Ретиноевая кислота как фактор дифференцировки клеток
advertisement
Ретиноевая кислота как фактор дифференцировки клеток гемопоэза Д.Б.Утешев, С.А.Коростелев, Г.И.Сторожаков, Б.С.Утешев, А.Ю.Барышников РГМУ, РОНЦ им. Н.Н.Блохина, Москва В последнее десятилетие было установлено, что такие фундаментальные процессы, как эмбрио- и морфогенез, клеточная дифференцировка и апоптоз являются ретинолассоциированными [1]. Оказалось, что образующаяся из ретинола ретиноевая кислота является лигандом суперсемейства ядерных рецепторов, к числу которых относятся рецепторы к стероидным гормонам, витамину D, тиреоидному гормону, некоторым простагландинам и др. В общей сложности на сегодняшний день выделено и проклонировано более 150 ядерных рецепторов. Ключевую роль в этом суперсемействе играют ретиноидные рецепторы, поскольку они входят в виде мономера в структуру подавляющего большинства других ядерных рецепторов [2]. Ядерные рецепторы выполняют роль транскрипционных факторов, контролирующих экспрессию генов. Целью настоящей работы явился анализ дифференцировочной активности ретиноевой кислоты в отношении клеток гемопоэза. Острый промиелоцитарный лейкоз (acute promyelocytic leukemia – APL) характеризуется реципрокной транслокацией хромосом 15 и 17: t (15; 17) (рис. 1). В результате этой транслокации образуются две рекомбинантных хромосомы: 15g+ и 17g-. Точки разрыва локализуются 15g24 и 17g21. Разрыв на хромосоме 15 приходится на ген PML (promyelocytic leukemia). В хромосоме 17 точка разрыва локализуется в локусе, который кодирует рецептор к ретиноевой кислоте (RAR – Retinoic Acid Receptor). В результате транслокации и слияния хромосом образуются два химерных гена: на 15g+ хромосоме PML/RAR ген, на 17g – RAR/PML [3]. С помощью цитогенетических и молекулярнобиологических методов было доказано, что t(15; 17) транслокации наблюдается в 100% случаев APL и во всех случаях химерный PML/RAR ген проявляет транскрипционную активность под контролем PML промотора [4]. Принципиальная структура PML-белка представлена на рис 2. PML-белок относится к семейству белков, в N-конце которых содержатся кольцевые структуры (zing finger) – С3НС4 [5], а также два цистеин-богатых домена (В-боксы) и димеризационный домен. PML является фосфопротеином и, как показали Z.Mu и соавт. [6], по крайней мере в одном сайте фосфорилируется тирозин/киназой. Функциональные домены PML, входящие в состав PML-RAR химерного белка, представляют собой отдельные цистеинсодержащие последовательности, обозначаемые как пальцевые структуры (Ring finger motif). Функциональные домены PML насчитывают более 40 белков, некоторые из них регулируют экспрессию генов [7]. Функция PML-белка в клетке остается еще недостаточно ясной. Результаты исследований Z.Mu и соавт. [6] показали, что PML является супрессором клеточной пролиферации и онкогенной трансформации. Мутантные формы PML утрачивают способность тормозить клоногенные свойства и туморогенную активность лейкозных клеток линии NB4. В основе этого лежит, по-видимому, то, что PML в обычных условиях выполняет функцию промоторспецифического супрессора и активатора транскрипции. Он также выступает как ростовой ингибитор [6]. Его синтез индуцируется интерфероном [8]. PML-белок локализуется в нуклеоплазме в составе специфических мультипротеиновых структур, так называемых PML ядерных телец [9]. На основании всего изложенного выше Z.Mu и соавт. [6] пришли к выводу, что физиологическая функция PML состоит в том, что он является супрессором опухолей. Из других функционально значимых свойств PMLбелка следует отметить способность димеризоваться и образовывать комплексы с PML, PML/RAR, RXR, следствием чего является внутриклеточная секвестрация PML или RXR, а возможно и того, и другого (рис. 3) [10]. Как было показано K.Kweis и соавт. [11], PML, входящий в структуру внутриядерных телец, может быть