МБ и ТБ биосинтеза

Стехиометрия процессов
культивирования микроорганизмов
Цель:
научится
составлять
уравнение
материального баланса процессов биосинтеза
План
1.
Основные принципы стехиометрии
2.
Вывод «формулы» биомассы микроорганизмов
3.
Расчет выхода биомассы на углеродный
субстрат
4.
Определение стехиометрических соотношений
в реальных процессах ферментации (на
примере биосинтеза лимонной кислоты)
1
Основные принципы
стехиометрии
1.

В химических процессах:
nAA + nBB = nCC + nDD
Подбор стехиометрических
коэффициентов в уравнении (nA, nB,
nC, nD) осуществляем на основании
закона сохранения материи
2
Основные принципы
стехиометрии
1.

В биохимических процессах:
Общее количество элементов, включенное в
структуры клетки, равно количеству,
взятому клеткой из питательной среды
3
Основные принципы
стехиометрии
1.

В биохимических процессах:
Субстраты
nС [углеродный субстрат]
nN [азотный субстрат]
nP [фосфорный субстрат]
nO2 [О2]
....
nX [биомасса]
Продукты
n [биомасса]
nP [продукт
метаболизма]
nCO2 [CO2]
nH2O [H2O]
...
(nX+1)X
=
4
Основные принципы
стехиометрии
1.

В биохимических процессах:
Субстраты
nС [углеродный субстрат]
nN [азотный субстрат]
nP [фосфорный субстрат]
nO2 [О2]
....
Продукты
=
nX [биомасса]
nP [продукт
метаболизма]
nCO2 [CO2]
nH2O [H2O]
...
5
2.
Вывод «формулы» биомассы

Каков элементный состав биомассы?
Таблица
1
–
Элементный
состав
биомассы
микроорганизмов (по данным элементного анализа)
Тип микроорганизмов
Элементный состав, %
С
Н
О
N
P
S
Зола
Дрожжи
47,0
6,5
30,0
7,5
1,5
1,0
6,5
Бактерии
53,0
7,0
20,0
12,0
3,0
1,0
4,0
50,0
8,0
20,0
14,0
3,0
1,0
4,0
«Усредненный»
Лесина Ю.А.
6
2.
Вывод «формулы» биомассы
Таблица 2 – Расчет числа грамм-атомов элементов в 100 г
сухой биомассы
Тип микроорганизмов
Элементный состав, %
С/12
Н/1
О/16
N/14
P/31
S/32
Дрожжи
3,92
6,5
1,88
0,54
0,05
0,03
Бактерии
4,42
7,0
1,25
0,86
0,1
0,03
«Усредненный»
4,17
8,0
1,25
1,0
0,1
0,03
«Формула»
дрожжи
бактерии
«усредненная» биомасса
С3,92 Н6,5 O1,88 N0,54 P0,05 S0,03
С4,42 Н7,0 O1,25 N0,86 P0,1 S0,03
С4,17 Н8,0 O1,25 N1,0 P0,1 S0,03
7
2.
Вывод «формулы» биомассы
С-моль - условный моль, приведенный
к одному атому углерода
«Формула»
дрожжи
С3,92 Н6,5 O1,88 N0,54 P0,05 S0,03
бактерии
С4,42 Н7,0 O1,25 N0,86 P0,1 S0,03
«усредненная» С4,17 Н8,0 O1,25 N1,0 P0,1 S0,03
С-моль
СН1,66 O0,48 N0,14
СН1,58 O0,28 N0,19
СН1,92 O0,3 N0,24
биомасса
Формула Стоутхаммера
С-моля биомассы
СН1,8 O0,5 N0,2
Молекулярная масса С-моля:
Мr = 1•12 + 1,8•1 + 0,5•16 + 0,2•14 = 24,6
С этого момента забудем о существующих мелких различиях в
составах биомассы микроорганизмов!
8
Расчет выхода биомассы на
углеродный субстрат
3.

Таблица 2 – Расчет стехиометрического выхода биомассы
для различных субстратов
Субстрат
Химическая
формула
Молекулярная
масса
субстрата
Молекулярная
масса С-моля
субстрата
Стехиометрический выход
биомассы
Фактически
измеренный
выход
биомассы, г/г
Глюкоза
С6Н12О6
(С6Н12О6)n
(С6Н12О6)n
C2H5OH
CH3OH
(CH2)nH2
180
180n
180n
46
32
14n + 2
30
30
30
23
32
~14
0,82
0,82
0,82
1,07
0.77
~1,76
0,5
0,5
0,5
0,75
0,5
1,0
CH4
16
16
1,54
0,62
Крахмал
Целлюлоза
Этанол
Метанол
Парафины
(н-алканы)
Метан
9
Определение стехиометрических
соотношений в реальных процессах
ферментации
4.



