Тарновская С.И

Saint Petersburg Institute of Bioregulation
and Gerontology
Пептидергическая регуляция функций
поджелудочной железы при
возрастной патологии
Tarnovskaya Svetlana
svetlanatarnovskaya@gmail.com
Возрастная патология поджелудочной железы
С возрастом физиологическая
активность эндокринных клеток
поджелудочной железы
(инсулинпродуцирующих β-клеток,
глюкагонпродуцирующих α-клеток и
соматостатинпродуцирующих δклеток) снижается, что приводит к
развитию сахарного диабета 1-го и 2го типов.
Регуляция дифференцировки клеток
поджелудочной железы
(Joel F. Habener, Daniel M. Kemp, and Melissa K. Thomas. Minireview: transcriptional
regulation in pancreatic development // Endocrinology. 146(3):1025-1034, 2005)
Тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp
Крысы с сахарным
диабетом, вызванным
введением аллоксана
Тетрапептид
Lys-Glu-Asp-Trp
Пациенты с сахарным
диабетом 1го и 2го типов
Снижение уровня
глюкозы в крови
Цель исследования:
изучить
влияние
тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию
факторов дифференцировки эндокринных клеток поджелудочной
железы человека.
Задачи:
1.Оценить возрастную динамику экспрессии сигнальных молекул –
маркеров дифференцировки клеток поджелудочной железы при
старении
2.Изучить влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию
указанных маркеров при старении клеток поджелудочной железы
методами иммуноцитохимии
Материалы и методы
Диссоциированное культивирование
Объект исследования: культура клеток поджелудочной железы человека получена из
14 недельного плода, умершего антенатально.
1 пассаж – «молодые» культуры,
14 пассаж – «старые» культуры.
Форма опыта:
Контрольные культуры клеток – контроль 1 (добавление физиологического раствора
0,9%),
контроль 2 (добавление контрольного тетрапептида
Ala-Glu-Asp-Leu, 20 нг/мл)
Подопытные культуры клеток – добавление тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp, 20 нг/мл.
Клетки культивировали во флаконах (25 см2, JetBiofit) в стандартных условиях (5% СО2,
среда ДМЕМ, L-глутамин, 15% FBS SC-BIOL, 1% пенициллин-стрептомицин).
В работе использовали первичные моноклональные антитела к Pax6, Nkx2.2, Pdx1
(1:50, Abcam) и вторичные антитела – биотинилированные антимышиные
иммуноглобулины (Novocastra).
Для пермеабилизации использовали 0,1% тритон Х100.
Визуализацию окраски проводили с применением пероксидазы хрена и
деаминобензидина (EnVision Detection System).
Площадь экспрессии маркеров оценивали морфометрическим методом (микроскоп
Nikon Eclipse E400, цифровая камера Nikon DXM1200, ПК Intel Pentium 4,
программное обеспечение «Vidеotest Morphology 5.2»).
Материалы и методы
Молекулярное моделирование
выполнялось с использованием лицензионного программного
обеспечения Molecular Operating Environment 2012.10
1. Построение молекул
Фрагмент ДНК 5‘-ATATGGCAGGGGTAA-3’•3'-TATACCGTCCCCATT-5‘
взят из белковой базы данных (PDB) под номером 2KV6.
Пептиды Lys-Glu-Asp-Trp и Ala-Glu-Asp-Leu построены в
левовращающей конформации.
Молекулы ДНК и пептиды протонировались при рН7, Т=300К,
NaCl 0.1 моль/л и минимизировались в силовом поле
Amber12:EHT. Растворитель учитывался в неявном виде как
генерализованная борновская модель с диэлектрической
