Дрожжи. признаки дрожжей; освоить методы микроскопической ... дрожжей; подсчета микробных клеток дрожжей в счетной камере

Дрожжи.
Цель занятия изучить культуральные и морфологические
признаки дрожжей; освоить методы микроскопической оценки
дрожжей; подсчета микробных клеток дрожжей в счетной камере
Горяева.
Задания:
1) приготовить препараты «раздавленная капля» чистых
культур различных физиологических рас дрожжей Saccharomyces
cerevisiae и аспорогннных дрожжей;
2) изучить морфологию отдельных видов дрожжей;
3) определить содержание гликогена и метахроматина в
дрожжевых клетках;
4) подсчитать количество нежизнеспособных дрожжевых
клеток в исследуемой суспензии;
5) подсчитать количество дрожжевых клеток в исследуемой
суспензии с помощью счетной камеры Горяева.
Препараты «раздавленная капля» просматривают с объективом 8Х и 40Х.
Оборудование и материалы: предметные и покровные
стекла; камера Горяева, специальное отшлифованное покровное
стекло, пипетки (микро пипетка и на 1 см3), раствор с массовой
долей серной кислоты 5%, раствор метиленового синего по Леффлеру, раствор Люголя, кристаллизатор с водой, раствор фуксина
или метиленового синего для простого окрашивания, метиленовый синий в разведении 1 : 40, бензин, набор красок, раствор йода, иммерсионное масло, бактериальные петли, пастеровские пипетки, микроскопы, бактериологические петли, препаровальные
иглы, марлевые салфетки, суточные культуры дрожжей Candida,
Torulopsis, Hausenula, Saccharomyces.
137
Теоретические сведения.
По современным представлениям в группу дрожжей объединяют одноклеточные микроскопические организмы, относящиеся к разным классам грибов, не образующие истинного мицелия, имеющие размеры в поперечнике 3-5 мкм, по длине – 10-15
мкм. Они встречаются среди различных классов высших грибов:
аскомицетов, базидиомицетов и несовершенных грибов. Растут
дрожжи на средах с кислым рН и образуют колонии мягкой консистенции, не врастающие в субстрат. Форма и цвет колоний различаются у разных видов дрожжей. Дрожжевые клетки могут
иметь: округлую, овальную, яйцевидную, цилиндрическую, апикулятную или лимоновидную форму (рис. 33).
Структура клеток (рис. 34) более сложная, чем у бактерий,
включает оболочку, цитоплазму, дифференцированное ядро и
другие фрагменты. Оболочка дрожжей легко просматривается в
обычном световом микроскопе. Содержимое клеток дрожжей на
ранней стадии роста однородно, затем в центральной части появляются многочисленные вакуоли и гранулы. Форма вакуолей изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста
культуры: в молодых клетках дрожжей вакуоли обычно соответствуют форме клетки, в зрелых они несколько сдавлены, а в отмирающих клетках могут быть сморщены и сжаты в результате
нарушения взаимодействия коллоидов внутри клетки.
В клетках дрожжей накапливается большое количество запасных питательных веществ: гликоген (вещество типа крахмала), капельки жира, а в вакуолях—волютин (метахроматин), основным компонентом которого являются полифосфаты.
Размножаются дрожжи вегетативным и половым путем.
Вегетативные способы размножения почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты), так называемые «культурные» дрожжи; к делящимся – виды рода Shizosaccharomyces (шизосахаромицеты).
При почковании на поверхности клетки образуется один или несколько бугорков — почек, которые постепенно увеличиваются.
Почки растут, пока не достигнут размеров материнской клетки,
138
после чего происходит деление ядер. В почку из материнской
клетки переходит часть протоплазмы и элементы ядра, после чего
между двумя клетками образуется поперечная перегородка и
почка отшнуровывается. Иногда почки, еще не отделившиеся,
начинают почкование, образуя скопление дрожжевых клеток
(рис. 35).
