Газовая хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография

Газовая хроматография и
высокоэффективная
жидкостная
хроматография
Хроматография, 1903
Принцип жидкостной хроматографии состоит в
разделении компонентов смеси, основанном на
различии в равновесном распределении их между
двумя несмешивающимися фазами, одна из которых
неподвижна, а другая подвижна.
Элюент (самотек)
Колонка (AL2O3, 50-100 мкм)
Разделение пробы на компоненты
(до нескольких часов и даже дней!)
Детектор?
М.С. Цвет (1872-1919) г
• У
Сократить путь
внешней
и внутренней
диффузии
Уменьшение
диаметра
зерен
Увеличить скорость разделения?
Большое входное
давление
Применение
насосов
высокого
давления
Уменьшение
диаметра и
увеличение
длины колонок
Высокоэффективная жидкостная
хроматография
1968б DuPont
Задачи ВЭЖХ: как можно более полно разделить вещества
за как можно меньшее время
Устройство аппаратуры ВЭЖХ
Дегазация элюента
растворённые в элюенте газы могут вызвать нарушения в
работе системы
выделяются в виде пузырьков, которые,
накапливаясь в детекторе, вызывают
усиленный дрейф нулевой линии
крупные пузырьки могут скапливаться в
обратных клапанах, из-за чего может меняться
произвольным образом расход и нарушаться
градиентный режим
•Кипячение
•Ультразвуковая баня
•Вакуумирование
•Бок дегазации (пористый фильтр с вакуумом)
•Фильтр с вытяжкой
Насыщающая колонка
При необходимости использовать агрессивных элюентов
• содержит материал, сходный с аналитической
колонкой
• размер зерна больше и имеет более широкое
распределение
• высокая пористость
• легко заменяемый вручную материал
• подвижная фаза растворяет набивку предколонки. Это
– колонка, которой жертвуют, чтобы насытить
подвижную фазу растворённым материалом набивки
Инжектор
устройство ввода пробы
• Ручной инжектор включает петлю-дозатор и
приёмник для иглы шприца. Проба вводится в
инжектор с помощью шприца-пробоотборника.
• В автоматических устройствах подготовки и ввода
пробы (и в автоматических инжекторах) роль петли
играет сама игла.
Предколонка
• Еще одна защита колонки от
примесей из проб или прибора
• заполненная тем же по размеру и
составу материалом, что и
аналитическая
• малая длина: от 10 мм до 30 мм – и
внутренний диаметр –от 2 мм до 4
мм (чтобы не увеличивать «мертвый
объем»)
Аналитическая колонка
Набивка, сорбент, неподвижная фаза?
Набивка+химическая модификация = неподвижная фаза
фиттинг
фритта
2.1 мм
1мм
4.6 мм
Дискраспределитель
фритта
Детекторы
• спектрофотометрический детектор ультрафиолетового (УФ)
диапазона (поглощение, нм)
• электрохимический (сила тока)
• Рефрактометрический –универсальный (показатель
преломления)
• Флуориметрический (флуоресцентное излучение
поглощенного света)
• Детектор рассеяния ( различие давлений паров
хроматографических растворителей, входящих в состав
элюента, и анализируемых веществ)
• Комбинирование с Масс-спекторметрией
Типы ВЭЖХ
(Виды фаз)
Нормальная фаза
Неоднородность поверхности силикагеля
•
•
•
•
•
Немодифицированные сорбенты: Al2O3,
SiO2, графитированный углерод, ZrO2,
гидроксилапатит [Ca10(PO4)6(OH)2]
Модифицированные материалы (привитая
фаза)
Импрегнированные серебром (πорбитали!)
Гликоли (жидкость-жидкость), быстро
вымываются
неполярные подвижные фазы (пентан,
гексан, гептан, изооктан)
Боятся воды!
Модифицированные материалы
(химически привитая фаза)
•
•
•
•
С18 (октадецил) - обращенная
С8 (октил)
С4 (бутил)
фенил
Двойственность применения: неполярные растворители – прямая фаза
Полярные растворители – обратная фаза
Обращенная привитая фаза
Алкил
Алкил + бензольное кольцо
• Фаза С18
используется в 80%
лабораторий
Нагрузка (8-12%)
Энд-кэппинг (хлортриметилсилан)
Вытравка металлов
Ион-парная хроматография
• Фаза: С18, С8
• Элюент: обычный + противоионы
(ион-парный агент): для анализа
анионогенных веществ используют
соли тетраалкиламмония, а для
катионогенных – алкилсульфонаты и алкилсульфаты.
• Объекты: Ионы или легко
ионизируемые вещества
Ионообменная хроматография
•
соединений с малой молекулярной массой и большим зарядом. контроль
содержания многочисленных анионов в питьевой воде (например, NO2–,
NO3–, ); контроль за составом сточных вод на присутствие как катионов (Cu2+,
Cr6+), и анионов(SO32–, CN-)
Особенности материала колонки:
Катионообменные материалы (катиониты) несут отрицательный
заряд и используются для разделения веществ, содержащих катионы.
Анионообменные материалы (аниониты) несут положительный заряд и используются для разделения веществ, содержащих анионы.
