1.8 Препаративная тонкослойная хроматография

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ РФ
Томский политехнический университет
Химико-технологический факультет
Кафедра ФАХ
Реферат
Плоскостная хроматография.
Выполнила ст.5а54
Бузанова А.Г.
Проверила доц. Чернышова Н.Н
ТОМСК-2008
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 3
Глава 1. Тонкослойная хроматография ................................................................. 4
1.1 Общее описание ............................................................................................. 4
1.2 ТСХ-пластинки и сорбенты .......................................................................... 4
1.3 Нанесение образца ......................................................................................... 5
1.4 Проявление хроматограммы......................................................................... 5
1.5 Просмотр хроматограммы ............................................................................ 6
1.6 Использование ТСХ в качественном анализе............................................. 7
1.7 Выбор проявляющего растворителя (подвижной фазы) ........................... 7
1.8 Препаративная тонкослойная хроматография ............................................ 8
Глава 2. Хроматография на бумаге. ...................................................................... 9
2.1 ”Бумажная” хроматография......................................................................... 9
2.2 Двумерная хроматография на бумаге ........................................................ 10
2.3 Методы проявления хроматограмм ........................................................... 10
2.4 Приготовление подвижной фазы ............................................................... 11
2.5 Нанесение вещества .................................................................................... 12
2.6 Проявление ................................................................................................... 12
2.7 Обработка хроматограммы ......................................................................... 12
Список литературы ............................................................................................... 13
2
ВВЕДЕНИЕ
Метод плоскостной хроматографии в настоящее время широко
используется в различных областях науки и техники. Плоскостная
хроматография включает в себя тонкослойную и бумажную хроматографию.
Рассмотрим для начала методы
и особенности тонкослойной
хроматографии, а затем перейдём к бумажной хроматографии и проведём
сравнительный анализ этих двух методов.
Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) нашёл широкое применение
и получил развитие вследствие ряда его преимуществ: быстрота выполнения
анализа, относительная простота метода, экономичность и универсальность.
Метод используют для разделения и анализа микроколичеств веществ
разнообразного происхождения, определения примесей с органических
соединениях, качественной и количественной оценки примесей в продуктах
пищевой и химической промышленности.
Возникнув первоначально как качественный метод, хроматография в
тонких слоях начинает с успехом использоваться для полуколичественного и
количественного определения и анализа органических соединений.
Тонкослойная хроматография или, как её часто называют, метод
хроматографии в тонком слое адсорбента к настоящему времени получила
всеобщее признание. Тонкослойную хроматографию с успехом применяют в
различных областях органической, аналитической и биологической химии
для анализа примесей в различных технических смесях и материалах, в
фармацевтической и нефтеперерабатывающей промышленности, технологии
пластических масс, сельском хозяйстве.
Метод тонкослойной хроматографии был предложен в 1938 г. Н. А.
Измайловым и М. С. Шрайбер для разделения и анализа в тонком слое окиси
алюминия некоторых алкалоидов из экстракта лекарственных растений.
Потребовалось, однако, ещё более двадцати лет, прежде чем этот метод
получил всеобщее признание. С выходом в свет работы Шталя начинается
новый этап в развитии хроматографии в тонких слоях. Тонкослойная
хроматография становится одним из основных методов органической химии
для анализа самых разнообразных органических соединений [3, c.4].
Хроматография на бумаге оказалась исключительно ценным способом
исследования весьма малых количеств многих органических веществ,
особенно в области биологической химии. Применение этого способа для
разделения аминокислот, содержащихся в продуктах гидролиза белков, для
изучения состава различных природных веществ и т. п. дало такие
результаты, которые невозможно было получить каким-либо иным путём.
[2, c.233]
Глава 1. Тонкослойная хроматография
Тонкослойная хроматография (ТСХ) – один из наиболее широко
используемых хроматографических методов – имеет огромное значение для
быстрого качественного анализа смесей, контроля реакций и определения
рабочих параметров, которые следует использовать в препаративной
колоночной хроматографии.
1.1 Общее описание
Разделение производят на плоской пластинке, покрытой тонким слоем
сорбента – силикагелем или оксидом алюминия (рис. 1,а).
Рис.1 Тонкослойная хроматография.