При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет
к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. Спорообразование может наступить после многократного
размножения путем почкования. Обычно спорообразование
наблюдается при истощении питательной среды и хорошей аэрации. Если такие дрожжи выращивать в постоянно обновляемой
среде или с частыми пересевами, то клетки их все время могут
сохраняться в вегетативном состоянии и размножаться только
почкованием. Но достаточно перенести такие дрожжи в среду,
бедную питательными субстратами, как большинство клеток переходит к спорообразованию. В одной клетке образуется 2 - 4, а
иногда 8 - 12 спор. Клетка при этом рассматривается как аск
(сумка), а споры — как аскоспоры.
К почкующимся дрожжам относятся представители рода
Saccharomyces (сахаромицеты).
Споры дрожжей имеют толстые оболочки и довольно
устойчивы к неблагоприятным воздействиям, но в меньшей степени, чем эндоспоры бактерий (быстро погибают при температуре 60 °С). Таким образом, образование спор у дрожжей — это одновременно процесс размножения и формирования устойчивых
форм.
Некоторые виды дрожжей размножаются так же, как и бактерии, бинарным делением путем образования одной или нескольких поперечных перегородок. Такой способ размножения
наблюдается,
например,
у
представителей
рода
Schizosaccharomyces (шизосахаромицетов). Дрожжам размножение делением несвойственно, поэтому данный род является исключением, отклонением от нормы. Шизосахаромицеты размножаются и половым путем, образуя споры что характерно для сумчатых грибов. Размножение делением свойственно также дрож139
жам рода Endomyces.
Дрожжи способны разлагать различные сахара. Поэтому
они встречаются там, где происходит выделение богатых сахаром
соков: на фруктах, листьях, в нектаре цветов. В практической деятельности человека они издавна используются для получения
хлеба, вина, пива, спирта, входят в состав кефирных грибков для
производства кефира.
В настоящее время в промышленности применяют различные виды дрожжей: наибольшее значение имеют культурные расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые обозначают римскими цифрами (XII, XI и т.д.) или заглавной буквой, соответствующей первой букве названия расы: М – минская, Я – Якубовского и т.д. Определенные физиологические расы Saccharomyces
cerevisiae используют в соответствии с их биологической активностью в различных отраслях пищевой промышленности.
Класс несовершенных грибов объединяет аспорогенные,
(ложные) дрожжи, неспособные к половому размножению и образованию спор. К ним относятся представители рода Candida,
Torulopsis, Cryptococcus, Rhodotorula, Pullularia и др. На твердых
питательных средах такие организмы так же, как и сахаромицеты,
образуют колонии различной консистенции. Несовершенные
дрожжи имеют более характерную форму, отличающую их от
других видов: стреловидную, треугольную, серповидную или
колбовидную. Дрожжи родов Candida и Trichosporon наряду с
круглыми и овальными клетками могут образовывать длинные
клетки псевдомицелия. Они представляют собой довольно крупные одноклеточные организмы, в среднем 5 – 9 х 7 – 12 мкм, не
образуют истинного мицелия, но могут вытягиваться в длину, соединяясь в цепочки. Такие образования называют псевдомицелием. Размножаются только почкованием, довольно широко
распространены в природе. Они встречаются в различных водоемах, в почвах, на растениях, продуктах питания, в организме человека и животных. Некоторые виды Candida вызывают заболевание, называемое кандидозом, в биотехнологии используются
для получения кормового белка при выращивании их на промышленных отходах (например, углеводородах), для получения
некоторых аминокислот (Candida utilis для получения триптофа140
на), витаминов (Candida guilliermondii для получения витамина В2
– рибофлавина).
Широко распространенными являются также дрожжи рода
Torulopsis, различные их виды используются в производстве
сбраживаемых напитков типа кумыса, но вызывают болезни пива
и некоторых других продуктов, получаемых путем брожения. Эти
болезни проявляются в потере аромата, появлении неприятного
запаха или ослизнения.