локализован на электронограммах с помощью флюоресцеин-меченных антител, полученных от больных с аутоиммунной патологией. В промиелобластах больных лейкозом гибридный белок PML-RAR имеет аномальную локализацию и входит в состав аберрантных структур, тесно связанных с хроматином. Под влиянием ретиноевой кислоты происходит полное восстановление внутриядерной структуры. Рис. 1. Схема транслокации t (15; 17) [по Grignani и соавт. с модификацией]. В верхней части рисунка представлены нормальная хромосома 15 (#15), содержащая PML-ген и хромосома 17 (#17), содержащая RAR-ген. В результате реципрокной транслокации при промиелоцитарном лейкозе сохраняется нормальная линейная структура хромосом. В нижней части рисунка изображены воссоединенные #15g+ и 17g-хромосомы, содержащие соответственно химерный PML/RARген и химерный RAR/PML-ген. Рис. 2. Схема пронципиального строения RAR и PML, а также химерных белков PML/RAR и RAR/PML, образующихся в результате транслокации t (15; 17) [по Grignani и соавт.с модификацией]. Буквами и цифрами обозначены различные домены RAR и PML. Все детали представлены в тексте. Рис. 3. Принципиальная схема строения PML белка [по Grignani и соавт. с модификацией]. Стрелками обозначены точки разрыва и процент различных изоформ, участвующих в образовании химерного белка. Иммуногистохимически обнаружена локализация PML в составе вновь формируемых внутриядерных органелл, так называемых PML онкогенных доменов [12]. Наряду с PML в структуру последних входит еще по крайней мере три нуклеопротеина. В промиелоцитах, полученных от больных с острым лейкозом, экспрессия PML-RAR химерного белка ассоциируется с деградацией внутриядерных органелл. Таким образом, PML-протеин является полифункциональным белком, участвующим в регуляции клеточного деления. Он способен гомо- и гетеродимеризоваться, связываться с ДНК, в том числе с ретинол-респонсивными генами, а также с генами, контролируемыми другими ядерными рецепторами (рецепторы к витамину D3, рецепторы к тиреоидным гормонам). Наиболее значимым для рассматриваемой нами проблемы имеет свойство PML-белка супрессировать клеточную пролиферацию. Другим структурным элементом, участвующим в образовании химерного PML/RAR белка, является рецептор к ретиноевой кислоте RAR. Этот рецептор относится к суперсемейству ядерных рецепторов. Существует 2 типа ретиноидных рецепторов: рецепторы к ретиноевой кислоте (RAR – Retinoic Acid Receptor) и ретиноидный X рецептор (RXR – Retinoic X Receptor). Последнему было присвоено такое наименование, поскольку до 1992 г. не был известен природный лиганд, с помощью которого функционирует данный ретиноидный рецептор (Х-рецептор; "сиротский" или безлигандный рецептор) [13]. Каждый из указанных типов рецепторов включает в себя еще три субтипа: a, b, g. Таким образом, на сегодняшний день выделено и проклонировано 6 ретиноидных рецепторов: RAR, RAR, RAR, RXR, RXR и RXR [14]. Трансретиноевая кислота служит природным агонистом RAR, ее стереоизомер, 9-цисретиноевая кислота является лигандом и RAR, и RXR, т.е. панагонистом всех ретиноидных рецепторов [13]. В качестве прямого доказательства участия RAR в клеточной дифференцировке можно указать на исследования M.Pratt и соавт. [15] и K.Robertson и соавт. [16]. Авторы описали отсутствие дифференцировки клеточной линии эмбриокарциномы Р19 и миелоидной линии HL-60 в результате мутации гена RAR, в результате которой экспрессировался рецептор, мишенной ретинол-связывающего домена. Не касаясь многих деталей строения и функции ретиноидных рецепторов, мы остановимся лишь на тех положениях, которые важны, с нашей точки зрения, для понимания проблемы дифференцировки. Молекула RAR содержит 6 доменов, обозначенных A, В, С, D, Е и F. Поскольку при транслокации t (15; 17) точка разрыва хромосомы 17 всегда локализуется во 2-м интроне рецептора RAR, то во всех случаях APL в состав