На правах рукописи 03.03.04 - клеточная биология, цитология и гистология
advertisement
На правах рукописи УДАРЦЕВА ОЛЬГА ОЛЕГОВНА СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭФФЕКТОВ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ СОСУДИСТОЙ СТЕНКИ IN VITRO 03.03.04 - клеточная биология, цитология и гистология 03.03.01 - физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем РАН Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна кандидат биологических наук Андреева Елена Ромуальдовна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Болтовская Марина Николаевна доктор биологических наук Ведущая организация: Романов Юрий Аскольдович Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова Защита диссертации состоится «___» марта 2011 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН (НИИМЧ РАМН) по адресу: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д. 3. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИМЧ РАМН Автореферат разослан « » февраля 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Л.П. Михайлова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Фотодинамическое воздействие (ФДВ) – неинвазивный двухкомпонентный метод, одним элементом которого является фотосенсибилизатор – вещество, повышающее чувствительность биологических тканей к свету, а другим – низкоинтенсивное лазерное излучение. В результате взаимодействия фотосенсибилизатора и света определенной длины волны происходит образование активных форм кислорода (АФК), которые, как известно, являются цитотоксичными агентами, вызывающими структурные повреждения клеток и приводящими к их гибели [Гельфонд, 2007; Castano, Demidova and Hamblin, 2004]. Метод ФДВ был впервые описан в 60-х годах ХХ века и с тех пор активно применяется в клинической практике для лечения онкологических и некоторых воспалительных (ревматоидный артрит, акне, псориаз и др.) заболеваний [Миронов, 1996; Странадко, 2002; Чиссов, Соколов, Булгакова и Филоненко, 2003; Толстых, Дербенев, Кулешов и др., 2008; Жилова, Бутарева и Волнухин, 2010]. При этом эффективная элиминация опухолевых клеток основана на селективном накоплении в них фотосенсибилизатора за счет более высокой метаболической активности по сравнению с окружающими здоровыми клетками. Наличие погибших клеток и их фрагментов индуцирует процесс естественной тканевой репарации, заключающийся в элиминации разрушенного клеточного материала и представляющий собой последовательные фазы воспалительной реакции. Возможность запуска аналогичных изменений в очагах поражений сосудистой стенки создает предпосылки для использования этого подхода для предотвращения дальнейшего развития патологического процесса. В последние годы был проведен ряд успешных доклинических исследований по лечению пациентов со стенозами периферических артерий с помощью ФДВ [Jenkins, Buonaccorsi, Raphael et al., 1999; Mwipatayi, Hockings, Hofman et al., 2008]. При попытках применения этого подхода для регрессии атеросклеротических поражений следует учитывать, что, в отличие от рестенозов, подобные патологические изменения артерий человека – результат сложного взаимодействия различных типов клеток: моноцитовмакрофагов, лимфоцитов, тучных клеток, эндотелия, гладкомышечных и субэндотелиальных стромальных клеток. Кроме того, в атеросклеротических поражениях нельзя однозначно указать клетки-мишени для ФДВ, так как одни и те же клетки, в зависимости от фазы атеросклеротического поражения, могут выполнять разнонаправленные функции (макрофаги – фагоцитоз липидов vs. синтез ферментов, разрушающих соединительную ткань). С другой стороны, в отличие от опухолей, в случае атеросклеротических поражений или рестенозов, 3 не ставится задача полной ликвидации какого-либо типа клеток. Достаточно приостановить интенсивность процесса, например, за счет снижения фагоцитарной активности макрофагов или пролиферативной активности субэндотелиальных стромальных клеток интимы. Одной из проблем применения ФДВ является отсутствие «идеального» фотосенсибилизатора – все фотоактивные вещества, разрешенные в настоящее время к клиническому применению (порфирины, фталоцианины, хлорины и др.), обладают рядом недостатков (неоднородный химический состав, малая селективность накопления в клеткахмишенях, длительная повышенная кожная фоточувствительность и др.). В связи с этим остро встает вопрос о разработке новых фотосенсибилизаторов с улучшенными свойствами, отвечающих современным требованиям: наличие интенсивной полосы поглощения в длинноволновой области спектра (650 нм ≤ ≤ 800 нм), высокий квантовый выход триплетного состояния, постоянный химический состав, высокая селективность накопления в тканях-мишенях, быстрое выведение из организма, низкая токсичность, устойчивость при хранении и введении в организм. К таким перспективным красителям относят Фталосенс® (новый фотосенсибилизатор ряда фталоцианинов) и про-фотосенсибилизатор 5- аминолевулиновую кислоту. Таким образом, гетерогенность клеточной популяции сосудистой стенки, а также отсутствие «идеальных» фотоактивных веществ диктуют необходимость проведения специальных исследований, посвященных изучению участия различных клеток в процессах, которые могут происходить после ФДВ в артериальной стенке, адаптации имеющихся и поиску новых фотосенсибилизаторов, а также оптимизации условий ФДВ для применения при патологии сосудов. Цель и задачи исследования Целью данной работы является изучение эффектов фотодинамического воздействия на клетки сосудистой стенки в модели in vitro. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) разработать тест-систему для изучения эффектов фотодинамического воздействия на клетки сосудистой стенки in vitro; 2) изучить динамику накопления и выведения фотосенсибилизатора Фотосенс в макрофагах, эндотелиальных и субэндотелиальных стромальных клетках человека; 3) изучить влияние фотодинамического воздействия с использованием Фотосенса® и его компонентов на клетки сосудистой стенки человека; 4 4) исследовать влияние дозы фотодинамического воздействия на механизм клеточной гибели; 5) проанализировать влияние фотодинамического воздействия на функциональные свойства клеток сосудистой стенки; 6) сравнить эффекты фотодинамического воздействия с использованием экзогенных фотосенсибилизаторов и про-фотосенсибилизатора на эндотелиальные клетки, макрофаги и субэндотелиальные стромальные клетки человека. Научная новизна Впервые проанализировано влияние фотодинамического воздействия (ФДВ) с использованием двух фотосенсибилизаторов (Фотосенс и Фталосенс) и одного профотосенсибилизатора (5-аминолевулиновая кислота) на эндотелиальные клетки, макрофаги и субэндотелиальные стромальные клетки, которые играют важнейшую роль в формировании поражений сосудистой стенки. Получены новые данные, свидетельствующие о различной чувствительности клеток сосудистой стенки к ФДВ. Впервые показано, что цитотоксический эффект ФДВ определяется не только способностью клеток сосудистой стенки накапливать Фотосенс, но и их функциональными особенностями, в частности, возможностью индукции в них активных форм кислорода. Установлено, что активация эндотелия увеличивает его устойчивость к ФДВ. Впервые изучены эффекты низкоинтенсивного ФДВ на функциональные особенности клеток сосудистой стенки. Показано, что при использовании низких доз ФДВ (0,25 Дж/см 2) происходит уменьшение экспрессии основных молекул межклеточной адгезии эндотелиальных клеток (VCAM-1 и E-селектина), а также значительно снижается адгезия мононуклеаров к TNF-активированному эндотелию. Впервые установлено, что ФДВ низкой интенсивности сопровождается снижением фагоцитарной активности макрофагов, уменьшением активности секретируемых ими матриксных металлопротеаз-2 и -9 и снижением уровня секреции интерлейкина-8, что свидетельствует об антивоспалительном воздействии низких доз ФДВ. Впервые показано, что ФДВ с использованием 5-аминолевулиновой кислоты может обеспечить селективную элиминацию субэндотелиальных стромальных клеток интимы. Проведенные сравнительные исследования позволили установить, что среди выбранных фотосенсибилизаторов ФталосенсС® позволяет численность клеток сосудистой стенки. 5 наиболее эффективно регулировать Теоретическая и практическая значимость работы Разработанная модель для изучения эффектов ФДВ in vitro позволяет подбирать и оптимизировать условия воздействия на различные клетки для выполнения экспериментальных и клинических задач. Выявлены механизмы реализации ФДВ различной интенсивности в эндотелиальных клетках, макрофагах и субэндотелиальных стромальных клетках. Данные, полученные в работе, существенно дополняют представления о влиянии ФДВ на клетки сосудистой стенки, а также позволяют расширить область применения этого метода. Результаты исследования могут стать основой для предклинических испытаний, направленных на апробацию ФДВ в качестве одного из новых методов функциональной диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Положения, выносимые на защиту 1. Фотодинамическое воздействие с использованием Фотосенса® позволяет эффективно элиминировать клетки сосудистой стенки, чувствительность которых к этому воздействию in vitro увеличивается в ряду макрофаги – субэндотелиальные стромальные клетки – эндотелиальные клетки и определяется их функциональными свойствами. 2. В условиях использованием in vitro Фотосенса® низкоинтенсивное оказывает фотодинамическое противовоспалительный воздействие эффект на с клетки сосудистой стенки, значительно модифицируя их функциональные свойства, что выражается в уменьшении их способности к адгезии, снижении фагоцитарной и секретирующей (матриксные металлопротеиназы-2, -9) активности. 3. Использование различных фотосенсибилизаторов позволяет оптимизировать условия воздействия в зависимости от поставленных задач: фотодинамическое воздействие с использованием 5-аминолевулиновой кислоты обеспечивает избирательную элиминацию субэндотелиальных стромальных клеток, в то время как Фталосенс®-ФДВ вызывает тотальную гибель всех клеток сосудистой стенки. Апробация работы Основные результаты и положения диссертации были доложены и обсуждены на: 7-й – 9-й Конференциях молодых учёных и специалистов, аспирантов и студентов, посвящённых дню Космонавтики (Москва, 2008, 2010); 7-й Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, Москва, 2009); 5-й Конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); 8-й Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 6 2010); 28th, 29th ASLMS Annual Conference (USA, Kussimmee, 2008; Washington DC, 2009); 15th International Symposium on Atherosclerosis (Boston, 2009); 23th International Congress Laser Medicine Laser Florence 2009 (Florence, Italy, 2009); French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach» (Angers, France, 2010); 9th WALT Congress (Bergen, Norway, 2010); межлабораторной конференции НИИ морфологии человека РАМН 17.01.2011 г. По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК РФ. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН “Космическая физиология и биология” 30.11.2010 г. Связь работы с научными программами Работа выполнена при частичной поддержке гранта МНТЦ № 2579, гранта РФФИ № 07-04-01504а и Госконтракта Минобрнауки № 02.518.11.7141. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 160 страницах, содержит 18 рисунков и 8 таблиц. Список литературы состоит из 289 цитируемых источников, из которых 42 - на русском и 247 - на иностранном языке. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований В качестве моделей основных типов клеток, принимающих участие в развитии поражений сосудистой стенки, использовали нормальный и TNF-активированный эндотелий пупочной вены человека (ЭК пупочной вены) 1-4 пассажей, эндотелий аорты человека (ЭК аорты) 1-4 пассажей, первичную культуру клеток субэндотелиального слоя аорты человека, мезенхимные стромальные клетки жировой ткани человека (лМСК) 1-10 пассажей и первичную культуру макрофагов (Мф) человека. Для определения кинетики накопления Фотосенса® (ФС®) клетки инкубировали с фотосенсибилизатором в конечной концентрации 10 мкг/мл от 1 до 72 ч и лизировали 0,1 М NaOH. В полученном лизате определяли интенсивность флуоресценции ФС® ( возбуждения = 608 нм, испускания = 687 нм) и концентрацию белка. Концентрацию ФС® в лизате определяли по калибровочному графику, полученному при измерении интенсивности флуоресценции в 7 пробах с известными концентрациями ФС®. Внутриклеточное содержание ФС® определяли как количество ФС® на 1 мг клеточного белка [нг/мг белка]. Для определения кинетики выведения клетки инкубировали с ФС в течение 24 ч, затем производили смену среды, инкубировали в ростовой среде без ФС® от 1 до 48 ч и определяли содержание ФС® в клетках. Для проведения ФДВ в среду культивирования добавляли ФС (10 мкг/мл), Фталосенс® (ФтС) (2 мкг/мл) и 5-аминолевулиновую кислоту (АЛА) (2 мМ) (Рис. 1). Через 24 ч краситель отмывали, клетки облучали различными дозами от 0,25 до 50 Дж/см2. Облучение производили лазерным аппаратом для ФДВ «Азор – ФДТ», длина волны облучения составляла 675 нм для ФС®, 692 нм для ФтС® и 633 нм для АЛА. Эффект ФДВ анализировали через различные сроки (1–24 ч) после облучения. Рисунок 1. Химические формулы используемых в работе фотосенсибилизаторов (R= H или R= SO3Na). А - Фотосенс®; Б – Фталосенс®; В – 5-аминолевулиновая кислота. АФК в клетках после дихлордигидрофлуоресцеиндиацетата воздействия (10 мкг/мл), детектировали который с добавляли помощью в среду культивирования непосредственно после облучения. Влияние ФДВ на функциональную активность митохондрий и лизосом оценивали через 3 ч после облучения с помощью потенциал-зависимого красителя MitoTracker Red 580 и рН-зависимого красителя LysoTracker Green DND-26 соответственно. Для определения способа клеточной гибели после воздействия использовали набор AnnexinV-FITC – PI. Кроме того, апоптотические клетки выявляли иммуноцитохимически с использованием антител к активной каспазе 3, а также цитохимически с помощью набора NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells для определения субстратной активности каспазы 3. Цитотоксический эффект ФДВ оценивали методом МТТ-теста через 24 ч после облучения. Влияние низкоинтенсивного ФДВ на функциональные свойства эндотелия выявляли путем оценки уровня экспрессии молекул адгезии (ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1 и Еселектина) методом проточной цитофлуориметрии, а также путем изучения адгезии мононуклеаров периферической крови к ЭК до и после воздействия. Для изучения адгезии 8 свежевыделенные мононуклеары предварительно метили зеленым флуоресцентным красителем DiO. Окрашенные мононуклеары инкубировали с ЭК в течение 30 мин, затем удаляли неадгезированные лейкоциты. Оценку адгезивных свойств эндотелия проводили путем подсчета количества адгезировавших мононуклеров, не менее чем 1000 ЭК. Для определения влияния ФДВ низкой интенсивности на функциональные свойства Мф оценивали секрецию ИЛ-1, -2, -6 и 8 этими клетками, их фагоцитарную активность и активность синтезируемых ими матриксных металлопротеаз-2 и -9 (ММП-2, -9). Активность матриксных протеиназ выявляли методом желатиновой зимографии [Рыбко, Книжник, Каинов и др., 2008]. Фагоцитарную активность макрофагов определяли с помощью флуоресцентных частиц латекса FluoSpheres Red диаметром 1 мкм, которые добавляли к Мф в концентрации 2х107 частиц на 1 мл ростовой среды на 2 ч. Для определения фагоцитарной активности вычисляли фагоцитарный индекс путем подсчета количества фагоцитирующих Мф. В каждом случае анализировали не менее 1000 клеток. Подсчет производили с помощью программы Sigma ScanPro 5. Секрецию цитокинов Мф оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа («сэндвич»-методика) с помощью набора FlowCytomix human Th1/Th2 11 Plex на приборе FACS Calibur (Becton Diсkinson, США). Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ “Excel” и “Statistica 7.0” для WinXP. При анализе данных рассчитывали среднегрупповое значение параметра и значение стандартного отклонения. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (р≤0,01). Результаты исследования и их обсуждение Влияние фотодинамического воздействия с использованием Фотосенса на клетки сосудистой стенки Одним из важнейших факторов, определяющим чувствительность клеток к ФДВ, является способность клеток аккумулировать фотосенсибилизатор. В работе было показано, что исследуемые клетки накапливают разное количество ФС: наибольшее количество красителя накапливалось в Мф, а наименьшее – в ЭК (Рис. 2 А, Б). Краситель был локализован преимущественно в перинуклеарной области диффузно, однако в некоторых клетках (в основном, в Мф) в цитоплазме выявлялись гранулярные структуры, содержащие фотосенсибилизатор. Для идентификации гранулярных структур, содержащих краситель, использовали LysoTracker Green. Анализ полученных данных показал, что большая часть таких гранул являлась лизосомами (Рис. 2 В), что коррелирует с данными других исследователей по внутриклеточному распределению 3-замещенных фталоцианинов [Peng, 9 Farrants, Madslien et al., 1991; Bonneau, Morliere and Brault, 2004]. Остальные гранулярные структуры, по-видимому, представляли собой комплекс Гольджи и митохондрии [Fabris, Valduga, Miotto et al., 2001]. Во всех исследованных клетках характер накопления красителя описывался многофазной кривой, состоящей из чередующихся участков быстрого накопления и плато (или медленного накопления) (Рис. 2 А). Основное количество красителя в клетках сосудистой стенки накапливалось во время 2-й экспоненциальной фазы, продолжительность которой у ЭК была около 25 ч, у лМСК и Мф – 18 ч. Различия в кинетике накопления ФС® в ЭК, лМСК и Мф объясняются, по-видимому, функциональными особенностями этих клеток: основная функция ЭК в сосудах осуществляется преимущественно путем трансцитоза, в то время как для Мф характерен активный эндоцитоз. Кинетика выведения ФС из ЭК, лМСК и Мф практически не различалась. Во всех исследованных клетках снижение внутриклеточного содержания фотосенсибилизатора носило двухфазный характер (Рис. 3). Полученная закономерность выведения красителя коррелировала с динамикой изменения уровня ФС® в крови при проведении ФДВ [Скидан, Бобрускин, Гуляев и др., 2001; Смирнова, Кубасова, Макарова и др., 2003]. Эти данные позволяют предположить, что в первые 6 ч фотосенсибилизатор выходит из клеток пассивно по градиенту концентрации, а затем активируются некие механизмы, препятствующие дальнейшему выходу красителя из клеток и обеспечивающие поддержание его постоянного уровня в течение длительного времени (Рис. 3). ФДВ – двухкомпонентный метод, отдельные составляющие которого неизбирательно воздействуют на все клетки и ткани, поэтому чрезвычайно важно, чтобы ФС® и лазерное излучение сами по себе не оказывали повреждающего воздействия. В работе было установлено, что ФС® в концентрации 10 мкг/мл при 24-часовой инкубации не оказывает влияния на жизнеспособность исследованных клеток. При этом накопление фотосенсибилизатора активирует лизосомальный компартмент ЭК и клеток интимы и не изменяет функциональные свойства лизосом у Мф. Влияние накопления ФС® на функционирование митохондрий также не было установлено. Второй компонент ФДВ – лазерное облучение (2-50 Дж/см2) – не оказывал повреждающего воздействия на клетки интимы и Мф. Эндотелий был менее устойчив к этому компоненту ФДВ: только низкие дозы излучения (2 Дж/см2) не снижали жизнеспособность ЭК, в то время как высокие дозы (10-50 Дж/см2) обладали выраженным цитотоксическим эффектом (рис. 4 А). Представленные в литературе данные позволяют предположить, что цитотоксический эффект связан, в первую очередь, с чувствительностью клеток к локальной гипертермии, возникающей при использовании высоких доз облучения [Tate, Yoshiba, Yoshiba et al., 2006]. 10 m(ФС)/ m(белка), нг/мг А 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Время инкубации с ФС, ч Мф m (ФС)/ m(белок), нг/мг Б лМСК ЭК В 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 эндотелий лМСК макрофаги Рисунок 2. Накопление ФС® клетками сосудистой стенки. А – кинетика накопления ФС® (10 мкг/мл) клетками сосудистой стенки (M±SD, n=3); Б – сравнение накопления ФС® клетками сосудистой стенки (M+SD, * - p<0,01, n=3); В, Г – частичная колокализация ФС® (красный) с лизосомами (LysoTracker Green, зеленый) в Мф, стрелки указывают на места колокализации (желтый). Данные репрезентативного эксперимента. 900 m(ФС)/ m(белка), нг/мг 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 10 20 30 40 50 Время инкубации без ФС, ч Мф лМСК ЭК Рисунок 3. Кинетика выведения ФС® (10 мкг/мл) клетками сосудистой стенки (M±SD, n=3) 11 Жизнеспособность клеток, % А 100 80 * * 60 40 20 0 Эндотелий без воздействия Клетки интимы ФС®, 10 мкг/мл 2 Дж/см2 Макрофаги 10 Дж/см2 50 Дж/см2 Б Жизнеспособность клеток, % 100,0 80,0 без воздействия 0,5 Дж/см2 60,0 1 Дж/см2 2 Дж/см2 40,0 5 Дж/см2 10 Дж/см2 20,0 50 Дж/см2 0,0 Эндотелий Клетки интимы Макрофаги Рисунок 4. Влияние ФДВ и его компонентов на жизнеспособность клеток сосудистой стенки (МТТ-тест). А – цитотоксический эффект ФС® (10 мкг/мл, 24-часовая инкубация) и лазерного излучения различной интенсивности; Б – сравнение чувствительности клеток сосудистой стенки к ФДВ. Усредненные данные 5-ти независимых экспериментов (M+SD; * – p<0,01, различия достоверны по сравнению с контролем, критерий Манна-Уитни). ФДВ нацелено на элиминацию клеток, поэтому в первую очередь