Методические указания к выполнению работы
Морфологические признаки дрожжей изучают просматривая препараты « раздавленная капля» с сухими объективами
(8х, 40х) .
Определение гликогена – полисахарид, животный крахмал
содержится в клетке у эукариот и прокариот в виде включений
(веществ, возникающих в результате метаболизма клетки). Служит в качестве запасного материала и при недостатке углеводов в
питательной среде используется клеткой. Гликоген окрашивается
йодом в бурый цвет.
Для обнаружения гликогена используют крепкий раствор
йода в йодистом калии (7 г йода + 20 г йодистого калия + 100 см3
воды). На предметное стекло наносят небольшую каплю раствора
йода и размешивают в ней петлей такую же каплю жидкой культуры дрожжей. На препарат накладывают покровное стекло, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой и через 2—3
мин микроскопируют. Наличие в цитоплазме бурых зернышек
или крапинок указывает на присутствие гликогена. Перед обработкой раствором йода рекомендуется обезжиривать препарат
путем фиксирования в смеси спирта с эфиром (1 : 2). Это делается для того, чтобы удалить из клетки жир, который тоже отчасти
окрашивается йодом. При подогревании окрашенного йодом препарата до 60° С красно-бурая окраска гликогена исчезает, а после
охлаждения восстанавливается. Иногда гликогену может быть
примешана гранулеза, и при слабом растворе йода получается
синее окрашивание, при крепком — красно-бурое. На препарате
сахаромицетов много почкующихся клеток. Поскольку гликоген
активно расходуется в процессе метаболизма, то его можно обна141
ружить только в материнских клетках. В зависимости от количества накопленного углевода их цвет может меняться от яркожелтого до бурого. В растущих клетках (почках) гликоген как
правило не обнаруживается.
Обнаружение волютина (метахроматиновые зерна).
Некоторые бактерии и дрожжи содержат в цитоплазме клетки
вещество, состоящее из неорганических полифосфатов, запасное
фосфор- и азотосодержащее вещество, производное нуклеиновой
кислоты, получившее название волютин. В дрожжевой клетке
при состоянии покоя волютин можно обнаружить в виде большой
круглой капли внутри вакуоли. При состоянии активного обмена
волютин в клетках располагается мелкими каплями по стенкам
вакуоли или непосредственно под клеточной стенкой. В большом
количестве волютин накапливается у дрожжей перед почкованием. Накопление волютина особенно интенсивно происходит при
выращивании дрожжей на средах, богатых фосфатами.
Для обнаружения волютина в дрожжах используют расу
XII дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на твердой
питательной среде. Метод окраски основан на плохой растворимости волютина в растворах кислот. На предметное стекло наносят каплю воды, петлей в форме замкнутого кольца вносят в неё
культуру дрожжей, распределяют равномерно и круговыми движениями делают тонкий мазок на площади 1 – 2 см2. Препарат
высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и окрашивают метиленовым синим по Лёфлеру (1,5 – 2 мин), после чего
смывают краситель водой и обрабатывают препарат раствором
серной кислоты с массовой долей 5 % в течение 5 – 7 сек. Кислоту смывают водой, препарат высушивают и просматривают с иммерсионным объективом. Цитоплазма дрожжевых клеток при
этом окрашивается в голубой цвет, а гранулы полифосфатов – в
синий. Можно окрашивать фиксированные препараты 20-30 с
карболовым фуксином Циля. Через 0,5-1,0 мин промыть препарат
водой, обесцветить 20-30 с раствором Н2SO4 с массовой долей
1%, промыть, дополнительно окрасить 20-30 с метиленовым синим (1 : 40), промыть, промокнуть, просмотреть с иммерсионной
системой. Гранулы волютина приобретают красный цвет, цитоплазма – синий.
