Основы биохимии, часть 1
advertisement
1 ВВЕДЕНИЕ Биологическая химия (биохимия) это наука о природе и свойствах веществ, входящих в состав живых организмов, путях биосинтеза и использования этих веществ различными организмами в процессе жизнедеятельности. Как самостоятельная научная дисциплина и как отдельный предмет преподавания биохимия сложилась в середине ХIХ века на основе органической химии и физиологии, изучавшими с различных сторон вопросы химии жизни. Первый, опубликованный в России в 1847 г. учебник по биохимии, был написан профессором Харьковского университета А.И.Ходневым и носил название “Курс физиологической химии”. В течение длительного времени биохимия называлась физиологической химией. Термин биохимия был введен К.Нейбергом в 1903 г. В учебных целях биохимию принято делить на ста т и ч е с к у ю и д и н а м и ч е с к у ю. Статическая биохимия изучает количественные соотношения, природу и свойства веществ, образующих живой организм. Этот раздел биохимии в значительной мере базируется на материале органической химии. Динамическая биохимия изучает все химические превращения вещества, происходящие в процессе жизнедеятельности организмов, и сопровождающие эти превращения изменения энергии. Статическая и динамическая биохимии тесно связаны между собой нельзя понять биохимические процессы, идущие в живом организме, не зная его состава и химической природы образующих его веществ. В зависимости от объекта или направления его исследования различают биохимию человека, биохимию животных, биохимию растений, биохимию микроорганизмов, техническую биохимию, радиационную биохимию и т. п. Приведенный далеко не полный перечень основных направлений биохимии указывает на ее огромное теоретическое и практическое значение. Биохимия дает знания необходимые для решения многих задач в биологии, медицине, сельском хозяйстве, промышленности микробиологического синтеза, вопросах охраны окружающей среды, пищевой промышленности. 2 В результате совместной работы биохимиков, генетиков, селекционеров выведены новые, ценные для промышленности сорта растений, породы животных и птиц. Среди них высокомасличные сорта подсолнечника и кукурузы, высокосахаристые сорта сахарной свеклы, сорта ячменя со сбалансированным аминокислотным составом белков, порода голубых норок и др. Исследования по биохимии микроорганизмов привели к созданию промышленности микробиологического синтеза. Продукцию этой промышленности составляют кормовой белок, аминокислоты, антибиотики, многие витамины, гормоны и ферменты. На достижениях биохимии базируются создание и применение лекарственных веществ, выяснение причин болезней, передающихся по наследству, управление поведенческими реакциями животных и человека, применение химических препаратов для повышения продуктивности растениеводства и животноводства. Существующая ныне теория “сбалансированного” пищевого рациона основана на исследованиях биохимии и физиологии роли белков, жиров, углеводов, витаминов, минеральных веществ в обмене у здорового человека в различных условиях труда и быта. Биохимия составляет научную основу пищевой технологии. Исключительная роль и широкий размах биохимических исследований переработки сельскохозяйственного сырья животного и растительного происхождения привели к формированию самостоятельной науки технической биохимии (биохимия мяса; молока и молочных продуктов; зерна и продуктов его переработки; солода и пива; виноделия и др.). Эта биохимия изучает химический состав сырья для пищевой промышленности, происходящие в нем процессы при хранении и переработке, разрабатывает способы применения биологических препаратов в биотехнологии. Знания химических процессов (они обычно ферментативные), происходящих при хранении пищевого сырья, помогают технологу направить эти процессы в нужную сторону с тем, чтобы выбирать оптимальные условия для хранения сырья, вырабатывать из него готовые продукты, имеющие хороший внешний вид, вкус, аромат и высокую пищевую ценность. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ 3 Глава I. ОБЩИЙ ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ. КЛЕТКА И ЕЕ СТРУКТУРЫ Биомасса единовременно живущих на Земле организмов составляет в пересчете на сухое вещество 1,82,4·1012т. Эти организмы ежегодно продуцируют около 1011т сухого вещества. Из общего числа известных химических элементов в организмах, составляющих биомассу Земли, обнаружено около 60; однако не все, входящие в это число химические элементы обязательно требуются каждому виду организмов. По количественному содержанию все, встречающиеся в живом организме химические элементы делят на три группы: макроэлементы, массовая доля их в живом веществе превышает 103% (C, O, N,H, P, S, Ca, Mg,K,Na,Cl,Fe), микроэлементы, массовая доля которых колеблется от 103 % до 106 % (Mn,Zn,Cu,B,Mo,Co и др.) и ультраэлементы, массовая доля которых не превышает 106 % (Hg,Au,U,Ra и др.) Из макроэлементов в живом веществе в наибольшем количестве содержатся C, O, N,H,P,S и Ca. Многочисленные химические элементы, образующие живое вещество, присутствуют в нем в виде различных органических и неорганических соединений. Органические соединения живого представлены молекулами белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, витаминов, гормонов, органических кислот и многими другими. Массовая доля органических соединений составляет: в животных организмах 25 30%, в семенах растений 80 90%, в стеблях, листьях, плодах, овощах, фруктах 5 25%. Неорганические соединения живого представлены водой и минеральными веществами. Вода один из широко распространенных компонентов живого. На долю ее в организме теплокровных животных приходится 65 70%, в растениях (листья, стебли, плоды, овощи, клубни, корни) 75 95%, в покоящихся семенах растений 5 15%. Вода играет огромную роль в создании условий для жизнедеятельности. Она основной участник всех физикохимических процессов организма, обеспечивающих функцио-нирование и возобновление живого. 4 Минеральные вещества в животных и растительных организмах могут быть в свободном ( в виде ионов) и связанном состоянии. Массовая доля минеральных веществ составляет: в животном организме до 10%, в семенах растений 25%, в стеблях, плодах, овощах, фруктах 0,3 1%. Наиболее разнообразными химическими компонентами живого являются различные по составу и сложности строения молекулы органических веществ, Причем более простые органические молекулы, называемые строителььными блоками (биомолекулами), связываясь ковалентно друг с другом, образуют более сложные органические соединения макромолекулы. Каждый вид макромолекул имеет характерные для него строительные блоки. Макромолекулы с помощью относительно слабых межмолекулярных связей объединяются в надмолекулярные комплексы (ансамбли), которые объединяются в органеллы. В конечном итоге формируется главная единица живого клетка. Таким образом в молекулярной организации клеток существует структурная иерархия (рис. 1.1). Переход от простых биомолекул к более сложным субклеточным структурам происходит скачкообразно. СТРОИТЕЛЬНЫЕ БЛОКИ: аминокислоты, моносахара, аденин и др. основания, жирные кислоты, глицерин и т.п. МАКРОМОЛЕКУЛЫ: белки, нуклеиновые кислоты, полиса хариды НАДМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ (АНСАМБЛИ): мембра ны, рибосомы, хроматин, микротрубочки ОРГАНЕЛЛЫ: ядро, митохондрии,аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум КЛЕТКА. Рис. 1.1. Структурная иерархия в молекулярной организации клеток (от простого к сложному) Клетки это структурные и функциональные единицы живых организмов. Диаметр клеток колеблется в пределах от 12 мкм у бактерий, до 20 30 мкм у животных. Такие размеры клеток определяются следующими условиями: минимальным числом необходимых для жизнедеятельности молекул; фиксированной 5 величиной этих молекул, задаваемой размерами входящих в их состав атомов углерода, кислорода, водорода и азота; скоростью диффузии молекул, растворенных в водной среде клетки. Клетка представляет собой самовоспроизводящуюся химическую систему. Стабильность этой системы обеспечена тем, что она физически отделена от своего окружения, обладает способностью поглощать из окружения требующиеся ей вещества и выводить наружу конечные продукты обмена. Роль барьера между данной химической системой и ее окружением выполняет плазматическая мембрана. Отдельные биохимические реакции, протекающие в живых клетках локализованы в компартментах (“отсеках”). Например, синтез белка про-исходит в рибосомах, фотосинтез - в хлоропластах, получение энергии в легко используемой форме - в митохондриях. Вследствие компартментализации - пространственного разделения биохимические реакции, зачастую противоположного характера, идут в клетке одновременно, не мешая друг другу. Клетки живых организмов чрезвычайно разнообразны по структуре и химическим основам функционирования. Чтобы не рассматривать структуры и химическую основу всего многообразия клеток, ввели понятие “обобщенная клетка”, т.е. содержащая набор стуктур, обязательных для обмена веществ и энергии и самовоспроизводства. Идентифицировать одни клеточные структуры можно с помощью светового микроскопа при максимальном увеличении в 1500 раз, другие, более мелкие - при помощи электронного микроскопа. Все клеточные структуры с позиции морфологии называют субклеточными, а с позиции химии - надмолекулярными. Четко очерченные структуры клеток называют органеллами (маленькими органами). Из известных клеточных структур одни имеются как в животных, так и в растительных клетках, другие - только в клетках растений. На рис. 1.2 показаны схема и структуры, общие для животных и растительных клеток. 6 Рис.1. 2. Строение клетки К л е т о ч н а я (п л а з м а т и ч е с к а я ) мембрана (1) состоит из двух слоев белка, между которыми расположены два слоя ориентированных амфипатических молекул липидов (бислой). Она отделяет клеточное содержимое от внешней среды, регулирует обмен между клеткой и средой, делит внутреннее пространство клетки на отсеки (компартменты), предназначенные для конкретных химических процессов. На мембране располагаются участки, улавливающие внешние стимулы (гормоны или другие химические вещества) и позволяющие клетке приспособиться к внешней среде, а также поддерживать связь с другими клетками. Ц и т о п л а з м а (2) состоит из водянистого основного вещества и находящихся в нем разнообразных клеточных сруктур и различных включений (нерастворимые отходы обмена, запасные вещества). Жидкую часть цитоплазмы, заполняющую пространство между клеточными структурами, называют ц и т о з о л е м. Химическую основу цитозоля составляет вода с растворенными в ней солями, сахарами, аминокислотами, жирными кислотами, нуклеотидами, белками и рибонуклеиновыми кислотами (РНК). В цитозоле происходят некоторые химические процессы (гликолиз, синтез жирных кислот, нуклеатидов и некоторых аминокислот). 7 Я д р о (3) - крупная органелла, заключенная в оболочку из двух мембран, пронизанную порами. Ядро содержит хроматин, ядрышко и нуклеоплазму. Нуклеоплазма (ядерный сок) - это гелеобразная структура, в которой располагаются хроматин и одно или несколько ядрышек. Основу хроматина составляет комплекс дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с белками. В ДНК хранится генетическая информация. В ядрышке происходит синтез рибосомной РНК и начинается сборка рибосом. Завершается эта сборка в цитоплазме. В ядрышке имеется хроматин. Э н д о п л а з м а т и ч е с к и й р е т и к у л у м сокращенно ЭР (4), представляет обширную систему уплощенных мембранных мешочков - цистерн - в виде трубочек и пластинок. Образует единое целое с наружной мембраной ядерной оболочки (наружная мембрана ядерной оболочки непосредственно переходит в ЭР). Если цистерны ЭР покрыты рибосомами его называют ш е р о х о в а т ы м, если рибосомы отсутсвуют, то его называют г л а д к и м. По цистернам шероховатого ЭР транспортируются белки, синтезированные рибосомами на его поверхности. Гладкий ЭР служит местом синтеза липидов и стероидов. А п п а р а т Г о л ь д ж и (5) представляет собой стопку уплощенных мембранных мешочков - цистерн - и связанную с ними систему пузырьков. На одном конце стопки мешочки непрерывно образуются - на другом отшнуровываются в виде пузырьков (пузырьки Гольджи). Многие клеточные продукты, например белки, поступают в аппарат Гольджи из эндоплазмического ретикулума, претерпевают в его цистернах модификацию (видоизменение) и в пузырьках транспортируются к нужному месту той же клетки, например в лизосомы или к плазматической мембране. Аппарат Гольджи участвует в выведении веществ из клетки наружу (секреции) и в образовании лизосом. Л и з о с о м ы (6) - это простые сферической формы мембранные мешочки заполненные, в основном, гидролитическими ферментами. Содержимое лизосом имеет кислую реакцию. Стенка мешочка состоит из одинарной мембраны. Лизосомы участвуют в переваривании поступившего в клетку извне материала и отслуживших свой срок клеточных сруктур, а также в саморазрушении клетки (автолизе), наступающем в результате высвобождения их содержимого. 8 Р и б о с о м ы (7) служат местом синтеза белка, представляют собой мелкие округлой формы органеллы, состоящие из двух субчастиц - большой и малой. Эти органеллы связаны с эндоплазматическим ретикулумом, а также свободно лежат в цитоплазме; обнаруживают их в митохондриях, ядре, хлоропластах (органеллы растений). Число рибосом в клетках бактерий достигает до 10 000; в клетках животных и растений - в несколько раз больше. Рибосомы состоят из примерно равных (по массе) количеств РНК и белка. М и т о х о н д р и и (8) - это органеллы клеток, имеющие различную форму и размеры. Митохондрии могут быть спиральными, округлыми вытянутыми, чашевидными. Длина митохондрии колеблется в пределах 1,5 - 10 мкм, а ширина - в пределах 0,25 - 1 мкм. Число митохондрий в клетке может колебаться от нескольких десятков до нескольких тысяч. Митохондрия окружена оболочкой, состоящей из двух мембран. Наружная мембрана гладкая, а внутренняя образует многочисленные гребневидные складки кристы, направленные во внутреннюю полость митохондрии. Эта полость заполнена гелеобразной массой, называемой м а т р и к с о м. В матриксе находятся рибосомы, молекула ДНК и фосфатные гранулы. В кристах происходит синтез аденозинтрофосфата (АТФ) универсального источника энергии для организма; в матриксе работают ферменты, участвующие в цикле Кребса и в окислении жирных кислот . М и к р о т е л ь ц а (9) - это не совсем правильной сферической формы органеллы, окруженные одинарной мембраной. Все микротельца содержат каталазу - фермент, катализирующий расщепление пероксида водорода. У растений в микротельцах протекает глиоксилатный цикл. В растительных клетках наряду с органеллами, обнаруживаемыми в клетках животных, имеются и свои особые структуры. К л е т о ч н а я с т е н к а - это окружающая клетку жесткая структура, расположенная снаружи клеточной мембраны. Она обеспечивает клетке механическую опору и защиту. Химическую основу клеточной стенки составляют полисахариды - целлюлоза, пектиновые вещества, гемицеллюлозы. В клеточной стенке имеются 9 поры, выстланные клеточной мембраной. По клеточной стенке происходит передвижение воды и минеральных солей. Х л о р о п л а с т представляет собой крупную, содержащую хлорофилл пластиду (органеллу растительной клетки), в которой протекает фотосинтез. На рис. 1.3 показана схема хлоропласта. Хлоропласт окружен оболочкой из двойной мембраны (1) и заполнен студенистой массой - с т р о м о й (2). В строме находится система мембран, собранных в стопки, или граны (3). Кроме того строма содержит рибосомы, молеклу ДНК и капельки масла; в ней может откладываться крахмал. Рис.1.3. Хлоропласт К р у п н а я ц е н т р а л ь н а я в а к у о л ь - это мешок, образованный одинарной мембраной, называемой тон о п л а с т о м. Вакуоль заполнена клеточным соком представляющим концентрированный раствор различных веществ (минеральные соли, сахара, пигменты, органические кислоты, ферменты и другие соединения. Глава 2. БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА 2.1. Общая характеристика белков Белком называют часть куриного яйца, приобретающего после термической обработки белый цвет. Соединения, напоминающие по многим свойствам белок куриного яйца, были выделены из всех тканей как животного, так и растительного происхождения. Все эти соединения были объединены под общим названием белковые вещества, или белки. Белки, или протеины (греч. протос - первый, важнейший, главный) -высокомолекулярные органические полимеры, построенные из остатков -аминокислот. Массовая доля белков в пересчете на сухое вещество в среднем составляет в организме животных 40 - 50%, в семенах растений - 10 - 35 %. 10 В пересчете на свежую ткань (сырую ткань) массовая доля белка в органах, тканях и жидкостях организма колеблется в следующих пределах: животный организм в целом 18 - 21%, яйца птиц - 12 14%, молоко 2,5 -5%, семена растений - 10 - 13 %, стебли и листья растений - 1,2 - 3% , корни и клубни растений - 0,5 - 3%, фрукты и ягоды - 0,3 -2%, грибы - 3 - 4%. Независимо от источников получения белки содержат при пересчете на сухое вещество (в %) углерода 50-55, кислорода 21-24, азота 15-18, водорода 6,5 - 7,3, серы 0,3 - 2,5 , фосфора 0 -2, золы 0 0,5. Б е л к и - важнейшие вещества, входящие в состав живых систем. Они обладают многими свойствами и функциями, отсутствующими у других органических соединений. С т р о и т е л ь н а я (с т р у к т у р н а я) ф у н к ц и я. Белки образуют основу цитоплазмы любой живой клетки, с липидами создают структуру всех клеточных мембран и органелл. К а т а л и т и ч е с к а я ф у н к ц и я. Все катализаторы биохимических реакций, называемые ферментами, по своей химической природе являются белками. Эта функция белков является уникальной, не свойственной другим полимерным соединениям. Д в и г а т е л ь н а я ф у н к ц и я. Любые формы движения в живой природе (сокращение и расслабление мышц, движение ресничек и жгутиков у простейших, движение протоплазмы в клетке и т.