Так, при использовании для первичной инокуляции мутантов ВТМ, неспособных синтезировать полноценный структурный белок оболочки (СБО), было показано, что эти мутанты способны индуцировать защитные механизмы растений табака. В то же время обработка растений штаммами вируса с нормальным геном СБО (геном «дикого» типа) приводила к значительно большему эффекту защиты. Однако, мутант ВТМ по СБО, в отличие от штаммов данного типа, индуцирует неспецифическую устойчивость растений вплоть до устойчивости к вирусу мозаики турнепса (ВМТ), относящегося к другой таксономической группе – потивирусов (см. раздел …). Тогда как обработка растений штаммом ВТМ «дикого» типа, индуцирует устойчивость к другим штаммам ВТМ в значительно большей степени, чем к вирусу мозаики турнепса. Это предполагает существование, по крайней мере, нескольких механизмов перекрестной устойчивости. Описанный выше подход к изучению механизмов перекрестной устойчивости имеет ряд ограничений, связанных в первую очередь с тем, что мутации в некоторых вирусных генах не могут выражаться фенотипически. Так, например, дефекты по гену репликазы будут приводить «летальному» для вирусов исходу. Значительный прогресс в этой области был достигнут после того, как была открыта возможность переноса отдельных фрагментов вирусного генома в клетки растений с последующей экспрессией перенесенных вирусных генов. Этот процесс называется трансгенозом, а полученные растения трансгенными. Трансгеноз белка оболочки вирусов Одним из первых вирусных генов, перенесенных в растения табака, был ген структурного белка оболочки (СБО) ВТМ. С помощью гетерологичных промотеров была осуществлена экспрессия этого гена в клетках растений табака. В этих экспериментах трансгенные растения табака, с высоким уровнем экспрессии СБО ВТМ, оказались более устойчивы к заражению суспензией ВТМ, чем к инокуляции препаратами РНК-ВТМ. Было высказано предположение о том, что одним из возможных механизмов устойчивости в данном случае может быть блокирование процесса диссоциации белка оболочки вирионов ВТМ, который необходим для высвобождения вирусной РНК и запуска начальных этапов инфекционного процесса. Успешное заражение трансгенных растений препаратами РНК ВТМ объясняется, помимо отсутствия в данном случае стадии диссоциации, еще и тем, что межклеточный транспорт вирусной РНК, в этой системе, не нуждается в наличии белка оболочки. Блокирование первичных стадий инфекционного процесса подтверждено в экспериментах по заражению протопластов, полученных из различных типов клеток табака. Экспрессия СБО-гена ВТМ в протопластах эпидермальных клеток приводит к возникновению устойчивости этих протопластов к заражению ВТМ. Использование же промотеров, специфически направляющих экспрессию гена СБО в мезофильных клетках, не приводит к устойчивости протопластов этих клеток к заражению ВТМ. Прямое доказательство гипотезы о механизме СБО-индуцированной устойчивости трансгенных растений к ВТМ получено в экспериментах с м-РНК β-глюкуронидазы (GUS), которую инкапсулировали в белок оболочки ВТМ. Такие ВТМ-подобные частицы (псевдовирионы) были использованы для инокуляции протопластов трансгенных и нетрансгенных табаков. Уровень экспрессии GUS м-РНК в протопластах трансгенных линий табака, несущих СБО-ген ВТМ, был значительно ниже экспрессии в протопластах нетрансгенных растений. Это однозначно можно объяснить только блокированием процесса отделения СБО от GUS м-РНК в клетках, синтезирующих большое количество структурного белка оболочки ВТМ. Дальнейшие исследования механизмов устойчивости растений к вирусам, обусловленной экспрессией генов СБО в трансгенах [СБО(+) растения], показали наличие в данном случае многоуровневой эшелонированной защиты. При инокуляции растений препаратами вирусов, вызывающих пятнистости на листьях, во всех случаях наблюдается снижение среднего удельного количества инфекционных пятен на один лист у СБО(+)-трансгенов, по сравнению с СБО(-) линиями того же сорта. Из этого следует, что одним из возможных сайтов реализации противовирусной защиты может быть барьер, создаваемый на первых ступенях развития инфекционного процесса. Таким образом, экспрессия генов СБО в клетках трансгенных растений, по-видимому, приводит к взаимодействию СБО со структурами растительной ткани, ответственными за устойчивость к проникновению вирусной инфекции. Сравнительное изучение последующих стадий развития инфекционного процесса в СБО(+)- и СБО(-)-растениях табака проводилось следующим образом. Были подобраны концентрации ВТМ в инокулюмах таким образом, чтобы они давали примерно одинаковое удельное число некрозов на лист СБО(+) и СБО(-) растений. Анализ среднего количества вируса в каждом инфекционном пятне показал, что существенной разницы по этому показателю между СБО(+) и СБО(-) линиями нет. Иммунологический анализ сегментов листьев, вырезанных из областей между инфекционными пятнами, однако, выявил, что в случае СБО(+)- растений накопление вируса в этих частях листьев достоверно меньше, чем в случае СБО(-)- растений. Это позволяет сделать вывод о том, что экспрессия генов ВТМ, кодирующих СБО, в растениях табака индуцирует возникновение второго защитного барьера на уровне распространения вирусов в листовой ткани. Для проверки влияния СБО на транспорт ВТМ по сосудистой системе был проведен прививочный эксперимент. Фрагмент трансгенного растения с СБО был привит на ВТМ-восприимчивое нетрансгенное растение. Оказалось, что транспорт ВТМ через привитый сегмент подавляется. Это подтверждает предположение о блокировании механизмов распространения вируса по сосудистой системе трансгенных растений, экспрессирующих ген СБО. Возможно, однако, что передвижение ВТМ по сосудам сопровождается чередующимися процессами ассимиляции и диссимиляции вирионов. В этом случае блокирование транспорта вируса по сосудистой системе может быть вторичным следствием ингибирования диссимиляции вирионов. Дополнительные доказательства, подтверждающие гипотезу о блокирующем действии генов вирусных СБО на стадии диссимиляции вирионов, основаны на результатах экспериментов с вирусом мозаики люцерны (ВМЛ). Однако в этом случае механизмы устойчивости более сложны, чем в случае с устойчивостью против ВТМ. У линий, имеющих низкий уровень экспрессии генов ВМЛ, кодирующих СБО, устойчивость наблюдалась только при заражении ВМЛ-вирионами. В противоположность этому, у трансгенных линий, экспрессирующих мутантный СБО или большие количества СБО дикого типа, устойчивость против ВМЛ имела место при заражении и препаратами РНК, и вирионами. Как и в случае с ВТМ, зависимость устойчивости от типа инокулюма позволяет предположить, что устойчивость против ВМЛ действует, по крайней мере, на двух уровнях. На одном уровне может иметь место ингибирование диссимиляции вирионов при низком уровне экспрессии СБО. Второй уровень устойчивости, который проявляется у линий с мутантным СБО или с высоким уровнем экспрессии гена СБО дикого типа, может включать в себя любые взаимодействия СБО, необходимые для инфекционного цикла вируса. Это могут быть взаимодействия с вирусной РНК, необходимые для сборки вирионов или репликации вируса, или взаимодействия с рецепторами СБО растения-хозяина. Устойчивость против X-вируса картофеля (XВК) также оказалась эффективной при заражении и РНК-инокулюмом , и вирионным инокулюмом. Как и в случае устойчивости к ВМЛ, здесь может иметь место блокирование всех стадий инфекционного процесса, необходимых для репликации и транспорта XВК в инфицированном растении. Есть основания предполагать, что взаимодействие синтезируемого трансгенным растением СБО с сайтом начала сборки XВК может приводить к возникновению устойчивости. У потексвирусов начало сборки происходит на 5’-конце вирусного генома, так что взаимодействие со СБО может блокировать трансляцию вирусной РНКзависимой РНК-полимеразы, которая кодируется на 5’-конце открытой считывающей рамки. Возможно, однако, также, что устойчивость к ХВК обусловлена ингибированием межклеточного транспорта, для которого СБО оболочки является необходимым фактором. Суммируя изложенные данные, можно сделать следующие выводы относительно механизмов защиты, реализующихся в трансгенных растениях, экспрессирующих ген белка оболочки вируса, 1) В СБО(+)-растениях блокирование инфекции происходит на стадии, предшествующей синтезу минус цепи вирусной РНК. 2) Уровень защиты СБО(+)-растений табака значительно выше по отношению к ВТМ, чем к РНК ВТМ. Эта защита обусловлена синтезом белка оболочки ВТМ в клетках трансгенных растений и не связана с синтезом m-РНК – транскриптов СБО. Аналогичная ситуация имеет место и в случае с трансгенными растениями, несущими ген белка оболочки вируса мозаики люцерны. 3) На уровень защиты СБО(+)-трансгенных растений влияет не только экспрессия гена белка оболочки, но и способность этого белка образовывать внутриклеточные вирусоподобные агрегаты. 4) Прививка стеблей СБО(+) растений на проростки СБО(-) растений табака приводит к индукции устойчивости к системной инфекции ВТМ, при этом не предотвращается возможность развития первичных стадий инфекции. Логично было бы предположить, что, помимо вирусных структурных белков оболочки, существуют и другие белки, экспрессия генов которых в растениях могла бы приводить к возникновению устойчивости к вирусным инфекциям. Рассмотрим свойства некоторых из таких белков, представляющих интерес как в теоретическом плане, поскольку могут быть использованы в качестве инструмента для изучения механизмов вирусоустойчивости, так и в практическом плане, поскольку полученные трансгены сельскохозяйственных культур могут представлять конкретный практический интерес. Устойчивость трансгенных растений, обусловленная экспрессией транспортных белков Устойчивость трансгенных растений в большинстве из в приведенных выше примеров обусловлена экспрессией генов вирусных белков оболочки дикого типа. Методами генетической инженерии, однако, возможно получение патоген-обусловленной устойчивости с использованием негативных мутантных форм вирусных генов, носящих доминантный характер. Эффективность этого подхода была продемонстрирована при трансгенной экспрессии вирусных транспортных белков (ТБ). Устойчивость, при этом, наблюдается только в тех случаях, когда трансгенные растения экспрессируют ген дефектного ТБ. Трансгенная экспрессия генов нормально функционирующих ТБ дикого типа либо не влияет на вирусную инфекцию, либо повышает восприимчивость. Устойчивость, индуцированная экспрессией гена ТБ ВТМ, возникает в результате конкуренции за сайты связывания на цитоплазматической мембране между мутантным ТБ и ТБ дикого типа вводимого в клетку вируса. Особенностью такого вида устойчивости является ее относительная неспецифичность. Так экспрессия гена ТБ ВТМ приводит к возникновению устойчивости растений к кукумовирусам, потексвирусам, тобравирусам и, естественно, к тобамовирусам. Аналогично этому экспрессия дефектного ТБ вируса мозаики костра приводит к возникновению устойчивости к ВТМ (Malyshenko et al., 1993). Изложенные факты позволяют сделать вывод о том, что транспортные белки фитовирусов, относящиеся к различным таксономическим группам, могут взаимодействовать с одними и теми же рецепторами цитоплазматической мембраны. Это свидетельствует о несомненной перспективности данного направления исследований как в практическом, так и в теоретическом плане. Вирусоустойчивость растений, обусловленная “молчанием генов” В предыдущих разделах рассматривались механизмы устойчивости, которая обеспечивалась белками, кодируемыми трансгенами. В других случаях патоген-производная устойчивость может выражаться прямым ингибированием вирусного инфекционного цикла самим трансгеном или его РНК-транскриптом. РНК (или ДНК)-опосредованная устойчивость может иметь место, например, если трансгенная нуклеиновая кислота действует как молекула-приманка (ловушка). Эта молекула может конкурировать с вирусным геномом за управление взаимодействием белков, кодируемых хозяином и вирусом, что может приводить к блокированию репликации и распространения вируса в инфицированном растении. Такое конкурентное ингибирование имеет место, когда трансген представляет собой дефектную интерферирующую РНК (или ДНК). Обширные исследования посвящены роли антисмысловой (antisence) РНК, которая вызывает супрессию трансляции вирусной РНК и m-РНК трансгена (посттрансляционное «молчание»). Наиболее вероятным претендентом на роль (–) цепи РНК-блокатора может быть антисмысловая РНК, имеющая