Проблемы расчета реальных процессов ферментации:
затраты субстратов на поддержание жизнедеятельности
микроорганизмов (непроизводительные затраты)
фактический выход сильно зависит от условий и скорости
роста биомассы
одновременно протекающие процессы катаболизма и
анаболизма
Стехиометрические коэффициенты определяются
из экспериментальных данных по потреблению
субстрата и образованию продуктов биохимического
взаимодействия
10
4.
Определение стехиометрических
соотношений в реальных процессах
ферментации
Общее стехиометрическое соотношение для объединенного
процесса, включающего катаболизм и анаболизм
nS S + nO2 [О2] + nN [NH3] →X + nP [Р] + nCO2 [CO2] + nH2O [H2O]
ПРИМЕР:
моль
С-моль
Экспериментально установлено, что в процессе
ферментации на 1 кг потребленной сахарозы получается
0,6 кг лимонной кислоты и 0,3 кг сухой биомассы.
Составить стехиометрическое уравнение для процесса
биосинтеза лимонной кислоты.
М (С12Н22О11) = 342 г/моль
М (С6Н8О7) = 192 г/моль
М (СН1,8О0,5N0,2)= 24,6 г/моль
11
Ответ:
nS [C12H22O11]
0,24
+
nP
0,26
+ 0,66
nO2[О2] + 0,2
nN [NH3] →[CH1,8O0,5N0,2] +
[C6H8O7] +
n0,32
n1,0
CO2 [CO2] +
H2O [H2O]
12
Материальный баланс
стадии ферментации
mст.ПС + mпос.мат. + mО2потр. ± mвл.возд. +
(mдолив.) + mст.пеног. = mк.ж. + mсо +
mбрызг.+ (mотлив.)
2
mст.ПС - масса стерильной питательной среды, кг
mпос.мат. – масса посевного материала, кг
mО2потр. – масса кислорода, потребленного из воздуха в процессе ферментации,
кг
mвл.возд. – масса влаги, принесенной (унесенной) из ферментатора, кг
mдолив./mотлив. – масса доливов (отливов), если предусмотрены технологией, кг
mст.пеног. – масса стерильного пеногасителя, кг
mк.ж. – масса культуральной жидкости, кг
mсо2 – масса СО2, выделившегося в процессе ферментации, кг
13
mбрызг. – масса жидкости, унесенной из ферментатора в виде брызг, кг
Тепловой баланс
ферментатора (на режиме ГД)
Q1 + Q2 + Q3 + Q4 = Q5 + Q6 + Q7 + Q8+ Q9
Q1- тепло, поступающее с исходными компонентами (питательная среда,
посевной материал, воздух на стерилизацию), кДж
Q2
Q3
Q4
Q5
Q6
Q7
Q8
Q9
- тепло, поступающее с теплоносителем, кДж
- тепловой эффект биосинтеза, кДж
- тепловой эффект перемешивания, кДж
- тепло, уходящее с культуральной жидкостью, кДж
- тепло, уходящее с отработанным воздухом, кДж
- тепло, на нагрев (охлаждение) аппарата, кДж
- тепло, затраченное на испарение влаги из воздуха, кДж
- потери тепла в окружающую среду, кДж
14
Тепловой эффект биосинтеза
(жизнедеятельности
микроорганизмов)

Q3 = Qж = QM0 + QS – QM – QP
QM0 – тепло, вносимое посевным материалом, кДж
QS – тепло, вносимое с компонентами питательной среды, кДж
QM – тепло, уходящее с мицелием, кДж
QP – тепло уходящее с продуктами биосинтеза, кДж
Q = mi•qсг.i
находим либо считаем
15
Тепловой эффект
перемешивания
Q4 = N • τпер.• 3600
N – мощность, затрачиваемая на перемешивание

(мощность электродвигателя), Вт
τ – время перемешивания, ч
16
Задача 1




Определить влияние объема
питательной среды и температуры
стерилизации на время выдержки.
Объемы стерилизуемой среды 5,32, 50 м3.
Температуры стерилизации 100, 120, 130 0С.
Вероятность выживания N=0,01.
Лесина Ю.А.
17
 выд.
Решение
(см.ЛК 9,10)
N0
1
  ln
К
N
К – удельная скорость гибели микроорганизмов, 1/мин
N0 – число микроорганизмов в стерилизуемом объекте
N – конечное число микроорганизмов в стерилизуемом объекте.
V,
м3
Т,
0С
К,
мин-1
N,
м.о.
N0,
м.о.
ln N0/N
τвыд.,
мин
τвыд.,
ч
5
100
0,013
0,01
51012
33,846
2603,5
43,4
5
120
1,48
22,9
0,38
5
130
14,8
2,29
0,038
32
100
0,013
2746,3
45,77
32
120
1,48
24,12
0,4
32
130
14,8
2,41
0,04
50
100
0,013
2780,6
46,34
50
120
1,48
24,42
0,41
50
130
14,8
2,44
0,041
321012
501012
35,702
36,148
18
К - в расчетах используется К Bacillius
stearothermothillus шт.1518 в зависимости от
температуры (табл. 10.2)
Т, Сº
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
К, мин-1
0.013
0.017
0.023
0.03
0.036
0.048
0.062
0.083
0.109
0.135
0.163
Т, Сº
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
К, мин-1
0.193
0.234
0.302
0.412
0.540
0.653
0.081
1.002
1.210
1.480
1.83
Т, Сº
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
К, мин-1
2.44
3.07
3.77
4.57
5.90
7.40
9.35
11.4
14.8
16.6
18.6
N0 = 106м.о./мл х 5106мл = 51012
N0 = 106м.о./мл х 32106мл = 321012
N0 = 106м.о./мл х 50106мл = 501012
19
Задача 2