химерного белка входят одни и те же домены: от B до F [17]. Иными словами, химерный белок PML/RAR всегда содержит домены RAR, отвечающие за связывание с лигандами, димеризацию, связывание с ДНК. Способность PML/RAR и RAR выступать как ретинол-индуцибильный транскрипционный фактор, оцениваемая по экспрессии специфических ретинолреспонсивных генов (TRE-TK, RAR2, RAR-2, CRAB-P II, CRBP I), была показана с помощью трансфекции различных клеток (COS-1, HeLa, HepG2, HL-60) [7]. Гены-мишени для ретиноевой кислоты содержат так называемые ретинол-респонсивные элементы, промоторную область и репортерный ген. Экспрессия репортерного гена в работах [7] оценивалась по способности RAR и PML/RAR связываться с ретинол-респонсивным элементом и активировать промотор. При этом было констатировано, что PML/RAR и RAR обладают различной трансактивационной эффективностью. Действие на транскрипцию и PML/RAR, и RAR может быть как стимулирующим, так и ингибирующим в зависимости от промотора и от типа клеток, взятых для трансактивации. Кроме того, транскрипция также зависит от присутствия или отсутствия лиганда. Однако при сравнении транскрипционной эффективности RAR и PML/RAR активность последней в целом была выше [7]. Это не совсем понятно, поскольку при t(15; 17) происходит деструкция A/B региона RAR и вследствие этого утрата в химерном рецепторе А-домена. С другой стороны, показано, что именно А/В регион RAR имеет функцию активатора транскрипции [18] и при его отсутствии в химерном PML/RAR белке трансактивационная эффективность должна снижаться. По-видимому, транскрипционная активность PML/RAR существенно зависит от наличия в молекуле еще другого, помимо А домена RAR, региона регулирующего транскрипцию. Таким образом, наиболее функционально значимой хромосомной перестройкой при APL является 15g+, содержащая PML/RAR ген; аберрантная хромосома 17g хотя и содержит транскрипционно активный ген RAR/PML, однако принципиального значения для эспрессии PML-фенотипа, по-видимому, не имеет. В результате t (15; 17) транслокации нормальная линейная структура хромосом не нарушается, поэтому центромера-теломерная транскрипционная ориентация как PML-, так и RAR-локусов сохраняется: 5I -- 3I [19]. В связи с этим в химерном гене PML/RAR как локус PML, так и локус RAR сливаются в конфигурации "голова-хвост", поэтому транскрипция химерного гена находится под контролем PML-промотоpa. Химерный ген PML/RAR является транскрипционно активным в 100% случаев APL [4]. Поэтому был сделан вывод, что продукт этого гена PML/RAR белок несет ответственность за трансформацию лейкозного фенотипа при APL. PML/RAR способен гомодемеризоваться. Гомодимерные комплексы в отсутствии лиганда связываются с ретинол-респонсивными элементами промоторов генов-мишеней и супрессируют их. Именно этим, по-видимому, и объясняется то, что PML/RAR оказывает доминантнонегативное влияние на нормальную дифференцировку различных клеточных линий. Терминальная дифференцировка гематопоэтических клеток-предшественников может быть индуцирована различными лигандами. Например, витамин D3 или комбинация витамина D3 и трансформирующего ростового фактора (TGFp1) дают терминальную дифференцировку промоцитарной клеточной линии U937 в зрелые моноциты [20]. При экспрессии PML/RAR эти клетки утрачивают способность к терминальной дифференцировке. Причем этот эффект является дозозависимым. Для торможения терминальной дифференцировки (по морфологическим и функциональным критериям) уровень экспрессии PML-RAR должен быть выше, чем экспрессия нормального RARпротеина. Аналогичная ситуация имеет место и с APL-бластами [12]. Ретиноевая кислота в физиологических концентрациях дает только частичную дифференцировку гематопоэтических предшественников, а если последние экспрессируют PML/RAR, то дифференцировка вообще отсутствует [12]. Однако ситуация полностью меняется, если