нуклеотидную последовательность - комплементарную последовательности РНК, являющейся продуктом транскрипции трансгена. Эти антисмысловые РНК могут быть синтезированы РНК-зависимой РНКполимеразой (RdRp) растения-хозяина, при использовании трансгенной РНК в качестве матрицы. Такие антисмысловые РНК могли бы комплементарно связываться с трансгенной и вирусной РНК (рис. 65). Механизм комплементарности взаимодействия цепей РНК обуславливает высокую степень штаммоспецифичности такого типа устойчивости. Например, устойчивость к ХВК не эффективна против штаммов вируса, нуклеотидные последовательности РНК которых отличались от последовательности трансгена всего на 22%. Феномен пост-транскрипционного молчания генов – важный фактор, с которым приходится считаться при создании любых трансгенных растений. Оказалось, что при интродукции в геном трансформируемого растения более чем одной копии целевого чужеродного гена может иметь место молчание этих интродуцированных генов. Блокирование экспрессии при этом происходит на пост-транскрипционных этапах. Попадающий в клетку такого трансгенного растения в процессе инфекции вирусный геном, имеющий последовательности, идентичные последовательностям трансгена воспринимается как его копия и поэтому также может подавляться механизмом пост-транскрипционного молчания. Интересно было бы исследовать взаимосвязь гомологично-зависимой устойчивости с механизмами устойчивости к вирусам, развивающейся в естественных условиях в инфицированных вирусом растениях, например, с устойчивостью, связанной с симптомом «зеленых островков». В инфицированных ВТМ растениях «зеленые островки» имеют низкий уровень содержания вирусных частиц и устойчивы к дальнейшей вирусной инфекции. Возможно, «зеленые островки» представляют собой естественное проявление механизма гомологично-зависимой устойчивости. Устойчивость трансгенных растений к вирусам, обусловленная экспрессией антивирусных антител В отличие от позвоночных животных, растения не имеют иммунной системы, способной продуцировать антитела, которые могут распознавать и инактивировать проникающие в организм патогены. Однако, благодаря достижениям генной инженерии и технологий, разработанных для получения трансгенных растений, в растительный геном могут быть введены гены, кодирующие иммуноглобулины, экспрессия которых приводит к образованию антител или их фрагментов, способных функционировать в растении. Этот подход был использован для получения трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции. Если в трансгенное растение вводить гены, экспрессия которых будет приводить к накоплению именно тех антител или их фрагментов, которые способны связывать антигены, играющие важную роль в патогенезе (например, токсины, ферменты, транспортные белки и т. д.), то данную технологию можно будет использовать в качестве одного из методов борьбы с болезнями. Cтруктура иммуноглобулинов (антител) хорошо изучена. Выявлены гипервариабельные области, ответственные за специфическое связывание с антигеном. Известны гены, кодирующие последовательность аминокислотных остатков в полипептидных цепях иммуноглобулинов и их функциональных фрагментов. Разработаны методы генной инженерии антител, позволяющие конструировать гены, экспрессия которых приводит к образованию всй молекулы антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, таких, например, как Fab-фрагмент (fragment antibody binding) и одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv – single chain fragment variable). Экспрессия антител в растениях Создание трансгеных растений, в которых происходит экспрессия молекул антител или их функциональных фрагментов, представляется вполне осуществимым. Один из способов достижения экспрессии антител в растениях состоит в том, что снанчала добиваются получения растений, в которых экспрессия тяжелой и легкой полипептидных цепей иммуноглобулинов происходит раздельно, а затем в потомстве от скрещивания таких растений получают полноценные молекулы антител. Согластно другому подходу, оба гена клонируют в одной кассете экспрессии с соответствующим промотором. Введение этой конструкции в растение приводит к образованию в нем целых антител. Для того, чтобы получить экспрессию целых молекул антител в растениях, очень важно включить в гены как тяжелой, так и легкой, цепей сигнальную пептидную последовательность (например, секреторные белки разных организмов, включая растения); это обеспечит их самосборку в эндоплазматическом ретикулюме. Без сигнальных пептидов нельзя достичь успешной экспрессии целых молекул антител в растении. Одноцепочечный фрагмент scFv, у которого отсутствуют сигнальные последовательности, может экспрессироваться в цитоплазме и специфически связывать антиген. Благодаря сравнительно небольшим размерам, этот фрагмент обладает хорошей тканевой проницаемостью. Для осуществления его функций не требуется самосборка. Кроме того, он может быть довольно легко получен генно-инженерными методами. Все это делает scFv привлекательным для создания трансгенных растений, продуцирующих анетитела, которые обусловливают устойчивость к болезням. При использовании данного фрагмента, возможно, удастся обойти проблемы, связанные с обеспечением экспрессии полных антител, тьакие как гликозилирование и (или) необходимость образования дисульфидных связей. Антитета против патогенов растений Тавладораки с сотрудниками (Tavladoraki et al., 199 ) создали генноинженерную конструкцию, содержащую ген фрагмента scFv, который был получен из моноклональных антител, обаладающих высокой аффинностью по отношению к белку оболочки вируса курчавости артишока. Полученные на основе этой конструкции трансгенные растения табака, имели повышенную устойчивость к заражению вирусом и более слабые симптомы заболевания. Другая группа исследователей провела клонирование кДНК тяжелых и легких цепей из антител, имевших высокую аффинность к поверхности интактного ВТМ. Одновременная экспрессия тяжелой и легкой полипептидных цепей приводила к самосборке в растении полноценных антител. У зараженных трансгенов отмечено снижение числа некротических пятен, которое коррелировало с количеством антител, продуцируемых растением. Другие направления в создании устойчивых к вирусам трансгенных растений Сообщение об устойчивости трансгенных растений к геминивирусам иллюстрирует принцип, который может иметь более широкое применение. Промотор геминивируса мозаики африканского маниока был соединен с кодирующей последовательностью цитотоксичного белка диантина, и продукт слияния был перенесен в Nicotiana benthamiana . Трансгенный вирусный промотор, контролирующий синтез диантина, активировался в трансположении при вирусной инфекции, инфицированные клетки убивались диантином, и распространение вируса, следовательно, ограничивалось инокулированной клеткой. Принцип, вытекающий из этой работы, - патогенпроизводная устойчивость может быть усилена соединением патогенпроизводной последовательности с последовательностями, определяющими цитотоксичные или антивирусные агенты. Продукты слияния могут содержать вирусные промоторы или цис-действующие репликационные элементы. Продукты слияния могут быть сконструированы также для кодирования белков, которые никак фенотипически не проявляются в неинфицированных клетках, но приобретают цитотоксичные или антивирусные свойства после заражения вирусом. Еще один подход к созданию устойчивых к вирусам трансгенных растений заключается в экспрессия вирусных элиситоров. Известны две вирусные системы, у которых эти элиситоры были идентифицированы: ВТМ-элиситор N`опосредованной устойчивости у табака и XВК-элиситор Rx-опосредованной устойчивости у картофеля (подробнее см. стр.). В обоих случаях молекула элиситора – вирусный СБО. Их перенос в трансгенные растения, имеющие соответствующие гены устойчивости, и соединение с индуцированными заражением промоторами, может привести к СВЧ-реакции инфицированных разными вирусами растений (подробнее см ниже о двухкомпонентных системах). СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ Известен набор различных механизмов защиты растений от грибных патогенов: - морфологические барьеры, - локальная гибель инфицированных клеток, - биосинтез фитоалексинов, - синтез ферментов, разрушающих клеточные стенки патогена, - синтез рибосоминактивирующих белков, и др. Рассмотрим возможности использования различных генов хозяина или патогена, продукты экспрессии которых влияют на взаимодействие партнеров, в создании трансгенных растений, устойчивых к грибным болезням. Устойчивость растений к грибам, как следствие экспрессии генов чужеродных фитоалексинов Устойчивость растений к грибным фитопатогенам обусловлена множеством защитных механизмов как конститутивной так и индуцированной природы. Одним из наиболее значимых инструментов защиты считается индуцибельный синтез растением фитоалексинов (ФА) – низкомолекулярных вторичных антимикробных соединений (подробнее см. стр. ). Преимущество такого механизма защиты заключается в том, что синтез ФА начинается быстро в ответ на внедрение патогена в ткани растения-хозяина, стресс или обработку некоторыми природными и синтетическими соединениями. Изучены гены, контролирующие биосинтез ряда ФА. Используя методы генной инженерии, осуществлен перенос этих генов из растений-доноров в растения-реципиенты, относящиеся к другому виду, роду или даже семейству, что позволило продемонстрировать роль ФА в защитных реакциях растений, для которых встроенные гены являются чужеродными. Наряду с важным теоретическим значением этих опытов по трансформации они позволяют предположить возможность использования генно-инженерных технологий в практических целях для создания трансгенных сортов сельскохозяйственных культур, устойчивость которых к грибным фитопатогенам будет обусловлена экспрессией генов чужеродных высокоэффективных ФА. В данном разделе рассмотрены результаты экспериментов в этой области. Гены из арахиса и винограда, кодирующие стильбен синтетазу (STS), которая отвечает за синтез стильбен-подобного ФА ресвератрола при переносе в геном растений табака экспрессируют ресвератрол в ответ на заражение грибным патогеном. STS - ключевой фермент, участвующий в образовании стильбена при превращении одной молекулы р-кумарол-СоА и трех молекул малонил-СоА в 3,4,5-тригидроксистильбен (ресвератрол). Эти данные свидетельствуют о принципиальной возможности экспрессии ФА ресвератрола в чужеродном растении-хозяине, однако, уровень экспрессии STS гена в табаке невысок. После обработки препаратом элиситора из Phytophthora megasperma количество STS mPHK, аккумулированное в каллусах трансгенных табаков, достигает только около 0.5% от количества STS mPHK, накапливающейся в гомологичной системе - каллусе арахиса. Причиной этого может быть наличие в норме, по крайней мере, 6 или 8 различных STS генов в клетках арахиса и винограда, в то время как в описываемых экспериментах использовался только один STS ген. Фитопатологические тесты в теплице с трансгенным табаком, содержащим STS ген арахиса, показали относительно более высокую устойчивость к заражению P. megasperma у трансгена. Повысить уровень экспрессии STS генов удалось путем переноса в растения табака двух STS генов винограда. При этом синтез STS m-РНК в каллусах табака достигает 5-10% от количества индуцированного элиситором синтеза STS m-РНК в каллусах винограда. Как и в случае с виноградом синтез STS в трансгенном табаке также оказался индуцибельным. Полученные трансгенныерастения табака, наряду с продуцированием больших количеств ФА ресвератрола, обнаруживают высокую степень устойчивости к Botrytis cinerea. Уровень подавления развития болезни колебался в пределах от 52 до 82% по сравнению с исходным нетрансгенным табаком. Повышение устойчивости к Phytophthora infestans и Fusasrium sulfureum было продемонстрировано в экспериментах с трансгенными растениями томатов и картофеля, экспрессирующих два STS гена виноградной лозы. Анализируя описываемые экспериментальные данные, следует подчеркнуть весьма принципиальный момент. Для повышения устойчивости к болезням определенный патоген должен индуцировать биосинтез ФА в растении-хозяине. Молекулярный анализ экспрессии STS генов показал, что она может быть индуцирована в гетерологичном растении, по крайней мере, некротрофными грибами. Так, Botrytis cinerea или Alternaria longipes способны индуцировать синтез ресвератрола в табаке. С точки зрения практической агрономии было бы важно выяснить может ли