Выделение геномной ДНК из листьев древесных растений

Выделение геномной ДНК из листьев древесных растений
Процедура выделения ДНК широко используется и часто является исходным пунктом в
большинстве генно-инженерных и молекулярно-генетических исследований. Предлагаемый метод
выделения ДНК с помощью детергента CTAB является модификацией метода Murray и Thompson
(1980) и может быть использован как для аналитического выделения при скрининге большого
количества материала, так и для препаративного выделения геномной ДНК из растительного
материала.
Процедура выделения растительной ДНК состоит из нескольких стадий: лизис клеток,
разрушение РНК, депротеинизация и экстракция ДНК с помощью органических веществ
(хлороформ) и последнее осаждение нуклеиновых кислот с помощью этанола или изопрапанола
(ДНК осаждается из раствора с помощью спирта при наличии высокой концентрации ионов
натрия, или лития, или аммония). Для разрушения клеточных стенок листья растений тщательно
растирают ошлифованным стеклянным пестиком в течение одной-двух минут в пробирке
“Eppendorf” в присутствиии CTAB Буфера для ДНК экстракции (см. приложение 1). Трис,
входящий в состав буфера, обеспечивает необходимый pH раствора (ДНК наиболее стабильна при
рН от 7.0 до 8.5).
ЭДТА используется в качестве хелатирующего агента для связывания
ионов магния и кальция в растворе.
В состав буфера экстракции входит CTAB – катионный детергент, который эффективно
разрушает клеточные мембраны, и при высокой концентрации NaCl (1М) нуклеиновые кислоты
растворяются, а белки и полисахариды осаждаются из раствора. После экстракции хлороформом
комплекс СТАB с полисахаридами и белками оказывается в интерфазе и в органической фазе. Для
осаждения белков и растворения комплекса ДНК-СТАB в буфер для экстракции добавляют 1.4М
NaCl. Дополнительно в буфер для экстракции перед использованием добавляют РНКазу А.
Удаление клеточной РНК необходимо при дальнейшем использовании образцов ПЦР. РНКазаА
эффективно деградирует клеточную РНК при 37С, поэтому желательно доинкубировать образцы
при 37С перед ДНК экстракцией с помощью хлороформа.
Для экстракции ДНК из раствора используется смесь хлороформа и изоамилового спирта
(24:1). Изоамиловый спирт уменьшает пенообразование и уменьшает окисление хлороформа при
хранении.
Осаждение ДНК проводится равным объемом изопропилового спирта при комнатной
темперетуре (см. прил.1). Процедуру осаждения ДНК необходимо проводить быстро, чтобы
предотвратить осаждение полисахаридов и пигментов с осадком ДНК. Осадок ДНК необходимо
тщательно промыть 70% этанолом, чтобы удалить остатки буфера для экстракции, изопропанола и
хлороформа.
Протокол:
1. 100 мг свежих листьев или проростков растений (или материал, сохраненный в растворе
RNAlater для хранения на основе сульфата аммония, см. прил.1) растереть в пробирке “Eppendorf”
объемом 1,5 мл с 500 мкл CTAB-буфера для ДНК экстракции, добавить 1 мкл РНКазы А (10
мг/мл), перемешать на вортексе и инкубировать при 55–65°C в течение 30–60 мин. Дополнительно
доинкубировать при 37°C в течение 10–15 мин., чтобы РНКаза А разрушила геномную РНК.
2. В пробирку добавить равный объем (500–600 мкл) смеси хлороформ: изоамиловый спирт (25:1),
тщательно перемешать на вортексе (важно максимально отделить ДНК от белков) и
центрифугировать при 14000 об/мин 5 мин (разделение органической и водной фаз).
3. Верхнюю водную фракцию перенести в чистую 1,5 мл пробирку, содержащую равный объем
(600 мкл) холодного изопропанола (+4°C), и тщательно перемешать на вортексе (спирт осаждает
ДНК из раствора при тщательном перемешивании).
4. ДНК осадить центрифугированием в течение 5 мин при 14000 об/мин; надосадочную жидкость
осторожно слить.