клетки, экспрессирующие лейкозный фенотип, подвергаются воздействию высоких концентраций ретиноевой кислоты, сопоставимых с той концентрацией, которая имеет место у лейкозных больных, получавших ретиноевую кислоту [21]. Процент клеток, экспрессирующих PML/RAR и подвергающихся дифференцировке под воздействием высоких уровней ретиноевой кислоты, значительно выше, чем в контроле. Таким образом, торможение дифференцировки, которое свойственно PML/RAR, сменяется при высоких концентрациях ретиноевой кислоты на стимуляцию дифференцировки. Обобщая приведенные выше данные, F.Grignani и соавт. [3] пришли к выводу, что PML/RAR осуществляет двойственное влияние на дифференцировку: ингибиторное и одновременно ретинол-независимое и второе – стимулирующее (ретинол-зависимое). Представляют интерес и в то же время трудно поддаются осмыслению данные F.Oberg и соавт. [22] о наличии функционального антагонизма между ретиноевой кислотой и витамином Моноциты D3 U-937 в отношении характеризуются дифференцировки полным отсутствием U-937-клеток. экспрессии CD14 (моноцитарно-макрофагальный антиген) и неким базальным уровнем экспрессии CD23 (низкоаффинный Fc-рецептор для IgE). Под влиянием форболмиристем ацетата, витамина D3 и ретиноевой кислоты моноциты U-937 дифференцируются в зрелые моноциты и задерживаются на Go/G1-фазе. Дифференцировка, индуцируемая форболовым эфиром, сопровождается up-регуляцией экспрессии как CD14, так и CD23. Наконец, ретиноевая кислота индуцирует СD23-экспрессию, но тормозит уже индуцированную форболовым эфиром и витамином D3 экспрессию CD23. Наиболее вероятной причиной этого функционального антагонизма, по мнению авторов, является взаимный антагонизм на транскрипционном уровне. Было сделано несколько попыток изучить дифференцировочную активность ретиноевой кислоты на уровнях эффекторных генов и отдельных ретиноидных рецепторов. Дело в том, что RAR и RXR являются лиганд-индуцибильными транскрипционными факторами, взаимодействующими не только со специфическими ДНК-последовательностями геновмишеней, но и с другими регуляторными факторами (коактиваторами и корепрессорами) в промоторной/энхансерной области. Оба природных лиганда ретиноидных рецепторов – транс-ретиноевая кислота и 9-цис-ретиноевая кислота – дают сходные эффекты в отношении дифференцировки. Однако это отнюдь не означает, что пути реализации у этих лигандов, а соответственно и функция RAR и RXR, совпадают. Обычно в большинстве клеток имеет место коэкспрессия и RAR, и RXR. Кроме того, ретиноевая кислота легко подвергается изомеризации. Поэтому связать тот или иной дифференцировочный эффект с определенным ретиноидным рецептором и конкретным лигандом бывает весьма затруднительно. Тем не менее с помощью специфических агонистов и антагонистов ретиноидных рецепторов было установлено, что дифференцировка промиелобластных лейкозных клеток линии HL-60 в зрелые гранулоциты реализуется через RAR-рецепторы и специфичные им лиганды. RXR и 9цис-ретиноевая кислота ответственны, очевидно, за индукцию апоптоза гранулоцитов, который сменяет их дифференцировку [23]. В связи с этим представляет интерес недавняя paбoтa M.Gianni и соавт. [24]. Ha лейкозной линии NB4 триокись мышьяка (Аs2О3) индуцировала незавершенную дифференцировку и апоптоз клеток, которые сочетались с деградацией химерного АРL/RAR-белка. На мышьяк-резистентной сублинии клеток дифференцировка индуцировалась Аs2О3, но способность к апоптозу клетки утрачивали. Аналогичным образом, на ретинол-резистентных клетках NB4, авторы констатировали деградацию белка PML/RAR при добавлении лиганда и незавершенную дифференцировку. По мнению M.Gianni и соавт. [9], деградация химерного белка является условием необходимым, но недостаточным для проявления дифференцировочного действия ретиноевой кислоты. Одним из кандидатов, претендующим на роль ключевого гена в дифференцировке