постоянной е=80
2. Расчет ДНК-пептидных комплексов
Для предсказания наиболее энергетически выгодных
ориентаций пептида в молекуле ДНК и расчета энергии связи
использовались алгоритмы докинга и штрафные функции
London dG и GBVI/WSA dG
Исследуемый и контрольный пептиды
Пептид
Lys-Glu-Asp-Trp
Пептид
Ala-Glu-Asp-Leu
(контрольный)
Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию
факторов дифференцировки клеток ПЖ
* - р<0,05 по сравнению с контролем
Pax6 – фактор дифференцировки (ФД) α-клеток; Pdx1 – фактор дифференцировки βклеток
Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию
факторов дифференцировки клеток ПЖ
* - р<0,05 по сравнению с контролем
Foxa2 – ФД β-клеток ; Nkx2.2 – ФД α-клеток и PP-клеток
Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию
факторов дифференцировки клеток ПЖ
* - р<0,05 по сравнению с контролем
Pax4 – ФД β-клеток; Ptf1a- ФД ацинарных клеток
Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию
генов ФД ПЖ
* - р<0,05 по сравнению с контролем
Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию
генов ФД ПЖ
* - р<0,05 по сравнению с контролем
Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию
генов ФД ПЖ
* - р<0,05 по сравнению с контролем
Предполагаемая мишень действия пептидов
PDX1 gene (или Ngn3, Pax4, Ptf1a )
mRNA
Спектры поглощения ДНК-пептидных
комплексов
C(Pep) = 1 mg/ml, C(DNA)=0,05 mg/ml, С(NaCl) = 0,005M
Гипотетический механизм действия
коротких пептидов
Электростатические характеристики пептидов
(pH 7.4, T=300 K)
Lys-Glu-Asp-Trp (Ʃq = 0)
Ala-Glu-Asp-Leu (Ʃq = -2)
Электростатические характеристики ДНК
(pH 7.4, T=300 K)
Большая бороздка
5’-AAAAAAAAAA-3’
3’-TTTTTTTTTT-5’
Малая бороздка
5’-AAAAAAAAAA-3’
3’-TTTTTTTTTT-5’
Электростатические характеристики ДНК
(pH 7.4, T=300 K)
Большая бороздка
5’-CCCCCCCCCC-3’
3’-GGGGGGGGGG-5’
Малая бороздка
5’-CCCCCCCCCC-3’
3’-GGGGGGGGGG-5’
Электростатические характеристики ДНК
(pH 7.4, T=300 K)
Большая бороздка
5’-ACGTACGTAC-3’
3’-TGCATGCATG-5’
Малая бороздка
5’-ACGTACGTAC-3’
3’-TGCATGCATG-5’
Электростатические характеристики ДНК
(pH 7.4, T=300 K)
Большая бороздка
5’-GACCGTCAGC-3’
3’-CTGGCAGTCG-5’
Малая бороздка
5’-GACCGTCAGC-3’
3’-CTGGCAGTCG-5’
Электростатические характеристики ДНК
(pH 7.4, T=300 K)
Большая бороздка
5’-GGCAGG-3’
3’-CCGTCC-5’
Пептид
Lys-Glu-Asp-Trp
Предполагаемый сайт связывания для
пептида Lys-Glu-Asp-Trp
Gene
gene regulatory region, range -499 to 100 bp (cDNA 5'→3')
GenBank №
Pdx1
ATCAAATGCTTCTGACCTAGAGAGCTGGGTCTGCAAACTTTTTTTTTATCGTATTCCGCAACAGTTAAATAAAAAATTAAAAACTCAACATGTCTCCT NM_000209.3
TGTAAACTACATCAATTAACAAACACACTATGTCCATTATCAAATATAATAGAAAAAATATAGGAAAATAGAAAATAGAAAAATATAGGAAAATAG
AAACTTTTAAGCCACGGTGAAAATGTTTCTATAAATGAGTGGTTCTAATGTTTTCGTGAGCGCCCATTTTGGGGAGCACCGCCAGCTGCCCGTTCAG
GAGTGTGCAGCAAACTCAGCTGAGAGAGAAAATTGGAACAAAAGCAGGTGCTCGCGGGTACCTGGGCCTAGCCTCTTAGTGCGGCCAGCCAGGC
CAATCACGGCCCCCGGCTGAACCACGTGGGGCCCCGCGGAGCCTATGGTGCGGCGGCCGGCCCGCCGGTCCGCGCTGGCTGTGGGTTCCCTCTG
AGATCAGTGCGGAGCTGTCAAAGCGAGCAGGGGTGGCGCCGGGAGTGGGAACGCCACACAGTGCCAAATCCCCGGCTCCAGCTCCCGACTCCCG
GCTCCCGGCTCCCGGCTCCCGGTGCCC
Pax6
GGCCCGAAGCCGCCGAGAGAGCTCGGGACAGCGCAGGACCAGGCAGCCGCTCGCTCTCCTGTCACCTTAACTGCAGGCTCCGAGGGGCGCCTTT NM_000280