Разделяемую смесь, растворенную в соответствующем растворителе,
наносят в виде капель на пластинку (рис 1, б) и после испарения
растворителя помещают пластинку в проявительную камеру (рис 1, в), в
которую налито немного растворителя. Растворитель поднимается по слою
сорбента под действием капиллярных сил. При этом различные соединения,
находящиеся в смеси, поднимаются с разными скоростями в зависимости от
их сродства к сорбенту. По достижении растворителем верхнего слоя
сорбента соединения в идеальном случае должны полностью разделиться
(рис. 1, г). Процесс разделения – это одна из форм жидкостно-адсорбционнй
хроматографии.
1.2 ТСХ-пластинки и сорбенты
Пластинки для ТСХ состоят из подложки обычно стекла, а иногда
пластмассы или толстой алюминиевой фольги, на которую нанесен тонкий
слой сорбента толщиной примерно 0,25 мм (рис. 1, а). Сорбентом обычно
4
служит либо силикагель, либо оксид алюминия с размером частиц до 10 – 30
мкм, к которым добавлено связующее ( до 10% гипса или крахмала),
обеспечивающее прочность слоя. Пластинки бывают двух основных типов:
многоразового использования и одноразовые.
Пластинки многоразового использования изготавливают из толстого
стекла, на которое при помощи специального оборудования наносят сорбент,
а затем после использования пластинки счищают его для повторного
покрытия. Пластинки бывают разных размеров от 20 Х 5 см до дешевых
пластинок, сделанных из микроскопных стекол ( 75 Х 25 мм), пригодных для
контроля реакций. В учебных лабораториях обычно используют пластинки с
заранее нанесенным слоем.
Одноразовые пластинки поставляются различными изготовителями с
готовым слоем сорбента, нанесенным на основу из тонкого стекла,
пластмассовую пластинку или алюминиевую фольгу. Особенно удобны
пластинки последних двух типов, так как большие листы легко разрезать
ножницами на полоски нужного размера.
Одноразовые пластинки дают лучшее разрешение, чем пластинки
многоразового использования. Причем для большинства разделений вполне
достаточна пластинка высотой 5 см. При работе с ними отрезают полоску
размером 5 Х 20 см, проводят карандашом слабую линию на расстоянии 5 мм
от длинной нижней кромки, чтобы указать, уда наносить капли образца, и
затем нарезают куски соответствующего размера.
Готовые пластинки имеют определенную активность, обычно от II до III
степени; их следует хранить над силикагелем.
1.3 Нанесение образца
Образец обычно наносят с помощью капилляра в виде 1 – 2%-ного
раствора в летучем растворителе типа дихлорметана или эфира (избегайте
полярных растворителей, например этанола); раствор удобнее всего готовить
в маленьком пузырьке. Капилляр для нанесения капель легко сделать из
капилляра для определения температуры плавления; для этого среднюю
часть капилляра помещают в пламя горелки, а затем осторожно растягивают
и ломают в месте растяжения.
Место нанесения капель в зависимости от размера пластинки должно
быть на расстоянии 1 см от нижнего края на больших (5 Х 20 см) пластинках
и около 5 мм на маленьких одноразовых пластинках. Важно также наносить
капли достаточно далеко от нижнего края (рис. 1,б и в), чтобы они не
погружались в проявляющий растворитель.
1.4 Проявление хроматограммы
Меры безопасности. В этой операции обычно используют летучие
легковоспламеняющиеся растворители, поэтому ее нужно проводить вдали
от источников возгорания предпочтительно в вытяжном шкафу.
Хроматограмму проявляют погружением нижнего края пластинки в
проявляющий растворитель в сосуде соответствующего размера (рис. 1, в).
5
Большие пластинки проявляют в специальных камерах (20 Х 5 см), а
маленькие – в широкогорлых бутылях с завинчивающимися крышками.
Камеру изнутри следует частично выложить фильтровальной бумагой,
которая погружалась бы в растворитель, чтобы создать атмосферу,
насыщенную парами растворителя, и свести к минимуму испарение с
пластинки. При проявлении хроматограммы сначала залейте в банку столько
растворителя, чтобы пятно образца оказалось над его поверхностью, а затем
опустите в банку пластинку, стараясь расположить ее вертикально.