Аффинная хроматография
•
•
•
•
•
•
•
ферменты и субстраты,
антитела, сахара
(1) загрузка пробы в колонку;
(2) вымывание
невзаимодействующего
вещества из колонки;
(3) отрыв анализируемого
вещества от поверхности
(конкурирующий лиганд или
не вызывающий денатурации
высвобождающий реагент)
(4) повторное
уравновешивание колонки.
Хиральная хроматография
Различие энергии взаимодействия между
поверхностью с хиральной привитой фазой
и каждого из энантиомеров определяемого
вещества, взаимодействующего с ней
L
D
Запах
Запах
цитрусов хвои
-Колонки типа I (Пиркле): силикагель- «ножка» -хиральная
привитая фаза высокой чистоты
-Колонки типа II: целлюлоза и амилоза
-Колонки типа III: циклодекстрины
-Колонки типа IV: лигандообменная хроматография, разделению
предшествует образование координационных соединений
-Колонки типа V: силикагелевая основа, к которой привит альбумин, выделенный из сыворотки коровьей крови, либо α-1-кислотный гликопротеин
Виды ВЭЖХ
•Обращенно-фазная
•Нормально-фазная
•Ионная
•Ион-парная
•Ионообменная
•Эксклюзионная
•Гел ь-фильтрационная
•Лигандообменная
• Хиральная
•Аффинная
•Мицеллярная
•Серебряная обрашенно-фазная
•Жидко-жидкостная
•Экстракционная
•Донорно-акцепторная
•Комплексообразующая
•Инверсионная эксклюзионная
•Нелинейная
•Капиллярная
•Микронасадочная
• Многомерная
•Перфузионная
•Вытеснительная
•Сверхбыстрая
•Турбулентная
•Непрерывная
•Противоточная
•Центрифужная
•С движущимся слоем
•Высокотемпературная
•Мембранная
•Иммунная
•Гидрофобная
Подготовка растворителя и пробы
• Растворители качества
ВЭЖХ: 0 сорт для УФдетектирования!
Иначе:
• Шумы на базовой линии
• Дрейф базовой линии
• Ухудшение разделения
• Взаимодействие с
веществами пробы
• Порча сорбента колонки
•Проба готовится в том же
растворителе, что используется для
элюирования
•Проба не должна иметь
механических примесей,
недопустимо образование эмульсяя,
только прозрачный раствор
•Если проба не растворяется,
добавляют растворитель,
смешивающийся с элюентом,
растворяющий пробу (необходимо
сделать холостой ввод этой смеси
растворителей)
подвижная фаза или элюент?
Способ Элюирования
Изократический
Преимущества:
1. Не требуется уравновешивание
колонки после анализа.
2. Отсутствует дрейф нулевой линии,
вызванный изменением состава
элюента.
3. Можно применять любые
детекторы.
Градиентный
Пеимущества:
перед изократическим:
1. Ёмкость колонки выше, чем в
изократическом.
2. Общая продолжительность
элюирования меньше, чем в
изократическом.
3. Удаётся получить более узкие пики,
что улучшает условия детектирования
Когда разделение считается
достигнутым?
Чем больше компонентов в смеси, тем
требуется больше времени для разделения
0
2
3
10
60
мин
время выхода анализируемого вещества больше, чем время выхода несорбируемого
вещества, например пика растворителя, но достаточно мало с точки зрения
практической осуществимости и эффективности анализа
Основная характеристика пика на
хроматограмме время удерживания
1. Структура (строение) молекул разделяемых веществ.
2. Состав растворителя, в котором растворена проба.
3. Объём пробы.
4. Физические характеристики и химизм поверхности материала
набивки.
5. Размеры колонки (т.е. длина и внутренний диаметр).
6. Состав подвижной фазы.
7. Температура в системе.
8. Скорость потока подвижной фазы.
9. Внеколоночный объём в системе (в большинстве случаев – объём
инжектора, соединительных трубопроводов и детектора).
• Agilent Compact LC с колонкой 150*4.6 с
неподвижной фазой Exlips Plus C-18 (5 мкм).
• Анализ с использованием ацетонитрила и
воды в качестве подвижной фазы, с
добавлением 0.1% трифторуксусной кислоты
как модификатора. Проба в объеме 20 мкл.
скорость потока 0.4 мл/мин, детектирование
осуществляется в УФ-диапазоне
Как выбрать длину волны для УФдетектирования?
Пример применения селективной длины волны, 310 нм
(Экстракт коры осины)
Параметры, используемые для описания хроматограмм
Параметры качества колонки
•
•
•
•
•
•
Время удерживания несорбируемого компонента, t0.
Время удерживания, tr, Время, за которое компонент проходит всю систему от инжектора (момент
ввода пробы принимается за t = 0) до детектора
Коэффициент ёмкости k‘ = степень удерживания компонента k’=(tr-t0)/t0
Высота пика hp.
Ширина пика wx
Число теоретических тарелок N = показатель эффективности разделения. N =5,54(tr /tw1/ 2 )2,
Высота, эквивалентная теоретической тарелке
ВЭТТ или Н = длина участка колонки, на котором
имеется одна теоретическая тарелка H = L / N
Приведенная высота, эквивалентная
теоретической тарелке ПВЭТТ или h. используется
для сравнения эффективности (т.е. качества
упаковки) колонок с разными диаметрами зёрен
сорбента h = H / dp