Ле_ Ван_Тхуан_Кx

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ
НАНОРАЗМЕРНОГО СИНТЕТИЧЕСКОГО И ПРИРОДНОГО
ГИДРОКСИАПАТИТА
Ле Ван Тхуан, Доан Ван Дат, Фам Тхи Тхуан
Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Научный руководитель – Трубицын Михаил Александрович, Габрук Наталья
Георгиевна
Изучение процессов образования и роста костной ткани на поверхности
имплантатов, а также стоматологические исследования процессов цементации и
образования связей пломба — зубная эмаль — дентин подтверждают необходимость
получения новых материалов, близких по структуре, строению и химическому составу
к биогенным композитам, для улучшения таких характеристик, как адгезия,
биоактивность и биосовместимость [1]. Среди разных видов биоматериалов,
используемых для замены поврежденной костной ткани, чаще применяют
гидроксиапатит (ГАП, Ca10(PO4)6(OH)2), который с некоторыми допущениями можно
считать кристаллохимическим аналогом минеральной составляющей тканей скелета
животного и людей [2]. В настоящее время преимущественно используется биоапатит,
полученный из костей крупного рогатого скота. При этом получают порошки с
широким спектром дисперсности 50-100 мкм. Характер взаимодействия ГАП с живым
объектом зависит от его химического состава, размера и морфологии кристаллов.
Согласно многочисленным сообщениям частицы биоапатита в кальцинированных
тканях имеют размеры в диапазоне от 2-5 до 200-600 нм, образуя строительные блоки
нанометрового размера [3]. Например, десятки и сотни кристаллов апатита
нанометровых размеров в коллагеновой матрице объединяются в самоорганизующиеся
структуры в процессе формирования костей и зубов. Последние результаты
исследований указывают, что это происходит естественным путем, поскольку
наноструктурные материалы обеспечивают лучшую способность специфических
взаимодействий с белками [4]. Поэтому получение наноразмерного синтетического
гидроксиапатита (НГАП) является задачей актуальной и востребованной.
К недостаткам использования имплантатов из ГАП, в сравнении с биоактивными
стеклами и стеклокерамикой, можно отнести его низкую реакционную способность при
регенерации поврежденной кости и недостаточную степень остеоинтеграции. Недавние
исследования показали, что биологическая активность синтетического гидроксиапатита
может быть повышена путем ионных замещений, которые позволяют получать
химические составы, сходные с природным минералом кости [5]. Было установлено,
что синтетические биоматериалы, которые содержат некоторое количество кремния в
своих структурах, демонстрируют заметно повышенную биологическую активность по
сравнению со незамещенным ГАП. Это увеличение биологической активности можно
объяснить Si-индуцированными изменениями свойств материалов, а также
непосредственным воздействием кремния на физиологические процессы в кости и
системе соединительной ткани [6]. В этом смысле включение кремния в структуру
биоапатита может улучшить биологическую активность гидроксиапатита, в частности
биорезорбируемость.
Таким
образом,
синтез
и
исследования
кремниймодифицированного
наногидроксиапатита
(Si-НГАП)
являются
перспективным направлением исследования.
Целью данной работы является синтез наноразмерного немодифицированного и
кремниймодифицированного гидроксиапатита, а также сравнительный анализ их
свойств с гидроксиапатитом животного происхождения.
Экспериментальная часть
В данной работе образцы наноразмерного ГАП были синтезированы методом
осаждения из водных растворов по методике [7]. Порошки Si-НГАП были получены по
оригинальной методике, приведенной в патенте[8]. Полученные суспензии
фильтровали, промывали дистиллированной водой и высушивали в сушильном шкафу
при до постоянной массы. Биоапатит “Биопласт-Дент” для проведений исследований,
полученный из костей крупного рогатого скота, был передан ЗАО "Опытноэкспериментальный завод ВладМиВа" г. Белгород.
Характеризацию образцов проводили методами рентгенофазового анализа (РФА),
на дифрактометре Rigaku Ultima IV (Япония) c детектором D/teX Ultra. Морфологию
поверхности синтетических и природных объектов изучали с помощью
просвечивающей (ПЭМ) и растровой электронной микроскопии (РЭМ) на приборах
JEM 2100 (JEOL Ltd., Япония) с разрешающей способностью – 0,2 нм и Quanta 200 3D
(FEI Company, США), соответственно. Размер области когерентного рассеяния (ОКР)
кристаллов определяли методом Williamson-Hall на основе данных РФА. Определение
удельной поверхности (Sуд) образцов по методу БЭТ проводили на автоматизированной
сорбционной установке TriStar II 3020. Использовался объемный вариант сорбционного
метода.