клеток гемопоэза, является P21WAF1/CIP1. Этот ген известен как ингибитор клеточного цикла. Продукт этого гена относится к группе недавно охарактеризованных белков, которые взаимодействуют и ингибируют циклин-циклин-зависимый киназный комплекс, поэтому обозначаются как CDK-ингибиторы (cyclin-dependent kinase). Типичным для CDK-ингибиторов эффектом является задержка клеток в C1-фазе клеточного цикла [25]. В настоящее время накапливается все больше данных о том, что CDK-ингибиторы являются мишенью для внутриклеточных и экстрацеллюлярных сигналов, регулирующих клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Вещества, которые индуцируют миелоидную дифференцировку, включая форболовые эфиры, демитилсульфоксид, витамин D3 и ретиноевую кислоту, up-регулируют экспрессию белков р21 и/или р27 на уровне и-РНК и уровне белковой макромолекулы [26]. M.Liu и соавт. на культуре миеломонобластов U937 показали, что ген P21WAF1/CIP1 является прямой мишенью для витамина D3 и ретиноевой кислоты. Экспрессия этого гена сопровождается дифференцировкой клеток U937 в моноциты. Авторы идентифицировали ретинолреспонсивный элемент в промоторе этого гена и показали, что дифференцировка моноцитов зависит от RAR/RXR гетеродимера [27]. Таким образом, в клетках U937 витамин D3 и ретиноевая кислота имеют, очевидно, в качестве мишеней один/одни и тот/те же гены. Однако в отличие от U937 клеток, которые коммитированы для дифференцировки в моноцитарно/макрофагальном направлении в ответ и на ретиноевую кислоту и D3, клетки HL-60 (промиелоциты) в ответ на ретиноевую кислоту дифференцируются в гранулоциты, и в моноциты - под влиянием D3 [28]. Из этого следует, что при наличии общей мишени у ретиноевой кислоты и D3 (ген р21) в клетках HL-60 эти лиганды активируют и еще ряд других сигнальных систем, специфичных для каждого из них. Косвенным свидетельством в пользу этого могут служить данные A.Takeuchi и соавт. [29] о том, что витамин D3 и его гетеродимерный партнер RXR связываются с дистальным элементом NFAT (nuclear factor activater thymocytes), локализующимся в промоторе IL-2. В результате этого связывания экспрессия гена IL-2 снижается. Другим геном, с которым в последнее время пытаются связать дифференцировочную активность ретиноевой кислоты, является c-myb. C-myb является протоонкогеном и клеточным гомологом v-myb-гена, идентифицированного в геноме вируса, вызывающего миелобластоз. Этот вирус ответственен за трансформацию миеломоноцитарных гемопоэтических клеток in vivo и in vitro. Существует достаточное число данных для предположения, что пролиферация, так же как и дифференцировка гемопоэтических клеток, ассоциирована с c-myb. Этот протоонкоген экспрессируется незрелыми гемопоэтическими клетками всех направлений гемопоэза и, очевидно, существенен для их пролиферации [30]. Более того, стабильная экспрессия c-myb блокирует терминальную дифференцировку клеток всех направлений гемопоэза [30]. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что как онкогенные, так и клеточные формы myb-белка играют существенную роль в поддержании недифференцированного статуса гемопоэтических клеток, по-видимому, за счет блокады дифференцировочных сигналов. Одновременно этот белок является стимулятором пролиферативных процессов. На основании экспрессии субклеточной и локализации, трансактивационных ДНК-связывающей свойств M.Tompson активности, и характера R.Ramsay [30] идентифицировали c-myb как транскрипционный фактор, необходимый для пролиферации незрелых гемопоэтических клеток. Они показали, что экспрессия c-myb снижается во время дифференцировки гемопоэтических клеток, индуцированной ретиноевой кислотой [30]. Это наводит на мысль, что RAR может down-регулировать экспрессию c-myb протоонкогена. Более того, недавние исследования показали, что активация транскрипции myb-респонсивного репортерного гена может быть