биосинтез чужеродных ФА индуцироваться и биотрофными грибными патогенами (такими как Erysiphe graminis, Bremia lactuca, Plasmopara viticola и Puccinia spp.) в соответствующих растениях-хозяевах. Результаты экспериментов, проведенных на паре патогенхозяин Plasmopara viticola-Vitis vinifera, показали положительную корреляцию между индуцированным синтезом ФА и устойчивостью растения-хозяина. Это очень важное обстоятельство позволяет надеяться на реальное использование описанных подходов для получения хозяйственно значимых источников устойчивости и дальнейшего их использования в селекционной работе. Одним из перспективных направлений поиска путей к повышению устойчивости растений к грибным болезням методами генной инженерии является детальное изучение механизмов регуляции и индукции неких ключевых генов, имеющих отношение к биосинтезу ФА. Например, касбенсинтетаза из клещевины - конечный фермент, участвующий в цепи биосинтеза, приводящего к образованию дитерпеноидного ФА касбена. Синтез касбенсинтетазы индуцируется в растительных тканях в ответ на заражение грибами, обработке грибным белком или другими элиситорами. В настоящее время клонирована кДНК этого фермента, что открывает путь к созданию трансгенных растений с возможно индуцируемой устойчивостью к грибным болезням. В связи с тем, что касбен синтетаза катализирует только одну, уникальную в цепи биосинтеза касбена, завершающую стадию, ген, перенесенный в другие растения, мог бы определить его роль в механизмах защиты растения. Другим возможным подходом к повышению устойчивости растений к грибным патогенам могло бы быть включение в геном растений генов, продукты которых способны модифицировать структуру ФА, делая их либо более фунгитоксичными, либо более устойчивыми к действию грибных детоксикантов. Так, например, известно, что разные грибные патогены гороха обладают разной чувствительностью по отношению к (+) или (-) стереоизомерам ФА пизатина. Кроме того, эти изомеры различаются по чувствительности к деградирующим факторам одного и того же патогена. Существуют ферменты (в данном случае - изофлавон оксидоредуктаза), которые могли бы быть использованы для преимущественного синтеза (+) или (-) стереоизомера ФА пизатина в зависимости от того, к какому патогену необходимо повысить устойчивость растения-хозяина. В настоящее время фермент изофлавон оксидоредуктаза выделен и очищен, а также клонирован ген, ответственный за синтез этого фермента. Реализация данного подхода могла бы быть примером получения трансгенных растений с искусственно повышенной активностью ФА, защищенных от деградирующих факторов грибных патогенов. Существуют и другие пути повышения фунгитоксичности ФА. Так, известно, что фунгитоксичные свойства стильбенов связаны с гидрофобностью этих соединений. Поэтому повышение их биологической активности возможно путем, например, метилирования. В этой связи перенос генов, подобных ресвератрол метилтрансферазе или пиносильвин монометилтрансферазе, в новые растения-хозяева может приводить к образованию более токсичных для грибов, соответственно, монометиловых эфиров птеростильбена или пиносильвина. Пиносильвин синтетаза (PSS), стильбен синтетаза из Pinus sylvestris, образует 3,5-дигидроксистильбен (пиносильвин), который более гидрофобен, чем ресвератрол. Выделен и клонирован ген PSS и был осуществлен перенос гена из сосны обыкновенной в растение табака. Экспрессия PSS проходила под контролем 35S PHK промотора и STS промотора из виноградной лозы. Активность этого фермента была обнаружена в свежевыделенных экстрактах тканей табака. Фитопатологические опыты в теплице показали повышение устойчивости этих трансгенных растений при заражении Botrytis cinerea. Приведенные данные открывают возможность синтеза других чужеродных ФА помимо ресвератрола, тем самым, увеличивая устойчивость к болезни и расширяя спектр антигрибной активности новых трансгенных растений. Одним из возможных претендентов для таких исследований мог бы быть фермент бибензил синтаза (BBS), который катализирует ступень в биосинтезе фенольного составляющего фенантреновых фитоалексинов. Эти фитоалексины продуцируются в тканях орхидеи Bletilla striata. Поскольку соответствующий этому ферменту ген выделен и отклонирован, есть возможность его переноса в чужеродные виды растений с целью индуцирования в них синтеза дигидрофенантреновых ФА. Таким образом, использование новых эндогенных антимикробных соединений - одна из наиболее многообещающих стратегий в молекулярной селекции растений на устойчивость к грибным патогенам. Основным ограничением этого подхода до сих пор является малое число доступных для таких экспериментов генов, ответственных за синтез ФА или их модифицикацию. По мере увеличения знаний о молекулярных механизмах взаимодействия между грибом и растением будут возрастать возможности применения описанных биотехнологических подходов и методов в сельскохозяйственной практике. Пероксидазы растения-хозяина Индукция синтеза пероксидаз является одной из ранних реакций растения на взаимодействие с микробным патогеном. Пероксидазы участвуют в нескольких защитных механизмах растений, в том числе и в лигнификации, связывании белков клеточной стенки, в процессах заживления ран и в генерации свободных радикалов, обладающих антимикробным действием. Грибные фитопатогены способны специфически индуцировать синтез новых изоформ пероксидаз в тканях растения-хозяина. Несмотря на наличие в геноме растений многочисленного семейства генов пероксидаз, c помощью одной из модификаций полимеразной цепной реакции (ПЦР) из тропического бобового растения Stylosanthes humilis удалось выделить индивидуальные пероксидазные гены (Shpx6a и Shpx6b). Транскрипты именно этих генов обнаруживаются на самых ранних этапах заражения боба грибным патогеном Colletotrihum gloeosporioides, а также после обработки растения регулятором защитных реакций метилжасмонатом (MeЖАК). Биоинженерные конструкции, созданные на основе этих генов, были перенесены в растения табака. Инокуляция листьев трансгенного табака конидиями фитопатогенного гриба Cercospora nicotianae, а также заражение этих растений Phytophthora parasitica var. nicotianae индуцировало экспрессию генов Shpx6a и Shpx6b. Аналогичный эффект наблюдался и при обработке листьев табака MeЖАК. Приведенные результаты имеют принципиальное значение, так как впервые продемонстрирована возможность индукции синтеза определенных растительных пероксидаз путем заражения патогеном и обработкой химическим индуктором. Это открывает возможность изучения сигнальных процессов, сопровождающих грибную инфекцию в данных системах патоген-хозяин. Практическая ценность полученных данных обусловлена тем, что показан реальный путь использования генов пероксидазы для создания трансгенных растений, устойчивых к грибным болезням. Элиситины Белки, продуцируемые видами Phytophthora, называют элиситинами (см. стр. ). Они различаются между собой по аминокислотным последовательностям, а также по способности индуцировать некрозы и защитные реакции растений. Белки, относящиеся к β-подсемейству элиситинов (с щелочными свойствами), обладают большей активностью в индукции некрозов, чем белки, относящиеся к α-подсемейству (с кислотными свойствами). Экспрессия в Escherichia coli синтетического гена, кодирующего β-криптогенин, приводит к продукции белка, способного индуцировать образование некрозов на листьях табака. Замена единственной аминокислоты (лизина в 13 положении на валин) приводит к снижению некрозообразующей активности до уровня аналогичной активности α-элиситинов. Определена четвертичная структура β-крптогенина и идентифицированы активные центры этих белков, ответственные за индукцию некрозообразования и за индукцию защитных реакций растения-хозяина. Фитопатогенный гриб P. parasitica var. nicotianae способен эффективно заражать растения табака, так как он продуцирует не узнаваемый табаком элиситин. При переносе в эти растения гена β-криптогенина, экспрессирующегося под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), среди трансформантов были получены клоны с высокой степенью устойчивости к заражению P. parasitica var. nicotianae. Веским доказательством того, что устойчивость обусловлена синтезом чужеродного βкриптогенина является снижение уровня устойчивости у трансформантов, экспрессирующих ген того же элиситина, но с заменой лизина на валин в 13 положении. Результаты этих экспериментов позволяют отнести гены продуцируемых патогеном белков – элиситинов – в разряд перспективных кандидатов для использования в конструировании трансгенных растений с устойчивостью к грибным патогенам. Хитиназы и глюканазы Известно большое число растительных белков, способных in vitro подавлять рост грибов. Не ясно, однако, какая часть из этих белков реально включена в защитные процессы, возникающие в растении в ответ на грибную инфекцию. Тем не менее, появившаяся возможность изучения экспрессии отдельных генов в растении позволяет с одной стороны исследовать роль этих белков в иммунитете растений, а с другой стороны использовать антигрибные белки в создании трансгенных растений с повышенной устойчивостью к грибным болезням. Наиболее известными антигрибными белками являются хитиназы и β-1,3глюканазы. Эти ферменты катализируют гидролиз соответственно хитина и β1,3-глюкана – основных компонентов клеточной стенки большинства грибов. Известно 4 класса (I – IV) растительных эндохитиназ. Из них, по крайней мере, 3 найдены в тканях табака. Из различных видов растений выделено три основных класса β-1,3- эндоглюканаз. Ферменты, относящиеся к классу I гидролаз, локализованы в растительных вакуолях и являются потенциальными ингибиторами роста многих грибов. Отмечен ярко выраженный синергизм хитиназ и β-1,3-глюканаз класса I, т. е. при смешивании разбавленных растворов гидролаз, каждый из которых не обладал фунгитоксичностью, получается смесь, активно блокирующая рост грибов. Гидролазы класса II локализованы на внешней стороне клеточной мембраны и не обладают антигрибными свойствами. Перенос гена вакуолярной хитиназы фасоли был осуществлен в геном табака и рапса. Экспрессия этого гена контролировалась конститутивным 35S – промотором ВМЦК. Результатом экспрессии гена хитиназы была частичная устойчивость трансгенных растений к возбудителю ризоктониоза Rhizoctonia solani. С помощью цитохимических методов было показано, что механизм защиты обусловлен лизисом грибных гиф, внедренных в ткани растенияхозяина. В аналогичных экспериментах конститутивная экспрессия гена β-1,3глюканазы из сои в клетках табака также индуцировала частичную устойчивость трансгена к Rhizoctonia solani. Анализ механизмов устойчивости в данном случае показал способность трансгенных растений более энергично высвобождать глюкановые фрагменты клеточных мембран, обладающих элиситорной активностью. Таким образом, экспрессия генов хитиназы и глюканазы повышает устойчивость трансгенных растений к грибным патогенам, но механизм защиты в том и в другом случае различен. Учитывая обнаруженный в опытах in vitro синергизм действия этих ферментов, была разработана экспериментальная схема совмещения двух целевых генов в одном трансгене. В качестве целевых генов использовались: ген RCH10 риса, кодирующий щелочную хитиназу и ген AGLU1 люцерны, кодирующий кислую β-1,3глюканазу (см. рис 66). Экспрессия обоих генов активно индуцируется в ответ на механические повреждения растительной ткани, действие микробных элиситоров или заражение фитопатогенными организмами. Для корректного сравнения защитного эффекта экспрессии отдельных генов и совместной экспрессии обоих целевых генов была использована схема, согласно которой каждая из генно-инженерных конструкций вводилась в отдельные растения табака. Определялась степень устойчивости монотрансгенов к одному и тому же патогену. Затем были получены половые гибриды между монотрансгенами и определялась устойчивость гибридов, несущих оба целевых гена. При тестировании монотрансгенов на устойчивость к Cercospora nicotianae в обоих случаях отмечалось повышение устойчивости трансгенов по сравнению с исходными нетрансгенными линиями табака. Устойчивость гибридов, полученных от скрещивания монотрансгенов, оказалась значительно выше устойчивости родительских монотрансгенов. Механизм защиты у гибридов носил сложный характер и выражался в задержке появления первых видимых симптомов болезни и последующем снижении как количества инфекционных пятен, так и среднего размера этих пятен. В результате