5. Добавить в пробирку с осадком ДНК 1мл 70% этанола, на вортексе тщательно перемешать,
чтобы осадок плавал в спирте. Повторить центрифугирование в течение 5 мин при 14000 об/мин;
надосадочную жидкость аккуратно слить (осадок плохо удерживается на дне пробирки после
промывки в 70% этаноле).
6. Осадок ДНК не сушить и сразу растворить в 200–500 мкл 1хТЕ (10 мМ Трис-HCl, pH 8.0 1mM
ЭДТА) при 55°С, периодически перемешивая, 10–20 минут. Как правило, осадок ДНК сразу же
всплывает на поверхность раствора 1хТЕ и растворяется. ДНК хранить при температуре -20°С
(длительное хранение) или при +4°С (при частом использовании).
7. Концентрацию ДНК определить с помощью флюориметра VersaFluor Fluorimetry или с
помощью кюветного спектрофотометра Smartspec Plus. С определением концентрации ДНК с
помощью спектрофотометра NanoDrop® ND-1000 UV-Vis можно познакомиться по
адресу:http://www.nanodrop.com.
8. Маточный раствор ДНК разбавить в новые микропробирки до концентрации 10 нг/мкл и
хранить при 4°С. Маточный раствор ДНК хранить при -20°С.
Амплификация ДНК с произвольными праймерами
Инкубационную смесь готовить в стерильных условиях в боксе для ПЦР работ BioSan UVCleaner box-1200 или под ламинаром. Для составления реакционной смеси используют 0,6 мл
пробирки “Eppendorf”.
Реактивы:
1. Деионизированная вода “MilliQ”;
2. 10хбуфер для ПЦР, содержащий 25 мМ MgCl2, (прилагается к Taq-полимеразе фирмойизготовителем);
3. Раствор 10 мМ dNTPs (дезоксинуклеотидтрифосфаты) (смесь 10 мМ каждого dATP, dGTP,
dCTP, dTTP);
4. RAPD- праймеры;
5. Раствор Taq-полимеразы (5 ед. на мкл);
6. Минеральное масло (только для амплификации в «Терцике МС-2+ »);
7. Образец матричной ДНК (с концентрацией 10 нг/мкл);
В состав ПЦР буфера (10х) входят следующие компоненты: 100 мM Трис-HCl (рН 9,0); 500
мM KCl; 1% тритон Х-100 и 25 мM MgCl2. Высокое значение рН необходимо из-за того, что при
повышении температуры рН Tрис-буфера падает (температурный коэффициент ~ -0.031ед. рН/°C)
и при 72°С составляет ~7.5. Оптимальная концентрация Taq-полимеразы – 1 единица фермента на
20 мкл реакционной смеси. Triton X-100 - предотвращает адсорбцию полимеразы на поверхности
пробирки. Диапазон рабочих концентраций MgCl2 – от 1.5 до 5.0 мM. При увеличении
концентрации Mg2+ увеличивается эффективность амплификации, но может снижаться
специфичность реакции. Диапазон используемых концентраций dNTP’s – 100 – 500 мкM (200
мкM – оптимальная концентрация). Используемый диапазон концентраций RAPD-праймера для
проведения ПЦР: 0.2–1.0 мкM.
Протокол:
1. Подготовить смесь «Master-Mix». При постановке эксперимента необходимо сделать общую
реакционную смесь для ПЦР («Мaster-mix»), содержащую все необходимы компоненты, кроме
ДНК и праймера. Для этого необходимо рассчитать общий объем реакционной смеси для всех
образцов плюс еще несколько образцов. Например, для амлификации 8 образцов по 25 мкл
конечного объема, приготовить смесь для 10 образцов, что будет составлять 250 мкл (в
последовательности от воды до Taq-полимеразы).
2. В стерильную и подписанную 0.5 мл пробирку для ПЦР внести 21 мкл смеси «Master-Mix»;
3. Необходимо заранее подготовить праймеры в концентрации 10 мкМ в растворе 1хТЕ. Это
можно сделать вручную или найти в табл. 2: необходимый объем каждого праймера на одну
реакцию находится в графе «Vpr=»; кроме того, в колонке «Tm» можно найти необходимую
температуру отжига для данного праймера.