д.) осуществляется белковыми веществами клеток. Т р а н с п о р т н а я ф у н к ц и я. В крови имеются белки, которые могут связывать и переносить определенные молекулы или ионы из одного органа в другой. В клеточных мембранах присутствует тип белков, способных связывать многие вещества и переносить их через мемрану. З а щ и т н а я ф у н к ц и я. Многие белки защищают организм от вторжения других организмов или предохраняют его от повреждений. Антитела, образующиеся в организме - это специфические белки, обладающие способностью распозанавать проникшие в организм бактерии, чужеродные белки, токсины, а затем обезвреживать их. Белки, участвующие в процессе свертывания крови, предохраняют организм от потери крови при повреждении кровеносных сосудов. Токсические белки (змеиные яды, токсины бактерий, токсичные белки 11 растений), по-видимому, также выполняют защитные функции. Р е г у л я т о р н а я ф у н к ц и я. Некоторые белки участвуют в регуляции обмена веществ в организме. Одни из регуляторных белков вырабатываются железами внутренней секреции животных и носят название гормонов. Каждый из белков-гормонов регулирует какую-либо из сторон обмена веществ, например, обмен глюкозы, транспорт ионов кальция и фосфора. Другие регуляторные белки, называемые репрессорами, регулируют биосинтез ферментов в бактериальных клетках. К регуляторным белкам можно отнести белковые ингибиторы ферментов. З а п а с н а я (п и щ е в а я) ф у н к ц и я. Семена многих растений образуют запасы белков, потребляемые как питательные вещества на первых стадиях развития зародыша. Пищевые белки имеются в яйце птиц, молоке и т.д. Перечисленные функции белков не охватывают все их многообразие. Можно указать и на другие функции белков, в частности, участие их в размножении, поддержании онкотического давления, реакциях “узнавания”, поведенческих реакциях человека и животных. Белки представляют собой незаменимые составные части пищи человека и кормов сельскохозяйственных животных. Они важнейший фактор биологической и пищевой ценности мясных и молочных продуктов, хлеба, крупы, макаронных изделий. Недостаток белка в питании человека приводит к белковому голоданию и болезни. От содержания белков и их качества в кормах зависит продуктивность сельскохозяйственных животных. Белки - это органические соединения, в состав которых входит азот. Массовая доля азота в белке зависит от вида биологического объекта и составляет в белках животных тканей 16 %, молока (казеин) - 15,65%, зерна пшеницы, ржи, ячменя, овса - 17,54%, зерна кукурузы и грчихи - 16,67%. По содержанию азота (определяемому, как правило, методом Кьельдаля) высчитывают массовую долю белка в биологических объектах и продуктах, используя коэффициенты пересчета. Последний определяют , исходя из массовой доли азота в белке. Если анализ белков, например, зерна пшеницы показал 17,54% азота, то это значит, что в 100 г чистых белков пшеницы содержится 17,54 г азота и коэффициент пересчета массовой доли азота на белок составит 100 : 17,54 = 5,7. 12 Например, в навеске зерна пшеницы массовая доля азота составила 2%, значит в исследуемом зерне массовая доля белка составляет 25,7= 11,4%. В ряде случаев для вычисления массовой доли белка по азоту берут коэффициент пересчета 6,25, учитывая, что массовая доля азота в белках составляет в среднем 16%. Интересным является то, что все белки, существенно различающиеся по структуре, свойствам и функциям, построены из одних и тех же аминокислот. 2.2. Аминокислоты - структурные элементы белков 2.2.1. Гидролиз белков - метод определения их аминокислот- ного состава При гидролизе белковые вещества распадаются до аминокислот. Гидолиз белка можно осуществить следующими методами: к и с л о т н ы й г и д р о л и з - нагревание белка в растворе с концентрацией соляной кислоты = 6 моль л при 100 - 105ОС в течение 20 - 24 часов в запаянных ампулах. Обычно берут 200-500кратное количество этого раствора кислоты к массе белка. После окончания гидролиза кислоту испаряют, смесь аминокислот промывают водой, и затем используют для анализа. При кислотном гидролизе аминокислота триптофан полностью разрушается; щ е л о ч н о й г и д р о л и з - нагревание белка в насыщенном растворе гидроксида бария или в растворе с концентраций гидроксида натрия = 2 - 5 моль л при 100ОС в течение 4-8 часов (кипятят с обратным холодильником). При этом виде гидролиза большинство аминокислот разрушается за исключением триптофана, тирозина, треонина и серина; ф е р м е н т а т и в н ы й г и д р о л и з - расщепление белка протеолитическими ферментами. При помощи ферментов можно произвести полный или частичный гидролиз белков. Процесс идет при температуре 37ОС, что не приводит к разрушению аминокислот. Однако, фермента-тивный гидролиз белков до аминокислот осуществить довольно трудно. 13 Разделение и определение аминокислот смеси, а также выделение отдельных аминокислот из нее производят посредством методов хроматографического анализа. Первым белком, для которого был установлен полный аминокислотный состав, был белок молока -лактоглобулин. Анализ этого белка, потребовавший нескольких лет, был завершен в 1947 году. 2.2.2. Определение и стереохимия аминокислот Аминокислоты - это органические соединения, в молекуле которых одновременно присутствуют основная аминогруппа (NH2) и кислая карбоксильная группа (СООН). Чтобы в названии аминокислоты можно было указать положение аминогруппы, атомы углерода в ее молекуле обозначают цифрами или буквами греческого алфавита: 4() 3() 2() 1 CH3 CH2 CH COOH NH2 -Аминомасляная кислота 4() 3() 2() 1 CH2 CH2 CH2 COOH NH2 -Аминомасляная кислота Из белков при помощи гидролиза выделено 20 аминокислот, которые представляют собой карбоновые кислоты , замещенные в положении (или в положении 2) аминогруппой и имеют следующую общую формулу: СООН Буквой R обозначена боковая группа ( R группа). Каждая -аминокислота имеет NH2 С H свою характерную для нее R -группу. R Первая аминокислота, аспарагин (точнее амид аспарагиновой кислоты), была выделена из сока спаржи в 1806 г. Последним из 20 обнаруженных в белках аминокислот был треонин, который идентифицирован в 1935 г. Аминокислоты, входящие в состав белков, называют ста н д а р т н ы м и, о с н о в н ы м и или н о р м а л ь н ы м и. Каждая из них имеет тривиальное (традиционное) название и трехбуквенное условное обозначение (см. классификацию аминокислот). Все 14 стандартные аминокислоты, кроме глицина, содержат а с и м м е т р и ч н ы й атом углерода в -положении (атом углерода, с которым связаны четыре разные замещающие группы) и, следовательно, оптически активны. Они способны вращать плоскость поляризованного луча в разные стороны, существовать в виде пары энантиомеров - D и L (молекул, имеющих несовместимые друг с другом зеркальные изображения). Заглавные буквы D и L указывают на конфигурацию молекулы. Если аминогруппа расположена справа от оси СООН R, то это Dаминокислота, если находится слева от оси СООНR, то Lаминокислота: СООН NH2 C H R L-аминокислота COOH H C NH2 R D -аминокислота Направление вращения плоскости поляризации света обозначают знаком (+) - вращение вправо (по часовой стрелке) и знаком () вращение влево (против часовой стрелки): СООН NH2 C H R L () - серин COOH H C NH2 R D (+) - серин Знак и величина оптического вращения зависят от природы растворителя, реакции среды, наличия в растворе солей и от природы боковой цепи (R - группы). Следует отметить, что знак оптической активности можно не указывать. В состав белков входят только аминокислоты L - ряда. При гидролизе белков в мягких условиях аминокислоты сохраняют свою оптическую активность. Аминокислоты, присутствующие в организме животных и растений в свободном виде также принадлежат к L - ряду. D-аминокислоты встречаются в природе очень редко и обнаружены в составе некоторых микроорганизмов и пептидных антибиотиков. 15 Аминокислоты D-ряда почти не усваиваются животными и растениями, поскольку ферментные системы этих организмов приспособлены к L-аминокислотам. Большинство D-аминокислот обладают сладким вкусом, а L-аминокислоты безвкусные или горькие. 2.2.3. Физико-химические свойства аминокислот Аминокислоты представляют собой белые кристаллические вещества хорошо растворимые ( за некоторым исключением) в воде, аммиаке и других полярных растворителях; в неполярных и слабополярных растворителях (метанол, этанол, ацетон) растворяются плохо. В водных растворах все -аминокислоты существуют в виде биполярных ионов (цвиттер-ионов) с диссоциированной карбоксильной группой и протонированной аминогруппой: СООН NH2 C H R COO + NH3 C H R В зависимости от рН среды аминокислоты могут быть в форме катионов, анионов, электронейтральных биполярных ионов или смеси этих форм, одна из которых обычно доминирует. Аминокислоты - амфотерные соединения; в сильнокислых растворителях имеют положительный заряд, в щелочных отрицательный заряд: СООН COO COO + +Н+ + +ОН NH3 CH NH3 C H NH2 C H + H2O R R R Значение рН среды, при которой аминокислоты электронейтральны, называется изоэлектрической точкой. Вследствие амфотерности аминокислоты в зависимости от состава раствора могут реагировать с кислотами и основаниями, образуя соответствующие соли: 16 СООН + Cl NH3 CH R Cолянокислая соль COONa NH2 C H R Натриевая соль Благодаря амфотерности аминокислоты являются буферными веществами, выполняющими важную функцию регулирования рН в организме. Аминокислоты могут вступать в реакцию как по карбоксильной группе, так и по аминогруппе. Аминогруппа может реагировать с азотистой кислотой и формальдегидом. При взаимодействии аминокислот с азотистой кислотой образуется соответствующая оксикислота, азот и вода: R CH COOH + HNO2 R CH COOH + N2 + H2O NH2 OH Измерение объема выделенного при этой реакции азота положено в основу количественного определения аминокислот по Д.Ван-Сляйку. При взаимодействии аминокислот с формальдегидом образуются метиленовые соединения, представляющие собой кислоты, которые можно титровать щелочью: О R CH COOH + H С NH2 R CH COOH + NaOH N= CH2 Н R CH COOH + H2O N= CH2 R CH COONa + H2O N= CH2 Эта реакция лежит в основе метода формольного титрования при количественном определении аминокислот по Серенсену. Все -аминокислоты реагируют с нингидрином (трикетогидринден-гидратом) с образованием продукта, окрашенного в сине-фиолетовый цвет (см. практикум по биохимии). Эта реакция 17 применяется для точного определения очень маленьких количеств аминокислот. Карбоксильная группа аминокислот может реагировать со спиртами, образуя сложные эфиры: О R CH COOH + СН3 OH R CH CO СН3 + H2O NН2 NH2 Эту реакцию используют для разделения и определения аминокислот путем фракционной перегонки их эфиров в вакууме. Аминокислоты могут вступать в реакцию с соединениями, содержащими карбонильную группу (С=О), например с восстанавливающими сахарами и альдегидами. В результате этой реакции из аминокислты образуются соответствующий альдегид , аммиак и диоксид углерода, а из сахара фурфурол или оксиметилфурфурол. Образующиеся альдегиды обладают определенным запахом, от которого зависит аромат пищевых продуктов. Фурфурол и оксиметилфурфурол легко вступают в соединение с аминокислотами, образуя темноокрашенные соединения м е л а н о и д и н ы. Особенно интенсивна реакция между аминокислотами и восстанавливающими сахарами происходит при повышенных температурах, имеющих место при сушке овощей, фруктов, молока и солода, при упаривании сахарных сиропов, выпечке хлеба и изготовлении кондитерских изделий, самосогревании зерна, обработке вина теплом. Реакция образования меланоидинов может происходить при взаимодействии сахаров с белками. 2.2.4. Строение и классификация аминокислот К настоящему времени описано около 200 природных аминокислот, выделенных из животного и растительного материала. Все природные аминокислоты делят на две группы: п р о т е и н о г е н н ы е, или белковые (обнаружены только в белках) и н е п р о т е и н о г е н н ы е, или небелковые ( в белках не обнаружены). 2.2.4.1. Протеиногенные аминокислоты Аминокислоты, обнаруженные в белках, можно классифицировать по разным признакам. По строению боковой цепи 18 (R-группы) различают алифатические, ароматические и гетероциклические аминокислоты, по числу аминных и карбоксильных групп - моноаминомонокарбоновые (одна NH2-группа и одна СООН-группа), диаминомонокарбоновые (две NH2 -группы и одна СООН-группа), моноаминодикарбоновые (одна NH2 -группа и две СООН-группы), по положению изоэлектрической точки нейтральные, основные и кислые. Аминокислоты, содержащие в радикалах ОН - группы, называют гидроксиаминокислотами, а содержащие серу - серосодержащими кислотами. По способности к синтезу в животном организме биохимики делят аминокислоты на заменимые и незаменимые. Аминокислоты, содержащие NH-группы вместо NH2 - групп, называют иминокислотами. По полярности R-групп, т.е. способности R-групп к взаимодействию с водой при соответствующих внутриклеточных условиях рН (рН вблизи 7,0) , аминокислоты делят на четыре группы: с неполярными или гидрофобными R-группами, полярными, но не заряженными R-группами, отрицательно заряженными Rгруппами и положительно заряженными R-группами. Рассмотрим строение аминокислот этих групп. А м и н о к и с л о т ы с н е п о л я р н ы м и (гидрофобными) R-г р у п п а м и. Эти аминокислоты, по сравнению с другими аминокислотами, медленно растворяются в воде; их R-группы представляют собой углеводороды, и, следовательно, гидрофобны. При растворении в воде диссоциируют только аминная и карбоксильная группы расположенные у -углеродного атома. В эту группу входят восемь аминокислот: 1.NH2CHCOOH CH3 Аланин, ала (-аминопропионовая кислота) 3. NH2CHCOOH СН2 CHCH3 2. NH2CHCOOH CHCH3 CH3 Валин, вал (-амино--метилмасляная кислота) 4. NH2CHCOOH CHCH3 СН2 19 СН3 Лейцин, лей (-амино--метилвалериановая кислота) 5. NH2CHCOOH СН2 СН2S CH3 Метионин ,мет (-амино-метилмасляная кислота) 7 . NH2CHCOOH СН2 NH Триптофан, три (-амино-индолилпропионовая кислота) СН3 Изолейцин, иле (-амино-метилвалериановая кислота) 6. NH2CHCOOH СН2 Фенилаланин, фен (-амино-фенилпропионовая кислота) 8. COOH N H Пролин, про (пирролидинкарбоновая кислота) Аминокислоты с неполярными нез а р я ж е н н ы м и R-г р у п п а м и. Эти аминокислоты лучше растворяются в воде, т.е. они более гидрофильны, чем неполярные аминокислоты, т.к. их радикалы имеют группы, способные образовывать водородные связи с молекулами воды . В эту группу входят пять аминокислот и два амида: 1. NH2CHCOOH Н Глицин, гли (аминоуксусная кислота) 2. NH2CHCOOH СН2 ОН Серин, сер (-амино--гидроксипропионовая кислота) 20 3. NH2CHCOOH СН2 SH Цистеин, цис (-амино-тиопропионовая кислота) 4. NH2CHCOOH СНОН СН3 Треонин, тре (-амино--гидроксимасляная кислота) 5. NH2CHCOOH СН2 ОН Тирозин, тир (-амино--парагидроксифенилпропионовая кислота) 6. NH2CHCOOH СН2 С=О NH2 Аспарагин, асн (-амид аспарагиновой кислоты, или полуамид аминоянтарной кислоты) 7. NH2CHCOOH (СН2)2 С=О NH2 Глутамин, глн (-амид глутаминовой кислоты, или полуамид -аминоглутаровой кислоты). R-группа глицина, представленная атомом водорода, не может компенсировать сильную полярность -аминогруппы и карбоксильной группы. Тиоловая группа цистеина и гидроксильная группа тирозина, диссоциирующие с образованием водорода, при рН 7,0 ионизированы в незначительной степени. Аспарагин и глутамин в водных растворах практически нейтральны, т.к. свзяи СN в амидах имеют частично двоесвязный характер из-за взаимодействия неподеленной пары азота с карбонильной группой: RC =О NH2 R С =О + NH2 21 Аминокислоты с отрицательно за р я ж е н н ы м и (кислыми) R- г р у п п а м и. Каждая из аминокислот этой группы содержит вторую карбоксильную группу, диссоциирующую с образованием ионов Н+ и при рН 7 несет суммарный отрицательный заряд. В группу входят две аминокислоты: 1. NH2CHCOOH СН2 СООН 2. NH2CHCOOH (СН2)2 СООН Аспарагиновая кислота, асп (-аминоянтарная кислота) Глутаминовая кислота, глу (-аминоглутаровая кислота) Аминокислоты с положительно заряженным и (основными) R - г р у п п а м и. К этой группе относят три следующие аминокислоты: 1. NH2CHCOOH (СН2)4 NH2 Лизин, лиз (,-диаминокапроновая кислота) 2. NH2CHCOOH (СН2)3 NH C = NH NH2 Аргинин, арг (-амино-- гуанидинвалериановая кислота) 3. NH2CHCOOH СН2 NH N Гистидин, гис (-амино--имидазол- 22 пропионовая кислота) Эти аминокислоты в радикалах имеют группы, способные принимать ион Н+. Такими группами служат: в радикале лизина аминогруппа, в радикале аргинина - гуанидиновая группа, в радикале гистидина - имидазольное кольцо. 1. NH2 C NH + NH2 положительно заряженная гуанидиновая группа радикала аргинина 2. NH + NH положительно заряженное имидазольное кольцо радикала гистидина 3. +NH3 - положительно заряженная аминогруппа радикала лизина. Все основные аминокислоты несут суммарный положительный заряд. Описанные аминокислоты обнаружены почти во всех белках и их называют с т а н д а р т н ы м и. Встраивание стандартных аминокислот в молекулу белка регулируется информацией генетического кода. Кроме стандартных существуют нестандартные аминокислоты, являющиеся компонентами лишь некоторых типов белков. Н е с т а н д а р т н ы е (редкие) а м и н о к и с л о т ы. Эти аминокислоты представляют собой производные некоторых стандартных аминокислот; образуются путем модификации соответствующих стандартных аминокислот после того, как они были включены в полипептидную цепь. В триплетном коде ДНК нет кодонов (троек нуклеотидов) для редких аминокислот. К таким аминокислотам относятся: оксипролин и оксилизин белка коллагена, десмозин и изодесмозин белка элластина и др. 1. НО COOH N Н Оксипролин 2. NH2 CH2 CHCH2 CH2 CHCOOH OH NH2 Оксилизин 23 Н е з а м е н и м ы е а м и н о к и с л о т ы. Растения и некоторые микроорганизмы могут синтезировать все аминокислоты, нужные им для построения клеточных белков. Животный организм способен синтезировать только около половины аминокислот, необходимых ему для построения белков своего тела. Эти аминокислоты получили название з а м е н и м ы е. Остальные десять протеиногенных аминокислот животные организмы синтезировать не могут и должны получать их с пищей. Эти аминокислоты называют нез а м е н и м ы м и или о б я з а т е л ь н ы м и. К ним принадлежат: валин, изолейцин, метионин, лейцин, лизин, треонин, триптофан, фенилаланин, аргинин и гистидин. Отсутствие или недостаток в пище каких-либо незаменимых аминокислот приводит к угрожающим жизни явлениям (задержка роста, расстройство биосинтеза белков, возникновение заболеваний и т.