ингибирована ретиноевой кислотой. Отсюда следует, что RAR также может ингибировать транскрипционную активность самого myb. Наконец, интродукция RAR в v-myb трансформированные монобласты тормозит сам процесс трансформации и делает возможной дифференцировку клеток под влиянием ретиноевой кислоты в макрофагоподобные клетки [31]. Напротив, myb ингибирует биологические эффекты ретиноевой кислоты и тиреоидного гормона на клетки-предшественники эритроидного ряда [32]. Таким образом, RAR и myb несут функцию антагонистических регуляторов пролиферации и дифференцировки. Как показали E.Pfitzner и соавт. [33], myb непосредственно взаимодействует с RAR, но не с RXR in vivo и in vitro. ДНКсвязывающий домен RAR как необходим, так и достаточен для этого взаимодействия. Очевидно, что связывание myb с RAR лежит в основе блокады дифференцировки миелобластных клеток, вызываемой этим вирусом. Заключение Хотя действие ретиноевой кислоты на дифференцировку в последнее время изучается интенсивно, однако механизм, с помощью которого оно реализуется, остается еще мало понятным. Более того, несмотря на то, что выявлено относительно большое число генов, которые индуцируются или репрессируются ретиноевой кислотой, однако в строгом смысле слова в качестве генов-мишеней RAR и RXR идентифицировано крайне мало. Это особенно справедливо в отношении миелоидной дифференцировки. Литература. 1. Утешев Д.Б., Сергеев А.В., Утешев Б.С. Аллергия, астма и клиническая иммунология. Инф. сборник ВИНИТИ, 1998; 5: l-10. 2. Утешев Д.Б., Сергеев А.В., Утешев Б.С. Росс. иммунол. журн. 1998; 3: 223–36. 3. Grignani F., Fagioli V., Alcalay M. et al. Blood 1994; 83; 10–25. 4. Miller W.H. Jr., Warrell R.P. Jr., Frankel S.R. et al. J Nat Gancer Inst 1990; 82: 1932–6. 5. Freemont P., Hanson I., Trowsdak S. Cell 1991; 64: 483–4. 6. Mu Z.M., Chin K.V., Liu J.H. et al. Mol Cell Biol 1994; 14: 6858–67. 7. Kakizuka A., Miller W.H. Jr., Umesono K. et al. Cell 1991; 66: 663–74. 8. Chelbialix M.K., Pelicano L, Quignon F. et al. Leukemia 1995; 9: 2027–33. 9. Chang K.S., Fan Y.H., Andreeff M. et al. Blood 1995; 85: 3646–53. 10. Jansen J.H., Mahfoudi A., Rambaud S. et al. Proc Nat Acad Sci USA 1995; 92: 7401–6. 11. Kweis K., Rambaud S., Lavau C. et al. Cell 1994; 76: 345–56. 12. Grignani F., Ferrucci P.F., Tasta U. et al. Cell 1993; 74: 423–31. 13. Heyman R.A., Mangelsdorf D., Dyck J.A. et al. Cell 1992; 68: 397–406. 14. Pfahl M. Retinoids today and tomorrow. 1996; 44: 2–6. 15. Pratt M.A.C., Kralova J. Mc Burney M.W. Mol Cell Biol 1990; 10: 6445–52. 16. Robertson K.A., Emani В., Collins S.J. Blood 1989; 80: 1885–9. 17. Chen J.Y., Clifford J., Zusi C. et al. Nature 1996; 382: 819–22. 18. Nagpal S., Saunders M., Kastner P. et al. Cell 1992; 70: 1007–19. 19. Alcalay M., Zangrilli D., Fagioli M. et al. Proc Nat Acad Sci USA 1992; 89: 4840–4. 20. Testa U., Grignani F., Barberi Т. et al. Cancer Res 1994; 54: 4508–13. 21. Mundi J., Frankel S.R., Miller W.H. Blood 1992; 299: 1992–2001. 22. Oberg F., Botling J., Nilsson K. J Immunol 1993; 150: 3487–95. 23. Nady L., Thomazy V.A., Shipley G.L. et al. Mol Cell Biol 1995; 15: 3540–51. 24. Gianni M., Koken M.H.M., Chelbi-Alix M.K. et al. Blood, 1998; 91: 4300–10. 25. Sherr C.J., Roberts J.M. Genes Dev 1995; 9: 1149–63. 26. Hsu C.A., Rishi A.K., Su-Lix et al. Blood 1997; 89: 4470–9. 27. Liu M., lavarone A., Freedman L.P. J Diol Chem 1996; 271: 31723–8. 28. Collins S.J., Robertson K.A., Mueller L. Mol Cell Biol 1990; 10: 2154–63. 29. Takeuchi A., Reddy G.S., Kobayachi Т. et al. J Immunol 1998; 160: 209–18. 30. Tompson M.A., Ramsay R.G. BioEssays 1995; 17: 341–50. 31. Smarda J., Sugarman J., Glass C. et al. Mol Cell Biol 1995; 15: 2474–81. 32. Rascle A., Ferrand N., Gandrillon O. Samarut J Mol Cell Biol 1996; 16: 6338–51. 33. Pfitzner E., Kirfel J., Becker P. et al. Proc Nat Acad USA 1998; 95: 5539–44.