было изучено его влияние на жизнеспособность эндотелия, клеток интимы и Мф. Было показано, что ФДВ снижает жизнеспособность клеток сосудистой стенки дозозависимым образом: высокие дозы облучения оказывают более сильное повреждающее воздействие, чем средние и низкие (Рис. 4 Б). Для сравнения чувствительности клеток к ФДВ использовали LD90 –дозу, при которой погибает 90% клеток. LD90 для эндотелия, клеток субэндотелиальной интимы и Мф составляла 2, 8 и 20 Дж/см2 соответственно. Таким образом, наиболее устойчивыми к этому воздействию были Мф, а наименее устойчивыми – ЭК. Основным действующим компонентом ФДВ являются АФК, оказывающие повреждающее воздействие на различные клеточные структуры. Облучение исследуемых 12 клеток, накопивших ФС, приводило к образованию внутриклеточных АФК (Рис. 5), однако их уровень в Мф был значительно меньше, чем в клетках интимы и ЭК, несмотря на высокое внутриклеточное содержание ФС® в них (Рис. 2 Б). При изучении влияния ФДВ на состояние клеточных органелл было показано, что подобное воздействие приводит к одновременному снижению функциональной активности митохондрий (Рис. 6 А, Б) и лизосом (Рис. 6 В), что выражалось как в уменьшении количества окрашенных зондами клеток, так и в снижении интенсивности флуоресценции зонда на клетку. На первый взгляд, полученные результаты по образованию АФК, а также по эффективности ФДВ противоречат нашим данным по накоплению ФС в исследуемых клетках. Однако следует учитывать, что чувствительность клеток к образующимся АФК определяется, в первую очередь, активностью антиоксидантных систем и экспрессией белков теплового шока. При этом в связи с функциональными особенностями активность антиоксидантных систем в ЭК сравнительно мала [Meilhac, Zhou, Santanam and Parthasarathy, 2000], а в Мф – достаточна высока [Pietarinen-Runtti, Lakari, Raivio and Kinnula, 2000], что, по-видимому, и объясняет указанный феномен. При применении фотодинамического подхода in vivo важно, каким способом будут гибнуть клетки, поскольку массовая некротическая гибель, в отличие от апоптоза, обычно сопровождается развитием воспалительной реакции, что является крайне нежелательным для сосудистой стенки. Было показано, что существует прямая корреляция между дозой облучения и типом клеточной гибели после ФДВ: низкие дозы воздействия (0,5-2 Дж/см2 для ЭК и 2-5 Дж/см2 для клеток интимы и Мф) индуцируют гибель клеток преимущественно путем апоптоза (Рис. 7 Б), в то время как высокие и средние – путем некроза (Рис. 7 В). При этом было установлено, что апоптотическая гибель клеток сосудистой стенки после воздействия протекает по каспаз-зависимому пути и сопровождается активацией каспазы 3. Таким образом, основываясь на полученных данных, можно заключить, что ФДВ может оказаться интересным и перспективным подходом для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, однако в связи со сложностью объекта воздействия необходимо дальнейшее проведение экспериментальных и клинических исследований. Влияние фотодинамического воздействия низкой интенсивности на функциональные свойства клеток сосудистой стенки Как было отмечено, при лечении сосудистых патологий не обязательно полностью элиминировать клетки, участвующие в развитии поражений, – достаточно изменить их функциональные свойства, уменьшив провоспалительную активность. 13 Рисунок 5. Образование АФК в клетках субэндотелиальной интимы после ФДВ. А – АФК в клетках до облучения; Б – АФК в клетках после ФДВ 1 Дж/см2. Для регистрации внутриклеточных АФК использовали H2DCFDA. Рисунок 6. Влияние ФДВ на состояние митохондрий (окраска MitoTracker Green) и лизосом (окраска LysoTracker Green) клеток субэндотелиальной интимы. А – митохондрии в клетках без воздействия; Б – митохондрии в клетках после ФДВ 1 Дж/см2; В – влияние ФДВ (1 Дж/см2) на активность лизосом, проточная цитофлуориметрия (синим цветом обозначена флуоресценция зонда в клетках без воздействия; зеленым – в клетках, инкубированных 24 ч с ФС®, красным – в клетках после ФДВ 1 Дж/см2). Рисунок 7. Влияние дозы облучения на способ клеточной гибели макрофагов (окраска Аннексин V – Пропидий Йодид). А – Мф без воздействия; Б – Мф после ФДВ 2 Дж/см2; В – Мф после ФДВ 10 Дж/см2. 14 В связи с этим во второй части работы было изучено влияние нзкоинтенсивного ФДВ на функциональные свойства ЭК и Мф, которым отводят ключевую роль в ремоделировании сосудистой стенки. В первую очередь, было установлено, что воздействие дозами 0,25 и 0,5 Дж/см2 практически не оказывает влияния на жизнеспособность исследуемых клеток, что позволило использовать эти дозы в дальнейших экспериментах. При изучении влияния низкоинтенсивного ФДВ на адгезивные свойства ЭК было показано, что низкие дозы ФДВ снижают адгезию мононуклеаров к активированному эндотелию в три раза (Рис. 8 А) и не оказывают влияния на взаимодействие неактивированных ЭК с лейкоцитами. Подобное изменение степени адгезии мононуклеаров к эндотелию сопровождалось уменьшением экспрессии VCAM-1 и E-селектина TNFαактивированными ЭК в 1,42 и 1,23 раза соответственно (Рис. 8 Б). Оценка функциональной активности Мф показала, что облучение клеток, нагруженных ФС, дозами 0,25 и 0,5 Дж/см2 приводит к существенному уменьшению уровня секреции ИЛ-8 (Рис. 9 А) и снижению их фагоцитарного индекса в 1,5 и 2,4 раза соответственно (Рис. 9 Б). Кроме того, низкоинтенсивное ФДВ уменьшает