п.). Состав незаменимых аминокислот несколько различается для разных видов животных организмов. Глицин стимулирует рост цыплят и, по-видимому, является для них незаменимой аминокислотой. У жвачных животных биосинтез всех незаменимых аминокислот производится микроорганизмами пищеварительного тракта (в основном рубца), при этом в достаточном количестве необходимы соединения азота (аммонийные соли, мочевина). Взрослому человеку требуется восемь незаменимых аминокислот: валин, изолейцин, метионин, лейцин, лизин, треонин, триптофан, фенилаланин. Детям, кроме этих восьми аминокислот, необходимы еще аргинин и гистидин - эти аминокислоты назвали у с л о в н о н е з а м е н и м ы е. С понятиями заменимые и незаменимые аминокислоты связаны понятия п о л н о ц е н н ы е и н е п о л н о ц е н н ы е белки. Полноценными называют белки, содержащие все незаменимые аминокислоты. Белки, не содержащие хотя бы одну незаменимую аминокислоту, называют н е п о л н о ц е н н ы м и. Например, триптофан отсутствует в желатине, зеине кукурузы, белках яблок. Однако ни человек, ни животные не употребляют в пищу отдельные белки, а едят пищевые продукты, содержащие комплекс разных белков. На основании аминокислотного состава суммарного белка данного пищевого продукта можно говорить лишь о его меньшей или большей биологической ценности. Биологич 24 е с к а я ц е н н о с т ь б е л к а - это интегральный показатель, который определяется качеством (аминокислотным составом ) и количеством белка в рационе, переваримостью белка в желудочнокишечном тракте, скоростями всасывания аминокислот и последующим использованием их на нужды организма. Высокую биологическую ценность имеют белок куриного яйца и белок молока. Эти белки содержат незаменимые аминокислоты не только в достаточном количестве, но и в необходимом для человека соотношении. Если принять биологическую ценность белков молока или яйца (их называют идеальными белками) за 100%, то для белков мяса и рыбы она будет составлять в среднем 90-95%, белков клубней картофеля - 85%, белков бобовых культур - 75-85%, белков пшеницы и ячменя - 60 - 70 %. Низкая ценность многих белков связана с небольшим содержанием в них незаменимых аминокислот (главным образом лизина, метионина, триптофана и треонина). 2.2.4.2. Небелковые аминокислоты Из животных, растений и микроорганизмов выделено свыше 150 аминокислот, которые существуют в клетке в свободном или связанном виде, но никогда не обнаруживаются в составе белков. Многие из этих аминокислот участвуют в качестве промежуточных продуктов в различных реакциях обмена веществ или служат предшественниками других соединений. Приводим химическое строение некоторых из них: 1. СН2 СН2 СООН NH2 - аланин 2. СН2 СН2 СНСООН ОН NH2 Гомосерин 3. СН2 СН2 СНСООН SH NH2 Гомоцистеин 4. СН2 СН2 СН2СООН NH2 -Аминомасляная кислота 5. COOH N 6. NH2 C=O NH2CH2CH2CH2CHCOOH 25 NH2 H Пипеколиновая кислота Цитруллин 2.3. Строение и пространственная структура белковой молекулы 2.3.1. Химические связи в молекуле белка Многочисленными исследованиями установлено, что в молекуле белка имеются следующие типы связей: пептидные, дисульфидные, водородные, ионные (солевые), гидрофобное взаимодействие. П е п т и д н а я с в я з ь. Взаимодействие аминогруппы одной аминокислоты с карбоксильной группой другой сопровождается выделе-нием молекулы воды. Реакция, идущая с выделением воды, называется реакцией к о н д е н с а ц и и , а возникающая ковалентная азот-углеродная ( СО NH ) связь - п е п т и д н о й (амидной) связью: NH2CHCOOH + NH2CHCOOH NH2 CHCONHCHCOOH + H2 O R R1 R R1 Образование пептидной связи в белках происходит только за счет взаимодействия -аминогруппы и -карбоксильной группы аминокислот. Соединение, образованное в результате конденсации двух аминокислот, называют дипептидом. На одном конце его молекулы находится свободная -аминогруппа, а на другом свободная -карбоксильная группа. Благодаря этому к дипептиду можно присоединить еще одну аминокислоту и получить трипептид и т.д. Аминокислотные звенья, входящие в состав пептида называют а м и н о к и с л о т н ы м и остатками. Исследованиями Л.Полинга и Р.Кори было показано, что пептидная CN-связь имеет характер частично двойной связи (промежуточной между простой и двойной) и поэтому вокруг нее не может происходить свободного вращения. В результате чего все четыре атома пептидных групп лежат в одной плоскости, причем кислород СО-группы и водород NH-группы могут находиться относительно пептидной связи в цис- или транс-конфигурации, из которых только транс-конфигурация встречается в белках и природных пептидах: О O H 26 СN H транс-конфигурация C N цис-конфигурация Жесткий плоскостной (планарный) характер пептидных связей имеет важное значение для структуры белков. Д и с у л ь ф и д н а я с в я з ь. Эта прочная ковалентная связь образуется в результате окисления SH-групп двух, рядом расположенных радикалов цистеина: NHCHCO CH2 SH 2Н SH CH2 NHCHCO + 2Н NHCHCO CH2 S S CH2 NHCHCO Дисульфидные связи могут возникать как между разными полипептидными цепями, так и между различными участками одной и той же полипептидной цепи. В о д о р о д н а я с в я з ь. Это особый вид химической связи, в которой атом водорода, ковалентно связанный с одним из электроотрицательных атомов, образует дополнительную связь с соседним электроотрицательным атомом, имеющим направленную вдоль линии этой связи неподеленную пару электронов. В биологических системах электроотрицательными атомами, участвующими в образовании водородных связей, являются кислород и азот. Известно несколько типов водородных связей: ОН••••О=С = =NН••••О=С = ОН••••N = = NН••••О= ОН••••О= = NН••••N = 27 Различают межмолекулярные и внутримолекулярные водородные связи. И о н н а я (солевая) с в я з ь. При определенном значении рН ионизированная аминогруппа может взаимодействовать с ионизированной карбоксильной группой, в результате чего возникает и о н н а я или с о л е в а я связь: NH NH CHCH2CH2CH2CH2NH3 •••OOC CH2CH2CH CO CO остаток лизина остаток глутаминовой кислоты Эта связь образуется как между положительно заряженными группами радикалов аминокислот, так и NH2 и СООН - группами свободных концов полипептидных цепей. Ионные связи легко разрываются при изменении рН среды. Г и д р о ф о б н ы е в з а и м о д е й с т в и я. Это особый вид слабых межмолекулекулярных сил, действующих только между неполярными молекулами (и радикалами) и только в водной среде. Суть гидрофобного взамодействия состоит в том, что две или большее число неполярных групп (например, радикалы валина, лейцина, аланина), сближаясь друг с другом, могут образовывать такую неполярную фазу молекулярного масштаба, из которой вытеснены все молекулы воды (система старается быть сухой). Благодаря этому свобода движения сближенных неполярных групп (относительно друг друга) ограничена, они совершают движения вместе, как бы соединенные между собой связями. 2.3.2. Пептиды Аминокислоты, соединяясь друг с другом при помощи пептидных связей, образуют пептиды. По числу аминокислотных остатков, содержащихся в пептиде, различают ди- , три-, тетра-, ... нона-, декапептиды и т.д. Пептиды, в молекулах которых меньше 10 аминокислотных остатков, условно относят к о л и г о п е п т и д а м; 28 пептиды, построенные из большего числа аминокислотных остатков (до 50) - к п о л и п е п т и д а м. Названия отдельных пептидов составляют следующим образом: аминокислоты, карбоксильные группы которых участвуют в образовании пептидных связей, рассматриваются как ацильные радикалы и приобретают окончание “-ил” ; аминокислота, карбоксильная группа которой в реакции не участвует, сохраняет свое первоначальное название. Например, пептид, состоящий из остатков аланина, серина, глицина и CH3 NH2 CHCO NH CHCO NH CHCO NH CHCOOH CH2 OH CH2 SH цистеина носит название аланил-серил-глицил-цистеин (сокращенно: ала-сер-гли-цис). В формулах линейных пептидов аминокислота со свободной аминогруппой называется N-к о н ц е в а я амин о к и с л о т а; в горизонтально изображенной пептидной цепи она стоит слева. Аминокислота со свободной -карбоксильной группой обозначается как С-к о н ц е в а я а м и н о к и с л о т а. Пептиды различной длины могут быть получеиы при неполном гидролизе полипептидных цепей белков. Пептиды широко распространены в природе. Они присутствуют в живых организмах как свободные соединения, не связанные со структурой белков. Свободные пептиды обладают высокой биологической активностью. Многие из них служат гормонами (химические вещества, участвующие в регуляции обмена веществ и функционировании органов и тканей), некоторые представлениы сильнейшими ядами (яды змей, жаб, насекомых, высших грибов, микроорганизмов), антибиотиками (химические вещества, вырабатываемые одними микроорганизмами и “убивающие” другие микроорганизмы), регуляторами клеточного деления, регуляторами психической деятельности, переносчиками молекул и ионов через клеточные мембраны. 29 Отдельные из свободных пептидов содержат аминокислоты и связи, не встречающиеся в белках. Приведем несколько примеров. Г л у т а т и о н (-глутаминилцистеилглицин - -глу-цис-гли) внутриклеточный трипептид, обнаруженный в клетках животных, растений, в грибах и микроорганизмах. Его содержание особенно высоко в зародышах пшеницы и дрожжах. Глутатион состоит из остатков глутаминовой кислоты, цистеина и глицина: HOOCCHCH2 CH2 CO NH CH CO NH CH2 COOH NH2 CH2SH Приведенная формула соответствует так называемому восстановлен-ному глутатиону (SH-глутатион). В клетках наряду с восстановленным глутатионом всегда присутствует окисленный глутатион (-S-S-глутатион), состоящий из двух молекул восстановленного глутатиона, соединенных дисульфидной (-S-S-)связью, которая образовалась в результате отнятия от каждой SHгруппы по одному водороду: 2 Г SH 2Н SH - глутатион Г SS Г SS - глутатион Восстановление окисленного глутатиона происходит за счет источников водорода, вырабатываемых в процессе обмена веществ в организме. Глутатион - сильный внутриклеточный восстановитель и его основная функция состоит в том, чтобы защитить SH-группы белков от окисления и тем самым сохранить биологическую функцию белков. Глутатион выполняет специфическую роль при восстановлении пероксида водорода и аскорбиновой кислоты, служит небелковой группой отдельных белков - ферментов, играет определенную роль в транспорте аминокислот через мембрану клеток, активирует протеолитические ферменты. К а р н о з и н и а н с е р и н - имидазолсодержащие дипептиды, входящие в группу так называемых экстрактивных азотистых веществ скелетных мышц: N CH2CHCOOH N CH2CHCOOH 30 N H NH O=CCH2CH2NH2 Карнозин (-аланилL-гистидин) N СН3 NH O=CCH2CH2NH2 Ансерин(-аланил-L- метилгистидин) Биологическая функция этих дипептидов окончательно не выяснена, считают, что они способны восстанавливать работоспособность утомленных скелетных мышц. 2.3.3. Полипептидная теория строения белков Первая теория строения белковых веществ - т е о р и я про т е и н а - была предложена голландским химиком и врачам Г.Я.Мульдером в 1836 г. В последующие годы было предложено еще несколько разнообразных теорий строения белковых веществ, но лишь одна из них - п о л и п е п т и д н а я теория стр о е н и я б е л к о в - предложенная Э.Фишером в 1902г., выдержала испытание временем. Следует подчеркнуть, что одна из теорий строения белка - теория элементарных рядов была обоснована в 1888 - 91 гг. А.Я.Данилевским. По А.Я.Данилевскому белковая частица состоит из нескольких десятков цепей, названных “элементарными рядами”. Соединения этих рядов друг с другом может происходить с образованием связей двух типов : во-первых, в результате взаимодействия двух карбоксильных групп и , во-вторых, в результате взаимодействия амино- и карбоксигрупп. Элементарные ряды А.Я.Данилевского не являются аминокислотами . Допущенные возможности “полимеризации” элементарных рядов с образованием связи - NH- CO- послужило причиной того, что А.Я.Данилевского назвали предшественником Э.Фишера в открытии пептидной связи. Согласно пептидной теории основой структуры белковой молекулы признана полипептидная цепь. Эта цепь построена из нескольких десятков, а иногда и сотен остатков аминокислот, связанных между собой пептидными связями. В самой общей форме полипетидную цепь можно изобразить следующим образом: 31 R1 R3 NH2CHCONHCHCO NHCHCO............ NHCHCOОН R2 Rn Граница между полипептидами и белками проведена условно. К белкам относят полипептиды с молекулярной массой 6 тысяч и более и числом аминокислотных остатков свыше 50. Такой принцип деления основан на способности к диализу через природные мембраны. Характерной особенностью в строении полипептидной цепи является то, что атомы углерода и азота в ее остове (основе, хребте), составленном из вносимых -аминокислотами повторяющихся NHCHCO фрагментов, располагаются приблизительно в одной плоскости. Радикалы аминокислтных остатков направлены к этой плоскости под углом 109О28. При этом радикалы соседних аминокислтных остатков находятся в транс-положении. Любая полипептидная цепь (аналогично с пептидами) имеет Nконцевую и С-концевую аминокислоты. Разработаны методы определения Nи С-концевых аминокислот Это важно для установления числа полипептидных цепей, входящих в состав белковой молекулы. Полипептидная цепь, составляющая белок, не содержит разветвлений. Это связано с тем, что в белках пептидная связь образуется только за счет взаимодействия -аминогруппы одной аминокислоты и -карбоксильной группы другой аминокислоты. Белковая молекула может состять из одной или нескольких полипептидных цепей. Цепи могут быть соединены между собой ковалентными или нековалентными связями. Белки, состоящие из двух или нескольких полипептидных цепей, не связанных между собой ковалентными связями, называют олигоме р н ы м и. Отдельные полипептидные цепи в таких белках называют п р о т о м е р а м и; функционально активные части белка - с у б ъ е д и н и ц а м и. Радикалы аминокислтных остатков полипептидных цепей структурно и функционально многолики. Они могут быть маленькими (у глицина и аланина) или большими (у триптофана и лейцина), полярными и неполярными, заряженными и 32 незаряженными. В радикалах находятся аминные, карбоксильные, гидроксильные, фенольные, тиольные, дисульфидные, амидные, метильные, имидазольные и другие функциональные группы. К функциональным группам принадлежат концевые NН2 и СООНгруппы. Разнообразие функциональных групп обеспечивает белкам полифункциональные свойства (разнообразие реакций, в которых могут участвовать белки). Белковые молекулы - это не беспорядочно построенные различной длины полимеры. Каждый тип белка обладает особым, свойственным только ему химическим составом, определенной молекулярной массой и специфической последовательностью аминокислотных остатков. 2.3.4. Пространственная структура белковой молекулы Молекулы многих органических соединений могут принимать множество различных конформаций (пространственных укладок). Полипептидная цепь нативного белка (белка, сохранившего структуру присущую ему в живой клетке) в нормальных биологических условиях - обычная температура и нейтральные значения рН имеет, как правило, одну к о н ф о р м а ц и ю, называемую н а т и в н о й (натуральной, естественной). Эта нативная конформация достаточно устойчива. Если выделение белка производить осторожно, избегая воздействий, приводящих к развертыванию цепей, то выделенный белок может полностью сохранить свою биологическую активность. Стабильность нативной конформации обусловлена отсутствием свободного вращения вокруг пептидной СNсвязи в нативных белках. Универсальным методом для изучения пространственной организации белковой молекулы является рен т г е н о с т р у к т у р н ы й анализ. На основании рентгеноструктурного анализа и других методов исследования белков получили подтверждение выдвинутые , исходя из методических соображений, представления К.У.Лингстрема Ланга о существовании первичной, вторичной, третичной и ,введенной в 1958 г. Берналом, четвертичной структур белковой молекулы. Рассмотрим каждую из этих структур. П е р в и ч н а я с т р у к т у р а - это число и последовательность расположенния аминокислотных остатков, образующих полипептидную цепь белковой молекулы. Для 33 первичной структуры характерны только ковалентные связи (включая и дисульфидные мостики) и поэтому ее обозначают как ковалентную структуру. Белки отличаются друг от друга по первичной струтуре. Соединяя аминокислоты в различном порядке, можно получить почти бесконечное число последовательностей и , значит, почти бесконечное множество разнообразных белков. Например,для полипептида из 20 различных аминокислот, ни одна из которых не повторяется в нем дважды, число последовательностей составит 20! (читается “20 факториал”)= 20·19·18·... и т.д. до единицы, что дает цифру, равную примерно 2,43·1018. Полипептид, состоящий из 20 остатков разных аминокислот имеет молекулярную массу около 2600. Если рассматривать белок с молекулярной массой 34000, в котором 12 различных аминокислот представлены в разных соотношения, то получится 10300 возможных последовательностей. В вариантах для 20 аминокислот таких последовательностей будет намного больше. Аминокислтная последовательность является специфической характеристикой данного белка; она определяет его биологическую функцию. В свою очередь аминокислотная последовательность белка задана генетически, т.е. определяется только нуклеотидной последовательностью ДНК. В функционально гомологичных белках (белки, выполняющие одну и ту же функцию) организмов разных видов в определенных положениях полипептидных цепей содержатся одни и те же аминокислотные остатки; другие аминокислотные остатки при переходе от вида к виду могут изменяться. Например, первичная структура цитохрома С - белка, выполняющего роль переностчика электронов - изучена более чем у 60 видов. У всех этих видов его молекула состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 104 аминокислотных остатка. Из них 27 положений в полипептидной цепи заняты у всех видов одинаковыми аминокислотными остатками. В других положениях аминокислотные остатки варьируют в зависимости от различий между отдельными видами. Так, цитохромы С лошади и дрожжей различают по 48 аминокислотным остатакам, утки и курицы только по двум. Молекулы цитохрома С у индейки и курицы идентичны; также идентичны цитохромы С коровы, овцы и свиньи. Следовательно, первичная структура гомологичных белков 34 может быть применена в качестве критерия для установления родства между отдельными видами живых существ. Первичная структура белков - основа для определения более высоких уровней их пространственной организации. Первые исследования по выяснению аминокислотной последовательности в белках были выполнены в Кембриджском университете Ф.