Лекция № 7 - ИНСТИТУТ ЖИВЫХ СИСТЕМ
advertisement
Лекция № 7 Теории радиобиологического действия Основные группы теорий биологического действия излучений. Теория точечного нагрева. Стохастическая теория. Гипотеза липидных радиотоксинов и цепных реакций. Структурно-метаболическая теория. Принцип попадания и мишени в радиобиологии. Границы применения принципа попадания и мишени. Единая теория биологического действия ионизирующих излучений. Если проанализировать основные вехи формирования взглядов на природу радиобиологического эффекта, то, как и для развития других научных дисциплин, здесь легко установить традиционную зависимость возникновения и судьбы гипотез от возможности интерпретации новых экспериментальных фактов. Смена представлений в радиобиологии происходила и происходит особенно быстро, так как они в значительной степени связаны с бурным прогрессом ядерной физики и молекулярной биологии. Можно четко наметить два направления в развитии теоретических построений. Одно из них выражает стремление установить общие, в основном феноменологические, но обязательно количественные закономерности, характеризующие начальные звенья лучевого поражения клетки. Другое – объединяет представления, стремящиеся объяснить все многообразие конкретных лучевых реакций биологических объектов; отсюда преимущественно качественный, описательный характер гипотез этого направления. Наиболее ранние и известные представления, относящиеся к первому направлению, принято обозначать термином количественная радиобиология, хотя, конечно, в радиобиологии есть много и других количественных закономерностей. Камень преткновения на пути разгадки основного радиобиологического парадокса состоит в необходимости правильного истолкования несоответствия между ничтожным количеством поглощенной клеткой энергии излучения и вызываемым экстремальным биологическим эффектом. При объяснении этого парадокса в количественной радиобиологии были сформулированы два положения, лежащие в основе так называемой теории мишени. Первое из них – принцип попаданий – характеризует особенности действующего агента – дискретность поглощения энергии. Второе – принцип мишени – учитывает особенность облучаемого объекта – клетки – ее высокую гетерогенность в морфологическом и функциональном отношениях, а, следовательно, различие в ответе на одно и то же попадание. История количественной радиобиологии восходит к началу 20-х годов, когда Ф. Дессауэр сделал весьма важное обобщение, распространив известные к тому времени физические закономерности взаимодействия излучения с веществом на биологические объекты. Он предположил, что большой биологический эффект при ничтожном суммарном поглощении энергии объясняется тем, что она концентрируется в малых объемах, приводя их к микролокальному разогреву; отсюда и ее название – гипотеза точечного тепла: – ионизирующее излучение обладает очень малой объемной плотностью по сравнению с другими излучениями – излучение обладает большой энергией, величина которой значительно превосходит энергию любой химической связи – облученный биологический объект состоит из относительно безразличных и весьма существенных для жизни микрообъемов и структур – в облучаемом объекте при поглощении относительно небольшой общей энергии в 1 отдельных, случайных и редкорасположенных микрообъемах оставляются настолько большие порции энергии, что их можно сравнить с микролокальным нагреванием – так как распределение «точечного тепла» является чисто статистическим, то конечный эффект в клетке будет зависеть от случайных "попаданий" дискретных порций энергии в жизненно важные микрообъемы внутри клетки; с увеличением дозы увеличивается вероятность таких попаданий и наоборот. Учитывая наличие в клетке более важных для жизни и менее существенных структур и микрообъемов, а также случайное распределение «точечного тепла», Ф. Дессауэр пришел к выводу о том, что исход клеточной реакции зависит от вероятности случайных попаданий дискретных порций энергии именно в эти жизненно важные микрообъемы-мишени. Наблюдая за количественными закономерностями радиобиологических реакций, он предположил, что они осуществляются лишь в том случае, если в клетке произошло определенное число «попаданий» в мишень. Действительно, если при анализе зависимости эффекта от дозы принять в качестве регистрируемой реакции долю пораженных объектов, то легко обнаружить две специфические черты действия ионизирующих излучений. 1. Большинство клеточных реакций протекает практически при отсутствии порога, с нарастанием эффекта при увеличении дозы, что трудно объяснить изменением индивидуальной чувствительности, так как требует допущения ее невероятно высокой вариабельности. 2. Кривые выживания отражают не столько степень проявления эффекта у отдельных особей (клеток) с повышением дозы, сколько увеличение количества (доли) пораженных единиц, т.е. возрастание вероятности проявления регистрируемой реакции. Иными словами, летальный эффект ионизирующих излучений имеет вероятностный характер вследствие случайного распределения элементарных актов первичного взаимодействия частиц с чувствительными объемами облученных объектов. В этом и состоит принципиальное значение первоначальных взглядов, хотя само понятие «точечного тепла» потеряло значение. Использование основных положений теории мишени ограничивается строго определенной областью – анализом самых первичных элементарных радиационных событий. Это становится понятным хотя бы из интерпретации самих терминов – мишень и попадание. При рассмотрении радиобиологических эффектов на молекулярном и (или) клеточном уровне термин мишень удобно использовать для формального обозначения того микрообъема, в котором должны произойти одна или несколько ионизаций, приводящих к изучаемой реакции. В зависимости от числа попаданий, необходимых для поражения, различают одно-, двух- или многоударные объекты или реакции, причем учитываются попадания в одну или разные мишени, которые функционально связаны. Отсюда ясно, что попытки применения теории мишени для объяснения природы и этапов формирования конечных лучевых реакций клеток и тем более организмов неправомочны. Так как при формулировании самих понятий «попадания» или «мишеней» не имеются в виду какие-то конкретные физикохимические или биохимические процессы, происходящие в микрообъеме. Достоинством описываемых теоретических