искусственной инокуляции конидиями C. nicotianae степень развития болезни у гетерозиготных Т2 – гибридов была достоверно ниже по сравнению с гомозиготными линиями табака, несущими по одному из целевых генов. Комбинация 1n хитиназы и 1n β-1,3-глюканазы оказалась более эффективной по сравнению с монотрансгенами, несущими двойные дозы целевых генов (соответственно, 2n хитиназы или 2n 1,3-глюканазы). Высокая степень защиты при комбинировании генов RCH10 хитиназы и AGLU1 глюканазы была также обнаружена при инокуляции гибридных трансгенных табаков возбудителем листовой пятнистости Thanatephorus cucumeris (базидиальная стадия Rhizoctonia solani). Комбинация этих двух генов, по-видимому, придает трансгенному растению устойчивость к широкому спектру грибных болезней. Это подтвердилось на модели трансгенных томатов, в геном которых были интродуцированы по два тандемно расположенных гена хитиназы и глюканазы. Экспрессия такой комбинации генов приводила к возникновению устойчивости трансгенных томатов к Fusarium oxysporum. Синергизм действия конститутивно экспрессируемых генов хитиназы и глюканазы обусловлен, по-видимому, двойным действием этих ферментов: разрушением клеточной стенки грибного патогена и высвобождением из клеточных мембран фрагментов хитиновой и глюкановой природы, обладающих элиситорной активностью. Двухкомпонентная система и неспецифическая устойчивость Одним из существенных механизмов защиты растений от болезней является способность микробных возбудителей продуцировать элиситоры in planta. Молекулы расоспецифических элиситоров кодируются генами авирулентности. Некоторые системы взаимодействия между патогеном и хозяином описываются теорией «ген-на-ген» (см. раздел ….). В этих системах несовместимая комбинация означает наличие гена авирулентности у микробного патогена и соответствующего гена устойчивости у растения. Доказательством реальности существования механизма взаимодействия по правилу «ген-на-ген» на молекулярном уровне стало возможным после выделения и клонирования генов авирулентности и соответствующих генов устойчивости растений. Гены авирулентности были выделены из вирусных, бактериальных и грибных фитопатогенов (см. стр. ). В числе первых грибных генов авирулентности были выделены и клонированы гены Avr-4 и Avr-9 из гриба Cladosporium fulvum. Рассмотрим возможность конструирования трансгенных растений табака и томатов, устойчивых к грибным патогенам на основе этих двух генов. Расы гриба C. fulvum, несущие ген авирулентности Avr9, вызывают реакцию сверхчувствительности в линиях томатов и табаков, имеющих ген устойчивости Cf9.СВЧ- реакция провоцируется в данном случае коротким пептидом из 28 аминокислотных остатков, который является конечным продуктом грибного гена Avr9. В ответ на инъекцию в ткани листа препарата очищенного белка-элиситора возникает такая же некротическая реакция, как и при инокуляции растений, содержащих ген устойчивости Cf9, расами гриба C. fulvum. Конститутивная экспрессия гена Avr9 в растениях, имеющих ген устойчивости Cf9, вызывает задержку роста, некротизацию тканей и, в конечном счете, полную гибель трансгенов. В растениях, инфицированных C. fulvum, белок, являющийся продуктом гена Avr9, процессирутся до полноценного элиситорного пептида, состоящего из 28 аминокислотных остатков. Грибные протеазы способны разрезать исходный пре-белок до пептидов, состоящих из 34, 33 и 32 аминокислотных остатков. Дальнейший процессинг до конечного элиситорного пептида из 28 аминокислотных остатков происходит под действием протеаз растения-хозяина. Из тканей трансгенных табаков, несущих ген Avr9, выделен пептидный элиситор, идентичный по размерам и первичной структуре элиситору, выделенному из томатов, зараженных C. fulvum. Из этого следует, что процессинг до конечного элиситорного пептида может происходить без участия грибных протеаз. Конечный AVR9-пептид стабилен в условиях экстремальных значений рН, высоких температур и устойчив к обработке некоторыми протеазами. Элиситорная активность AVR9-пептида в трансгенных растениях проявляется при использовании в генно-инженерной конструкции как растительных промоторов (PR-S или PR-1a), так и грибного сигнального участка. Перенос грибного гена Avr9 в геном растений томатов и табака, имеющих ген Cf9, и его последующая экспрессия приводит к взаимодействию между низкомолекулярным элиситорным белком и продуктом гена Cf9, что выражается в виде реакции СВЧ. Поскольку конститутивная экспрессия обоих генов этой двухкомпонентной системы приводит к гибели клеток, то экспрессия Avr9 гена должна очень жестко регулироваться (рис. 67). Выделение гена резистентности Cf9 сделало возможным изменение механизмов его регуляции таким образом, что оба продукта двухкомпонентной системы синтезировались только в ответ на внедрение патогена и только в клетках, прилежащих к зоне его внедрения. Двухкомпонентная система Avr9Cf9 может использоваться как генная кассета для внедрения в геном растений, не имеющих Cf9 генов (рис. 68). У растений, в которых система Avr9-Cf9 не функционирует, возможно использовать сочетание других генов авирулентности и соответствующих им генов устойчивости. Если описанный подход к получению устойчивости растений к патогенам будет разработан до степени готовности использования в практике сельского хозяйства, он будет иметь существенное преимущество перед другими известными стратегиями из-за низкой специфичности и практически неограниченной возможности приложения. Успешность развития данной концепции будет зависеть от доступности соответствующих промоторов для прямой экспрессии генов устойчивости и соответствующих генов авирулентности. Гены барназы и “Barstar”-ген Интенсивно разрабатываемые биотехнологические подходы к повышению устойчивости растений к грибным фитопатогенам с использованием генов, контролирующих синтез хитиназ, глюконаз или рибосоминактивирующих белков, а также низкомолекулярных фунгитоксичных соединений таких как фитоалексины могут привести к реальному созданию высоко устойчивых сортов. Следует, однако, учитывать по крайней мере некоторые предсказуемые заранее недостатки такого подхода. Высокий уровень устойчивости полученных таким путем трансгенных растений обусловлен специфичностью используемых механизмов. Избирательная устойчивость к узкой таксономической группе фитопатогенов не выгодна с агрономической точки зрения. Теоретически высокоспецифические защитные барьеры растенияхозяина легче преодолеваются патогеном в результате, например, одной или нескольких мутаций в геноме гриба. В этой связи представляется наиболее приемлемым с точки зрения сельскохозяйственной практики использовать для получения трансгенных растений с множественной устойчивостью к грибным болезням гены, ответственные за естественные механизмы неспецифической защиты, такие, например, как СВЧ-реакция. Преодоление патогеном такого типа защиты теоретически должно быть значительно труднее и займет больше времени, нежели в случае высокоспецифических механизмов болезнеустойчивости. Одним из возможных подходов к искусственно созданной СВЧ-реакции, сопровождаемой быстрой гибелью клеток восприимчивого сорта является синтез цитотоксичных соединений в тканях хозяина. Успешность применения такого подхода зависит от возможности локализовать цитотоксический эффект в пределах инфицированных клеток. Это может быть достигнуто путем экспрессии генов цитотоксинов под контролем промотора, который специфически активировался бы только в ответ на внедрение патогена в ткани растения. Другой возможный путь достижения такого типа защиты – это подавление синтеза цитотоксина во всех неинфицированных клетках. В промоторе картофельного гена prp1-1 имеется регуляторный участок, который в норме не активен, но способен быстро и локализовано активировать транскрипцию контролируемого гена в ответ на внедрение грибного патогена. Этот участок промотора не реагирует на воздействие абиотических факторов и неактивен в неинфицированной ткани любого типа. Ген барназы, выделенный из Bacillus amyloliquefaciens, кодирует РНКазу, которая обладает высокой цитотоксической активностью. Была создана генноинженерная конструкция, в которой ген барназы был помещен под контролем вышеупомянутого фрагмента prp1-1 промотора (рис. 69). Для того чтобы свести к минимуму возможность разрушительного действия барназы в неинфицированных тканях, в геном тех же клонов была введена химерная генная конструкция, представляющая собой гибридный ген (bastar) под контролем 35S промотора ВМЦК. Barstar, также выделенный из B. amyloliquefaciens, является супрессором активности барназы. Созданную конструкцию использовали для трансформации восприимчивых к фитофторозу сортов картофеля. Трансгенные растения оказались более устойчивыми к фитофторозу по сравнению с исходным нетрансгенным сортом, что выразилось в задержке спороношения и в снижении продукции спорангиев, образующихся на поверхности листьев. У части трансгенных клонов наблюдались резко выраженные морфологические изменения листьев, вплоть до разрушения листовой ткани, не связанное с заражением грибом. Эти линии не использовались в дальнейшей работе. Возникновение таких вариантов среди трансгенов свидетельствует о том, что эффективность защиты, обусловленное двухкомпонентной системы зависит от баланса между экспрессией двух целевых генов и что этот баланс у различных линий может быть сдвинут в ту или иную сторону. Для проверки экспрессии целевого гена барназы линии трансгенного картофеля с нормальной морфологией листьев обрабатывали этиленом (химический индуктор активации промотора prp1-1). Результатом обработки этиленом была массовая деструкция листовой ткани трансгенных линий, из чего следует, что в клетках этих растений встроенный ген барназы действительно способен экспрессироваться в ответ на индукцию prp1-1 промотора. Слабо выраженную устойчивость трансгенных растений можно, повидимому, объяснить либо высоким уровнем конститутивной экспрессии гена barstar, либо низкой индуцирующей активностью промотера prp1-1 в ответ на грибную инфекцию. Для достижения оптимального баланса между экспрессией двух целевых генов необходимо либо заменить 35S промотер ВМЦК на менее активный промотер, либо найти более чувствительный промотер для гена барназы. Альтернативной моделью, генерирующей быстрый и эффективный защитный барьер в виде погибающих клеток в зоне внедрения патогена, может быть одновременная трансформация растений генами авирулентности грибного патогена и соответствующим геном устойчивости растения-хозяина. ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К БАКТЕРИАЛЬНЫМ БОЛЕЗНЯМ ПОСРЕДСТВОМ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Бактериальные болезни имеют большое экономическое значение для многих сельскохозяйственных растений, нанося большие потери урожаям зерновых, овощных и фруктовых культур. В большинстве случаев применение защитных агрохимических технологий недостаточно для эффективной борьбы с бактериальными болезнями. Использование химических средств защиты имеет большие ограничения из-за их потенциально вредного влияния на окружающую среду, так что борьба с бактериозами часто сводится к профилактике. Существование природных источников устойчивости к бактериальным болезням делает возможным создание устойчивых вариантов путем обычной селекции (гибридизации). Классическая гибридизация ограничена внутривидовыми скрещиваниями (или скрещиваниями между близкородственными видами), в то время как имеются источники потенциально эффективных источников устойчивости. Перенос генов устойчивости из диких видов в коммерческие сорта требует, как правило, больших затрат труда и времени. Современные достижения в области разработок методов трансформации растений (рис. ) и прогресс в изучении взаимодействий растений с патогенами дают возможность использовать генетическую инженерию для создания растений, устойчивых к болезням. В отличие от классической гибридизации, генетическая инженерия позволяет модифицировать или интродуцировать один или более признаков устойчивости в восприимчивые сорта. В течение последнего десятилетия было предложено много различных генетических подходов для получения устойчивых к бактериальным болезням растений, с использованием методов генетической инженерии, включая продуцирование антибактериальных белков нерастительного происхождения, ингибирование бактериальных факторов патогенности и вирулентности, повышение природных защитных свойств растений и искусственную индукцию запрограммированной