GGAGTGTACTGAGGTGTGTCCTAATCGTGCGGCATTCAACAAATGGACTTCTGGTGTGTGGTCAGAAGAGAAAAGCCATTTACTTACTTTCCTCCC
CGGTTTTCTGGCAACAGCTGAAGGGGAGCTGCCTCCGTGGACTGAGCAGACCCAGGAGAGGGAGTCGTGGTGCGGAGACACACGCACCACACA
CAGATGACCGGTGGCACACACGACACACGCTGACATACCGACATCGCCAGTGGGACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGA
GAGAGAGAGAGAATCCCTCCCAGCATTGGTCATCCGCCCCCCCACCCAGGCTTCCACTCCCCCTCCCCTCTTATCTCCCCTGGCTTCCCCTCCTCTCG
GGCGCTGCGAAAAGCAGCCGCACTTAGTCAACAAATGGCACGTGGGAGAAGTTGGTGAGTGTTTGGTGAGGACTCTTCAGGGCTTTTCACAAGA
ACCCTCTGTACACAAAGTAAGTGGCGTGTT
Pax4
GCCAGCTCTCAAAGAAAGCAGCTTGCGTTGACAGCCTGGGGGCAGCAAGGATGCAGTCTCCCAGGAGAGGATGCACTCGGTGGTGGGAAGCCA NM_006193
GGCTGGAGGGGCCTGAGTGACCCTCTCCACAGGCGGGCAGGGCAGTGGGAGAGGTGGTGTGTGGATACCTCTGTCTCACGCCCAGGGATCAGC
AGCATGAACCAGCTTGGGGGGCTCTTTGTGAATGGCCGGCCCCTGCCTCTGGATACCCGGCAGCAGATTGTGCGGCTAGCAGTCAGTGGAATGC
GGCCCTGTGACATCTCACGGATCCTTAAGGTAATGGGCCAGCACCTTTACCCAGTGATGGGGACAGGAAGCAGGGAGAAAGGGCTCCTCTGAAG
GCAAGAGCCTGGGGCTGTTGCAGGCTCTGAGGGCTTCTGGGACTTGGGTCACTTCCTGGGAGATCCTCTCGGAGGTTGAAAAGGGGAGCCTCAG
GCCCTCAAAGGTGAGGCTGGACTCCCGACTTCATGGCCTGGTCCAGTAAGTCTTGGCTTTGTCTTATAGCCTCCTCCTGTCCCAGGGACACTCTCCT
TCCTTCTGCCCATCATGCCTCACCTGTCCCTGCTT
Nkx2.2
TCCCCTCCTCCTCCCCACCCCCACCTTTTTTAAGATGCAATTTGTTAAAACGGCCCTTTCAAGTGTGTGGACTCGCGAGCGACGCGGTGGCCCTTTGT NM_002509.3
ATGTAAATACTGGGTTTAAAAAAAAAAAGGCTCGCCCCGTCTTTGCAATTAATTGACACGTTACACCTCTCATCTTGCTCTAGAGGGCCGTTGGCTG
GGAGCGCGGAGCTCCCCAAAACCCACAATTTCACATCTGCAAATACTGTCTTCATCCACTTGACTCCCAAGACCCGCCCACACGTGGCCAACCTTTG
CGTTTTTAATGTCTCTTCCCCCTTTTTTCCACCCTTCTCCCGCTCCCTCTCTCGCTCCCCCTCCCTCCCTCTTTCTTTCCCTCCCTCCCTCTCTTTCTCCCCC
TCTCCCCGCCTCCCCAGGTTCGTGAGTGGAGCCCAGCCTTATATGGACTGATCGCTCGGGCAATGGCCCATTTTTTCCTCGCCACCAGCCGCCACCG
CGCGCCGAGCGGCCGCCGGAGCCCGAGCTGACGCCGCCTTGGCACCCCTCCTGGAGTTAGAAACTAAGGCCGGGGCCCGCGGCGCTCGGCGCGC
AGGCCGCCCGGCTT
Foxa2
CGAAGCTCCGTGTCTGCCATCTCGCCTGTCTTCTGCCACCATCGCCCCCAATTTTGGACAGGTGGGCTGGATGCCCACTAGTTCCTATGCATTCTCTG NM_153675.2
TGTCTGAGGGGGTGGGTACAGGGCTGGATCCCCAAGGTCCAGCCAGGTTTTCAGAACCAAGAAAGAGCCTCCACATCCAAACACCTGCAATATCC
CCCCACTCCAAATCTGGGCTCACAGGCTAACCCAGAACAGAAGACAATTTTTGAACCCAAGAGCTGCTGGGGAAATAAAAGTATACGATTGCTGG
AGTTTCTAATTTCTATTAAGCAGTCCCTCTGGAAGACAGAGAGGACAGAGACGCTCTTGAAGTCAACTCCATATGCCCCATCATTGATTCCTGGATT
CTTCTCTCCTCACCCCTCCCTCCCCACCTCCTGCCCTGTTTGTTTTAGTTACGAAATGCTGTGGGCACCTCGGTTGTGACTGAAAAGTAACCTTGAAA
CACGCCGGCCTGAATATCAGAGACAAATCTCAGCCTCCCAACCGTCGGCCGCTGCTAGAGGGGCTGCTTGCGCCAGGCGCCGGCCGCCCCACTGC
GGGTCCCTGGCGGCCGGTGTCT
Взаимодействие пептидов с ДНК
Фрагмент В-ДНК
(5‘-ATATGGCAGGGGTAA-3’•3'TATACCGTCCCCATT-5‘)
получен из Protein Data Bank
PDB code 2KV6 (SOLUTION NMR) .
Ebond = -14.5 kcal/mol
Пептид
Lys-Glu-Asp-Trp
Пептид
Ala-Glu-Asp-Leu
Pdx1 связывается с ДНК по большой
бороздке
..nlterhikiwfqnrrmkwkkeed
2.4 Ȧ resolution crystal structure of the Pdx1
bound to a target DNA (PDB: 2H1K, Method: x-ray
diffraction)
Заключение
• Экспериментальные данные, полученные методами
иммуноцитохимического анализа и ПЦР, позволили
выявить стимулирующее действие пептида Lys-GluAsp-Trp на факторы дифференцировки клеток
поджелудочной железы
• Методами молекулярного моделирования рассчитан
комплекс ДНК-пептид в предполагаемом сайте
связывания
Спасибо за внимание!