142
Определение процентного содержания нежизнеспособных клеток. На предметном стекле смешивают каплю суспензии
дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII, выращенной на неохмеленном пивном сусле, смешивают с каплей метиленового
синего. В препарате просматривают 10 полей зрения. Мертвые
клетки окрашены в нем в синий цвет, живые остаются бесцветными. Определяют процентное содержание нежизнеспособных
клеток по отношению к общему числу клеток, наблюдаемых в
поле зрения. Активные культуры дрожжей, используемые для
засева, содержат не более 5 % мертвых клеток.
Определение способности дрожжей к размножению. Количество почкующихся клеток характеризует способность
дрожжей к размножению: активные дрожжи содержат 40—70 %
клеток с почками. Из дрожжевой суспензии готовят препарат
«раздавленная капля» и определяют процентное содержание почкующихся клеток по отношению к суммарному количеству
дрожжей с почками и без них.
Подсчет количества клеток в счетной камере. Для подсчета клеток крупных бактерий, дрожжей, конидий плесневых
грибов применяют различные счетные камеры, из которых
наиболее часто используют камеру Горяева (рис. 39). Она представляет собой толстое предметное стекло, разделенное глубокими бороздками на поперечные площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена пополам. На каждой ее части нанесена сетка. Боковые площадки расположены на 0,1 мм выше центральной (глубина камеры) и служат для притирания покровного
стекла.
Сетка камеры Горяева разделена на 225 больших квадратов
(15 рядов по 15 квадратов в ряду). Площадь большого квадрата
равна 1/25 мм2 и разделена на 16 малых квадратов. Сторона малого
квадрата равна 1/20 мм, площадь – 1/400 мм2. Часть больших квадратов разграфлена вертикально, горизонтально или не разграфлена.
Камеру и специальное шлифованное покровное стекло хорошо промывают и просушивают. На поверхность сеток наносят
небольшую каплю исследуемой суспензии, накрывают шлифованным стеклом и притирают покровное стекло к боковым пло143
щадкам. Жидкость под покровным стеклом должна растекаться
по всей сетке равномерно, без пузырьков. Для того чтобы объем
жидкости точно соответствовал расчетному объему камеры, покровное стекло притирают к боковым площадкам камеры до появления цветных колец (можно вначале притереть стекло, а потом из пипетки осторожно заполнить камеру). Подсчет клеток
рекомендуется производить через 3—5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и расположились в одной плоскости.
Подвижные формы микроорганизмов перед нанесением на сетку
следует убить нагреванием или добавлением 0,5 % формалина.
Камеру помещают на предметный столик микроскопа и
рассматривают с объективом 8Х или 40X (в зависимости от размеров клеток изучаемого объекта). Для получения достоверных результатов подсчет следует проводить в 5 больших или 20 малых
квадратах по диагонали или по углам сетки и в центре в трех
препаратах. Учитывают все клетки, находящиеся внутри квадрата
и на пограничных линиях, если они больше чем наполовину лежат внутри квадрата. Клетки, пересеченные пограничной линией
пополам, считают только на двух из четырех сторон квадрата;
клетки, расположенные вне квадрата, не учитывают.
Количество клеток в 1 мл исходной суспензии:
С
а  1000
n,
hS
где С – число клеток в 1 мл суспензии;
а – среднее число клеток в квадрате сетки;
h – глубина камеры, мм;
S – площадь квадрата сетки, мм2;
n – степень разведения исходной суспензии;
1000 мм3 = 1 мл.
144
Контрольные вопросы.
1. К каким группам грибов относятся дрожжи?
2. Назовите физиологические признаки дрожжей. Где используются дрожжи?
3. Опишите форму клеток дрожжей и способы их размножения.
4. Дайте характеристику аспорогенных дрожжей.
5. Какие включения клеток дрожжей Вы знаете?
6. Как обнаруживается волютин в дрожжах?
7. Как определить способность дрожжей к размножению?
8. Как обнаружить гликоген в клетках дрожжей?
9. Каким методом можно определить количество дрожжей
в 1мм суспензии?
145