гибели клеток в месте инфекции. Они основаны на знаниях механизмов действия антибактериальных агентов и последовательных этапов взаимоотношений «растение-бактерия». В данном разделе описываются различные подходы и обсуждаются их возможности и ограничения для получения трансгенных растений, устойчивых к бактериальным болезням растений. Использование антибактериальных белков нерастительного происхождения Антибактериальные белки являются важными компонентами антимикробных защитных механизмов у многих групп животных. Действуя синергически , они оказывают бактерицидное действие на широкий круг Грамотрицательных и Грам-положительных бактерий. Некоторые гены, кодирующие антибактериальные белки, отклонированы и экспрессированы в растениях в ходе попыток получить устойчивые к бактериальным болезням трансгены. Литические пептиды насекомых Литические пептиды – низкомолекулярные белки, действие которых заключается в формировании пор в бактериальных мембранах. Они включают в себя цекропины, гены которых были выделены из шелкопряда, и их синтетические аналоги Shiva-1 и SB-37, экспрессированные в трансгенных растениях картофеля и табака. Были получены противоречивые результаты относительно приобретения устойчивости. Потомство трансгенных растений табака, экспрессирующее ген Shiva-1, показало задержку развитие симптомов и снижение процента погибших растений после заражения Burkholderiana (Pseudomonas) solanacearum (возбудитель бактериального вилта). Устойчивость к B.solanacearum и Pseudomonas syringae pv.tabaci не обнаруживается у трансгенных растений табака, экспрессирующих ген цекропина В, как оказалось, из-за деградации цекропинов растительными протеазами. Устойчивость, однако, возникает в том случае, когда в табаке экспрессируется стабильный аналог цекропина (МВ 39), причем устойчивость сохраняется и у потомства трансгенных растений. Аттацины – другой класс литических пептидов, выделенных из шелкопряда. Ген аттацина Е был интродуцирован в растения яблони, и несколько трансгенных клонов показали снижение восприимчивости к Erwinia amylovora, возбудителю бактериального ожога. Одна из этих линий показала снижение количества симптомов на 50% в условиях полевого эксперимента на искусственном инфекционном фоне. Лизоцимы Лизоцимы – широко распространенные ферменты, специфически гидролизирующие пептидогликана клеточных стенок бактерий. В растениях экспрессировались три различных лизоцимных гена (яичного белка, бактериофага-Т4 и человеческого лизоцима). Бесклеточные экстракты из трансгенных растений табака, продуцирующих лизоцим куриного яичного белка, ингибировали рост некоторых видов бактерий. Эксперименты в теплице и in vitro показали частичную устойчивость к Erwinia carotovora pv. atroseptica трансгенных растений картофеля, продуцирующих лизоцим бактериофага-Т4, и небольшое уменьшение симптомов, вызываемых P. syringae pv.tabaci, у растений табака, продуцирующих человеческий лизоцим . Другие антибактериальные пептиды Лактоферрин – связанный с железом гликопротеин, имеющий антибактериальные свойства. Экспрессия гена человеческого лактоферрина приводила к задержке появления симптомов заражения растений табака Р. solanacearum на 5-25 дней. Устойчивость обусловлена расщеплением лактоферрина в растении и образовании короткого пептида с высокой антибактериальной активностью. Ген, кодирующий литический пептид тахилепсин, выделенный из камчатского краба, также экспрессировался в трансгенном картофеле и приводил к снижению числа пораженных гнилью клубней, вызываемых E.carotovora . Эффективность этих подходов может быть повышена путем совместной экспрессии нескольких генов литических пептидов, позволяющей получить синергические эффекты. В настоящее время проводится активный поиск антибактериальных белков из разных источников. Обнаружение новых семейств белковых молекул повысит возможности генетической инженерии в деле создания трансгенных растений, устойчивых к бактериальным болезням. Результатом изучения структуры и функций этих белков может быть конструирование синтетических молекул с повышенной экспрессией и стабильностью в растительных тканях. Ингибирование бактериальных факторов патогенности Экспрессия в растении любого механизма, ингибирующего бактериальные факторы патогенности или вирулентности, должна теоретически приводить к устойчивости или пониженной восприимчивости. Хотя многие из этих факторов (токсины, пектиновые ферменты, экзополисахариды, гормоны) хорошо изучены у многих видов бактерий, эти знания не были широко использованы для разработки генно-инженерных подходов к созданию устойчивых к бактериальным болезням сельскохозяйственных культур. Ингбирование бактериальных токсинов Токсины, продуцируемые различными патотипами P.syringae, вызывают симптомы в виде хлоротических пятен на листьях растения-хозяина. Бактерии устойчивы к собственным токсинам вследствие наличия различных механизмов самозащиты. У P.syringae pv.tabaci ген ttr (устойчивости к таб-токсину) кодирует фермент, который инактивирует табтоксин, являющийся ингибитором глютаминсинтетазы (стр. ). Этот ген был экспрессирован в табаке, и трансгенные растения оказались абсолютно устойчивыми к бактериям. В основе иного механизма является синтез «мишени», нечувствительной к токсину. Например, токсин P.savastanoi pv.phaseolicola ингибирует фермент орнитинкарбомоилтрансферазу, участвующую в биосинтезе аргинина (см. стр. ). Бактериальная орнитин-карбомоилтрансфераза устойчива к собственному фазеолотоксину. Кодирующий ее ген (arg K) был отклонирован и использован для трансформации растений сои, которые оказались устойчивы к инфицированию P.syringae pv.phaseolicola. Другие возможные подходы Экспрессия моноклональных антител в трансгенных растениях – альтернативный подход, который уже был успешно использован для защиты растений от вирусной инфекции. Одноцепочечные антитела особенно подходят для этой цели, так как их синтез не особенно сложен, и они могут достигать цели в различных отделах клетки. Для успешной защиты растений должны быть использованы специфичные для одного из бактериальных факторов патогенности или вирулентности антитела. Описано получение антител против пектолитических ферментов Erwinia chrysanthemi и E.carotovora . Другой возможный подход основан на недостатке железа в растительных тканях. E.chrysanthemi синтезирует сидерофор (соединение, связывающее железо), хризобактин, который обеспечивает бактерии железом в железодефицитных условиях, преобладающих в растениях. Железо необходимо для жизнедеятельности бактерий. Трансформация растений генами, кодирующими мощные поглотители железа у позвоночных - трансферрины, в целях лишения бактерий железа во время инфекции, предложена как метод повышения устойчивости к болезням. Еще один подход – использование бактериального гена (b0), кодирующего работу протоновой помпы (бактериальный опсиновый белок). Механизм его действия пока точно не известен. Экспрессия b0-гена в трансгенном табаке приводила к повышенному уровню устойчивости к некоторым вирусам и к полной устойчивости к P.syringae pv.tabaci. Трансгенные растения также накапливали большие количества салициловой кислоты, которая является ключевым химическим сигналом индуцируемой патогеном системноприобретенной устойчивости. Однако, у трансгенного картофеля экспрессия b0гена приводила к изменению фенотипа и пониженной жизнеспособности. Повышение природных защитных свойств растений Молекулярные взаимодействия, приводящие к активации защитных механизмов растения, интенсивно изучаются, и последние достижения открывают ряд возможностей для повышения устойчивости сельскохозяйственных культур к болезням и вредителям методами генетической инженерии. Повышенная продукция элиситоров Элиситоры продуцируются либо самим патогеном, либо компонентами клеточных стенок растений, образующихся после гидролизующего действия патогена (см. стр. ). Продукция элиситоров в растениях вследствие применения технологий с использованием рекомбинантных ДНК – заманчивый подход к решению вопроса повышения устойчивости к болезням, и уже были сделаны попытки применить его на картофеле. Трансгенные клубни, продуцирующие пектолитический фермент E.carotovora (известно, что он может освобождать из клеточной стенки олигомерные сахариды, действующие как элиситоры), были намного менее восприимчивы к бактериям, чем клубни нетрансгенных растений. В этом случае фермент продуцировался внутриклеточно, и элиситоры освобождались только при инфекции в результате выделения фермента из тканей, разрушающихся в процессе инфекции. Экспрессия клонированных генов устойчивости В течение последнего десятилетия были изучены молекулярные основы взаимодействий растения-хозяина и патогена и отклонированы гены авирулентности (avr) и соответствующие гены устойчивости (R). Эти разработки были применены для защиты риса от бактериальной пятнистости листьев, вызываемой Xanthomonas oryzae pv.oryzae. Трансформация восприимчивого сорта риса R-геном Xa-21, выделенным из устойчивой линии, приводила к появлению растений риса, высокоустойчивых ко многим изолятам X.oryzae . Сигнальные пути в царстве растений, по-видимому, одинаковы, по крайней мере, у близкородственных видов. Действительно, трансгенный табак, экспрессирующий R-ген Pto (выделенный из томата и дающий устойчивость к P.savastanoi pv.tomato), показал устойчивость к P.syringae pv.tabaci. Это открывает возможности для межвидового и межродового переноса функциональных R-генов. Продукты R-генов, придающие устойчивость к бактериям или грибам, имеют сходные структурные особенности: такие, например, как богатые лейцином повторяющиеся последовательности, которые, возможно, участвуют в восприятии сигналов генов авирулентности (подробнее см. стр. ). Многообещающей выглядит возможность создания синтетических Rгенов, способных реагировать на широкий спектр патогенов и/или ориентированных на стабильные Avr-сигналы этих патогенов. Повышенная продукция форм активированного кислорода Ранняя ответная реакция, которая имеет место сразу после инфицирования растений бактериальными (и иными) патогенами - это локальная, кратковременная, но массированная генерация активных форм кислорода (АФК), называемая окислительным взрывом (см. стр. ). Накопление перекиси водорода и других АФК, по-видимому, несет несколько функций в защитных механизмах растений (рис. ): 1) запуск локальной гибели СВЧклеток; 2) усиление прямой антимикробной активности; 3) укрепление клеточной стенки растений. Кроме того, перекись водорода может служить сигналом для индукции генов контролирующих защиту в окружающих тканях. Экспрессия гена глюкозооксидазы из Aspergillus niger индуцировала выработку высокой концентрации перекиси водорода в тканях трансгенных растений картофеля и повышенную устойчивость к E.carotovora (а также к оомицету Phytophthora infestans). Значительное повышение концентрации перекиси водорода в растительных тканях обнаруживалось только при бактериальной инфекции. Бактериальные пектолитические ферменты, возможно, освобождали внутриклеточную глюкозу, которая, в свою очередь, служила субстратом для глюкозооксидазы. Экспрессия защитных генов растений Экспрессия гетерологичных генов растений, приводящих к синтезу антимикробных пептидов тионинов, была использована для получения трансгенных растений, устойчивых к бактериям. Активность тионинов объясняется их электростатическим взаимодействием с мембранными фосфолипидами, приводящим к образованию пор. In vitro тионины токсичны для ряда бактериальных патогенов растений. Однако, трансгенные растения табака, экспрессирующие тиониновые гены ячменя, имели различную устойчивость к P.syringae pv.tabaci. В одном случае через три дня после заражения листа патогеном наблюдался очень низкий уровень некротических повреждений, а в другом случае не наблюдалось никакого изменения устойчивости, даже несмотря на то, что трансгенные растения синтезировали большие количества тионинов. Этот отрицательный результат был приписан отсутствию секреции тионинов в межклеточных пространствах, где обычно находятся бактерии. Как правило, перенос отдельных защитных генов обеспечивает только частичную устойчивость трансгенных растений. Возможно, это происходит потому, что в растении защитные реакции работают против патогена в комплексе. Следовательно, экспрессия комбинации гетерологичных защитных генов должна более действенно повышать устойчивость трансгенных растений. Фактически, это уже продемонстрировано на примере нескольких