Биорезорбируемость исследуемых образцов оценивали по выходу кальция в
модельный раствор через фиксированное время экспозиции. Выход кальция
рассчитывали как отношение массы Са2+, выходящего в раствор, к исходной массе
кальция, содержащегося в исследуемом образце. Для этого точную навеску материала
массой 0,2 ± 0,002 г помещали в химические стаканы с добавлением ацетатного
буферного раствора для поддержания рН = 5,5 и выдержали при температуре 37 оС с
помощью термостата. Через заданные промежутки времени измеряли концентрацию
кальция с помощью иономера ИПЛ-113 с использованием кальций-селективного
электрода «ЭКОНИКС Са».
Результаты и их обсуждение
В табл.1 приведены основные физико-химические характеристики образцов
НГАП, Si-НГАП и биоапатита “Биопласт-Дент”.
Таблица 1. Физико-химические характеристики исследуемых образцов
Образец
Фаза
Кристалличность, %
Размер ОКР
кристаллов, нм
Sуд, м2/г
(по методу БЭТ)
НГАП
ГАП
93,15
35,6
163,49
Si-НГАП
ГАП
90,10
18,6
219,18
Биоапатит “Биопласт-
ГАП
92,15
25,6
17,90
Дент”
Определение фазового состава синтезируемых образцов производилось путем
сопоставления результатов рентгенодифракционного анализа полученных образцов со
значениями данных ICDD (2008). По данным РФА установлено, что все исследуемые
образцы принадлежат к той же пространственной группе, что и гидроксиапатит –
гексагональной системы P63/m и являются однофазными. По характерному смещению
пиков в сторону, соответствующую меньшим межплоскостным расстояниям (большим
углам) (рис.1b) и изменению параметров элементарной ячейки порошков Si-НГАП по
сравнению с немодифицированным ГАП можно сделать вывод о встраивании в
решетку силикат-ионов. Кристалличность и средний размер кристаллов полученных
порошков ГАП составляли 90-93% и 18,6-35,6 нм, соответственно. Кроме того,
внедрение силикат-ионов в структуру ГАП приводило к уменьшению среднего размера
его кристаллов, и следовательно увеличению удельной поверхности от 163,49 до 219,18
м2/г (табл.1). Удельная поверхность у ГАП животного происхождения “Биопласт-Дент”
почти в 9 и 12 раз меньше, чем у НГАП и Si-НГАП, соответственно.
17268
9510
8510
7510
15268
Meas. data:10_Bio_net/Data 1
Hydroxyapatite,Ca4.992 ( P O4 )3 ( O H
)0.684,01-074-9779
Amorphous,00-000-0000
a
6510
13268
11268
9268
Intensity (cps)
Intensity (cps)
5510
4510
3510
2510
1510
7268
5268
3268
1268
510
-732
-490
20
Integrated Intensity (cps deg)
Meas. data:8_Si_net/Data 1
Hydroxylapatite,Ca5 ( P O4 )3 ( O H ),01
-073-1731
fon,00-000-0000
fon_1,00-000-0000
Amorphous,00-000-0000
b
Hydroxyapatite, Ca4.992 ( P O4 )3 ( O H )0.684, 01-074-9779
Amorphous, 00-000-0000
40
60
80
20
40
60
80
Hydroxylapatite, Ca5 ( P O4 )3 ( O H ), 01-073-1731
fon, 00-000-0000
fon_1, 00-000-0000
Amorphous, 00-000-0000
5000Методом
Integrated Intensity (cps deg)
15000 Порошковые рентгенограммы биоапатита «Биопласт-Дент» (а) и Si-НГАП (b) .
Рис.1.
Штрих-диаграмма соответствует стандартному
гидроксиапатиту.
10000
30000
20000
энергодисперсионного рентгеновского
анализа установлено, что
помимо0 кальция, фосфора, кислорода в образце
Si-НГАП присутствует кремний.
10000
20
40
60
80
Результаты ПЭМ
показывают
значительное
уменьшение
размера частиц Si- НГАП по
0
2-theta (deg)
20
40
60 факт, 80что
сравнению с незамещенным НГАП (рис. 2), но не был подтвержден
2-theta (deg)ранее отмечалось в
включение кремния в структуру ГАП влияет на форму частиц как
работе [2]. Как видно из ПЭМ-микрофотографий частицы Si-НГАП имеют игольчатую
форму длиной 60-95 нм, шириной 4-8 нм, а у частиц НГАП длина и ширина кристаллов
составляют 100-130 нм и 20-30 нм, соответственно. Такая структура и размер частиц SiНГАП должны способствовать повышению резорбируемости, а, следовательно, и
биоактивности материала по сравнению с незамещенным НГАП.
Рис. 2. ПЭМ-микрофотография наночастиц ГАП (а) и Si-НГАП (b)
Рис. 3. РЭМ- изображения порошка биоапатита «Биопласт-Дент» при различных
увеличения: а) х200, b) х1000 и с) х2000.
Размер частиц, определенный с помощью ПЭМ (рис. 2 а и b), и размер кристаллов,
рассчитанный по данным РФА, имеют близкий порядок величин. Это позволяет
предположить, что наблюдаемые частицы НГАП и Si-НГАП соответствуют
монокристаллам, а не кристаллическим агломератам.