Сенгером. Первым белком, для которого была выяснена первичная структура, был гормон поджелудочной железы инсулин. Молекула инсулина имеет молекулярную массу 5733, состоит из двух полипептидных цепей (А-цепь - 21 аминокислотный остаток и В-цепь - 30 аминокислотных остатков), соединенных между собой двумя дисульфидными мостиками. Работа по выяснению первичной структуры инсулина заняла 13 лет (1943-1956 гг.). За исследование структуры белков, прежде всего инсулина, Ф.Сенгер в 1958г. был удостоен Нобелевской премии. В настоящее время известна первичная структура более 2000 белков. В ее расшифровке приняли участие ученые многих стран, в том числе и России. Большая часть работ по расшифровке первичной структуры белков автоматизирована. В т о р и ч н а я с т р у к т у р а - это способ укладки остова (стержня, хребта) полипептидной цепи без учета укладки радикалов. Она включает два различных типа регулярных структур, встречающихся во многих белках: спиральные структуры и структуры складчатого слоя (листа). Из спиральных структур признанной является -спираль (спираль Полинга и Кори). Она стабилизирована водородными связями, образованными между находящимися поблизости СО и NHгруппами пептидных связей данной полипептидной цепи. При этом кислород каждой СОгруппы образует водородную связь с водородом четвертой по ходу цепи NHгруппой. Благодаря спирали белковая молекула напоминает растянутую пружину (рис 2.1). Один виток спирали включает 3,6 остатка аминокислот (11 атомов полипептидной цепи), высота одного витка по оси (шаг спирали) равна 0,54 нм, вертикальный прирост, соответствующий одному аминокислотному остатку, составляет 0,15 нм; внутренний диаметр спирали равен 1,01 нм. Водородные связи приблизительно параллельны оси спирали. 35 Теоретически все СО- и NH-группы могут участвовать в образовании водородных связей, стабилизирующих -спираль. Однако степень спирализации белка сильно варьирует. Например, полипептидные цепи гемоглобина спирализованы на 75, инсулина на 60, рибонуклеазы - 57, лизоцина -42, пепсина - 30%. Наиболее часто в молекуле белка спирализованные участки полипептидной цепи чередуются с линейными. Это связано с тем, что дисульфидные связи и радикалы некоторых аминокислот (пролина, глицина,тирозина, аспарагина) нарушают спиральную структуру. Другой тип вторичной структуры - -структура (или структура складчатого листа) стабилизирован водородными связями, возникающими между СО- и NH-группами прилегающих друг к другу различных полипептидных цепей или различных участков одной и той же полипептидной цепи. Рис. 2.1. Структура -спирали. А. Показаны -атомы углерода. Соединяющая их линия описывает -спираль. Б. Часть -спирали в растянутом виде. Спираль стабилизирована водородными связями. В пространственном представлении -структура обнаруживает “плиссированность” (складчатость), причем радикалы аминокислотных остатков стоят попеременно с разных сторон складчатого листа (рис 2.2). В зависимости от взаимного положения атомов в разных цепях или участках одной цепи возможно существование двух типов складчатого листа. Если обе цепи направлены в одну сторону, такое расположение называют па 36 р а л л е л ь н ы м, если цепи направлены в противоположные стороны - а н т и п а р а л л е л ь н ы м. Рис 2.2. Структура складчатого листа. А. Показано расположение на листах атомов двух антипараллельных полипептидных цепей. Б. Схематическое изображение структуры складчатого листа. Водородные связи между СО- и NH-группами обозначены пунктиром. Исследования белков с известной первичной и вторичной структурами показали, что если на участке полипептидной цепи сгруппированы остатки аланина, гистидина, лейцина, метионина, метионина, то образуется -структура. Наличие в полипептидной цепи остатка пролина позволяет ей изгибаться и складываться “самой на себя”. Молекулы белков имеют присущий им тип вторичной структуры: для одних характерна -спираль (гемоглобин, миоглобин), для других - -структура (фиброин шелка, белок семян конавалии конавалин А), пептидные цепи третьих имеют участки постренные как в виде -спиралей, так и по типу -структур (гексокиназа, карбоксипептидаза, папаин, фосфоглицераткиназа и др.). Тр етична я с т р у к т у р а - это способ компактного расположения в пространстве всех атомов и групп полипептидной цепи, имеющей вторичную структуру. Эта структура трехмерна и характеризует конформацию молекулы белка в целом. В стабилизации третичной структуры участвуют водородные связи как между пептидными группами, так и радикалами аминокислотных остатков, ионные дисульфидные связи, гидрофобное взаимодействие и некоторые другие связи (рис 2.3). 37 Рис 2.3.Схема третичной структуры белка. 1.Водородные связи -структуры. 2.Водородные связи между R-группами аминокислотных остатков. 3. Водородные связи -спирали. 4. Гидрофобные взаимодействия. 5. Солевые (ионные) связи. 6. Дисульфидные связи. Важное значение в формировании третичной структуры белковой молекулы имеют последовательность аминокислотных остатков полипептидной цепи, размер, форма и полярность радикалов аминокислотных остатков. При формировании третичной структуры большая часть гидрофобных радикалов располагается внутри белковой молекулы; полярные (гидрофильные) радикалы находятся на ее поверхности, т.е. поверхность молекулы белка преимущественно гидрофильна. Анализ взаимодействия белков с другими молекулами, например липидами, позволили установить, что на гидрофильной поверхности молекулы белка имеются негидратированые (или мало гидратированные) участки, которые могут обусловливать взаимодействие с другими белками или с липидными участками мембран. Таким образом было установлено, что преимущественно гидрофильная поверхность белка содержит небольшие неполярные участки. 38 Третичная структура многих белков составлена из нескольких компактных фрагментов, называемых д о м е н а м и. Домены представляют собой структурную и функционально обособленные области молекулы белка, соединенные друг с другом вытянутыми короткими участками полипептидной цепи, называемыми ш а р н и р н ы м и участками (рис.2.4). Рис 2.4. Домены молекулы белка. А и Б - домены. Пунктиром обозначен участок полипептидной цепи, соединяющий между собой домены. Знаком “ “ обозначены участки с спиралью; знаком ““ - участки с -структурой. При обработке белков протеолитическими ферментами (протеазами) пептидные связи, расположенные в этих участках, ращепляются в первую очередь, тогда как отдельные домены могут быть достаточно устойчивы к протеолизу. Первыми белками, у которых была установлена третичная структура, являются миоглобин мышц кашалота и гемоглобин крови лошади.Молекула гемоглобина состоит из четырех полипептидных цепей, молекула миоглобина - из одной полипептидной цепи. Исследование по установлению структур гемоглобина проводил М.Перуц с сотрудниками с 1936 по 1959 гг; исследование по установлению пространственной структуры миоглобина - Д.Кендрю с сотрудниками с 1946 по 1957 гг. В 1962 г. М.Перуцу и Д.Кендрю 39 была присуждена Нобелевская премия по химии за исследование структуры глобулярных белков. Ч е т в е р т и ч н а я с т р у к т у р а. Белки, имеющие молекулярную массу более 50000 состоят из двух или нескольких отдельных полипептидных цепей и называются ол и г о м е р н ы м и. Ранее указывалось, что отдельные полипептидные цепи в таких белках называют п р о т о м е р а м и, а функциональные части с у б ъ е д и н и ц а м и. Субъединицы могут состоять из одной или более полипептидных цепей. Каждая из полипептидных цепей, образующих субъединицу, характеризуется своей первичной, вторичной и третичной структурами. Наиболее часто в составе олигомерных белков содержится 2 или 4 протомера, реже - от 6 до 12 или 24 и в редчайших случаях их число может быть нечетным. Между собой отдельные протомеры соединяются водородными, ионными, гидрофобными и другими нековалентыми связями. Способ совместной упаковки и укладки в пространстве полипептидных цепей олигомерного белка в его нативной конформации называют ч е т в е р т и ч н о й с т р у к т у р о й. Эта структура олигомерных белков определяется первичной структурой, входящих в их состав протомеров. Классическим примером белка, для которого методом рентгеноструктурного анализа М.Перуц и его сотрудники установили третичную и четвертичную структуры, является гемоглоби н. Молекула гемоглобина состоит из четырех полипептидных цепей двух -цепей (по 141 остатку) и двух -цепей (по 146 остатков аминокислот), каждая из которых связана с небелковым железосодержащим веществом - г е м о м ( рис 2.5). При образовании единой молекулы гемоглобина одинаковые цепи ( - и - ) мало соприкасаются и между ними осуществляется лишь ион-ионное взаимодействие конце-вых групп. В то же время между - и -цепями образуется большое число неполярных и водородных связей. При этом в образовании связей меж-ду 1 и 1 ( 2 и 2 ) димерами участвуют 34 боковых остатака, а между 1 и 2 ( 2 и 1) - лишь 19 остатков. 40 Рис.2.5.Схема строения гемоглобинаПрямоугольником обозначен гем. К настоящему времени выяснена четвертичная структура нескольких сотен белков. Молекулы белков, имеющие четвертичную структуру, при определенных условиях могут обратимо диссоциировать в растворе на субъединицы, которые в свою очередь расщепляются на отдельные протомеры. Например, тетрамер гемоглобина, состоящий из двух -цепей и двух -цепей, в растворе находится в равновесии с субъединицами и свободными цепями: 11 22 2 2 + 2 Свойства 11 и 22 димеров гемоглобина идентичны. Многие олигомерные белки наделены способностью к самосборке, т.е. способны восстанавливаться из отдельных полипептидных цепей; легко происходит, например, самосборка гемоглобина из смеси - и -цепей. Это обстоятельство доказывает, что порядок чередования остатков аминокислот в полипептидной цепи олигомерного белка определяет не только третичную структуру, но и геометрическую форму контактных участков , с котрыми соединяются контактные участки других специфических протомеров. Таким образом, первичная структура полипептидной ценпи содержит информацию о вторичной , третичной и четвертичной структурах. То обстоятельство, что крупные молекулы белков состоят обычно из нескольких полипептидных цепей, а не из одной очень длинной цепи, дает ряд преимуществ: при их биосинтезе требуется 41 значительно меньшая генетическая информация (меньший участок структурного гена ДНК), чем при большой одноцепочечной молекуле; сводятся к минимуму появления случайных ошибок при их биосинтезе, становятся возможными регуляторные взаимодействия. 2.4. Физико-химичекие свойства белков 2.4.1. Молекулярная масса белков. Размеры молекул белка Молекулярные массы белков колеблются от 6 000 (условно принятый нижний предел) до 1 000 000 и выше: Белок Молекулярная масса Инсулин бычий 5733 Рибонуклеаза поджелудочной железы 12600 -Казеин 24000 Глиадин пшеницы 27500 Пепсин 35500 Альбумин яиц 45000 Зеин кукурузы 50000 Гемоглобин лошади 65000 Гексокиназа из дрожжей 96000 Белок Молекулярная масса -Глобулин человека 160000 Каталаза 250000 Эдестин семян конопли 310000 Уреаза семян сои 480000 Глутаматдегидрогеназа печени быка 1000000 Синтаза жирных кислот из дрожжей 2300000 Пируватдегидрогеназный комплекс 4600000 Вирус табачной мозаики (ВТМ) 40600000 Молекулярные массы белков определяют с помощью специальных методов: по скорости осаждения в центробежном поле, по скорости диффузии белков в растворителе, по осмотическому давлению, на основании рентгеноструктурного анализа и др. Для примера рассмотрим некоторые из этих методов. Определение молекулярной массы белка по скорости осаждения в центробежном поле проводят в аналитических ультрацентрифугах. В этом аппарате можно создать центробежные ускорения (g) в десятки и сотни тысяч раз превышаюшие ускорение земного 42 притяжения. Под действием таких центробежных полей, противодействующих диффузионным силам, происходит осаждение (с е д и м е н т а ц и я) белковых молекул. В результате осаждения между свободной от молекул белка областью растворителя, и содержащей их , образуется граница раздела (с е д и м е н - т а ц и о н н а я г р а н и ц а). Перемещение этой границы в процессе ультрацентрифугирования регистрируют через определенные промежутки времени с помощью специальной оптической системы, встроенной в ультрацентрифугу. Скорость седиментации, выражаемая через коэффициент седиментации (S), зависит как от массы, так и от формы частицы: dx/ dt S = , w2 x где х - расстояние от оси вращения до седиментационной границы,см; w -угловая скорость ротора, рад·с–1 ; t - время в секундах. Значения коэффициентов седиментации для белков лежат в пределах от 1·10–13 до 200·10–13с. Величина коэффициента седиментации, равная 1·10–13 принята за единицу, называемую с в е д б е р г о м (S). Таким образом, коэффициент седиментации 12 S равен 12·10–13с. На основании коэффициента седиментации по уравнению Сведберга рассчитывают молекулярную массу белков. С увеличением молекулярной массы коэффициент седиментации увеличивается, однако прямой пропорциональности при этом не наблюдается. Первая ультрацентрифуга с оптической приставкой, позволяющей наблюдать и фотографировать процесс седиментации частиц была сконструирована шведским физко-химиком Т.Сведбергом в 1922 г. Делая 10тыс. оборотов ротора в минуту эта центрифуга создавала центробежное ускорение, превышающее ускорение силы тяжести в 5000 раз. В последние годы широкое распространение получил гел ь ф и л ь т р а ц и о н н ы й метод определения молекулярной массы белков. Этот метод применяют в двух вариантах: к о л о н о ч н а я гельфильтрация (колонку заполняют пористым гелем, например сефадексом) и т о н к о с л о й н а я гельфильтрация, или 43 тонкослойная хроматография (пористый гель тонким слоем наносят на твердую подложку). При колоночном варианте строят калибровочный график зависимости lg M (М - молекулярная масса) от Ve / Vo, где Ve - объем растворителя, необходимый для элюирования (извлечения) интересующего белка; Vo- объем растворителя, требуемый для элюирования соединения, непроникающего в неподвижную фазу (например, голубой декстран). Калибровочный график строят по 5 - 6 стандартным белкам с различной молекулярной массой (белки -маркеры). Затем, определив отношение Ve / Vo для исследуемого белка, находят по калибровочному графику его молекулярную массу. При тонкослойной хроматографии молекулярную массу исследуемого белка находят по калибровочному графику зависимости lg M от длин пробега (в мм) белков-маркеров за определенное время. Некоторое распространение имеет х и м и ч е с к и й метод. Сущность его заключается в том, что определяют в составе белка массовую долю характерного для него химического элемента или аминокислоты. Затем проводят расчет минимальной молекулярной массы (Мmin ), исходя из того, что в молекуле белка содержится один атом этого элемента или один аминокислотный остаток. Например, гемоглобин содержит 0,335% железа (атомная масса железа 55,8). Минимальная молекулярная масса гемоглобина, рассчитанная по формуле: атомная масса элемента Мmin = · 100 массовая доля элемента в белке, % равна 16700. В молекуле гемоглобина имеется четыре атома железа и истинная молекулярная масса гемоглобина составит 4·16700 = 66800. Эта величина очень близка к молекулярной массе гемоглобина, определенной по скорости седиментации в ультрацентрифуге. Подобным образом может быть рассчитана минимальная молекулярная масса, исходя из содержания остатков аминокислот, присутствующих в белке в небольших количествах. Следует отметить, что величины молекулярных масс белков, определенные различными методами имеют близкие значения (расхождения в несколько сотен и тысяч допустимы). Например, 44 определение различными методами молекулярной массы белка молока -лактоглобулина дало следующие результаты: Диффузия 38000 Скорость седиментации 41500 Рентгеноструктурный анализ 33000 - 35000 Осмотическое давление 35050 Молекулярную массу белков с выясненной первичной структурой можно рассчитать с высокой точностью. Белки относят к высокомолекулярным соединениям, так как их молекулярные массы колеблются от нескольких тысяч до миллионов. Размеры молекул белков составляют 1- 100 нм и соответствуют размерам частиц высокодисперсных систем. Молекулы белков вследствие необычайно больших размеров называют макромолекулами. 2.4.2. Амфотерные свойства и изоэлектрическая точка белков Макромолекулы белков несут на своей поверхности большое количество карбоксильных и аминных групп, что придает им свойства амфотерных полиэлектролитов. Карбоксильные группы, способные к диссоциации с образованием протонов (Н+), определяют кислотные свойства молекулы белка; аминогруппы, способные присоединять протоны, определяют ее основные свойства. Соотношение между количеством кислых и основных группировок варьирует у различных белков. Белки, в которых преобладают кислые группировки, имеют при рН 7 (или близких к 7) суммарный отрицательный заряд и их называют кислыми; белки, в которых преобладают основные группировки, имеют при указанных значениях рН положительный заряд и их называют основными. В живых организмах преобладают кислые белки. В растворе молекулы белков могут менять свой заряд в зависимости от рН среды: + + NH3 NH3 +H+ ООС COO HOOC COO O + NH3 + H+ HOOC COOH + 45 при рН 7 при снижении рН + + ООС NH2 + + OH NH3 ООС H2O при рН 7 O NH3 NH2 + ООС NH2 +OH NH3 H2O при увеличении рН Следовательно, изменяя рН среды добавлением кислот или щелочей, можно не только уравнять положительные и отрицательные заряды на поверхности молекулы белка, но и усилить один из них или изменить на противоположный. В кислой среде молекулы белка приобретают положительный заряд и в поле постоянного электрического тока движутся к катоду; в щелочной среде они приобретают отрицательный заряд и в поле постоянного электирческого тока движутся к аноду. Передвижение заряженных растворенных частиц в поле постоянного электрического тока получило название э л е к т р о ф о р е з а (“движение посредством электрического поля”). Для каждого белка (равно пептида и аминокислоты) существует рН при котором положительные и отрицательные заряды в молекуле белка уравновешиваются и суммарный заряд ее становится равным нулю. Такая молекула теряет подвижность в электрическом поле. Величина рН, при котором молекула белка не несет суммарного заряда и не движется в электрическом поле, называется и з о э л е к т р и ч е с к о й т о ч к о й (ИЭТ) и обозначается рН J; это одна из характерных констант белков. Приводим рНJ некоторых белков: Пепсин 1,0 Гемоглобин 6,8 Глиадин пшеницы 4,0 Миоглобин 7,0 Глобулин моркови 4,4 Уреаза бобов 7,9 Казеин 4,7 Рибонуклеаза 9,4 Желатин 4,9 Лизоцим 11,0 Значение рНJ белка определяется соотношением свободных кислых и основных групп в его молекуле. Для кислых белков рНJ будет ниже 7, для основных - выше 7. В изоэлектрической точке белок обладает наименьшей растворимостью, легко выпадает в осадок, растворы его менее вязки. 