растительногрибных систем, в которых синергическое действие хитиназы и глюканазы повышало устойчивость растений к грибам. Другой стратегией может быть контролируемая активация системной приобретенной устойчивости (SAR) (см. стр. ). Многие исследования направлены на идентификацию генов, участвующих в индукции SAR, что обеспечивает перспективы для получения растений, устойчивых к широкому кругу патогенов, включая бактерии, посредством генетических манипуляций. ОГРАНИЧЕНИЯ, КОТОРЫЕ НЕОБХОДИМО УЧИТЫВАТЬ ПРИ КОММЕРЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ БИОИНЖЕНЕРНЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К БОЛЕЗНЯМ РАСТЕНИЙ Описанные выше подходы к созданию устойчивых к болезням растений посредством генетической инженерии, основаны на нескольких исследованных моделях взаимодействия растений и паразитов. Расширение этих исследований с вовлечением новых видов растений и паразитов и переход к выращиванию трансгенных растений в промышленном масштабе потребует строгого следования определенным критериям, таким как эффективность, надежность, отсутствие токсичности и слабое воздействие на окружающую среду. Эффективность той или иной стратегии трудно оценить до проведения экспериментов по трансформации растений. После интеграции целевого гена в геном растения-реципиента, эффективность действия этого гена зависит от уровня экспрессии, на который может влиять, в некоторых случаях, гомологично-зависимое бездействие (молчание) гена. Это может быть серьезной проблемой при разработке методик, использующих гомологичные последовательности (R-гены, тионины, ФА). Более того, белки должны синтезироваться, экспортироваться из клетки и передвигаться в нужное место достаточно быстро, не подвергаясь серьезным модификациям во время процесса транспорта; они должны быть также стабильны в месте их дислокации, избегая деградации растительными протеазами. Длительность сохранения устойчивости трудно предсказать, так как она зависит от способности патогенов преодолевать новый тип устойчивости. Так как действие антибактериальных пептидов на бактериальные клеточные стенки или мембраны не рецепторно-специфично, только очень значительные изменения в строении этих структур могут сделать бактерии способными противостоять литическим механизмам, что маловероятно. С другой стороны, известно, что мутации avr-генов происходят часто, и, таким образом, устойчивость, обусловленная интеграцией соответствующего R-гена, может быть преодолена. Комбинирование нескольких различных методических подходов при работе с определенным растительным генотипом уменьшит риск появления множественных мутаций патогена, которые могут привести к потере устойчивости. Генно-инженерная селекция растений заставляет обратить внимание на возможную токсичность или аллергический риск для людей и животных при потреблении трансгенных растений, а также влияния этих растений на окружающую среду. Первый вопрос касается методов, использующих пептиды, не входящие в рацион человека или животных, - в этом случае необходима полная и всесторонняя оценка токсичности. Такие пептиды, как лактоферрин, или пептиды, выделенные из съедобных растений, вряд ли могут быть опасны. Основным вопросом, касающимся влияния на окружающую среду, является возможное воздействие на природную микрофлору (эндофитные и эпифитные микробные популяции, ризосферную микрофлору) вследствие экспрессии в трансгенных растениях чужеродных генов. Это особенно касается методов с использованием пептидов, имеющих широкий спектр активности против различных микроорганизмов. Для полного решения этого вопроса должны быть разработаны адаптированные методики. Наконец, существует опасность некотролируемого перехода генов в близкородственные виды растений; последствия этого трудно прогнозировать. Совсем не изученной областью являются возможные направления эволюции патогенов на фоне взаимодействия с устойчивыми к ним трансгенными растениями. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Общие работы Борьба с болезнями растений: Устойчивость и восприимчивость. Ред. Р.Стейплз, Г.Теннисен. М. Колос. 1984. 292 с. Деверолл Б.Дж. Защитные механизмы растений. М.Колос. 1980 С.1-120. Дьяков Ю.Т. Физиолого-биохимические механизмы устойчивости растений к грибным болезням. Итоги науки и техники. Защита растений. Т.3. М. ВИНИТИ, 1983. С.5-90. Дьяков Ю.Т. Пятьдесят лет теории «ген-на-ген». Усп. Совр. Биол. 1996. Т.116. С.293-305. Ильинская Л.И., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Биохимические механизмы устойчивости и восприимчивости растений. ВИНИТИ, Итоги науки и техники, сер. Защиты растений. 1991 T.7. C.1-194. Инфекционные болезни растений. Физиологические и биохимические основы. М. Агропромиздат. 1985. Метлицкий Л. В. Иммунологический контроль в жизни растений. ХLV Тимирязевские чтения. 1987. 69 с. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л. Как растения защищаются от болезней. М. Наука. 1985. 189 с. Успехи современной генетики (под ред. И.А.Захарова). 1994. В.19. 205 с. Biology and Molecular Biology of Plant-Pathogen Interaction. Nato Asi Series. V H1. 1986. 415 p. Genes Involved in Plant Defense. Eds. T.Boller, F.Meins. Springer Verlag. 1992. Keen N.T. The molecular biology of disease resisitance. Plant. Molec. Biol. 1992. V.19. P.109-122. Molecular Strategies of Pathogens and Host Plants (eds. S.S.Patil e.a.). SpringerVerlag Staskawicz .J., Ausuber F.M., Baker B.J., Ellis J.G., Jones J.D.G. Molecular genetics of plant disease resistance. Science. 1995. V.268. P.661-667. К главе 1. Hansen E.M. Speciation in plant pathogenic fungi: the influence of agricultural practice. Canad J. Plant Pathol. 1987. V.9. P. 403-410. Hardham A.R. Cell biology of pathogenesis. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1992. V.43. P.491-526. Lewis D.H. Concepts in fungal nutrition and the origin of biotrophy. Biol.Rev. 1973. V.48. P.261-278. Scott K.J. Obligate parasitism by phytopathogenic fungi. Biol. Rev. 1972. V.4. P.537-572. Shaner G. Stromerg E.L., Lacy G.H., Baker K.R., Pirone T.P. Nomenclature and concepts of pathogenicity and virulence. Ann. Rev. Phytopathol. 992. V.30. P. 47-66. Stall R.E., Roerts D.A. Plant pathology and the control of plant disease. In: Plant Pest Control. San Francisco. 1978. P.89-121. К главе 2. Бойко А.Л. Экология вирусов растений. Киев, Выща школа, 1990. 164 с. Гиббс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений. М. Мир.1978. 429 с. Карасев А.В. Структура частиц генома палочковидных и нитевидных вирусов растений. Итоги науки и техники. Общие проблемы физикохимической биологии. ВИНИТИ. 1990. Т.22. С.3-30. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М. Наука. 1983.247 с. Fundamentals of Bacterial Plant Pathology. Acad. Press. 1992. 342 P. Hibbett D.S., Donoghue M.J. Integrating phylogenetic analysis and classification in fungi. Mycologia. 1998. V.90. P. 347-356. Kohn L M. Developing new characters for fungal systematics: an experimental approach for determining the rank of resolution. Mycologia. 1992. V.84. P.139-153. Milne R.G. Plant virus taxonomy and nomenclature: what’s new? Revista de Investigaciones Agropecuarias. 1990. V.22. P.206-224. Recognition and Responce in Plant-Virus Interactions. Ed. R.S.S.Frasier. Springer-Verlag. 1990. P.467. Young J.M., Takikawa Y., Gardau L., Stead D.E. Changing concepts in the taxonomy of plant pathogenic bacteria. Ann. Rev. Phytopathol. 1992. V.30. P.67-105. Young J.M., Sadder G.S. et al. Names of plant pathogenic bacteria 1864-1995. Rev. of Plant. Pathol. 1996. V.75. P.921-763. К главе 3. Caten C.E. The concept of race in plant pathology. In: Populations of Plant Pathology. Eds. M.C.Wolfe & C.E.Caten. Blackwell Sci. Publ. 1987. P. 21-37. Flor H.H. Current status of the gene-for-gene concept. Ann. Rev. Phytopathol. 1971. V.9. P.275-296. Keen N.T. Specific recognition in gene-for-gene host-parasite systems. Adv. Plant Pathol. 1982. V.1. P.35-82. Loegering W.Q. Current concepts in interorganismal genetics. Ann. Rev. Phytopathol. 1978. V.16. P.309-320. Newton A.C., Andrivon D. Assumptions and implications of current gene-forgene hypothesis. Plant Pathol. 1995. V.44. P.607-618. К главе 4. Bohlmann H., Apel K. Thionins. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1991. V.42. P.227-240. Chappell J. Biochemistry and molecular biology of the isoprenoid biosynthetic pathway in plants. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1995. V.46. P.521548. Collmer A. The molecular biology of pectic enzyme production and bacterial soft root pathogenesis. In: Biol. and Molecular Biol. of Plant-Pathogen Interaction. Ed. J.Bailey. Springer Ferlag, 1986. P.277-289. Gross D.C. Molecular and genetic analysis of toxin production by pathovars of Pseudomonas syringae. Ann. Rev. Phytopathol. 1991. V.29. P.247-278. Herrmann K.M., Weawer L.M. The shikimate pathway. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1999. V.50. P.473-504. Howard R.J., Ferrari M.A. Role of melanin in appressorium function. Exp. Mycol. 1989. V.13. P.403-418. Menden K., Hahn M., Deising H. Morphogenesis and mechanisms of penetration of plant pathogenic fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 1996. V.34. P.367-386. Phytotoxins and Plant Pathogenesis (eds. A.Graniti e.a.). Acad. Press. 1989. 508 p. Romantschuk M. Attachment of plant pathogenic bacteria to plant surface. Ann. Rev. Phytopathol. 1992. V.30. P.225-243. Schafer W. Molecular mechanisms of fungal pathogenicity to plants. Ann. Rev. Phytopathol. 1994. V.32. P.461-477. Whetten R.W.,, MacKay J.J., Sederoff R.R. Recent advances in understanding lignin biosynthesis. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1998. V.49. P.585610. Yamada T. The role of auxin in plant-disease development. Ann. Rev. Phytopathol. 1993. V.31. P.253-273. К главе 5 Альберсгейм П. Дарвилл А. Олигосахарины. В мире науки. 1985. № 11. С. 16-23. Усов.А.И. Олигосахариды - новый класс сигнальных молекул растений. Успехи химии. 1999. Т.62. С.1119-1144. Ahro R., Dreier J., Eichenlaub R. Genetics of phytopathogenic bacteria. Progress in Botany. 1997. V.58. P.410-427. Boller T. Chemoreception of microbial signals in plant cells. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1995. V.46. P.189-214. Ush D.S. Calcium regulation in plant cells and its role in signaling. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1995. V.46. P.95-122. De Wit P.J.G.M. Molecular characterization of gene-for-gene systems in plantfungus interactions and the application of avirulence genes in control of plant pathogens. Ann. Rev. Phytopathol. 1992. V.30. P.391-418. Hahn M.G. Microbial elicitors and their receptors in plants. Ann. Rev. Phytopathol. 1996. V.34. P.387-412. Kogel K. H., Beiβmann B. Isolation and characterization of elicitors. Ann. Rev. Phytopathol.. 1995. V.33. P.240-257. Lamb C.H., Dixon R.A. The oxidative burst in plant disease resistance. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1997. V.48. P.251-275. Leach J.E., White F.F. Bacterial avirulence genes. Ann. Rev. Phytopathol. 1996. V.34. P.153-179. Lindgren P.B. The role of hrp genes during plant-bacterial interactions. Ann. Rev. Phytopathol. 1997. V.35. P.129-152. Yoshikawa M., Yamooka N., Takeuchi Y. Elicitors: Their significance and primary modes of action in the induction of plant defense reaction. Plant Cell Physiol. 1993. V.34. P.1163-1173. К главе 6. Аверьянов А.А. Активные формы кислорода и иммунитет растений. Успехи современной биологии 1991. Т.111. С. 722-737 Гречкин А.Н., Тарчевский И.А. Оксилипины высших растений: биосинтез и функции. Физиология растений, 1999. Т.46. С.132-142. Линдер М.Е., Гилман А.Г. G-белки. В мире науки, 1992, № 9-10. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки. ВИНИТИ, Итоги науки и техники, серия Физиология растений. 1989. В.6. С.1-168. Тарчевский И.А. Элиситор- индуцируемые сигнальные системы. Физиология растений. 2000. Т.47 (в печати). Boller T. Chemoreception of microbial signals in plant cells. Ann Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1995. V.46. P.189-214. Dixon R.A. Harrison M.J., Lam C.J. Early events in the activation of plant defense responses. Ann. Rav. Phytopathol. 1994. V.32. P.479-501. Gabriel D.W., Rolfe B.G. Working models of specific recognition in plant – microbe interactions. Ann. Rev. Phytopathol. 1990. V.28. P.365-391. Wenzel G. Function of genetic materials responsile for disease resistance in plants. Progress in Botany. 