Это легко проделать с большими пластинками, но с маленькими легкими
одно разовыми пластинками необходимо обращаться с большей
осторожностью, используя щипцы или пинцет, для опускания и вынимания
их из камеры. На время проявления камера должна оставаться закрытой.
Когда фронт растворителя поднимется почти до верха пластинки, выньте ее
из камеры и сразу же карандашом или шпателем отметьте положение фронта
растворителя. Высушите пластинку в вытяжном шкафу.
1.5 Просмотр хроматограммы
Если соединения в образце окрашены, то после проявления их легко
различить визуально, однако для бесцветных соединений требуется какойлибо метод визуализации.
Наиболее употребительный метод – введение в слой сорбента
неорганического флуоресцентного агента (0,5 %). В продаже имеются такие
одноразовые пластинки. При освещении такой пластинки УФ-лампой (254
нм) сорбент начинает светиться бледно-зелёным или голубым светом, а
органические соединения, которые гасят флуоресценцию, выделяются в виде
темных пятен.
Меры безопасности. Хотя специальные УФ-лампы для ТСХ имеют
низкую мощность их все же следует вмонтировать в смотровой бокс или
колпак, чтобы защитить глаза наблюдателя от УФ-излучения и чтобы
дневной свет не попадал в камеру.
Еще один распространенный метод состоит в использовании склянки с
иодом. (В качестве склянки можно использовать эксикатор или другую
емкость с плотно притертой крышкой). Она представляет собой емкость
такого же размера, как и камера для проявления, куда помещено несколько
кристалликов иода.
Если сухую проявленную пластинку поместить в камеру на несколько
минут, пары иода растворяются в органических пятнах, окрашивая их в
коричневый цвет, до тех пор, пока вся пластинка не потемнеет.
Какой бы метод не использовался для визуализации, положение пятен
для проведения дальнейших измерений необходимо пометить карандашом
или шпателем (рис. 1, г).
Необходимо отметить, что, хотя описанные выше методы в целом
довольно эффективны, одни соединения «проявляются» сильнее, другие
слабее, а некоторые иногда не видны совсем. Поэтому не принимайте
6
относительную яркость пятен даже в качестве грубой характеристики
относительных концентраций в смеси.
Имеется целый ряд реагентов, нанесение которых из пульверизатора на
пластинку после проявления хроматограммы, окрашивает соединения
определенных классов в различные цвета.
1.6 Использование ТСХ в качественном анализе
При конкретном наборе условий (сорбент и растворитель)
характеристикой соединения является значение Rf (рис. 1,г). Таким образом,
идентичность значения Rf “подлинного” образца (вещества сравнения) дает
полное основание считать, что они одинаковы (см. предостережение ниже).
Поскольку сорбенты различны, а состав смеси растворителей трудно
воспроизвести точно, необходимо доказать, что значения Rf одинаковы. Для
этого хроматографируют смесь и вещество, сравнивая рядом друг с другом
на одной и той же пластинке, или добавляют небольшое количество вещества
сравнения к отдельной пробе смеси, чтобы удостовериться в точном
совпадении пятен. На рис. 1, д (1) и (3) – вещество сравнения В, (2) – смесь, а
(4) – смесь плюс вещество сравнения.
ВНИМАНИЕ! Идентичность хроматографического поведения даже на
разных сорбентах с различными растворителями нельзя рассматривать как
абсолютное доказательство структурной идентичности. Изучаемое
соединение необходимо выделить методом препаративной хроматографии
и затем идентифицировать, например, методом ИКС или ЯМР.
1.7 Выбор проявляющего растворителя (подвижной фазы)
Высота, на которую поднимается по пластинке пятно соединения,
зависит от сродства последнего к сорбенту и силы (полярности)
проявляющего растворителя (см. табл.1).
Полярные соединения (спирты, кетоны и.т.п.) сорбируются сильно и
поэтому плохо продвигаются при использовании слабых проявляющих
растворителей типа гексана, тогда как неполярный углеводород типа
нафталина хорошо поднимается по пластинке. Наилучший растворитель
приходится находить методом проб и ошибок. Силу растворителя легче всего
регулировать, используя смеси сильного и слабого растворителей. Обычно
начинают с 1:1-смеси эфира (сильный растворитель) с гексаном или (60 / 80
петролейным эфиром) (слабый растворитель) и затем соответственно меняют
соотношение. Очевидно, что, если чистый эфир не способен поднять «пятна»
вверх по пластинке, необходимо перейти к более «сильному» растворителю.