46 Эти явления можно объяснить отсутствием электростатического отталкивания между молекулами белка. 2.4.3. Растворимость и осаждаемость белков Подавляющее большинство белков обладает гидрофильными свойствами, т.е. способностью легко взаимодействовать с молекулами воды. Гидрофильность белков обусловлена полярными заряженными и полярными незаряженными группами, расположенными на поверхности их молекул. Полярными заряженными группами в молекуле белка являются радикалы лизина, гистидина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот; полярными незаряженными - радикалы серина, треонина, тирозина, цистеина, аспарагина, глутамина и др. Гидрофильные вещества легко растворяются в воде и водных растворах. Растворимость белков в растворителях неодинакова и зависит от многих факторов: природы, состава и рН растворителя, ионной силы и температуры раствора, структурных особенностей молекулы данного белка и других факторов. В результате чего одни белки хорошо растворимы в воде, другие - в водных растворах нейтральных солей, третьи - в слабых растворах кислот или щелочей, четвертые в смеси воды и органических растворителей (например, этанола или ацетона). В большинстве чистых органических растворителей белки не растворяются. Среди белков есть и нерастворимые во всех перечисленных растворителях. Это связано с особенностью их структуры. Большое значение для растворимости белка имеет ионная сила раствора ( в частности, концентрация электролита). При низких ионных силах растворимость белка увеличивается, а при высоких уменьшается. Зависимость раствримости большинства белков от рН при данной ионной силе описывается U -образной кривой с минимумом растворимости вблизи изоэлектрической точки и увеличенной растворимостью при значениях рН меньше и больше изоэлектрической точки. С повышение температуры до определенной величины (например, от 0 до 25 - 40О С) растворимость большинства белков повышается ( это правило имеет исключение). При растворении белков в воде и водных растворах происходит гидратация каждой белковой молекулы, т.е. взаимодействие полярных групп белка с водой. При этом например, -СО-NH- 47 группы связывают по одной молекуле воды, карбоксильные группы по четыре молекулы воды, аминогруппы - по одной молекуле воды. В результате гидратации вокруг заряженных молекул белка образуется электрозаряженный водный слой (гидратная оболочка), состоящая из молекул воды, ориентированных по отношению к молекуле белка строго определенным образом: Чем дальше молекулы воды удалены от поверхности молекулы белка, тем беспорядочнее их расположение в растворе. Вокруг электронейтральных молекул белка гидратная оболочка не образуется. Гидратная оболочка препятствует агрегации белковых частиц и тем самым способствует устойчивсти раствора белка. Таким образом, заряд и гидратная оболочка являются важными факторами, обусловливающими устойчивость белковых растворов. Вода, входящая в состав гидратной оболочки обладает специфическими свойствами ( не растворяет солей и сахаров, замерзает при температуре ниже 0О С и др.) и называется свя з а н н о й, или с т р у к т у р и р о в а н н о й водой. При осаждении белков необходимо устранить факторы, обусловливающие устойчивость их растворов, т.е. разрушить гидратную оболочку и снять электрический заряд. Разрушить гидратную оболочку можно прибавлением к раствору белка достаточно больших количеств водоотни м а ю щ и х (дегидратирующих) веществ, таких как этанол, ацетон, сульфат аммония, нейтральные соли. При добавлении этих веществ к раствору белка происходит значительное связывание воды, что приводит к разрушению гидратной оболочки вокруг молекул белка 48 и, затем, к слипанию последних в более крупные частицы, выпадающие из раствора в осадок. После удаления водоотнимающих веществ белковый осадок в большинстве случаев может быть растворен в первоначальном растворителе (воде, разбавленных растворах нейтральных солей и т.п.). Осаждение белка из раствора при добавлении нейтральных солей и сульфата аммония называют в ы с а л и в а н и е м . Осаждающая способность нейтральной соли зависит как от катиона,так и от аниона. Катионы и анионы по уменьшающейся слева направо осаждающей способности можно разместить в следующие два ряда: Катионы: Cs+, Rb+ , K+, Na+, Li+, Ba+, Sr+, Ca+, Mg+; Анионы: SO4, Cl, Br , NO3, J, CNS. Эти ряды носят название л и о т р о п н ы х р я д о в. Разные белки высаливаются при неодинаковых концентрациях нейтральных солей. Это свойство широко используют для разделения смеси белков. Электрический заряд можно снять добавлением к раствору белка кислоты или щелочи до рН, равной изоэлектрической точке растворенного белка. Как указывалось выше в изоэлектрической точке отсутствует электростатическое отталкивание между молекулами белка и они легко выпадают в осадок. Поскольку разные белки имеют разные изоэлектрические точки, то их можно отделить друг от друга путем осаждения в изоэлектрической точке. Наиболее полное осаждение белка может быть достигнуто путем разрушения гидратной оболочки и снятия электрического заряда. Перед проведением некоторых исследований (определение сахаров, аминокислот и других низкомолекулярных соединений) возникает необходимость освободить жидкость (молоко, кровь, вытяжку из тканей) от присутствия белка. Для этих целей часто используют трихлоруксусную, сульфосалициловую или хлорную кислоты, которые образуют с белками кислотонерастворимые соли. Такими же осадителями белков являются вольфрамовая, фосфовольфрамовая и метафосфорная кислоты. Белки можно осадить также с помощью катионов тяжелых металлов [ Zn(ll), Pb(ll), Cu(ll) и др.). 2.4.4. Коллоидные свойства белков 49 Растворы белков обладают свойствами как истиных, так и коллоидных растворов. Это связано с тем, что белки в растворе диспергированы до единичных молекул, но, вследствие большой молекулярной массы и связанного с ней большого размера частиц (1 100 нм), растворы белков имеют коллоидный характер. Растворы белка, в связи с коллоидным характером, рассеивают свет (явление Тиндаля), характеризуются высокой вязкостью, при определенных условиях могут терять текучесть и образовывать г е л и, или с т у д н и (студни, сформированные из молекул белков, рассматривают как частную форму гелей). Гели образуются в результате объединения молекул белка в виде сетчатого каркаса, внутренне пространство которого заполенео большим количеством растворителя (обычно водой). Вода в гелях может находиться в двух состояниях: связанном и свободном. Связанная вода входит в состав гидратной оболочки молекулы белка; свободная - механически (подобно впитывания в губку) включена в каркас геля. Полагают, что в ряде тканей животных и растений белки находятся как в виде растворов, так и гелей (протоплазма клеток, хрусталик глаза, соединительная ткань и др.). При подготовке растений к зиме происходит переход части белков из растворенного состояния в гелеобразное. При старении гели сжимаются и выделяют воду. Этот процесс получил название с и н е р е з и с а. Его можно наблюдать при стоянии простокваши и кефира. Высушенный гель способен впитывать в больших количествах воду, что сопровождается увеличением его объема и сильным повышением давления в нем. Впитывание воды гелем называют н а б у х а н и е м. Степень набухания (относительное увеличение массы) белка может достигать 200%. Набухание сопровождает жизнедеятельность всех растительных и животных организмов (прорастание семян, регуляция обмена воды и др.). Оно имеет важное значение при изготовлении теста, для облегчения разрушения зерна при помоле (гидротермическая обработка зерна), при выделке кожи, меха и др. процессах. Молекулы белка вследствие большого размера медленно диффундируют в растворе в направлении более низкой концентрации и неспособны проникать через поры искусственных мембран из целлофана, коллодия, пергамента, а также большинства мембран 50 клеток растений и животных. В то же время молекулы низкомолекулярных веществ (вода, этанол, соли, аминокислоты, сахара и т.п.) свободно проходят через такие мембраны. Целлофановые мембраны часто используют для удаления растворенных низкомолекулярных веществ из растворов, содержащих белки. Этот метод очистки растворов белка от низкомолекулярных веществ называют д и а л и з о м. Мембраны, которые пропускают малые молекулы, но задерживают большие, называют п о л у п р о н и ц а е м ы м и. В настоящее время прием диализа широко используют для концен-трирования белковых растворов (например, молока) методом у л ь т р а ф и л ь т р а ц и и. Принцип этого метода состоит в том, что полупроницаемую мембрану с калиброванным отверстием, укрепленную на поддерживающем слое с губчатой структурой, вставляют в специальное устройство. Прохождение жидкости через мембрану в этом устройстве происходит либо посредством снижения давления, чтобы “отсосать” воду, либо,чаще, под давлением. Белки способны образовывать п е н у. Это их свойство широко используют в пищевой промышленности (приготовление пастилы, безе, зефира, хлеба и т.п.). 2.4.5. Денатурация белков Под денатурацией понимают вызванную различными физическими и химическими факторами утрату молекулой белка присущей ей нативной конформации. Денатурация - характерное свойство белков. При денатурации происходит разрыв нековалентных (в первую очередь водородных) связей в молекуле белка, что сопровождается нарушением четвертичной, третичной и частично вторичной структур белка без каких-либо изменений первичной структуры. Разрыв нековалентных связей приводит к тому, что компактная молекула белка превращается в беспорядочный клубок (рис 2.6). ——— А Рис 2.6. Схема денатурации белка Б 51 А - нативная молекула Б- беспорядочный клубок Денатурация белковых молекул сопровождается потерей ими биологической активности (способности выполнять свойственную функцию) и изменением многих физико-химических свойств: уменьшением (и даже потерей) растворимости, способности кристаллизоваться, водопоглотительной способности и способности к набуханию, смещением изоэлектрической точки и константы седиментации, повышением вязкости, увеличением поглощения света в ультрафиолетовой области и др. Из химических соединений денатурацию вызывают кислоты и щелочи (при рН ниже 3 и выше 10-11), этанол и ацетон при продолжительном воздействии, мочевина, гуанидинхлорид, ионы тяжелых металлов, йода, тиоцианата, поверхностно-активные вещества (додецилсульфат), дубильные вещества (танин) и др. Механизм денатурирующего воздействия различных химических веществ окончательно не выяснен и в настоящее время излагается, исходя из их строения и свойств. Например, мочевина и гуанидинхлорид разрывают в молекуле белка водородные связи, органические растворители нарушают гидрофобные взаимодействия, ионы тяжелых металлов образуют с белками труднорастворимые соединения. Способность белков осаждаться ионами тяжелых металлов используют в медицинской практике; при отравлении солями тяжелых металлов, например ртути, больному дают большое количество яичного белка или молока и, тем самым, связывают ионы тяжелого металла. Следует отметить, что некоторые белки довольно устойчивы к денатурации при крайних значениях рН. Например, гистоны, протамины и лизоцим не денатурируют при рН 2 и рН 10, а у пепсина при рН 1,5 - 2,5 наблюдается максимальная активность. Из физических факторов денатурацию вызывают сильное перемешивание или встряхивание. высокое давление - 500-1000 Мпа, высушивание, нагревание, активное вспенивание растворов белка, ультрафиолетовое, рентгеновское и радиактивное облучение, обработка ультразвуком и др. Наиболее распространенным фактором денатурации является нагревание. Этот прием широко используют в пищевой промышленности. Важное значение при тепловой денатурации белка 52 имеет вода. Например, в водн ых растворах белки денатурируют при нагревании выше 50-60ОС; обезвоженный белок не денатурирует при нагревании до 100ОС. Существуют многочисленные данные о том, что у термофильных микроорганизмов большинство белков обладает повышенной устойчивостью к нагреванию (при 60ОС белки этих микроорганизмов не денатурируют). При нагревании происходит агрегация и выпадение белков в осадок. Однако, этот факт представляет собой вторичное явление, так как в выпадении денатурированного при нагревании белка в осадок важную роль играют соли и рН среды. В сильно кислых (за исключением азотной, трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот) и сильно щелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, что связано с приобретением частицами белка заряда. Наиболее полное и быстрое осаждение белка происходит в изоэлектрической точке. Денатурация белков имеет большое значение и в явлениях жизни. Так, по мере старения организма происходит постепенная, хотя и очень медленная денатурация белков, сопровождаемая снижением их гидрофильности. Примером такой денатурации служит старение семян. При длительном хранении, даже в благоприятных условиях, происходит уменьшение гидрофильности белков семян и, как следствие, снижается интенсивность прорастания. При переработке сырья животного и растительного происхождения в продукт в одних случаях необходимо создать условия, способствующие денатурации белков, в других предотвратить этот процесс. Денатурация белков имеет важное значение при изготовлении консервов, выделке кожи и меха, выпечке хлеба и кондитерских изделий, при сушке макарон и овощей, приготовлении пищи и т.п. Это повышает срок хранения, качество и ценность готового продукта. Кроме того, денатурированные белки легче расщепляются под влиянием протеолитических ферментов, чем нативные. П ри получении биологически активных препаратов ( ферментов, гормонов и т.п.) процесс денатурации необходимо предотвратить. С этой целью часто применяют сахара, глицерин, органические анионы (например, капроновой кислоты). Денатурация белка не происходит при быстром замораживании тканей животных и растений (например, 53 в жидком азоте). Не вызывают денатурацию этанол и ацетон при низких температурах; эти вещества часто используют при получении некоторых ферментных препаратов. Важным приемом в получении биологических препаратов и чистых белков является л и о ф и л ь н а я сушка (высушивание в вакууме из замороженного состояния). Высушенные этим способом белки можно хранить при комнатной температуре в течение длительного времени без потери нативных свойств. Денатурация в большинстве случаев - процесс необратимый, однако известны случаи обратимой денатурации белков, называемой р е н а т у р а ц и е й. Например, денатурация под действием мочевины и хлористого гуанидина может иметь обратимый характер, но это бывает лишь на первых этапах, вслед за обратимой фазой процесса наступают более глубокие необратимые изменения. 2.4.6. Химические реакции, характерные для белков. Оптические свойства белков Для белков наиболее характерны - цветные реакции и реакции осаждения. Из цветных реакций важнейшими являются биуретовая, нингидриновая, ксантопротеиновая и некоторые другие. Биуретовая реакция обусловлена наличием пептидных связей, образущих в щелочной среде с ионами двухвалентной меди комплекс, окрашенный в фиолетовый или красно-фиолетовый цвет. Нингидриновая реакция обусловлена наличием в белках аминных групп, образующих при нагревании с нингидрином соединение, окрашенное в сине-фиолетовый цвет. Ксантопротеиновая реакция заключается в том, что при нагревании раствора белка с концентрированной азотной кислотой появляется желтое окрашивание, обусловленное наличием в молекуле белка радикалов аминокислот, содержащих бензольное кольцо. Из реакций осаждения часто пользуются получением осадка при действии на раствор белка так называемых белковых осадителей: растворов трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот, таннина, ацетата свинца, вольфрамата натрия, гидроксида меди. Белки можно осадить при нагревании их нейтральных или слабокислых растворов. 54 Наиболее полно цветные реакции на белки и реакции осаждения белков изложены в руководствах к лабораторным занятиям по биохимсии. Растворы белков обладают способностью поглощать ультрафиолетовый свет (УФ-свет) в трех областях: вблизи 190, при 210-250 и более 250 нм. Поглощение УФ-света при длинах волн более 250нм с максимумом при 280нм обусловлено радикалами триптофана, тирозина и, в меньшей степени, фенилаланина. Это свойство белков используют для их количественного определения методом с п е к т р о- ф о т о м е т р и и. Поскольку число остатков ароматических аминокислот в одной и той же массе разных белков варьирует в широких пределах, метод не является точным. При работе с белками условно принимают, что одна единица оптической плотности при 280 нм соответствует массовой концентрации белка, равной приблизительно 1мг/мл ( при толщине слоя жидкости 1 см). На основании этого делают расчет. Метод прост и быстр в исполнении, поэтому, несмотря на недостаточную точность его широко применяют при работе с индивидуальными белками. 2.5. Выделение белков из биологических объектов. Очистка белков Выделение белков из биологического материала (семян, листьев, плодов, корней, органов и тканей животных и т.