экспрессию и протеолитическую активность как ММП-9, так и ее предшественника – про-ММП-9 (Рис. 9 В). В настоящее время эффекты низких доз ФДВ остаются малоизученными. Однако из единичных работ известно, что АФК (в малых концентрациях), образующиеся в результате такого воздействия, выполняют преимущественно роль внутриклеточных посредников в различных сигнальных каскадах [Griendling, Sorescu, Lassegue and Ushio-Fukai, 2000; Martindale and Holbrook, 2002; Valko, Leibfritz, Moncol et al., 2007]. При этом основной мишенью таких радикалов являются тирозин- и протеинкиназы, опосредующие экспрессию и транслокацию специфических транскрипционных факторов – NF-B и AP-1. Поскольку указанные факторы транскрипции принимают непосредственное участие в регуляции экспрессии молекул межклеточной адгезии, интерлейкинов и секретируемых протеолитических ферментов, можно предположить, что эффект низких доз ФДВ обусловлен специфическим ингибированием этих факторов в результате образования АФК. Уменьшение фагоцитарной активности после низкоинтенсивного ФДВ связано, вероятно, с перестройкой цитоскелета и перекисным окислением липидов в мембранах в результате воздействия образующихся АФК. Таким образом, ФС-ФДВ с использованием очень низких доз существенно изменяет функциональные свойства ЭК и Мф, уменьшая их провоспалительую активность. 15 Б Количество адгезировавших Мо на 1000 ЭК Интенсивность флуоресценции, усл.ед. А 400 * 350 300 250 200 # 150 100 50 0 без воздействия TNFα ФДВ 0,25 Дж/см2 TNFα+ФДВ 0,25 Дж/см2 800 700 600 500 400 300 200 100 0 PECAM-1 без воздействия ICAM-1 VCAM-1 ФДВ 0,25 Дж/см2 TNFα E-селектин TNFα+ФДВ 0,25 Дж/см2 Рисунок 8. Влияние низкоинтенсивного ФДВ (0,25 Дж/см2) на функциональные свойства эндотелия. А – влияние низких доз ФДВ на адгезию мононуклеаров периферической крови к ЭК (n=3; M+SD; *, # – p<0,01, критерий Манна-Уитни); Б – влияние ФДВ низкой интенсивности на экспрессию молекул адгезии ЭК, данные проточной цитофлуориметрии (n=3). А Концентрация IL-8 в среде, пг/мл 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 без воздействия ФДВ 0,5 Дж/см2 В 100,00 90,00 80,00 * 70,00 60,00 * 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 без воздействия ФДВ 0,25 Дж/см2 ФДВ 0,5 Дж/см2 Активность ММП-9, % от контроля Фагоцитарный индекс, % Б ФДВ 0,25 Дж/см2 100,0 80,0 * 60,0 * * 40,0 20,0 0,0 Без воздействия ФС® ФДВ 0,25 Дж/см2 ФДВ 0,5 Дж/см2 ФДВ 1 Дж/см2 Рисунок 9. Влияние низкоинтенсивного ФДВ на продукцию IL-8 (А), фагоцитарную активность Мф (Б) и протеолитическую активность секретируемой ими ММП-9 (В) (n=3; M+SD; * – p<0,01, критерий Манна-Уитни). 16 Сравнение эффектов фотодинамического воздействия на клетки сосудистой стенки при использовании Фотосенса, Фталосенса и 5-аминолевулиновой кислоты В качестве фотосенсибилизатора для исследований первоначально был выбран ФС®. Однако, несмотря на неоспоримые преимущества, этот краситель обладает рядом недостатков, одним из которых является длительное выведение из подкожно-жировой клетчатки, что обуславливает повышенную кожную фоточувствительность после воздействия. В связи с этим в данной части работы сравнивали эффективность ФДВ при использовании двух фотосенсибилизаторов ряда фталоцианинов (ФС® и ФтС®) (Рис. 1 А, Б) и одного про-фотосенсибилизатора (АЛА) (Рис. 1 В) на клетки сосудистой стенки, поскольку проведение подобных скрининговых исследований позволяет оптимизировать условия воздействия в зависимости от поставленных задач. 5-аминолевулиновая кислота (АЛА) сама по себе не обладает фотоактивными свойствами, однако при её введении в организм в клетках происходит эндогенное образование и Соответственно, накопление фотосенсибилизатора эффективность ФДВ при её – протопорфирина использовании, будет IX (ПпIX). определяться количеством накопленного в клетках ПпIX. В работе было показано, что способность исследуемых клеток аккумулировать ПпIX значительно различается: лМСК аккумулируют наибольшее количество фотосенсибилизатора, в то время как в ЭК накопление ПпIX практически не детектируется (Рис. 10). Способность Мф накапливать краситель зависела от индивидуальных особенностей доноров: клетки от некоторых доноров достаточно эффективно накапливали ПпIX (Мф+), в то время как от других – не накапливали вообще (Мф–). Поскольку ПпIX является промежуточным продуктом биосинтеза гема, способность ЭК, лМСК и Мф аккумулировать эндогенный фотосенсибилизатор определяется, повидимому, различной активностью ферментов цепи биосинтеза гема в этих клетках [Hillegersberg, Berg, Kort et al., 1992; Castano, Demidova and Hamblin, 2004]. Кроме того, на способность клеток накапливать ПпIX могут влиять и другие факторы: выделение клетками NO, экспрессия молекул-переносчиков -аминокислот и пролиферативная активность [Rebeiz, Rebeiz, Arkins et al., 1993; Okimura, Fujita, Ogino et al., 2007]. Изучение «темновой» цитотоксичности выбранных веществ показало, что ни ФС, ни ФтС в концентрациях 2-10 мкг/мл не оказывают цитотоксического воздействия на клетки сосудистой стенки, в то время как 10 мМ АЛА значительно снижает жизнеспособность ЭК и клеток интимы. Дальнейшее определение зависимости эффективности ФДВ от концентрации фотосенсибилизатора позволило подобрать оптимальные концентрации красителей, позволяющие обеспечить высокую эффективность ФДВ для элиминации клеток: 10 мкг/мл 17 для ФС, 2 мкг/мл