(Табл. 1)
Таблица 1. Сила некоторых растворителей для хроматографии*
7
Приведены значения для хроматографирования на оксиде алюминия, но аналогичный
порядок наблюдается и для силикагеля.
*
В случаях когда разделению препятствует сильное перекрывание двух
пятен, даже если они хорошо поднимаются по пластинке (Rf 0,6 – 0,9),
можно попытаться улучшить разделение двумя путями: 1) изменением
химической природы проявляющего растворителя при сохранении его силы (
это изменит значение k’ - коэффициент распределения и следовательно, α –
коэффициент разделения – или 2) изменением природы неподвижной фазы,
например заменой оксида алюминия на силикагель и наоборот. На практике
при наличии разных пластинок последний путь часто является более
эффективным и быстрым.
В случаях, когда смесь содержит несколько полярных и неполярных
соединений, может потребоваться двукратное проявление. Сначала смесь
проявляют в слабом растворителе для отделения неполярных соединений
(полярные остаются на старте), а затем в более сильном растворителе для
отделения полярных соединений (неполярные при этом сходятся вместе у
фронта растворителя). [4, c.141]
1.8 Препаративная тонкослойная хроматография
Препаративная ТСХ представляет собой пропорционально увеличенный
вид аналитической ТСХ, позволяющий проводить
разделение в
препаративном масштабе. Используемые в ней пластинки (рис. 2) больше,
чем аналитические (обычно 20 Х 20 см), и покрыты более толстым слоем
сорбента (толщиной 0,5 или 1 мм). Пластинка такого размера пригодна для
разделения до 100-150 мг в смеси в зависимости от трудности разделения.
8
Рис.2. Препаративная химия
Раствор образца наносится в виде полосы вдоль нижней кромки
пластинки. Его можно наносить в виде перекрывающихся капель (с помощью
пипетки или шприца) или в виде непрерывной линии (с помощью усечённой
пастеровской пипетки с ватным тампоном) (рис. 3)
Рис. 3. Нанесение раствора образца на пластинку для препаративной ТСХ.
В обоих методах нанесения требуется направляющее приспособление,
приподнятое над поверхностью сорбента. Для нанесения узкой однородной
полосы необходима особая тщательность. Если предстоит большой объем
работы по препаративной ТСХ, то желательно пользоваться механическим
приспособлением для нанесения полос. Оно имеет каретку для перемещения
шприца вдоль пластинки, которая автоматически распределяет раствор по
ходу передвижения. Чтобы получить узкую полоску, лучше всего нанести
несколько тонких полосок одна поверх другой, давая каждой высохнуть
перед нанесением последующей.
После проявления пластинки компоненты обычно обнаруживают УФметодом. Реагенты для опрыскивания и иод разрушили бы образец, поэтому
отмечают движение полос, затем соскребают сорбент с пластинки.
Меры безопасности. Эту операцию следует выполнять в вытяжном
шкафу.
Затем соединения извлекают, помещая соскобленный сорбент в
стеклянную воронку Шота и добавляя соответствующий растворитель,
обычно дихлорметан или этилацетат в зависимости от полярности
соединения. [4, c. 183]
Глава 2. Хроматография на бумаге.
2.1 ”Бумажная” хроматография
При бумажной хроматографии неподвижной жидкой фазой служит вода,
адсорбируемая волокнами бумаги в количестве до 20%, ил другой полярный
растворитель; в качестве подвижной фазы чаще всего применяют бутиловый
спирт, коллидин, фенол, крезолы. Носителем служит хорошая фильтрованная
бумага, достаточно однородная по толщине и плотности.
Для разделения смеси способом бумажной хроматографии каплю
исследуемого раствора наносят на полоску фильтрованной бумаги шириной
9
15-20 мм и длиной 300-500 мм на расстоянии 20-30 мм от конца. Конец
полоски погружают в соответствующий органический растворитель,
предварительно насыщенной водой, а весь прибор помещают в
герметическую камеру, атмосфера в которой насыщена парами
органического растворителя и воды. Движение растворителя вдоль полоски
бумаги, происходящее вследствие капиллярных сил, обеспечивает
проявление хроматограммы, причем отдельные зоны перемещаются с
различной скоростью.