п.) представляет собой сложный и трудный процесс, так как при внешних воздействиях белки легко теряют свои природные, присущие им в естественном состоянии нативные свойства (растворимость, биологическую активность и др.) и переходят в денатурированное состояние. Чтобы избежать денатурации белка в процессе его выделения все операции проводят при температуре около 4 ОС и стараются избегать экстремальных значений рН, хотя известны и исключения. Перед выделением белка исходный биологический материал тщательно измельчают, добиваясь максимального разрушения не только тканей, но и клеток. Для измельчения используют специальные валковые или шаровые мельницы, в которых исходный материал многократно продавливается между тесно сближенными валками или разрушается непрерывно сталкивающимися шарами. С этой целью широко применяют гомогенизаторы, в которых материал либо измельчается специальными ножами, вращающимися с 55 огромной скоростью (6000 обмин и более), либо растирается между пришлифованными стенками цилиндра и тефлонового пестика, либо в замороженном состоянии продавливается через фильеры специального пресса. В крайнем случае биологический материал можно разрушить растиранием в ступке с кварцевым песком или стеклом. После измельчения материала переходят к следующему этапу - э к с т р а г и р о в а н и ю белков тем или иным растворителем. В качестве растворителей используют воду, растворы нейтральных солей с небольшой ионной силой, буферные смеси (боратные, цитратные, ацетатные и т.п.), спиртово-солевые смеси, глицерин. Многие белки в клетке находятся в ассоциированном состоянии с другими веществами (углеводами, липидами и др.) или клеточными структурами. Для лучшей солюблизации таких белков применяют слабые растворы детергентов (додецилсульфата натрия, дезоксихолата натрия, тритона Х-100), а также неполярных растворителей, например ацетона или эфира, удаляющих липиды, или бутанола, разрушающего клеточные структуры. В результате экстракции, как правило, получают смесь различных белков. Разделение смеси на фракции (группы белков) может быть достигнуто за счет изменения условий, влияющих на растворимость: концентрации солей, рН, концентрации органического растворителя (этанола, ацетона). Часто эффективным для осаждения оказывается ступенчатое увеличение концентрации сульфата аммония (в полунасыщенном растворе сульфата аммония осаждаются одни белки, в насыщенном - другие). Осаждение белков этанолом и ацетоном необходимо, во избежание денатурации, проводить при температуре минус 3 ÷ 5ОС. Дальнейшее разделение и очистку белковых осадков проводят по сехмам , специально разработранным для отдельных белков или групп гомологичных белков. Среди методов разделения наибольшее распространение получили ультрацетрифугирование, различные виды электрофореза и хроматографии. При ультрацентрифугировании сначала осаждаются более тяжелые молекулы, затем менее тяжелые, т.е. в ультрацентрифуге можно разделить белки, различающиеся по молекулярной массе. 56 Метод электрофореза основан на способности различных белков перемещаться в электрическом поле со скоростью, зависящей от величины их зарядов при данном рН и ионной силе раствора. Электрофоретическое разделение белка производят при нескольких значениях рН, так как установлено, что при одном рН препарат белка ведет себя как однородное вещество, то при другом рН этот же препарат может быть неоднородным. Электрофоретическое разделение белков можно проводить в растворе или на различных поддерживающих средах (носителях) фильтровальной бумаге, гелях крахмала, агар-агара и полакриламида. Твердые носители имеют высокую разрешающую способность. Так, при разделении белков сыворотки крови человека посредством электрофореза на бумаге наблюдают 6 функций, в крахмальном геле 10, а в полиакриламидном геле 16 фракций. Белки на электрофореграммах выявляют с помощью красителей, например амидового черного (амидолшварц 10 В). Наиболее тонкой и современной разновидностью электрофореза является и з о э л е к т р и ч е с к а я э л е к т р о ф о к у с и р о в к а, позволяющая разделить белки, отличающиеся изоэлектрическими точками на 0,02 рН. Градиент рН при этом виде электрофореза создается посредством а м ф о л и н о в полиаминополикарбоновых кислот, синтезированных специально для этих целей. Хроматографический метод разделения заключается в пропускании смеси белков через колонку, заполненную адсорбентом. В качестве адсорбента применяют фосфат кальция, гидроксилапатит, производные целлюлозы (диэтиламиноэтилцеллюлоза, триэтиламиноэтилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза) и другие носители. Особенно хорошие рзультаты дает а ф ф и н н а я х р о м а т о г р а ф и я на колонках, заполненных носителем, избирательно адсорбирующим определенный белок. Например, -амилазу можно выделить из смеси белков на колонке, заполненной крахмалом. В настоящее время широкое применение в биохимии получила хроматография, основанная на принципе молекулярных сит (г е л ьф и л ь т р а ц и я). При этом методе хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого геля, чаще всего с е ф а д е к с а. Сефадекс получают путем обработки эпихлоргидрином 57 глицерина полисахарида д е к с т р а н а, в результате чего из молекул этих соединений формируется пористая структура (молеклярное сито). При пропускании через такую колонку смеси низкомолекулярных и высокомолекулярных белков происходит разделение в зависимости от величины молекул. Молекулы, размер которых меньше размера пор, легко проникают внутрь гранул сефадекса и , вследствие этого , движутся по колонке с меньшей скоростью; молекулы, размер которых превышает размер пор, движутся в пространстве между гранулами сефадекса и выходят из колонки первыми. Гель-фильтрация дает хорошие результаты при очистке белка от низкомолекулярных примесей, например солей. С этой целью используют сефадексы с самым малым размером пор (например, G25). Очистку белков от низкомолекулярных соединений можно производить и методом диализа. При определении степени чистоты выделенного белка следует при-менять методы, основанные на рзличных свойствах молекулы, таких как размер, заряд, растворимость и т.д. Важным методом исследования однородности белков считается метод, основанный на изучении их поведения при растворении и на построении кривых растворимости. Выделенный и очищенный белок должен храниться при низкой температуре. Чаще всего белки хранят в высушенном состоянии; сушку производят под высоким вакуумом из замороженного состояния (лиофилизация). 2.6. Номенклатура и классификация белков К настоящему времени из животных и растительных организмов выделено большое количество самых разнообразных белков, что требует создания определнной системы в их номенклатуре и классификации. Однако попытки создать строгую номенклатуру и четкую классификацию белков на какой-либо единой основе встречают некоторые затруднения. Это трудности обусловлены сложностью строения белковых молекул, огромным разнообразием их функций и свойств; близкие по строению белки могут существовенно отличаться друг от друга по свойствам и функциям. 58 Названия белкам дают по различным признакам: латинскому названию объекта, из которого выделен белок, химическому составу белка, выполняемой функции и т.п. Например, название авидин белок яиц - происходит от латинского слова avis -птица; оризин белок риса - от oryza - рис; авенин - белок овса - от avena - овес; гордеин - белок ячменя - от hоrdeum - ячмень и т.д. На основании химического состава и функций названы: ферритин - белок тканей животных и зеленых растений, содержащий железо; трансферрин белок животных тканей, участвующий в транспорте железа; церулоплазмин - белок крови, содержащий медь и участвующий в ее обмене и др. В основу классификации белков положено несколько подходов, а именно различие в форме их молекул, различие в функциях, различие в структуре, различие в химическом составе. В зависимости от формы молекул белки делят на глобулярные (шаровидные) и фибриллярные (нитевидные). Г л о б у л я р н ы е белки характеризуются тем, что их молекулы, называемые глобулами, по своей форме приближаются к шару или эллипсоиду вращения. Отношение длинной оси к короткой (степень асимметрии) в молекулах этих белков наиболее часто колеблется в пределах от 3 до 6 (1 бывает редко). В некоторых случаях степень асимметрии может достигать 11 - 20 и даже более. В общем, одни из глобулярных белков могут иметь шарообразную форму, другие - форму сигары, третьи - форму эллипсоида вращения. Для глобулярных белков наиболее типична третичная структура, они растворимы в воде и разбавленных растворах нейтральных солей. К этой группе белков относятся все фементы и, за исключением структурных, большинство других белков животных и растительных организмов. Ф и б р и л л я р н ы е белки - ус тойчивые, нерастворимые в воде и разбавленных растворах нейтральных солей, вещества. Для этих белков наиболее характерной является вторичная структура; третичная почти или полностью не выражена. Полипептидные цепи, располагаясь параллельно друг другу вдоль одной оси, образуют длинные волокна (фибриллы) или слои. Отношение длинной оси к короткой в молекулах этих белков составляет несколько десятков, сотен и даже тысяч единиц. Фибриллярные белки являются 59 основными элементами сухожилий, костей, хрящей, волос, перьев, рогов, паутины и т.п. Некоторые белки принадлежат к п р о м е ж у т о ч н о м у типу. Эти белка имеют фибриллярную природу, но растворимы в водных растворах нейтральных солей. К таким белкам относятся миозин мышц и фибриноген - предшественник фибрина (основного компонента сгустка крови). В соответствии с биологическими функциями можно выделить следующие группы белков: ферменты, транспортные белки, пищевые и запасные белки, сократительные и двигательные белки, структурные белки, защитные белки, регуляторные белки. В зависимости от химического состава все белковые вещества разделили на две группы: п р о с т ы е белки и сложные белки. Простые белки построены из аминокислот. Сложные белки состоят из какого-либо простого белка и небелкового компонента, называемого простетической группой. Каждая из этих групп белков подразделяется на ряд подгрупп. Деление белков на простые и сложные является, по-видимому, условным, поскольку ряд белков, ранее отнесенных в группу простых (например, глобулин крови) на самом деле оказались сложными. Следует отметить, что сделана попытка классифицировать белки в соответствии с их структурой. На основании этого подхода выделены четыре четко различающиеся структурные группы: , , + , / - белки. К -группе относятся белки, в которых как в гемоглобине и миоглобине преобладают -спирали; к - группе относятся белки, построенные из -слоев, расположенных один над другим и образующих многослойную структуру (например, рубредоксин - железосодержащий белок из клостридий и конканавалин А - лектин из канавалии мечевидной); + -белки имеют в составе одной и той же полипептидной цепи участки, целиком построенные из -спиралей, и участки, целиком состоящие из -слоев (например, папаин - белок млечного сока дынного дерева и термолизин - цинксодержащий белок, продуцируемый термостабильными микробами; / -группа - белки, в которых спирали и -слои чередуются по ходу полипептидной цепи (например, гексокиназа, карбоксипептидаза, глицеральдегидфосфатдегидро-геназа и др.). 60 Характеристику отдельных представителей групп простых и сложных белков рассмотрим с учетом необходимости знания этого вопроса для дальнейшего обучения студентов-технологов вузов пищевой промышленности. 2.6.1. Простые белки На основании условно выработанных критериев (растворимость, аминокислотный состав, осаждаемость и др.) простые белки делят на следующие группы: протамины, гистоны, альбумины, глобулины, проламины, глютелины, протеиноиды. Первые шесть подгрупп (часто называемых фракциями) по форме молекул относят к глобулярным белкам, а последнюю к фибриллярным. Простые белки выполняют самые различные функции. Современными методами исследования (например, электрофорезом) установлено, что каждая из названных белковых фракций представляет собой смесь большого числа различных белков. П р о т а м и н ы (простейшие белки). Это относительно небольшие белки с молекулярной массой до 10 000, благодаря чему некоторые из них проходят через целлофан при диализе. Протамины встречаются в большом количестве в молоках рыб (семга, скумбрия, сельдь и др.), обнаружены в половых клетках млекопитающих и птиц, а также у представителй растительного царства (например, спорах плауна). В составе молекулы этих белков содержится до 85% аминокислот с положительно заряженными радикалами (обычно аргинин) и ограниченный набор (6 - 8) других аминокислот, что обусловливает их основные свойства. Примером протаминов может служить белок из молок семги с а л ь м и н , содержащий 85,2% аргинина, 9,1% серина, 5,8% пролина, 3,1% валина, 2,9% глицина, 1,6% изолейцина и 1,1% аланина (при описании аминокислотного состава белков превышение суммарного итога 100% допустимо). Протамины растворимы в слабых растворах кислот, не осаждаются при кипячении, имеют изоэлектричекую точку при рН 10 -12, входят в состав белков нуклеопротеинов, не содержат триптофан и серу. Г и с т о н ы. Представляют собой основные белки с молекулярной массой от 12000 до 20000, содержащие в составе молекулы 20-30% аминокислот с положительно заряженными 61 радикалами (обычно аргинин и лизин). Гистоны не содержат триптофана, растворимы в разбавленных кислотах (0,2М HСl ), осаждаются аммиаком и этанолом, имеют изоэлектрическую точку при рН 8,5. Гистоны содержатся главным образом в ядрах клеток животных и растений, где играют важную роль в структуре хроматина (нитевидного комплекса ДНК, гистонов и др. белков). По содержанию аргинина и лизина гистоны разделили на пять типов: Н1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Например, гистон Н1 содержит 27% лизина и 2% аргинина, а Н4 - 10% лизина и 14% аргинина. Типы гистонов различаются между собой и по молекулярной массе. Следует подчеркнуть, что гистоны одного и того же типа, выделенные из разных животных и растений имеют сходную первичную структуру. Так аминокислотные последовательности гистона Н4 из проростков гороха и тимуса (железа внутренней секреции) быка отличаются только двумя из 102 остатков, присутствующих в молекуле. А л ь б у м и н ы относятся к белкам, широко распространенным в животных и растителтных организмах. Содержатся эти белки в сыворотке крови, белке яиц, мышцах, молоке, семенах, листьях, стеблях и корнях растений. От общей массы всех белков на долю альбуминов приходится в сыворотке крови животных организмов 35-70%, белках яиц - до 70%, молоке - 10-15%, семенах масличных культур - 20 25%, семенах ржи - 20-40%, семенах пшеницы, ячменя, кукурузы, гороха - 5-15%. Альбумины растворяются в воде, из водных растворов высаливаются сульфатом аммония при полном насыщении, при кипячении выпадают в осадок в виде сгустков денатурированного белка. Наиболее известными представителями альбуминов являются сывороточный и яичный альбумины, лактальбумин молока,лейкозин из зародыша зерна пшеницы, легумелин из семян гороха и др. Альбумины выполняют различные функции: участвуют в качестве ферментов в каталитических реакциях, альбумины сыворотки крови поддерживают кислотно-щелочное равновесие, выполняют транспорт-ную функцию (переносят липидов, аминокислоты, жирные кислоты, ионы металлов), альбумины яйца, молока, семян выполняют питательную (резервную) функцию и т.д. 62 Альбумины из белка яиц и молока применяются в кондитерской промышленности. Г л о б у л и н ы белки, нерастворимые в воде, но растворимые в разбавленных растворах нейтральных солей (4-10%); осаждаются из раствора при полунасыщении сульфатом аммония,а также при полном удалении солей, например посредством диализа. Представителями этой группы белков являются глобулины сыворотки крови, глобулины молока, яичный глобулин, легумин семян гороха, фазеолин семян фасоли, эдестин семян конопли и др. От общей массы всех белков на долю глобулинов в сыворотке крови животных организмов приходится 30-65%, молоке - 2-3,5% (в молозиве - 50-75%), белке яиц - 7%, семенах кукурузы - 7-15%, семенах пшеницы - 10-20%, семенах овса и ржи - 15-25%, семенах гороха - 60-80%, семенах фасоли - 80-90%, семенах масличных культур - 30-55%. В животных организмах глобулины выполняют защитную , транспортную и некоторые другие функции; в семенах растений они являются в основном запасными белками, но среди них имеются белки, выполняющие каталитические функции. П р о л а м и н ы - группа хорошо растворимых в 60-80% водном растворе этанола белков. Они являются растительными белками, характерны исключительно для семян злаковых, в животном мире не встречаются. Проламины содержат много пролина (15%) и глутаминовой кислоты (30-45%); при их гидролизе образуется много аммиака. От общей массы белков на долю проламинов в семенах ржи приходится 10-20%, семенах овса - 20-30%, семенах пшеницы - 20-40%, семенах ячменя - 25-40%, семенах кукурузы - до 50%. Проламины семян довольно хорошо изучены; установлены их молекулярная масса, изоэлектрическая точка, аминокислотный состав и др. В семенах они выполняют функцию запасных веществ, необходимых для развивающегося зародыша на начальных этапах прорастания. Некоторые из них проявляют ферментативную активность. К наиболее изученным проламинам относятся глиадины пшеницы и ржи, гордеин ячменя, зеин кукурузы, авенин овса и др. Проламины входят в состав клейковины - белкового сгустка, обеспечивающего упругость и элластичность теста. Г л ю т е л и н ы хорошо растворяются в слабых растворах щелочей (0,1-0,2%), но не растворимы в воде, растворах этанола и 63 нейтральных солей. Эта группа белков, содержится в семенах злаков и других культур, а также в зеленых частях растений. От общей массы белков на долю глютелинов в семенах риса приходится 6070%, семенах пшеницы, ячменя и овса - 25-40%, семенах масличных культур - 10-30%, семенах большинства бобовых - 10-20%, семенах фасоли - 5-10%. Наиболее изученными белками этой группы являются глютенин семян пшеницы, оризенин семян риса, глютелин кукурузы. Глютелины вместе с проламинами входят в состав клейковины. Глютелины содержат до 45% глутаминовой кислоты. П р о т е и н о и д ы (склеропротеины). Характерной особенностью протеиноидов является полная нерастворимость в воде, растворах нейтральных солей, разведенных кислотах и щелочах. Для этих белков имеются специфические растворители, например фиброин шелковой нити можно растворить в концентрированных водных растворах роданида лития и бромистого калия. Потеиноиды относятся к фибриллярным белкам. Эти белки входят в состав кожи, сухожилий, костей, хрящей (коллаген), волос , рогов, копыт, перьев (кератин), паутины и шелковой нити (фиброин). Кератины содержат до 3% серы. При длительном нагревании с водой коллаген превращается в растворимый желатин. Желатин применяют в пищевой промышленности. 