1998. V.59. P.80-123. Greelman R.A., Muller J.E. Biosynthesis and action of jasmonates in plants. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1997. V.48. P.355-382. Hammond-Kozak K.E., Jones J.D.G. Plant disease resistance genes. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1997. V.48. P.575-607. Hardie D.G. Plant protein serine/threоnine kinases: classification and function. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1999. V.50. P.97-132. Hutcheson S.W. Current concepts of active defense in plants. Ann. Rev. Phytopathol. 1998. V.36. P.59-90. Keen N.T. The molecular biology of disease resistance. Plant Molec. Biol. 1992. V. 19. P.109-122. Lam C.J. Plant disease resistance genes in signal preception ane transduction. Cell. 1994. V.76. P.419-422. Moffat A.S. Mapping the sequence of disease resistance. Science. 1994. V.265. P.1804-1805. Ryan C.A., Farmer E.E. Oligasaccharide signals in plants: a current assessement. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1991. V.42. P.651-674. Semdner G., Parthier B. The biochemistry and the physiological and molecular actions of jasmonates. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1993. V.44. P.569-589. К главе 7. Мосолов В. В., Валуева Т.А. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов. ВИНИТИ.1993. С.1-207. Фитоалексины. Под ред. Бейли Д.А. и Мансфильда Д.В. Киев. Наукова Думка. 1985. 320 c. Alexander D., Lawton K., Uknes S., Ward E., Ryals J. Defense-related gene induction in plants. Genetic Engineering. 1994. V.16. P.195-212. Dixon R. A., Palva N. L. Stress-induced phenylpropanoid metabolism. Plant Cell. 1995. V.7. P 1085-1097. Enyedi A. J., Yalpani N., Silverman P., Raskin I. Signal molecules in systemic plant resistance to pathogenes and pests. Cell. 1992. V.70. P.879 886. Hammerschmidt R. Phytoalexins: what we have learned after 60 years? Ann. Rev. Phytopathol. 1999. V.37. P.28-306. Kuc J. Phytoalexins, stress metabolism and disease resistance in plant. Ann. Rev. Phytopathol. 1993. V.33. P.275-297. Linthorst J. M. Patogenesis- related proteins of plant. Critical Reviews in Plant Sciences. 1991. V.10. P.123-150. Raskin J. Role of salicylic acid in plants. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1992. V.43. P.439-463. Ryals J., Uknes S., Ward E. Systemic aquired resistance. Plant Physiol. 1994. V.104. P.1109-1112. Ryan C.A., Pearce G. Systemin: a polypeptide signal for plant defense genes. Ann. Rev. Cell and Developmental Biol. 1998. V.14. К главе 8. Beiβmann B., Kogel K. H. Identification and characterization of suppressors. Ann. Rev. Phytopathol. 1995. V. 33. P. 259-275. Oliver R., Osbourn A. Molecular dissection of fungal phytopathogenicity. Microbiology. 1995. V.141. P.1-9. Walton J.D., Panoccione D.G. Host-selective toxins and disease specificity. perspectives and progress. Ann. Rev. Phytopathol. 1993. V.31. P.275-303. VanEttenH., Mattews D., Mayyews P. Phytopalexin detoxification: Importance for pathogenicity and practic implications. Ann. Rev. Phytopathol. 1980. V.27. P.143164. К главе 9. Озерецковская О.Л. Индуцирование устойчивости растений биогенными элиситорами фитопатогенов. Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т..30. С. 325-339. Озерецковская О.Л., Ильинская Л.И., Васюкова Н.И. Механизмы индуцирования элисторами системной устойчивости растений к болезням. Физиология растений. 1994. Т. 41. С.626-633. Baulcombe D.C. Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in transgenic plants. The Plant Cell. 1996. Vol.8, P.18331844. Cornelissen B. J. C., Melchers L.S.. Strategies for control of fungal diseases with transgenic plants. Plant Physiology. 1993 Vol.101. P. 709 712. Depicker A., Van Montagu M., Schell J. Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In: Genetic Engineering of Plants. Plenum Press, New York, London.1983. P.143-176 Djavakhia V.G., Nikolaev O.N., Voinova T.M., Battchikova N.A., Korpela T., Khomutov R.M.. DNA sequence of gene and amino acid sequence of protein from Bacillus thuringiensis, which induces non-specific resistance of plants to viral and fungal diseases. Russian Journal of Phytopathological Society. 2000. Vol.1, p. 12–23 Fisher R., Hain R.. Plant disease resistance resulting from the expression of foreign phytoalexins. Current Opinion in Biotechnology. 1994. Vol.5. P. 125-130 Fitchen J.H. Beachy R.N. Genetically engineering protection against viruses in transgenic plant. Ann. Rev. Microbiol. 1993. V.47. P.739-764. Lyon G.D., Reglinski T., Newton A.C. Novel disease control compounds: the potential to “immunize” plants against infection. Plant Pathol. 1995. V.44. P.407-427. Malyshenko S.I., Kondakova O.A., Nazarova J.V., Kaplan I.B., Taliansky M.E, Atabekov J.G. Reduction of tobacco mosaic virus accumulation in transgenic plants producing non-functional viral transport proteins. Journal of General Virology. 1993. Vol. 74. P.1149-1156. Michelmore R. Molecular approaches to manipulation of disease resistance genes. Ann. Rev. Phytopathol. 1995. V.33. P.393-427. Mourgues F., Brisset M.-N., Chevreau E. Strategies to improve plant resistance to bacterial diseases through genetic engineering. TibTech. 1998. Vol.16. P.203-210. Nelson R.S., Powell P.A., Beachy R.N.. Coat protein-mediated protection against virus infection. In: Genetic Engineering of Crop Plants. Butterworths, London, 1990. P.13-23. Strittmatter G., Janssens J., Opsomer C., Botterman J.. Inhibition of fungal disease development in plants by engineering controlled cell death. Bio/Technology. 1995. Vol.13. P.1085-1089. СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ Рис.1. Строение гаустория Puccinia graminis (Андреев, Плотникова, ). МКГ – материнская клетка гаустория; ЭМ – экстрагаусториальная мембрана (инвагинированная плазмалемма); ЭГМ – экстрагаусториальный матрикс. Рис.2. Концентрация радиоактивно меченых продуктов фотосинтеза в зоне пустул ржавчны на листе пшенцы (Shaw,Samborski, 1956) Рис.3. Миграция ядер, митохондрий и протопластид из клетки паразита в клетку хозяина (Goff, Coleman, 1995) А. Клетка паразита (слева) формирует кон:юкторную клетку, которая сливается с клеткой хозяина, доставляя в нее органеллы паразита (ядра паразита – черные, хозяина – белые). Б. Ядра и митохондрии паразита реплицируются в клетке хозяина, вытесняя хозяйские. В. Клетка паразита отделяется от хозяйской, имеющей смешанные органеллы. Она содержит собственные ядра и митохондрии и протопластиды, возникшие из пластид хозяина. Рис 4. Гипотетическая схема эволюции анастомозных групп Rhizoctonia solani в агроценозах. АГ – анастомозные группы; г + ц – процент гуаниновых и цитозиновых оснований ДНК; цифры над стрелками – процент гомологии ДНК по результатам гибридизации. Рис. 5. Геном ВТМ и кодируемые им белки. Объяснения в тексте. Рис. 6. Поражаемость четырех сортов картофеля тремя расам Phytophthora infestans. По оси ординат – степень пораженности (в процентах). Сорт Северная Роза восприимчив ко всем раса (нет устойчивости); сорт Вольтман умеренно устойчив ко всем расам (горизонтальная устойчвость); сорт Домодедовский асолютно устойчив к расам 0 и 1.4, но сильно поражается расой 3 (вертикальная устойчивость к отдельным расам); сорт Олев абсолютно устойчив к расам 0 и 3, и умеренно устойчив к расе 1.4 (сочетание вертикальной устойчвости к отдельным расам с горзонтальной устойчивостью к всем расам). Рис.7. Шкала типов реакции пшеницы на заражение расами Puccinia graminis (шкала Стекмена). Рис 8. Жизненный цикл Puccinia graminis. А кариогамия в покоящихся телиоспорах; Б мейоз и образование промицелия с 4-я гаплоидными базидиоспорами, заражающими барбарис. В лист барбариса с спермогониями и спермациями, которые переносятся насекомыми из одного спермогония в другой; Г после слияния гетероаллельных по типу спаривания клетк на нижней стороне листа формируется эций с двухядерными эциоспорами; Д– заражение эцоспорой стебля пшеницы приводт к формированию пустулы с двуядерными уредииноспорами; Е После отмирания стебля в пустулах формируются толстостенные, зимующие, двухядерные телиоспоры. Рис. 9. Генетические системы паразитов и растений-хозяев, ответственные за их взаимодействия (Lamb et al., 1989; с дополнениями). Рис.10. Ориентация ростковой трубки урединиоспоры Puccinia graminis перпендикулярно длинной оси листа пшеницы (Андреев, Плотникова, 1989). Рис. 11. Инфекционные структуры Puccinia graminis (Андреев, Плотникова, 1989). У урединиоспора; РТ – ростковая трубка; А – апрессорий; ПВ – подустьчное вздутие; ИГ – инфекционная гифа; МКГ – материнская клетка гаустория; Г – гаусторий; Я – ядра клеток хозяина; Хл – хлоропласты. Рис. 12. Модель клеточной стенки растений (Alerscheim, 1975) Рис. 13. Ферментативный гидролиз пектина. PG – полигалактуроназа; PGL – пектатлиаза; PME – пектинметилэстераза. Рис. 14. Вивотоксины. 1. Тентоксин Alternfria alternata. 2. Фузариевая кислота Fusarium oxysporum. 3. Фузикокцин Fusicoccum amygdali. 4. Фазеолотоксин Pseudomonas syringae pv. phaseaolicola. 5. Табтоксин P.syryngae pv. tabaci. 6. Коронатин P.syringae pv.coronafaciens. Рис. 15. Фитогормоны Рис. 16. Биосинтез ИУК у бактерии Pseudomonas savastanoi. а триптофан монооксигеназа; b – индолацетамид гидролаза Рис. 17. Схема ближнего транспорта ВТМ (Waigmann, Zamriski, 1995) Рис. 18. Пути биосинтеза фенолов в растении. А – шикиматный путь (1, 2. 3 – этапы), Б – ацетатный путь Рис. 19. Структура лигнина Рис. 20. 1. Конденсация двух молекул изопрена 2. структура монотерпена. 3. Сесквтерпен манзонон. Рис. 21. Фитостерины: 1. ситостерин; 2 - стигмастериин Рис. 22. β-каротин Рис. 23. Фенольный агликон лука квертицин (1) и продукты его распада протокатеховая кислота (2) и о-катехол (3). Рис.24. Пиносильвин Рис. 25. Формирование 2-бензоксазолинона, агликона бензоксазина. Рис. 26. Пути деградации линамарина с образованием синильной кислоты. 1 β-глюкозидаза, 2 – оксинитрилаза. Рис. 27 Деградация молекулы тюлипозида грибом Botrutis cinerea. Рис. 28. Сапонин овса авенацин. Рис. 29. Стероидные гликоалкалоиды: 1 – соланин; 2 - томатин Рис. 30. Образование изороданидов из тиоглюкозида синигрина Рис.31. Модель взаимодействия паразита и хозяина, основанная на диаллельных взаимоотношениях по правилу «ген на ген». Квадраты – генотипы растения; кружки – генотипы паразита. R (устойчивость) –доминантный аллель и его продукт – специфический рецептор (на поверхности квадрата); s (восприимчивость) – рецессивный аллель (отсутствие рецептора). А (авирулентность) – доминантный аллель паразита и его продукт – специфический элиситор (стрелка); v (вирулентность) – рецессивный аллель (отсутствие элиситора). Заштрихованы – совместимые комбинации, обусловленные отсутствием взаимодействия генопродуктов. Рис. 32. Классификация элиситоров Рис. 33. Модель взаимодействия паразита и хозяина, основанная на диаллельных взаимоотношениях, противоположных правилу “ген на ген”. S (восприимчивость) – доминантный аллель и его продукт – специфический рецептор; r (устойчивость) – рецессивный аллель (отсутствие рецептора). V (вирулентность) – доминантный аллель и его продукт – специфический супрессор; а – авирулентность (отсутствие супрессора). Заштрихованы – совместимые комбинаци, обусловленные взамодействием генопродуктов. Рис. 34. Первичная структура 5 гепта-β-глюкозидов (Yoshikawa et al.,1993). Glc и G – глюкозидные остатки. Рис. 35. Схема строения молекулы ксилоглюкана и его фрагментов Рис. 36. Сиринголиды – элиситоры Pseudomonas syringae pv.tomato Рис. 37. Модели функционирования avr-генов бактерий и индукции ими защитных эффектов у растений (Leach,White,1996). 1. Продукт avr-гена – элиситор, который экспортируется из клетки с помощью аппарата Hrp-генов и взаимодействует с специфическим рецепторов, находящимся на плазматической мембране. 2. Avr-продукт направляет синтез или модификацию метаболита, играющего роль расоспецифического элиситора. 