для ФтС и 2 мМ для АЛА. Выбранные концентрации использовали в дальнейших экспериментах. m(ПпIX)/m(белок), нг/мкг 600 500 400 300 200 100 0 0 5 10 15 20 25 Время инкубации клеток с АЛА, ч Мф (-) Мф (+) лМСК ЭК Рисунок 10. Накопление протопорфирина IX в клетках сосудистой стенки. При сравнении эффективности воздействия с использованием ФС, ФтС и АЛА на клетки сосудистой стенки (Рис. 11) было показано, что цитотоксический эффект ФтС-ФДВ значительно выше, чем ФС-ФДВ. При этом воздействие с использованием безметального фталоцианина позволяет наиболее эффективно элиминировать не только эндотелий и клетки интимы, но и Мф. АЛА-ФДВ позволяло достаточно эффективно элиминировать лМСК и Мф (+), при этом устойчивость Мф к такому воздействию была значительно выше, чем у клеток интимы: LD90 для них составляла 50 Дж/см2 и 10 Дж/см2 соответственно (Рис. 11 Б, В). ЭК и Мф (–) оказались абсолютно не чувствительными к АЛА-ФДВ (Рис. 11 А, Г). Исходя из литературных данных, можно предположить, что описанная эффективность ФтС-ФДВ обусловлена не столько способностью клеток накапливать значительное количество этого фотосенсибилизатора, сколько очень высокой фотоактивностью этого вещества [Якубовская, Морозова, Кармакова и др., 2004]. В случае АЛА-ФДВ полученные результаты хорошо согласуются с данными по способности клеток накапливать эндогенный фотосенсибилизатор (Рис. 10), а также с данными других исследователей [Iinuma, Farshi, Ortel and Hasan, 1994; Spörri, Chopra, Egger et al., 2001]. Таким образом, в данной части работы было показано, что ФДВ с использованием экзогенных и эндогенных фотосенсибилизаторов может применяться для решения различных поставленных задач, однако для этого требуется более глубокое изучение эффектов такого воздействия на разные типы клеток. 18 А Живые клетки, % 100 80 * 60 # 40 * 20 # * # 0 без в оздейств ия 0,5 Дж/см2 1 Дж/см2 ФС®, 10 мкг/мл * # 2 Дж/см2 ФтС®, 2 мкг/мл * # 5 Дж/см2 10 Дж/см2 5-АЛА, 2 мМ Б Живые клетки, % 100 # 80 ^ ^ ^ * 60 40 * 20 # * ^ # * 0 без в оздейств ия 0,5 Дж/см2 1 Дж/см2 ФС®, 10 мкг/мл 2 Дж/см2 ФтС®, 2 мкг/мл * # # 5 Дж/см2 ^ 10 Дж/см2 5-АЛА, 2 мМ В Живые клетки, % 100 * 80 ^ 60 # 40 ^ ^ * * # 20 # * # ^ * # ^ 0 без в оздейств ия 2 Дж/см2 5 Дж/см2 ФС®, 10 мкг/мл ФтС®, 2 мкг/мл 20 Дж/см2 50 Дж/см2 5-АЛА, 2 мМ 100 Живые клетки, % Г 10 Дж/см2 80 * # 60 40 * 20 # * # 0 без в оздейств ия 2 Дж/см2 ФС®, 10 мкг/мл 5 Дж/см2 10 Дж/см2 ФтС®, 2 мкг/мл * # * # 20 Дж/см2 50 Дж/см2 5-АЛА, 2 мМ Рисунок 11. Сравнение эффективности ФДВ при использовании ФС, ФтС и АЛА. А – ФДВ на ЭК; Б – ФДВ на субэндотелиальные стромальные клетки; В – ФДВ на Мф (+); Г – ФДВ на Мф (–). Приведены усредненные данные 5-ти независимых экспериментов (M+SD; *, #, ^ – p<0,01, различия достоверны по сравнению с контролем, критерий Манна-Уитни). 19 ВЫВОДЫ 1. Разработаны и успешно апробированы клеточные модели для изучения эффектов фотодинамического воздействия in vitro, подобраны условия для обеспечения эффективности (изменение функциональных свойств клеток или клеточная гибель) и специфичности воздействия. 2. Показано, что среди клеток сосудистой стенки макрофаги обладают наибольшей способностью накапливать Фотосенс, а эндотелиальные клетки – наименьшей. Характер выведения фотосенсибилизатора не зависит от функциональных особенностей исследуемых клеток и практически не отличается у эндотелия, макрофагов и перицитоподобных клеток. 3. Накопление Фотосенса и лазерное облучение по отдельности не оказывают влияния на жизнеспособность клеток сосудистой стенки, при этом накопление Фотосенса активирует лизосомальный компартмент эндотелиальных и перицитоподобных клеток и не изменяет функциональные свойства митохондрий. 4. Фотодинамическое воздействие приводит к дозозависимому снижению жизнеспособности клеток сосудистой стенки, а также к снижению активности митохондрий и лизосом. Чувствительность клеток сосудистой стенки к фотодинамическому воздействию уменьшается в ряду эндотелиальные клетки – субэндотелиальные стромальные клетки – макрофаги. Цитотоксический эффект воздействия определяется, в первую очередь, количеством образующихся активных форм кислорода, которое зависит не только от количества накопленного фотосенсибилизатора, но и от функциональных особенностей клеток. Активация эндотелиальных клеток TNF увеличивает их устойчивость к фотодинамическому воздействию. 5. Механизм гибели макрофагов, эндотелиальных и субэндотелиальных стромальных клеток после фотодинамического воздействия определяется дозой облучения и функциональными особенностями исследуемых клеток: высокие дозы облучения индуцируют некроз, в то время как низкие – апоптоз. 6. Фотодинамическое воздействие очень низкой интенсивности значительно изменяет функциональные свойства клеток сосудистой стенки, уменьшая их провоспалительную активность и не оказывая влияния на жизнеспособность. Фотодинамическое воздействие дозой 0,25 Дж/см2 (на эндотелиальные клетки) снижает адгезию мононуклеаров к TNF-активированному эндотелию в 3 раза, а 20 также уменьшает экспрессию VCAM-1 и активированными E-селектина эндотелиальными клетками в 1,42 и 1,23 раза соответственно. Облучение низкими дозами макрофагов, нагруженных Фотосенсом, приводит к снижению их фагоцитарной активности и уровня секреции интерлейкина-8. 