В соответствии с данными РЭМ частицы биоапатита, предварительно
измельченного до порошкообразного состояния в агатовой ступке, характеризуются
длиной 200-1000 мкм, шириной 50-100 мкм и имеют многослойную пластинчатую
структуру (рис.3). Существенное различие размеров частиц по данным
дифракционного (табл.1) и микроскопического методов можно объяснить тем, что
дифракционный метод дает объективную и усредненную информацию о субструктуре
большого количества кристаллов, находящихся в зоне облучения, включая мелкие
частички, которые, как правило, субъективно игнорируются оператором при прямом
мотоде измерений. Это обстоятельство приводит к завышению средних размеров
кристаллов, измеренных методом РЭМ. В этой связи размеры кристаллов по данным
микроскопии существенно больше, чем таковые, рассчитанные методом рентгеновской
дифракции. Кроме, того результаты химического анализа свидетельствуют о том, что
соотношение Ca/ P для биоапатита ниже (1,60), чем для стехиометрического НГАП
(1,67), т.е. в случае ГАП природного происхождения имеет место дефицит кальция в
структуре.
Рис. 4. Биорезорбируемость исследуемых образцов в ацетатном буферном
растворе.
Результаты исследования биорезорбируемости показали, что максимальная
величина резорбции наблюдалась у образца Si-НГАП, для которого выход Са2+
составляет 12 масс. % через 5 мин и 16,5 масс.% через 180 мин после помещения
навески материала в модельный раствор (рис. 4).Образцы НГАП и Si-НГАП имеют
резорбируемость примерно в 3,5 и 4,5 раз выше, чем образцы биоапатита «БиопластДент».
Вместе с тем, важно отметить, что все графики, приведенные на рис. 2, имеют два
участка (первый от 5 до 15 мин, второй – 15-180 мин.) с разными углами наклона, что
указывает на разную скорость растворения образца в данный период времени. В
начальном диапазоне времени (0 - 15 мин) скорость растворения максимальная, а затем
наблюдается уменьшение скорости растворения. Все полученные данные по изучению
биорезорбируемости в ацетатном буферном растворе хорошо коррелируют с величиной
удельной поверхности экспериментальных образцов. Чем выше значение удельной
поверхности, тем лучше резорбируются данные образцы и наоборот.
Выводы
Методом осаждения из водных растворов синтезированы образцы
незамещенного и кремнийсодержащего наноразмерного гидроксиапатит. Проведен
сравнительный анализ физико-химических и биологических характеристик полученных
образцов с биоапатитом животного происхождения «Биопласт-Дент», представленным
ЗАО "ОЭЗ ВладМиВа" г. Белгород. Установлено, что, несмотря на существенную
разницу в условиях формирования синтетического и биологического гидроксиапатитов,
как свидетельствуют экспериментальные данные рентгеновского анализа, их
кристаллическая структура и кристалличность существенным образом не отличаются.
Внедрение силикат-ионов в структуру ГАП приводит к уменьшению среднего размера
кристаллов и увеличению удельной поверхности материала. Синтезированные
порошки НГАП и Si-НАП имеют развитую удельную поверхность и, следовательно,
потенциально обладают повышенной биорезорбируемостью по сравнению с
биоапатитом животного происхождения.
Список литературы
1. Д. Л. Голощапов, В. М. Кашкаров и др. Получение нанокристаллического
гидроксиапатита методом химического осаждения с исспользованием
биогенного источника кальция // Конденсированные среды и межфазные
границы, Том 13, №4 – с. 427-441.
2. Elliott J.C. Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium
Orthophosphates / Studies in Inorganic Chemistry 18.-Amsterdam: Elsevier, 1994.389p.
3. Weiner, S., and Addadi, L., Design strategies in mineralized biological materials. J.
Mater. Chem. 1997, 7, р. 689-702.
4. Narayan, R. J., Kumta, P. N., Sfeir, C., Lee, D. H., Choi, D., and Olton, D.,
Nanostructured ceramics in medical devices: applications and prospects. JOM 2004,
56, р38-43.
5. I.R. Gibson, S.M. Best, W. Bonfield, Chemical characterization of silicon-substituted
hydroxyapatite, J. Biomed. Mater. Res. 4 (1999) 422–428.
6. A.E. Porter, N. Patel, J.N. Skepper, S.M. Best, W. Bonfield, Comparison of in vivo
dissolution processes in hydroxyapatite and silicon-substituted hydroxyapatite
bioceramics, J. Biomater. 24 (2003) p. 4609–4620.
7. Патент 2342319 RU. Способ получения наноразмерного гидроксилапатита//
Колобов Ю.Р. и др.- дата приоритета 06.07.07, опубл. 27.12.08.
8. Патент
2500840
RU.
Способ
получения
нанокристаллического
кремнийзамещенного гидроксиапатита // Трубицын М.А. и др.- дата приоритета
16.06.2012, опубл. 10-12-2013.