3. Расоспецифический рецептор находится внутри клетки. Белок-элиситор проникает в клетку растения-хозяина с помощью Hrp-белка. Рис. 38. Схемы перестроек хромосом, осуществляющихся путем кроссинговера между повторяющимися последовательностями ДНК (Глазер, 1998). а –внутримолекулярная рекомбинация между обращенными повторами bcd и d’c’b’ в участке между b и c (здесь и далее апострофы позволяют различать одинаковые части двух повторов) сопровождается поворотом на 1800 (инверсией) участка efg, заключенного между повторами; б – внутримолекулярная рекомбинация по прямым повторам bdc и b’c’d’. Для их вхождения в синапсис дуплекс ДНК должен изогнуться в виде петли. Кроссинговер происходит на участке между b и c, что приводит к вырезанию сегмента хромосомы между участками кроссинговера и состыковке сегментов, распооложенных снаружи от участков кроссинговера. Вырезаемая последовательность (efg вместе с одной копией повтора bcd) имеет кольцевую форму; в – рекомбинация по прямым повторам bcd и b’c’d’ между сестринскими хроматидами (известная под названием «неравный кроссинговер»). Ее результатом является утрата (делеция) сегмента efg и одной копии повтора bcd в одной хроматиде и их добавление (дупликация) к другой хроматиде. Многократное повторение неравного кроссинговера может привести к увеличению числа (амплификации) генов в хромосоме. Рис. 39. Модель связывания R-белков с элиситорами паразитов и передачи сигнала, основанная на структуре R-белков (Hammond-Kozak, Jones, 1997). Белок Pto способен непосредственно связываться с avrPto. Другие белки связываются непосредственно или в ассоциации с другими рецепторными белками. Pto и Xa21 имеют протинкиназный домен. Механизм активирования протеинкиназ другими R-белками не ясен. Возможно Cf-белки взаимодействуют после активации элиситорами с киназой типа Pto. Prf, повидимому, необходим для взаимодействия Pto с элиситором. Сокращения: LZ – область лейциновой застежки, TIR – область гомологии с геном Toll дрозофилы и рецептором интерлейкина 1; LRR – мотив, богатый лейциновыми повторами; N – амино-терминальный участок; С – карбоксилтерминальный участок. Рис. 40. Модель индуцирования активной защитной реакции растений (Hutcheson, 1988). Продукт Аvr-гена (треугольник) секретируется патогеном в апопласт клетки хозяина или переносится туда средствами доставки, например, hrp-белками. Обратимое связывание Avr-продуктов R-белками обозначены двухсторонними стрелками. LRR область R-белков обозначена в виде цепочек, состоящих из круглых звеньев. R1 – белки, подобные Ptoпродукту; R2 – белки, имеющие домены LRR-NBS-LZ; R3 - LRR-NBS-TIR класс R-белков; R4 – гомологи продукту гена Cf9; R5 – гомологи продукту гена Xa21; R6 – возможный продукт гена устойчивости, локализованный в ядре. Продукты генов устойчивости изображены в виде димеров, но они могут иметь и иную конформацию. Пути трансдукции сигнала (затемненная часть клетки) включают посттрансляционную активацию белков. К – протеинкиназы; SA – салициловая кислота. Рис.41. Циклический аденозин монофосфат Рис.42. Структура главных фосфолипидов в клетках растений и их гидролиз фосфолипазами. Рис. 43. Фосфатидилинозитозный путь трансдукции сигнала Рис. 44. Образованиие оксилипидов из линоленовой кислоты в растениях Рис. 45. Сигнальные системы растений (Тарчевский, Чернов, 1998). Обозначения: цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; ПК – протеинкиназа; ККМАРК - киназа киназы МАР-киназы; КМАРК - киназа МАРкиназы; МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа; ИФ3 – инозитолтрифосфат; ДАГ –диацилглицерин; ПЖК -гидропероксиформы полиеновых жирных кислот; ЛОГ – липоксигеназа; ФДК - 12-оксофитодиеновая кислота; ЖК - жасмоновая кислота; ЛФС – лизофосфатиды; СК - салициловая кислота; СОД – супероксиддисмутаза; NО - оксид азота; цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат; цАДФриб - циклическая форма аденозиндифосфат рибозы. Рис. 46. Фитоалексины, содержащие только углерод, водород и кислород. (Kuc, 1995). А - медикарпин (красный клевер, белый клевер, люцерна, нут); Бцибулин 1д (лук); В- летуценин А (салат); В- касбен (касторовые бобы); - Г ресвератрол арахис, виноград); Д - скопарон (цитрусовые ); Е- эфир кофейной кислоты арабинозил-5-0-апогенинидин (сорго). Рис.47. Фитоалексины, содержащие другие атомы, кроме углерода, водорода и кислорода (Kuс,1995). А -циклобрассинин (капуста, китайская капуста, редька, турнепс; Б- 3-цианометил-3-гидроксиоксиндол (капуста ); В - спиробрассинин (турнепс); Г- дианталексин (гвоздика). Рис. 48. Пути биосинтеза некоторых фитоалексинов (Kuс,1995). Рис. 49. Схема передачи сигнала индукции генов ингибиторов протеиназ у растений при поранении насекомыми (I) и при поражении фитопатогенными микроорганизмами (II). (Ryan, 1992). Рис. 50. Биосинтез стресс-индуцируемых фенилпропаноидов (Dixon, Paiva, 1995). Сплошные линии демонстрируют детально исследованные реакции, катализируемые отдельными ферментами, многие из которых клонированы. Штрихованные линии требуют нескольких ферментов, которые или менее изучены или варьируют среди растительных видов. Ферменты: СА4Н - 4-гидроксилаза коричной кислоты; СНI - халкон изомераза; СРR - халкон редуктаза; СНS - халкон синтаза; 4СL - 4-кумаран: СоА лигаза; СОМТ - О-метилтрансфераза кофейной кислоты; DHFR - дегидрофлавонол редуктаза; DMID - 7,2-дигидрокси-4-метоксиизофлавонол дегидраза; F3OH флавоно-3-гидроксилаза; F5H - 5-гидроксилаза флавоновой кислоты; IFR изофлавон редуктаза; IFS - изофлавон синтаза; PAL - фенилаланин-аммиаклиаза; SS - стильбен ( или ресвератрол ) синтаза; TAL - тирозин-аммиак-лиаза; UFGT - УДФ-глюкоза флавонол-3-0-глюкозил трансфераза; VR - веститон редуктаза. Рис. 51. Структуры соединений, предположительно участвующих в сигнализации системной защиты. А- салициловая кислота; Б- жасмоновая кислота; В- метиловый спирт жасмоновой кислоты; Г- олигогалактурониды (Х=2 - 10 ); Д - этилен; Е - абсцизовая кислота; Ж - арахидоновая кислота. Рис.52.Биосинтез салициловой кислоты Рис. 53. Глюкозид тубероновой кислоты Рис. 54. Влияние β-глюканов Phytophthora infestans на формирование раневой перидермы в клубнях картофеля (Васюкова,1990). Поверхность диска клубня обработана (слева направо): глюканом несовместимой расы, водой и глюканом совместимой расы. Рис. 55 Патотоксины Рис. 56. Деградация фитоантииципинов. 1. Деградация тюлипозида видами Botrytis. Под действием метаболитов B.cinerea образуется высокотоксичный лактон (слева); под действие B.tulipae образуется слаботоксичная кислоота (справа). 2. Деградация цианида Stenphylium loti. Рис. 57. Пути деградации молекулы фазеоллина разными грибами (Fuchs,1982). Рис. 58. Деградация пизатина грибом Nectria haematococca Рис. 59. Рис. 60. Деградация любимина грибом Gibberella pulcaris Рис.61. Способы переноса генов в растительные клетки (Mourgues et al., 1998). А) Прямой перенос генов – ДНК попадает непосредственно в ядерный или пластидный геном растительной клетки с помощью различных методов, которые стимулируют, пассивный захват ДНК мембранами протопластов (электропорация или химическая обработка), либо ускорение микрочастиц, покрытых ДНК, для переноса ДНК прямо в растительные клетки ( метод биологической баллистики. Б) Непрямой перенос генов, основанный на использовании Ti-плазмиды Agrobacterium. В процессе развития природной инфекции эти фитопатогенные бактерии переносят и интегрируют онкогены в растительный геном. ДНК, переносимая A. tumefaciens, - представляет собой сегмент ДНК из бактериальной Ti-плазмиды ( внехромосомный самореплицирующийся генетический элемент), резидента клетки. Ti-плазмида используется в генетической инженерии с целью получения эффективных непатогенных векторов для трансформации растительных клеток. Из-за низкой частоты трансформации в обоих случаях отбор трансгенных растений легче производить при совместном переносе целевого гена со сцепленным геном селектируемого маркерного гена (обычно ген устойчивости к антибиотикам или гербицидам). Рис. 62. Трансформация тканей растения, индуцируемая pTi-плазмидой, и образование корончатого галла. Рис. 63. Упрощенная схема генетической карты нопалиновой плазмиды pTi . Стрелками указаны последовательности из 25 пар нуклеотидов на правой и левой границах Т-ДНК. Правосторонняя последовательность необходима для интеграции Т-ДНК в растительный геном. Область гена ori ответственна за репликацию плазмиды в клетках A. tumefaciens. Ген nos кодирует нопалинсинтетазу, область noc регулирует катаболизм нопалина. (Singer a. Berg, 1997). Рис. 64. Схема конструирования и использования промежуточного вектора. Рис. 65. Антисмысловые РНК и гомологично-зависимая устойчивость. (А) Синтез антисмысловых фрагментов вирусной РНК. Представлена модель, в которой предположено, что трансгенная вирусная кДНК транскрибируется, а потом копируется кодируемой растением-хозяином РНК-зависимой РНКполимеразой (RdRp) в виде маленьких фрагментов антисмысловых РНК. Вирусная кДНК может быть окружена активными элементами вирусного генома, которые необходимы либо для репликации, либо для инкапсидации и/или для транспорта от клетки к клетке. (В) Гипотетические молекулярные механизмы, реализации антисмысловой РНК-опосредованной гомологичнозависимой устойчивости. Антисмысловые-РНК-фрагменты связываются с гомологичной вирусной или трансгенной РНК с разными последовательностями в зависимости от а/ происхождения РНК-мишени (производная вируса или трансгена); б/ функции белка, кодируемого гибридизующимся участком; в/ наличия какой-либо другой функции РНК кроме функции белок-кодирующей матрицы. (i) и (ii) – антисмысловая РНК связывается с трансгеном (i) и/или с вирусной (ii) РНК, блокируя трансляцию и, тем самым, дестабилизируя транскрипты. Если кодируемый белок необходим для репликации вируса, то накопление вирусной геномной РНК ингибируется. (iii) и (iv) – связывание антисмысловых-фрагментов РНК с трансгенными (iii) и вирусными (iv) . РНК “подставляет” их под РНК-азу, специфичную к двуцепочечным РНК, которая расщепляет транскрипт-мишень. (v) – связывание с антисмысловыми-РНК маскирует регуляторные элементы вирусного генома, предотвращая его взаимодействие с белком, кодируемым вирусом- (VP). Взаимодействие VP сРНК может быть необходимо для репликации вируса, транспорта и других существенных фаз инфекционного цикла. Ингибирование этого взаимодействия может, следовательно, предотвратить накопление вируса в зараженном растении. (Lindbo et al., 1993). Рис. 66. Генные конструкции для конститутивной экспрессии генов хитиназы и глюконазы. (А) Конструкция состоит из: 35S энхансера вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), повышающего частоту инициации транскрипции целевого гена ( гена щелочной хитиназы риса RCH10 / Nos). (Б) Конструкция состоит из 35S двойного промотора ВМЦК, повышающего уровень транскрипции целевого гена (гена кислой 1,3-глюканазы люцерны AGLU1 / Nos). Обе конструкции несут терминирующие 3’-концевые последовательности гена нопалинсинтазы (Nos) pTi-плазмиды A. tumefaciens (Zhu et al., 1994). Рис.67. Модель использования системы avr9-Cf9 генов для индукции СВЧ различными фитопатогенами (deWit, 1992). Двухкомпонентная сенсорная система включает наличие в растительной клетке (обозначена кружком) сенсора (ген avr9, находящийся под контролем промотора, индуцируемого патогеном) и эффектора (гена устойчивости Cf9). Соединенный с avr9 промотор активизируется неспецифическими элиситорами разных патогенов. Продуцируемый вследствие этого процесса avr-белок (черная фигурка) взаимодействует с продуктом гена устойчивости Cf9 (серая фигурка), что приводит к СВЧ-реакции. Рис. 68. Физическая карта кассеты экспрессии трех векторов трансформации pAVIR1, pAVIR2 и pAVIR21. Сокращения означают: P35S - 35S промотор ВМЦК с двойным энхансерным участком; ALMV - 4 лидерные последовательности РНК вируса мозаики люцерны; 63аа - последовательность, кодирующая пре-белок AVR9, состоящий из 63 аминокислотных остатков; 40aa - последовательность, кодирующая пре-белок AVR9, состоящий из 40 аминокислотных остатков; 28aa - последовательность, кодирующая зрелый пептид AVR9, состоящий из 28 аминокислотных остатков; PR-S - последовательность, кодирующая сигнальную последовательность белка PR-S; PR-1a - последовательность, кодирующая сигнальную последовательность белка PR-1a; Tnos - терминирующая последовательность гена нопалинсинтазы. (Honee G. et al., 1995) Рис. 69. Химерические генные конструкции, используемые для трансформации. В плазмидах pTCV13 и pTCV14 ген барназы был слит с prp1-1 промоторными регионами (Р1) или соединенен ТАТА боксом 35S промотора ВМЦК (Р2). Плазмиды pTCV15, pTCV16 и pTCV17 содержат ген Барстар под контролем 35S промотора ВМЦК. Все плазмиды содержат в качестве селектирующего маркера ген неомицинфосфотрансферазы II (neo) под контролем промотора nos (Pnos); 3’g7, 3’nos 3’ocs полиаденилатные сигналы Т-ДНК гена A. tumefaciens соответственно для nos и ocs. LB и RB, соответственно, левый и правый пограничные повторы T-ДНК.(Strittmatter G. et al., 1995)