2.6.2. Сложные белки Как уже отмечалось, в состав сложных белков входит белковая часть и какая-либо небелковая (простетическая) группа. В зависимости от химической природы простетической группы различают: хромопротеины, фосфопротеины, липопротеины, гликопротеины, металлопротеины, нуклеопротеины. Х р о м о п р о т е и н ы состоят из простого белка, связанного с каким-либо окрашенным соединением небелкового характера. Эти белки обладают высокой биологической активностью. Одни из них участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, другие - в процессе фотосинтеза, третьи - в переносе кислорода и диоксида углерода и т.д. Окрашенными небелковыми компонентами хромопротеинов могут быть производные каротина, изоаллоксазина, порфиринов и др. Производные 64 каротина входят в состав хромопротеина родопсина (см. витамин А); производные изоаллоксазина служат компонентами для построения простетической группы флавопротеинов (окислительно- восстановительные ферменты); производные порфирина с магнием образуют хлорофилл, комплекс которго с белком обеспечивает фотосинтетическую деятельность растений; производные порфирина с железом служат для образования гемоглобина, миоглобина, цитохромов, каталазы, пероксидазы и др. Хорошо изученным представителем хромопротеинов является г е м о г л о б и н - белок, играющий важную роль в дыхательной функции крови теплокровных (транспорт кислорода и диоксида углерода). Молекула гемоглобина состоит из белка глобина и небелковой группы гема. Видовая специфичность гемоглобина человека и животного обусловлена глобином; гем у всех гемоглобинов имеет одинаковое строение. Глобин состоит из четырех полипептидных цепей. Две из них, обозначаемые -цепями, имеют одинаковую структуру и включают по 141 аминокислотному остатку. Две другие, называемые -цепями, также построены идентично, но содержат по 146 аминокислотных остатков. Каждая из цепей глобина связана через остаток гистидина с одной группой гема (в гемоглобине четыре группы гема). Связанные с гемом полипептидные цепи попарно объединены в две субъединицы, каждая из которых содержит одну -цепь и одну цепь. Субъединицы, ассоциируясь, образуют молекулу гемоглобина (см. четвертичная струтура белков). Строение гема выяснено главным образом благодаря работам М.В. 65 Ненцкого и Х.Фишера. В основе химической структуры гема лежит протопорфирин IX (1,3,5,8-тетраметил-2,4-дивинил-6,7дипропионовокислый порфирин), представляющий собой производное порфирина - ароматического макроцикла, состоящего из пиррольных колец, соединенных метиновыми группами (СН ). Протопорфирин IX, соединенный с двухвалентным железом, является гемом. Приводим формулы каждого из этих соединений: Гемоглобин обладает очень интересной и биологически важной особенностью. Он легко соединяется не только с кислородом, но и с СО, NO и другими газами. При воздействии окислителей к железу гемоглобина присоединяется группа ОН и оно становится трехвалентным. М и о г л о б и н - относительно небольшой глобулярный, кислород-связывающий, белок (мол. масса 16700) мышечных клеток. Его молекула состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 153 аминокислотных остатка с установленной последовательностью и одного гема. Миоглобин депонирует доставляемый кровью кислород и способствует его переносу в митохондрии для окисления поступающих в клетку питательных веществ. У наземных животных миоглобин связывает около 10% всего кислорода тканей, у морских животных (дельфин, кит, тюлень) - до 40%. Создание резерва кислорода в тканях обусловлено тем, что миоглобин,при равных условиях, обладает более высоким сродством к кислороду, чем гемоглобин. Миоглобин окрашивает мышцы в красный цвет. В активно работающих мышцах миоглобина содержится несколько больше, чем в работающих менее интенсино или неработающих. С увеличением содержания миоглобина мышцы приобретают более темный цвет (например, мышцы лошади, мышцы шеи и конечностей крупного рогатого скота, грудные мышцы летающих птиц). Миоглобин, кроме кислорода, способен легко соединяться с сероводородом, окисью азота и другими газами. При этом железо гема остается двухвалентным. В результате взаимодействия миоглобина с окисью азота образуется NO-миоглобин (нитрозомиоглобин), который после тепловой денатурации сохраняет красную окраску, что имеет важное значение в изготовлении соленовареных мясных изделий. 66 Ф о с ф о п р о т е и н ы - белки, содержащие в своем составе ортофосфорную кислоту, присоединенную сложноэфирной связью к остаткам серина, реже треонина. Фосфопротеины играют важную роль в питании как зародышей животных, так и молодого, растущего животного организма. Важными представителями этой группы белков являются казеин главный белок молока, вителлин и фосфовитин - белки яичного желтка, ихтулин, выделенный из икры рыб и некоторые другие. ОН СН2 H2NCHCOOH Cерин + Н3РО4 OH OP=O OH СН2 H2NCHCOOH Фосфосерин (серинфосфорная кислота) Казеин часто относят к фосфогликопротеинам, так как кроме фосфорной кислоты содержит углеводный компонент. Посредством электрофореза казеин можно разделить на ряд индивидуальных белков. Следует отметить, что ряд некоторых белков (ферментативных, мембранных, рибосомальных и др.) существует в виде фосфопротеинов непродолжительное время и их, по-видимому, следует отличать от структурно-постоянных фосфопротеинов. Л и п о п р о т е и н ы - это сединения, состоящие из липидов и специфических белков, связанных между собой посредством гидрофобных и электростатических взаимодействий. Из липидов в составе липопротеинов обнаружены ацилглицерины, жирные кислоты, фосфолипиды, холестерин и его эфиры. Среди липопротеинов различают структурные (нерастворимые) и свободные (растворимые в воде). Структурные липопротеины входят в состав мембран клетки и ее структурных образований,оболочки нервных волокон и жировых шариков молока, пластид растительной клетки (хлоропластов) и др. Структурные липопротеины обеспечивают проницаемость мембран. Свободные липопротеины содержатся в плазме крови, молоке, желтке яиц и др. Они занимают ключевое место в транспорте и 67 обмене липидов. Наиболее изученными являются липопротеины крови. Г л и к о п р о т е и н ы - белки, содержащие в качестве небелковой группы углеводы и их производные (галактозу, маннозу, аминосахара, олигосахариды, гетерополисахариды и др.) Углеводный и белковый компоненты в гликопротеинах соединены О или N гликозидными связями. В образовании Огликозидных связей между углеводным компонентом и белком участвуют остатки серина, треонина, гидроксилизина и гидроксипролина. В образовании N гликозидной углевод-белковой связи могут участвовать глюкозамины (или N-ацетилглюкозамины) и амидная группа аспарагина пептидной цепи. Углеводная часть в молекуле гликопротеина может составлять менее 1%, а может достигать 30% и более. Гликопротеины содержатся в организме животных, растений и микроорганизмах, где выполняют самые разнообразные функции. В составе поверхностных мембран клеток имеются гликопротеины, выполняющие роль систем для биологического узнавания определенных клеток и соединений и, на основе этого, определяющие взаимодействие клетка-клетка, клетка-молекула, молекула-молекула. В этом состоит функция избирательного взаимодействия и высокоспецифичного узнавания. Гликопротеины придают эластичность и упругость коже, хрящам и сухожилиям, выполняют роль смазки суставов и защитной смазки слизистых оболочек, выполняют транспортную функцию и каталитическую функцию. Так назывемые а н т и ф р и з н ы е б е л к и, обнаруженные в крови арктических и антарктических рыб, являются гликопротеинами, способными снижать температуру замерзания крови до минус 1,85ОС. Гликопротеины являются широкораспространенными структурными компонентами различных клеточных мембран. К числу наиболее полно изученных гликопротеинов животных организмов относят: г л и к о ф о р и н - белок мембраны эритроцитов, определяющий группу крови и связывающий некоторые патогенные вирусы; ф и б р о н е к т и н - белок внешней поверхности клеток плотных тканей, обладающий высокой адгезионной способностью ; а в и д и н - белок яиц, обладающий способностью связывать биотин (витамин Н) и др. 68 Примерами гликопротеинов растений могут служить: виц и л и н -запасной белок семян бобовых; б р о м е л а и н - фермент из стеблей ананаса, катализирующий гидролиз белков; п е р о к с и д а з а хрена - фермент из класса оксидоредуктаз; р и ц и н токсичекий белок клещевины и др. В семенах и других частях растений имеются гликопротеины, способные связываться с эритроцитами и вызывать их агглютинацию (склеивание и осаждение). Эти белки получили название ф и т о г е м - а г г л ю т е и н ы или л е к т и н ы. Лектины обладают также способностью связывать и осаждать полисахариды и гликопротеины. Некоторые лектины вызывают избирательную агглютинацию клеток злокачественных опухолей. Физиологическая роль лектинов в растениях пока не выяснена. Предполагается, что они функционируют как защитные белки, предохраняя растения от паразитирующих бактерий и грибов. Существует также предположение, что лектины участвуют в узнавании и фиксации симбиотических бактерий, связывающих азот. К гликопротеинам относятся и н т е р ф е р о н ы - белки, синтезируемые некоторыми клетками позвоночных при заражении их вирусами. Эти белки связываются с мембраной незараженных клеток и придают им иммунность по отношению к инфекции этим же или каким-либо другим вирусом. М е т а л л о п р о т е и н ы - сложные белки, в состав которых входят ионы какого-либо одного или нескольких металлов, соединенные с белковой частью посредством комплексной связи. Ионы металлов в металлопротеинах можно отделить от белка только при энергичном воздействии. К металлопротеинам относятся ф е р р и т и н, содержащий железо, ц е р у л о п л а з м и н и п о л и ф е н о л о к с и д а з а, содержащие медь, а м и л а з а, содержащая кальций и др. Некоторые металлопротеины, особенно из группы ферментов, содержат в качестве простетической группы несколько различных веществ. Так, например, в сукцинатдегидрогеназе, наряду с производным флавина, содержится железо, ксантиноксидаза содержит производное флавина и молибден, алкогольдегидрогеназа производные пиридина и цинк и т.д. Н у к л е о п р о т е и н ы - это комплексы нуклеиновых кислот с белками. Они содержатся в каждой клетке и выполняют важнейшие 69 специфические функции, связанные с хранением и реализацией генетической информации. Белковой составляющей нуклеопротеинов могут быть гистоны, протамины и так называемые негистоновые белки. Природа негистоновых белков пока не выяснена. Из нуклеиновых кислот в состав нуклеопротеинов входят дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК). Нуклеопротеины, содержащие ДНК называют дезоксирибонуклео-протеинами (ДНП), а содержащие РНК рибонуклеопротеинами (РНП). ДНП и РНП представляют собой сложные комплексы, построенные из одной-двух молекул нуклеиновой кислоты и большого числа прикрепленных к ней белковых молекул. Типичными представителями РНП являются органеллы клеток - рибосомы (комплексы рибосомных РНК с белками); типичный представитель ДНП - хроматин (комплекс ДНК с гистонами и негистоновыми белками, составляющий основу ядер клеток). К нуклеопротеинам относят вирусы - паразиты, способные проникать в клетку специфического хозяина и , размножаясь, вызывать заболевание. Вирусы в виде чистых препаратов (вне клетки хозяина) не способны к самовоспроизведению. Вирусы, вызывающие заболевания человека и животных, содержат либо РНК, либо ДНК; вирусы растений обычно содержат РНК. Белки и нуклеиновые кислоты в нуклеопротеинах соединены между собой посредством нековалентных взаимодействий. ГЛАВА 3. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ Нуклеиновым кислотам, как и белкам, принадлежит ведущая роль в явлениях жизни. Они являются генетическим материалом всех живых организмов и вирусов. Несмотря на огромную значимость для жизни, рацион человека, животных и птиц по нуклеиновым кислотам не балансируют; в процессе жизнедеятельности этих организмов нуклеиновые кислоты синтезируются из других компонентов. Нуклеиновые кислоты в виде сложного соединения, названного н у к л е и н о м, были выделены из лейкоцитов человека Ф.Мишером в 1868г. Анализируя нуклеин Ф.Мишер установил, что это сложное соединение, состоящее из кислого компонента с 70 высоким содержанием фосфора и белкового компонента. Р.Альтман предложил в 1889г. кислый компонент нуклеина называть нуклеиновой кислотой. 3.1. Химический состав нуклеиновых кислот При нагревании с хлорной кислотой нуклеиновые кислоты распадаются на следующие типы веществ: пуриновые и пиримидиновые азотистые основания, пентозы и ортофосфорную кислоту. Из пентоз в нуклеиновых кислотах обнаружены р и б о з а и д е з о к с и р и б о з а. В составе нуклеиновых кислот оба сахара находятся в -D-рибофуранозной форме: ОН 5 СН2ОН О 1 Н ОН 4 Н Н 2 3 ОН 5 СН2ОН О 1 Н Н ОН 4 Н Н 2 3 Н -D- Рибоза Н ОН -D-2 Дезоксирибоза Нуклеиновые кислоты, в зависимости от химической природы входящего в их состав сахара, делят на два типа: рибонукле и н о в ы е (РНК), содержащие рибозу, и дезоксирибон у к л е и н о в ы е (ДНК), содержащие дезоксирибозу. Пуриновые азотистые основания нуклеиновых кислот являются производными п у р и н а, молекула клторого состоит из двух конденсированных колец: пиримидина и имидазола. В гидролизатах нуклеиновых кислот постоянно встречаются два производных пурина - а д е н и н (А) и г у а н и н (Г): O NH2 6 N1 5 N 7 N N 8 N NH 71 2 4 3 N 9 N H N H N Пурин H2N Аденин (А) N H N Гуанин (Г) Пиримидиновые азотистые основания являются производными п и р и м и д и н а. Из пиримидиновых оснований в составе нуклеиновых кислот постоянно обнаруживают ц и т о з и н (Ц), у р а ц и л (У), т и м и н (Т): 4 N3 О NH2 5 O N CH3 NH 2 NH 6 1 N Пиримидин O N H Цитозин (Ц) O N H Урацил (У) O N H Тимин (Т) Нуклеиновые кислоты отличаются друг от друга не только углеводными компонентами, но и составом азотистых оснований. В состав ДНК входят аденин, гуанин, цитозин, тимин; в состав РНК аденин, гуанин, цитозин, урацил. Очень редко тимин встречается в составе РНК, а урацил - в составе некоторых ДНК. Кроме перечисленных азотистых оснований в нуклеиновых кислотах присутствуют в небольших количествах так называемые необычные, или м и н о р н ы е, азотистые основания. Так, в состав ДНК входят 5-метилцитозин, N-6-метиладенин, 7-метилгуанин и другие. Особенно много минор-ных компонентов содержится в РНК: ксантин, гипоксантин, тиоурацил, оротовая кислота и другие, всего около 60. Все оксопроизводные азотистые основания присутствуют в составе нуклеиновых кислот в форме лактамов (кето-форма). Свободные пуриновые основания легко разделить и идентифицировать методами хроматографии на бумаге или в тонком слое. Входящая в состав нуклеиновых кислот ф о с ф о р н а я кислота, придает им свойства кислот. Биологическая роль производных пурина и пиримидина не ограничена нуклеиновыми кислотами. В процессе жизнедеятельности растительные и животные организмы на основе этих соединений 72 образуют ряд продуктов, среди которых можно назвать мочевую кислоту, кофеин, теобромин и некоторые другие. У человека мочевая кислота является конечным продкутом пуринового обмена. Кофеин содержится в зернах кофе, листьях чая и других растениях. Теобромин находится в чае и бобах какао. Кофеин и теобромин обладают важными фармакологическими свойствами (например, кофеин стимулирует деятельность центральной нервной системы). OH О N HO OH NCH3 O= N H NH NCH3 O= N Мочевая кислота (енол-форма) Н3СN N N O N N N CH3 CH3 Кофеин Теобромин В последние годы некоторые синтетические пиримидины широко используют в качестве биологически активных соединений. 3.2. Стуктурные компоненты нуклеиновых кислот. Полинуклеотиды В присутствии специальных катализаторов биологического происхождения - н у к л е а з - нуклеиновые кислоты распадаются на свои структурные единицы, называемые нуклеотидам и, или мононуклеотидами. Нуклеотиды состоят из трех компонентов: пуринового или пиримидинового основания, пентозы (рибозы или дезоксирибозы) и фосфорной кислоты. Сахар в нуклеотидах занимает среднее положение. При отщеплении от нуклеотида остатка фосфорной кислоты остается еще более простое соединение - н у к л е о з и д. Нуклеозиды - это N-гликозиды пуриновых или пиримидиновых оснований, в которых первый атом углерода (С-1) рибозы или дезоксирибозы связан гликозидной связью с N-9 пурина или N-1 пиримидина. Атомы углерода в рибозе и дезоксирибозе нумеруют со штрихом (1 - 5), чтобы не путать их с атомами в пуриновых и пиримидиновых основаниях (1 - 9 и 1 - 6). Примеры химического строения нуклетидов и нуклезидов приведены ниже (стр. 92). 