7. Эффекты фотодинамического воздействия с использованием эндогенных и экзогенных фотоактивных веществ на клетки сосудистой стенки значительно различаются. Фотодинамичское воздействие с фотосенсибилизатором Фталосенсом позволяет наиболее эффективно регулировать численность исследуемых клеток всех типов, в то время как ФДВ с использованием 5-аминолевулиновой кислоты обеспечивает избирательную элиминацию клеток субэндотелиального слоя, которые играют важнейшую роль в формировании поражений сосудистой стенки. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Андреева ЕР, Ударцева О.О., Возовиков ИН, Кузьмин СГ, Тарарак ЭМ. Изучение in vitro фотодинамического воздействия на возможные клетки-мишени сосудистой стенки.// Кардиологический вестник. – 2008. – Т. 15. – №2. – С. 12-15. 2. Андреева Е.Р., Ударцева О.О., Кузьмин С.Г., Возовиков И.Н., Тарарак Э.М. Влияние фотодинамического воздействия на эндотелиальные клетки в модели in vitro.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 148. – № 2. – С. 228-231. 3. Ударцева О.О., Андреева Е.Р., Рылова Ю.В., Буравкова Л.Б. Влияние фотодинамически индуцированной генерации АФК на состояние митохондрий и лизосом культивируемых мезенхимальных стромальных клеток человека.// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2010. – Т. 5. – № 4. – С. 38-42. 4. Ударцева О.О., Андреева ЕР, Буравкова ЛБ, Тарарак ЭМ. Изучение цитотоксических эффектов ФДВ на макрофаги in vitro.// Авиакосмическая и экологическая медицина. – 2010. – № 4. – С. 23-27. 5. Udartseva O.O., Andreeva ER, Buravkova LB, Tararak EM. Photodynamic Effects of three different photosensitizers on human macrophages.// AIP Conference Proceedings. – 2010. – Vol. 1226. – P. 59-68. 6. Ударцева О.О. Влияние внутриклеточного накопления липидов на эффективность фотодинамического воздействия на культивируемые макрофаги человека. // VII Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. г. Москва, 2008. С. 67. 7. Ударцева О.О., Гринаковская О.С. Активация TNFα повышает устойчивость эндотелиальных клеток к фотодинамическому воздействию. // V Конференция молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». г. Москва, 2008. С. 128. 8. Ударцева О.О., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Влияние генерации в мезенхимальных стромальных клетках АФК на состояние митохондрий и лизосом. // Всероссийская научная школа-конференция для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования». г. Москва, 2009, С. 74-75. 21 9. Ударцева О.О., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Влияние культивирования в среде с различным содержанием О2 на чувствительность МСК к повреждающему воздействию. // VII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород, Москва, 2009. С. 82-83. 10. Ударцева О.О. Изучение эффектов фотодинамического воздействия на клетки сосудистой стенки. // IХ Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. г. Москва, 2010. С. 74-75. 11. Ударцева О.О., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б., Тарарак Э.М. Влияние фотодинамического воздействия на макрофаги. // VIII Всероссийская конференция по патологии клетки. г. Москва, 2010. С. 259-260. 12. Andreeva E.R., Udartseva O.O., Tararak E.M., Kuzmin S.G., Vozovikov I.N. Human monocyte/macrophages in vitro model for screening of photodynamic effects. // 7th ICCAD International Congress on Coronary Artery Disease: From Prevention to Intervention, Venice, Italy, October 7 – 10, 2007, P. 1285. 13. Andreeva E.R., Udartseva O.O., Tararak E.M., Kuzmin S.G., Vozovikov I.N. In vitro study of photodynamic effects on vascular cells. // 28th ASLMS Annual Conference April 2-6, 2008, Kissimmee, Florida, USA. 14. Udartseva O.O., Andreeva E.R., Buravkova L.B., Kuzmin S.G., Vozovikov I.N., Tararak E.M. Photodynamic Effects of three different photosensitizers on human macrophages. 29th ASLMS Annual Conference April 2-5, 2009, Washington DC, USA. 15. Udartseva O.O., Andreeva E.R., Buravkova L.B., Tararak E.M., Vozovikov I.N. PDT Application for experimental atherosclerosis in rabbits. // 15th International Symposium on Atherosclerosis. Atherosclerosis Suppl. 2009, 10 (2), 250. 16. Udartseva O.O., Andreeva E.R., Buravkova L.B., Tararak E.M., Vozovikov I.N. Photodynamic effects of three different photosensitizers on human arterial smooth muscle cells. // 15th International Symposium on Atherosclerosis. Atherosclerosis Suppl. 2009, 10 (2), 251. 17. Udartseva O.O., Andreeva E.R., Buravkova L.B., Tararak E.M. Photodynamic Effects of three different photosensitizers on human macrophages. // 23th International Congress Laser Medicine Laser Florence 2009: Lasers in Medical Science. Florence, Italy. 2009. P. 37-38. 18. Udartseva O.O., Andreeva E.R., Buravkova L.B., Tararak E.M. Photodynamically induced impairment of vascular cells. // French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach». Angers, France. 2010. P. 42. 19. Udartseva O.O., Andreeva E.R., Buravkova L.B. Effects of low-fluence PDT on human macrophages. // 9th WALT Congress. Bergen, Norway. 2010. Список используемых сокращений: TNF – фактор некроза опухолей АЛА – 5-аминолевулиновая кислота АФК – активные формы кислорода ИЛ – интерлейкин ММП – матриксные металлопротеазы лМСК – мезенхимные стромальные клетки жировой ткани человека Мф – макрофаги ПпIX – протопорфирин IX ФДВ – фотодинамическое воздействие ФС – Фотосенс ФтС – Фталосенс ЭК – эндотелиальные клетки. 22