4. Добавить 1.5 мкл 10 мкМ RAPD-праймера в конечной концентрации 0.6 мкМ на пробу;
5. Добавить Tag-полимеразу из расчета 0.8 мкл (2 ед.акт.) на 1 реакцию;
6. Внести в пробирку образец ДНК 2.5 мкл (10нг/мкл), конечная концентрация ДНК в
реакционной смеси составляет 1 нг/мкл;
7. При проведении амплификации в амплификаторе «Терцик МС2+» поверх реакционной смеси
поместить 2 капли минерального масла, предохраняющего смесь от испарения при нагревании во
время амплификации;
8. Смесь аккуратно перемешать на вортексе;
9. Сбросить содержимое на дно пробирок (центрифугирование 5 сек при 2400 об./мин);
10. Установить пробирки в блок амплификатора в симметричной ориентации, плотно закрыть
крышку блока;
11. Запустить программу амплификации последовательностью команд: <пуск>, <блок № >,
<программа № >, <25 мкл >.
12. После окончания амплификации выполнить команду <сброс>.
При вводе количества праймеров на одну пробу и числа проб итоговые количества реактивов
рассчитываются автоматически (все объемы указаны в мкл). Распечатанной таблицей можно
пользоваться как документом, описывающим ход и результат реакции.
Амплификацию провести в амплификаторе «Терцик» или «MJ MiniCycler» по следующей
программе:
1. Предварительная денатурация – 94°C, 4 мин;
2. Тридцать пять циклов: 1) 95°С, 15 сек; 2) 37°С, 1 мин; 3) 70°С, 2 мин;
3. Конечная элонгация: 72°С, 5 мин.
После окончания амплификации провести электрофорез ДНК в агарозном геле.
Электрофорез ДНК в агарозном геле
1. Взвесить необходимое количество агарозы. Количество агарозы рассчитывается по формуле:
m = V*C/100%, где m – масса агарозы в граммах, V – объем геля в мл, С – концентрация агарозы в
процентах.
2. Перенести агарозу в термостойкую стеклянную посуду
на 250 мл и залить нужным
количеством буфера 1х TBE (или 1х STBE).
3. Добавить нужный объем бромистого этидия (объем бромистого этидия, вносимого в гель, равен
(в мкл) 1/10 объема геля (в мл)). Работу с бромистым этидием вести в перчатках, перед
открыванием пробирки аккуратно стряхнуть ее содержимое на дно центрифугированием в течение
3 сек. при 2400 об/мин.
4. Подготовить форму для геля и установить подготовленную форму горизонтально на стол.
5. Вставить в прорези формы гребенки так, чтобы расстояние от дна формы до зубцов гребенки
составляло 2 – 3 мм, крайние зубцы не должны касаться боковых стенок формы. Гребенка должна
быть параллельна торцам формы.
6. Нагревать агарозу в микроволновой печи до полного растворения при регулярном
помешивании. После закипания (дождаться появления крупных пузырей) достать колбу и
остудить до температуры 55°– 60°С. Добавить в смесь бромистый этидий, хорошо перемешать и
залить его в форму для геля. Проверить положение гребенок и оставить гель для застывания на
20–30 мин.
7. В пробирки с амплификационной смесью добавить по 1 капле глицерина, тщательно
перемешать смесь на вортексе и центрифугировать пробирки 5 сек. при 2400 об/мин. Расставить
пробирки в соответствии с порядком нанесения проб. После полного застывания геля залить его
буфером 1x TBE и аккуратно вытащить гребенки. Слить буфер и нанести на гель отдельной
микропипеткой пробы (по 10 мкл) и маркер молекулярного веса (6 мкл).
8. Аккуратно поместить гель в камеру для электрофореза, закрыть крышку камеры, включить
источник тока и провести электрофорез в режиме 5 В/см.
9. Электрофорез проводить в течение 2 ч. Убедиться, что полосы четко видны, выключить ток,
снять крышку камеры и достать гель из формы (работать в перчатках).
Фотографирование и анализ спектров ДНК
1. Поместить гель на рабочее стекло системы гель-документации Gel Doc XR , опустить защитное
стекло и включить систему гель-документации.
2. Сфотографировать полученные спектры ДНК (рис.2) с помощью системы гель-документации в
коротковолновом УФ-свете и сохранить результаты в памяти компьютера.
3. Провести обработку спектров ДНК с помощью программ «Adobe Photoshop» или «Quantity
One».