73 Разделить и идентифицировать нуклеозиды можно методами хроматографии на бумаге или в тонком слое. Нуклеозиды легко гидролизуются специфическими биологическими катализаторами нуклеозидазами и при нагревании с кислотами. Нуклеотиды, как указывалось выше, состоят из пуринового или пиримидинового основания, связанного с сахаром (рибозой или дезоксирибозой) и фосфата, этерифицирующего эти пентозы по атомам С-3 или С-5. Наиболее распространенной является этерификация по С-5 . Следовательно, нуклеотиды это фосфорнокислые эфиры нуклеозидов. При дальнейшем изложении материала мы будем иметь в виду нуклеозид - 5-фосфаты. Все нуклеотиды - сильные кислоты, так как остаток фосфорной кислоты легко диссоциирует. Фосфоэфирная связь в нуклеотидах относительно устойчива при кислотном гидролизе. При участии специфических катализаторов - нуклеотидаз - можно легко отщепить фосфатную группу, не затрагивая N-гликозидную связь. Нуклеотиды можно легко разделить и идентифицировать методами электрофореза или хроматографии. Нуклеотиды, содержащие рибозу, называют общим словом рибонуклеотиды, а содержащие дезоксирибозу дезоксирибонуклеотиды. Названия отдельных нуклеозидов и нуклеотидов с указанием входящих в них азотистых оснований приведены в табл. 3.1. Следует отметить, что в названии нуклеотидов используют два подхода: их рассматривают как кислоты (например, адениловая кислота и др.) или как фосфорные эфиры (например, аденозинмонофосфат и др.). Таблица 3.1 Номенклатура нуклеозидов и нуклеотидов Азотистые основания Нуклеозиды Аденин Аденозин Гуанин Гуанозин Цитозин Цитидин Урацил Уридин Нуклеотиды полное название сокращенное название Адениловая кислота АМФ (аденозинмонофосфат) Гуаниловая кислота ГМФ (гуанозинмонофосфат) Цитидиловая кислота ЦМФ (цитидинмонофосфат) Уридиловая кислота УМФ (уридинмонофосфат) 74 Тимин Тимидин Тимидиловая кислота (тимидинмонофосфат) ТМФ В таблице приведены названия нуклеозидов и нуклеотидов, содержащих рибозу. В названии рибозных производных тимина часто употребляют приставку “рибо”: риботимидин, риботимидиловая кислота (риботимидинмонофосфат). Если в состав нуклеозида или нуклеотида входит дезоксирибоза, то перед полным названием каждого из них ставится приставка “дезокси”, а перед сокращенным названием - строчная буква “д”, например, дезоксиаденозин, дезоксиадениловая кислота (дезоксиаденозинмонофосфат, дАМФ). Приводим примеры химического строения нуклеозидов и нуклеотидов, содержащих аденин и цитозин: NH2 6 N1 2 5 4 3 N N 7 8 9 N O 5 CH2 OH 1 H H 4 2 3 H OH H 5 4 3 N N 7 8 9 N H ОН O 5 Н2 CОР=O 1 H H 4 2 3 H ОН OH O 5 CH2 OH 1 H H 4 2 3 OH H OH Цитидин NH2 N1 2 H OH Аденозин 6 NH2 4 N3 5 2 6 O= 1 N OH Адениловая кислота NH2 4 N3 5 2 6 O= 1 N ОН O 5 Н2CОР=O 1 H H 4 H 2 3 H ОН OH OH Цитидиловая кислота Остальные нуклеозиды и нуклеотиды, освобождающиеся при гидролизе нуклеиновых кислот, имеют аналогичное химическое 75 строение. Для записи нуклеотидов и их компонентов существует схематическая символика (приводим одну из них): Р Р Нуклеотид Фосфат Пентоза Основание 76 Рис. 3.1 Строение фрагмента нуклеиновой кислотыI полусхематическая и II - схематическая форма записи; 1 и 2 - фосфодиэфирная связь; А, Г, Ц, - азотистые основания; у РНК R - есть группа ОН, а у ДНК R - Н. Нуклеотиды это повторяющиеся мономерные единицы олигону-клеотидов и полинуклеотидов. Олигонуклеотиды состоят из нескольких нуклеотидов, полинуклеотиды из многих. Нуклеиновые кислоты представляют собой полинук л е о т и д ы. Последовательно расположенные в молекулах нуклеиновых кислот нуклеотиды ковалентно соединены друг с другом при помощи фосфатных “мостиков”. Роль этих мостиков выполняет ф о с ф о д и э ф и р н а я связь между С-31 рибозы или дезоксирибозы одного нуклеотида и С-51 рибозы или дезоксирибозы соседнего нуклеотида (рис 3.1). Связь между нуклеотидами в нуклеиновых кислотах обозначют как 31 51 фосфодиэфирную связь. 77 Из строения фрагмента нуклеиновой кислоты видно, что на одном его конце при 51-углеродном атоме пентозы нуклеотид содержит остаток фосфорной кислоты, а на противоположном конце при 31-углеродном атоме пентозы - гидроксильную группу. Такие нуклеотидные остатки образуют 51 и 31-концы полинуклеотидных цепей в молекулах нуклеиновых кислот. 3.3. Строение и билогическая роль ДНК ДНК служит универсальным хранителем и источником наследственной информации, записанной в виде специальной последовательности нуклеотидов и определяющей свойства живого организма. Ее молекулярная масса колеблется от 107 до 109, а число нуклеотидных остатков в молекуле достигает нескольких сотен тысяч и даже миллионов. Как уже было сказано, из главных азотистых оснований в ДНК содержится аденин, гуанин, цитозин и тимин. Основная масса ДНК сосредоточена главным образом в ядрах клеток. Некоторое ее количество содержится в митохондриях и хлоропластах. ДНК ядра клеток животных и растений представляет собой не одну молекулу, а состоит из многих молекул, распределенных по разным хромосомам, число которых зависит от вида организма. Например, клетки мягкой пшеницы имеют 42 хромосомы, ржи и гороха - по 14, человека - 46, курицы - 78 и т.д. В хромосомах различают специфические участки молекулы ДНК, называемые генами. Роль гена заключается в том, что в нем закодирован тот или иной специфический признак. При изучении нуклеотидного состава ДНК, выделенных из самых разных организмов, Э.Чаргафф с сотрудниками установили, что почти во всех исследованных ДНК число остатков аденина равно числу остатков тимина (А = Т), а число остатков гуанина равно числу остатков цитозина (Г = Ц), т.е. оказалось, что в молекулах ДНК содержание пуриновых оснований равно содержанию пиримидиновых оснований (А+Г = Ц+Т). В отличие от этого в молекулах ДНК разных видов число пар оснований А+Т и Г+Ц может существенно отличаться. Все эти закономерности получили название п р а в и л Ч а р г а ф ф а. Следует отметить , что в случаях, когда ДНК содержит “необычные” основания, такие, например, как замещенные цитозины, под “Ц” подразумевается “Ц” плюс все замещенные цитозины (цитозин + 5-метилцитозин = Ц), а под “Т” - урацил плюс все замещенные урацилы (включая тимин). 78 На основании работ Э.Чаргаффа с сотрудниками и результатов ренгеноструктурного анализа М.Уилкинса и Р.Франклин, а также с учетом химических данных, полученных другими авторами, Д.Уотсон и Ф.Крик предложили в 1953 году модель стуктуры ДНК. Эта модель впервые дала возможность объяснить ряд важных биологических явлений, например в передаче наследственности. Согласно модели Уотсона-Крика молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей. Каждая цепь закручена в спираль вправо, и обе они свиты вместе, т.е. закручены вправо вокруг одной и той же оси, образуя д в о й н у ю с п и р а л ь. Цепи антипараллельны по отношению к направлению связей 3151. Это означает, что межнуклетидные связи одной цепи ориентированы в направлении 3151, , а в другой - в направлении 51 31. В результате чего 51конец одной цепи раполагается напротив 31-конца другой. В каждой полинуклеотидной цепи выделяют углеводнофосфатный остов, вдоль которого перпендикулярно длинной оси располагаются один над другим основания. При скручивании цепей в двойную спираль углеводно-фосфатные остовы составляют периферию молекулы, а основания располагаются внутри таким образом,что пурин одной цепи всегда образует пару с пиримидином другой цепи и наоборот (рис 3.2). Цепи в молекуле ДНК соединяются между собой водородными связями, возникающими между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Наряду с водородными связями фиксации двойной спирали ДНК способствуют и другие межмолекулярные взаимодействия (гидрофобные взаимодействия между основаниями, силы Ван-дер-Ваальса и др.). В силу пространственного соответствия структур двух молекул соединяться водородными связями могут лишь аденин с тимином и наоборот, а также гуанин с цитозином и наоборот. Причем между аденином и тимином образуются две вородные связи, а между гуанином и цитозином - три (рис.3.3). 79 Рис. 3.2 Схематическое изображение струтуры молекулы ДНК 1.Малая борозда; 2.Большая борозда; 3.Углеводно-фосфатный остов; 4.Азотистые основания; 5.Водородные связи между азотистыми основаниями. Пространственное соответствие структур двух молекул (в случае ДНК пуринов и пиримидинов) получило в химии название к о м п л ем е н т а р н о с т и. Вследствие комплементарности нуклеотидная последовательность одной цепи ДНК однозначно определяет нуклеотидную последовательность другой цепи. Двойная спираль ДНК имеет диаметр 2нм. Каждый ее виток состоит из 10 пар нуклеотидов общей длиной 3,4нм (шаг спирали). Спираль имеет мелкие и глубокие бороздки. Рис. 3.3 Спаривание оснований аденина с тимином и гуанина с цитозином. N N R HNH O NHN CH3 O= N N R OHNH NH N N N R N NHO= H N R 80 Аденин Тимин Гуанин Цитозин Модель Уотсона-Крика позволяет объяснить механизм передачи генетической информации, закодированной в ДНК, от одного поколения к другому. По этому механизму цепи ДНК разделяются и вдоль каждой из них синтезируется новая цепь, что дает в результате две новые молекулы ДНК, по одной на каждую из двух дочерних клеток (рис 3.4). Синтез дочерней молекулы двухцепочечной ДНК, идентичной родительской двухцепочечной ДНК получил название р е п л и к а ц и я. Рис. 3.4 Схема репликации ДНК АТАЦГ АТАЦГ: : : : : ТАТГЦ- АТАЦГ : : : : : ТАТГЦ ТАТГЦ АТАЦГ: : : : : ТАТГЦ- За установление молекулярной структуры ДНК и ее роли в передаче информации в живой материи М.Уилкинсу, Д.Уотсону и Ф.Крику в 1962 г. была присуждена Нобелевская премия. У нуклеиновых кислот, как и у белков, различают первичную, вторичную и третичную структуры. Первичная структура, т.е. последовательность нуклеотидов, изучена у многих ДНК. Методы определения первичной структуры ДНК были разработаны Ф.Сенгером и У.Гильбергом. За вклад в определении последовательности оснований в нуклеиновых кислотах Ф.Сенгеру и У.Гильберту в 1980 г. была присуждена Нобелевская премия. Двуцепочечная спираль ДНК получила название вторичной структуры. Третичная структура ДНК характеризуется тем, что ее двуцепочечная спираль на отдельных участках может подвергаться дальнейшей укладке в суперспираль, приобретать кольцевую форму или свертываться в клубок. При нагревании, при экстремальных значениях рН, при обработке амидами, мочевиной и другими аналогичными веществами, при уменьшении диэлектрической постоянной водной среды в результате добавления спиртов и кетонов происходит раскручивание двухцепочечной спирали ДНК, называемое д е н а т у р а ц и е й, с образованием неупорядоченных одноцепочечных 81 молекул. В процессе денатурации происходит разрыв водородных связей между цепями; все ковалентные связи в молекуле сохраняются. Если процесс раскручивания не произошел полностью и цепи остались соединенными даже в одном небольшом участке, то денатурация ДНК легко обратима. Если же цепи разделились полностью, то их соединение (ренатурация , или обратимая рекомбинация) происходт, как правило, значительно медленнее. Процесс раскручивания двухцепочечной спирали ДНК и обратной рекомбинации отдельных полинуклеотидных цепей постоянно происходит в живой клетке при физиологических условиях под действием специальных биологических катализаторов. Эта способность ДНК имеет важное значение в жизни клетки (деление клетки, синтез белков и др.). Большая часть ДНК клеток находится в соединении с белками, образуя нуклеопротеины (см. сложные белки). 3.4. Строение и биологическая роль РНК Рибонуклеиновые кислоты представляют собой одноцепочечные молекулы разной длины. Последовательность нуклеотидов,т.е. первичная структура, различных РНК, содержащихся в клетке определяется последовательностью нуклеотидов в ДНК -матрице. РНК имеют также вторичную и третичную структуры. В зависимости от функций и местонахождения в клетке РНК делят на три основных типа: рибосомные (рРНК), информационные, или матричные (иРНК , или мРНК) и транспортные (тРНК). Каждый из перечисленных типов РНК выполняет специфическую роль в сложном процессе биосинтеза белка. Р и б о с о м н ы е РНК (рРНК) составляют до 80-90% от всей РНК клетки. Они содержатся в рибосомах - внутриклеточных органеллах, принимающих участие в биосинтезе белка. С рибосомами связан механизм, при помощи которого аминокислоты вступают в реакцию поликонденсации, образуя полипептидные цепи. В цитоплазматических рибосомах высших организмов содержится четыре типа рРНК : -5S - рРНК (мол. масса 40 тыс), 5,8S - рРНК (мол. масса 50 тыс), 18S - рРНК (мол. масса 650 тыс) и 28S - рРНК (мол. масса 1,7 млн) - и свыше 70 различных белков. Рибосомные РНК образуют основу, на которой располагаются белки. 82 М а т р и ч н ы е РНК (мРНК) составляют около 5% общей массы рибонуклеиновых кислот клетки. Их молекулярная масса колеблется в пределах 300 тыс - 2млн. Функция мРНКзаключается в переносе генетической информации, записанной в ДНК, на синтезируемый белок. Клетка способна синтезировать сотни и тысячи различных молекул мРНК. Характерная структурная особенность любой мРНК состоит в уникальной последовательности нуклеотидов, содержащих одно из азотистых оснований - аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) или урацил (У). Каждый последовательно присоедненный набор из трех нуклеотидов (триплет), называемый кодоном, обеспечивает информацию для последовательного (упорядоченного) присоединения аминокислот при биосинтзе полипетидной цепи. Например, кодон УУА обеспечивает присоединение лейцина, ГЦА аланина, ААА - лизина и т.д. Последовательность УУАГЦАААА (читается по три нуклеотида УУА-ГЦА-ААА) определяет фрагмент полипептида лейалализ. Некоторые молекулы мРНК могут кодировать только один полипептид, другие - два или три полипептида. Нуклеотидный состав мРНК подобен нуклеотидному составу одного из участков цепи ДНК, т.е. тройка оснований в ДНК (кодоген, или рождающий код) определяет соответствующую тройку оснований (кодон) в молекуле мРНК. Матричные РНК присутствуют в ядре (где они синтезируются) и в цитоплазме. Транспортные РНК (тРНК) составляют 10-15% от общей массы РНК клетки, включают в себя 74-93 нуклеотида и имеют молекулярную массу 23-30 тыс. Они находятся в клетке в растворенном состоянии, поэтому их раньше называли растворимыми РНК. Функции тРНК заключаются в доставке аминокислот к рибосомам, взаимодействии с мРНК и рибосомами в процессе биосинтеза белка. Для перноса каждой аминокислоты имеется своя собственная тРНК, а для некоторых из них известно несколько тРНК и общее число видов тРНК доходит до 60. Транспортные РНК содержат много (8-19%) нуклеотидов с минорными основаниями, среди них различные метилированные аденины и гуанины, метилированные тимин, цитозин и др. 83 Форма молекулы транспортных РНК укладывается в структуру, получившую название типа к л е в е р н о г о л и с т а (рис 3.5). Эта структура состоит из спирализованных областей, в которых между соответствующими парами оснований (обычно между А и У, Г и Ц) образовались водородные связи, и трех основных петель, образованных неспаренными основаниями. Одна из таких петель несет а н т и к о д о н, т.е. такой триплет в молекуле тРНК, который непосредственно взаимодействует с комплементарным кодоном мРНК. Антикодоны являются индивидуальными для каждого вида тРНК. Рис. 3.5 Структура тРНК типа клеверного листа 1,2 и 3 - основные петли; 4 минорная петля; 5 - антикодон; 6 - водородные связи; 7 - акцептиру-ющий аминокислоту стебель Кроме того, в молекуле тРНК имеется минорная петля неодинакового размера в разных транспортных РНК. Акцептирующий аминокислоту стебель всех тРНК заканчивается последовательностью ЦЦА. 3.5.Свободные нуклеотиды и их производные. Динуклеотиды Нуклеотиды не только входят в состав нуклеиновых кислот,но также в значительных количествах содержатся в клетках в свободном состоянии. Они образуются либо путем синтеза, либо в результате частичного гидролиза нуклеиновых кислот. 84 Нуклеотиды в своем составе могут содержать еще дополнительно один или два остатка фосфорной кислоты, т.е. встречаться в клетках в виде нуклеозид-51-дифосфатов (НДФ) и нуклеозид-51-трифосфатов (НТФ). В названии каждого из этих соединений учитываются входящие в его состав основание и пентоза. Например, рабонуклеозидфосфаты, содержащие аденин и один, два или три остатка фосфорной кислоты, называются соответственно аденозинмонофосфат (АМФ), аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинтрифосфат (АТФ); содержащие урацил - уридинмонофосфат (УМФ), уридиндифосфат (УДФ) и уридин-трифосфат (УТФ) и т.д. Приводим строение рибонуклеозидфосфатов на примере семейства аденозина: NH2 N N N 5 O H2 CO N H 1 H OH H H OH O POH OH O O POPOH OH OH O O O POPO POH OH OH OH АМФ (аденозинмонофосфат) АДФ (аденозиндифосфат) АТФ (аденозинтрифосфат) Аналогичное строение имеют УМФ, УДФ и УТФ, ГМФ, ГДФ и ГТФ, ЦМФ, ЦДФ и ЦТФ. При названии дезоксирибонуклеозидфосфатов ставится приставка “дезокси” (сокр. “д”). Например, дезоксиаденозинмонофосфат (дАМФ), дезоксиаденозиндифосфат (дАДФ), дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезокситимидинмонофосфат (дТМФ), дезокситимидиндифосфат (дТДФ), дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) и т.д. Знаком ““ в формулах НТФ и НДФ обозначены высокоэнергетические фосфатные связи (макроэргические связи). Фосфатные группы, содержащие высокоэнергетические связи, могут быть перенесены на другие соединения в результате чего последние 85 становятся более реакционноспособными и будут использованы далее в обмене веществ. НТФ и НДФ выполняют многие важные функции. Так, УДФ в форме уридиндифосфатглюкозы (см. обмен углеводов) выступает как донор остатка глюкозы при биосинтезе гликогена, крахмала, сахарозы; цитидиндифосфат служит донором холина при биосинтезе холинсодержащих фосфолипидов (см. обмен липидов). НТФ служат высокоэнергетическими предшественниками мононуклеотидов при биосинтезе РНК и ДНК. Для нормальной жизнедеятельности клетки важное значение имеют все НТФ, но среди них особое место занимает АТФ. Большая часть энергии. освобождающейся в процессе брожения, дыхания, фотосинтеза запасается в виде АТФ, который называют “биологически универ-сальной энергетической валютой”. АТФ во всех клетках выступает в качестве депо для хранения и переноса химической энергии (на молекулярном уровне). Он действует как связующее звено между процессами, производящими энергию и процессами, требующими затраты энергии. При этом его высокоэнергетические фосфатные группы не-прерывно отщепляются и заменяются новыми. Для образования одной высокоэнергетической фосфатной связи АТФ требуется 30,6 Кджмоль. Следовательно, АТФ может образоваться лишь в таких реакциях, при которых выход энергии составляет не меньше 30,6 Кджмоль. Вся энергия, высвобождающаяся в данной реакции сверх 30,6 Кджмоль, равно как и вся энергия от реакций, дающих менее 30,6 Кджмоль, не может быть запасена в АТФ и рассеивается в виде тепла. В клетках из НТФ образуются соответствующие циклические нуклеотиды. Например, из АТФ при участии биологических катализаторов образуется аденозин-31-51 циклический фосфат (циклоАМФ или цАМФ):