2.2 Двумерная хроматография на бумаге
Еще более точные результаты получаются при помощи так называемой
двухмерной хроматографии на бумаге. Для этого варианта применяют не
полоски фильтрованной бумаги, а прямоугольники размером примерно
400Х500 мм. Каплю исследуемого раствора наносят вблизи одной из вершин
прямоугольника, а Хроматограмму проявляют дважды различными
растворителями, например фенолом и коллидином, сперва одним
растворителем, а затем, после поворота на 90◦, -другим. [2, c.233]
2.3 Методы проявления хроматограмм
Восходящая хроматография. Бумага погружается нижним концом в
подвижную фазу. Подъём жидкости происходит под действием капиллярных
сил.
Рис.4. Восходящая хроматография.
«+» Прибор прост, возможна количественная оценка результатов;
«–» Сила тяжести и капиллярные силы действуют в противоположных
направлениях; скорость всасывания после подъема до 20 см сильно падает.
Применима для веществ, имеющих достаточно большие различия в
значениях Rf
Нисходящая хроматография. Бумага погружается в подвижную фазу
верхним концом. Стекание жидкости происходит под действием силы
тяжести.
«+» - быстрое прохождение подвижной фазы; отсутствие ограничения длины
пробега пятен (проточная хроматограмма); возможно разделение веществ с
незначительно отличающимися значениями Rf и количественная оценка
результатов.
«-» - Прибор сложнее, чем для восходящей хроматографии.
10
Рис. 5. Нисходящая хроматография
Радиально-горизонтальная хроматография. Подвижная фаза непрерывно
наносится в центр круглого листа бумаги.
Рис.6. Радиально-горизонтальная хроматография.
«+» разделения, чем для первых методов.
«-» - Возможна только качественная оценка результатов; применение
«свидетелей» возможно только лишь при так называемом «секретном
методе» (т.е. при делении бумаги на секторы).
Примечание: Rf (ratio of fronts – отношение фронтов)
Расстояние от точки старта до середины пятна вещества
Rf =
Расстояние, пройденное фронтом растворителя от точки старта
2.4 Приготовление подвижной фазы
Ниже описан простейший случай хроматографии на бумаге
восходящая хроматография с водой в качестве восходящей фазы.
–
11
Компоненты выбранной системы растворителей смешивают в указанном
соотношении в делительной воронке. Две несмешивающиеся фазы доводят
при помощи встряхивания до взаимного насыщения; в качестве подвижной
фазы выступает органическая.
2.5 Нанесение вещества
Из бумаги определенного сорта вырезают полоску, размер которой
соответствует размерам применяемого для хроматографии цилиндра. На
расстоянии 3 см от нижнего края карандашом наносят маркировочную
линию. На этой линии через 2 - 2,5 см друг от друга и от краев полоски
помечают точки старта. Специальной пипеткой наносят каждую точку
старта; при этом образуются пятна около 1 см в диаметре. Затем
растворителю дают испариться.
2.6 Проявление
На дно цилиндра наливают подвижную фазу и подвешивают полоску бумаги.
Оставляют ее так висеть в течение ночи, а затем нижний край полоски
погружают на 0,5 см в подвижную фазу. После того как растворитель
поднимется на 20 - 25 см, полоску вынимают, отмечают карандашом
положение фронта растворителя и Хроматограмму высушивают.
2.7 Обработка хроматограммы
Если пятна на хроматограмме не окрашены и не флуоресцируют в
ультрафиолетовом свете, Хроматограмму опрыскивают подходящими
реактивами, дающими окрашивание с соответствующими компонентами при
помощи пульверизатора.
12
1.
2.
3.
4.
Список литературы
Органикум; Практикум по органической химии : пер. с нем. / Г. Беккер,
В. Бергер, Г. Домшке и др. — М. : Мир, 1979
А. Я. Берлин «Техника лабораторной работы в органической химии» М. : ГХИ, 1952
С. А. Кибардин, К.А.Макаров «Тонкослойная хроматография в
органической химии» - М. : Химия, 1978
Дж. Шарп, И. Госни, А. Роули «Практикум по органической химии» М. :Мир, 1993
13