Рассчитать геометрический объем емкостного выдерживателя для
стерилизации питательной среды.
Исходные данные для расчета.
1. Состав концентрата питательной среды (вес.%)


сахароза
7,0
кукурузный экстракт
3,0
сульфат калия
0,15
соевая мука
3,5
мел
0,8
хлорид натрия
0,4
подсолнечное масло
0,6
2. Объем питательной среды, м3
35
3. Температура стерилизации, 0С
127
4. Плотность концентрата питательной среды, кг/м3
1070
5. Объем конденсата, % от объема питательной среды
15
6. Время операции стерилизации , ч
3
Вероятность выживания микроорганизмов при непрерывной
стерилизации принять 0,001.
Обсемененность минеральных солей принять по обсемененности мела,20
подсолнечного масла – по зеленой патоке.
Решение
(см. ЛК 9,10)
V ПС
Vап. 
Vp


 стер.
N0
1
  ln
К
N

VПС – объем стерилизуемой питательной среды с конденсатом, м3;
τстерил. – время стерилизации всей среды, ч;
φ - коэффициент заполнения выдерживателя, 0,9

Vап.
К = 7,4 мин-1, N = 0,001
N0
35 1
35 1
5840,03

 ln

 ln
3 7,4
0,001 3 7,4
0,001


 63,59 м3
0,9
0,9
Лесина Ю.А.
21
Расчет No

Рассчитаем массу концентрата ПС:
Объем конденсата составляет
Vконд. = 3515/100 = 5,25 (м3)

Объем концентрата ПС
Vконц.ПС = 35–5,25 = 29,75 (м3)

Масса концентрата ПС
m конц.ПС = Vρ = 29,75 1070 = 31832,5 (кг)

Лесина Ю.А.
22
Расчет No
mконц.ПС•вес.%\100

Компонент
100-(7,0+3,0+,0,15+3,5+0,8+0,4+0,6)=84,55
Рассчитаем обсемененность ПС
сахароза
K2SO4
соевая
мука
мел
NaCl
подсолн.
масло
вода
водопров.
0,15
3,5
0,8
0,4
0,6
84,55
Вес.%
7,0
rукурузный
экстракт
3,0
Масса, г
2228,3103
954,96103
47,75103
1114,14103
254,66103
127,33103
191,0103
26914,36103
6102
6106
1102
8,8104
1102
1102
4102
4102
1,337109
5729,76109
0,0048109
98,04109
0,0255109
0,0127109
0,0764109
10,77109
Обсемененность, сп./г
Обсемененность, сп.
Обсемененность
концентр.
ПС, сп.
(1,337+5729,76+0,0048+98,04+0,0255+0,0127+0,0764+10,77) 109 =
5840,03109
mкомп.ПС(г)•обсемененность, сп./г
Лесина Ю.А.
23
Таблица 10.1 – Обсемененность компонентов
питательных сред споровыми формами
микроорганизмов
Компонент среды
Число спор в 1 г вещества
Глюкоза
(3.3-6.0)·104
Сахароза
(1.9-6.0)·102
Зеленая патока
4·102
Кукурузный экстракт
(3.0-6.0)·106
БВК
0.7·104
Соевая мука
(8.2-8.8)·104
Кукурузная мука
(2.1-3.0)·106
Мел
(0.2-1.0)·102
Вода водопроводная
(2-6)·102
Лесина Ю.А.
24
Задача 3


Рассчитать оптимальный трубчатый
выдерживатель для стерилизации
питательной среды
Исходные данные для расчета:
1. Объем среды, м3
50
2. Температура стерилизации, 0С
132
3. Объем конденсата, % от объема стерильной ПС
15
4. Плотность среды, кг/м3
5.Вязкость среды, Пас
6. Время операции стерилизации, ч

1030
2,510-3
5
Вероятность выживания микроорганизмов при непрерывной стерилизации
принять 0,001.
25
Решение
 4  Vсек .   

d  



0 , 0385
 4  Vсек . 1030 
d 

2500


0 , 0385
 2 V р 


  К   
ср . 

0 , 307


2 V р


 3,14К   
ср . 

Лесина Ю.А.
0 , 307

26
Vсек . 
VПС
 стер.
50
  10 м3/ч
5
N0 = 106м.о./мл х 50106мл = 501012
N
 210-13
N0
К    48
   48 / 18,6  2,58
ср .
ср .
V p  Vсек .  ср.  10  2,58  25,8
27
 4 10 1030 
d 

 2500 
0, 0385
 2  25,8 


 3,14  48 
0, 307
 1,1139  0,7181  0,8 м
Vp
25,8
l

 41,1м
0,785  d 0,785  0,8
Лесина Ю.А.
28