представлений о механизме летального действия ионизирующих излучений является простота объяснения основных экспериментальных данных. Для определения природы мишени следует привлекать данные, получаемые при использовании специальных методов исследования. Именно эти обстоятельства уже в 40-ых годах сделали очевидным необходимость строгого ограничения применения теории мишени только для анализа поражения одноударных эффектов. В частности, потребовалось расширить само понятие попадания, так как стало известно, что первичные повреждения элементарных клеточных структур могут 2 вызываться не только непосредственной их ионизацией, но и опосредованной: химически активными продуктами радиолиза окружающей среды. Кроме того, вследствие обнаружения миграции энергии по макромолекулам даже при непосредственных формах взаимодействия, реализация повреждения может происходить далеко от места первоначального «попадания». Таким образом, классическая теория попаданий, плодотворная при анализе количественных закономерностей радиационного поражения отдельных мишеней, не ставит своей задачей решения вопроса о том, какими процессами связано поражение мишеней с проявлением конечного эффекта. Все это обусловило появление в конце 60-х годов новой теории, призванной, согласно определению ее авторов О. Хуга и А. Келлерера, изложить теорию попаданий на основе стохастического принципа. В основе теории мишени лежало предположение о том, что характерные зависимости доза–эффект могут быть отражением квантованного характера взаимодействия излучения с веществом и наличия в клетках высокочувствительных объемов – мишеней. В случае очень массивных повреждений конечный эффект действительно детерминирован уже на начальной стадии, но в подавляющем большинстве других ситуаций все случайные факторы затрагивают более поздние звенья причинноследственной цепи, ведущей к конечному эффекту. При этом каждому лабильному состоянию объекта соответствует определенная повышенная вероятность наступления регистрируемой реакции, возрастающая с увеличением предварительного повреждения. Таким образом, при формировании радиобиологического эффекта всегда существует суперпозиция множества случайных событий, что и учитывает стохастическое рассмотрение. При таком подходе любой биологический объект, в частности клетку, представляют в качестве лабильной динамической системы, которая постоянно находится в стадии перехода из одного состояния в другое. Вследствие крайней сложности системы любой такой переход сопровождается и связан с множеством комплексных и элементарных сопряженных реакций отдельных клеточных органелл и макромолекул. Естественно, что в процессе жизнедеятельности, благодаря влиянию самых разнообразных, не подлежащих учету факторов и малейших сдвигов в исходном состоянии, возникает вероятность «отказов» в элементарных звеньях, а вследствие этого – «крушения» всей системы. Поэтому любое критическое событие, например митоз или гибель клетки, можно предсказать лишь с известной вероятностью. На биологическую стохастичность при облучении объекта накладывается стохастичность вследствие случайного характера взаимодействия излучения с веществом, что резко увеличивает вероятность «крушений» системы, происходящих со значительно меньшей частотой и в необлученном контроле. Стохастическая теория рассматривает различные возмущения биологической системы, возникающие в процессе жизнедеятельности или под влиянием облучения, с позиций теории вероятностей, стремясь описать их моделями, максимально соответствующими представлениям динамической биохимии и молекулярной радиобиологии. В этом случае мишенями являются все компоненты живой системы, а регистрируемая реакция обусловлена суперпозицией самых разных событий. Существенно, что стохастическая гипотеза учитывает как физиологические, так и индуцированные излучением процессы в их динамике, в то время как классическая теория мишени рассматривает эффекты, вызванные облучением, как строго детерминированные первичными актами абсорбции энергии. Эффект, обусловленный попаданием в одну из уникальных структур клетки, приводящим ее к гибели, формально может быть описан как с классических позиций 3 теории мишени, так и с позиций стохастической теории. Иными словами, выводы теории мишени являются частным случаем стохастического подхода. Стохастическая гипотеза учитывает современные данные о микрораспределении энергии, вариабельности радиочувствительности логических объектов, а также роль репарационных процессов. Тем самым она значительно расширяет круг явлений, которые можно интерпретировать с новых позиций. Она более «биологична» по своей природе, так как устанавливает связи с конкретными морфологическими и функциональными разделами цитологии и физиологии. Однако ее математический аппарат достаточно сложен и это затрудняет ее широкое применение. Анализ количественных закономерностей различных реакций дрожжевых клеток на облучение показал, что ни классические модели, основанные на принципе попадания, ни концепция биологической стохастичности не способны объяснить всю совокупность полученных экспериментальных данных. Дополнив принцип попадания предположением о вероятностном характере проявления повреждений, Ю. Г, Капульцевич (1978) предложил вероятностную модель радиационного поражения клетки. Согласно этой модели разные клетки, подвергнутые облучению в одной и той же дозе, поражаются в разной степени в соответствии с принципом попадания, но в отличие от классических представлений и потенциальные, и реализованные повреждения проявляются с вероятностью меньше единицы. Реализованные повреждения (или индуцированные ими изменения) наследуются при делении клеток и с некоторой вероятностью, зависящей от числа этих повреждений, приводят к неосуществлению клеточного деления. При этом вероятность проявления повреждения может зависеть как от биологических (генетических) особенностей клеток, так и от условий их культивирования, увеличиваясь при ухудшении этих условий. Вегетативное размножение облученных клеток согласно этой модели – случайный процесс «рождения и гибели», приводящий к появлению нежизнеспособных клеток в отдельных размножающихся клонах (т. е. к наблюдающейся в эксперименте частичной инактивации); дело случая, образует ли данная облученная клетка макроколонию или погибнет после того или иного числа делений. Вероятностная модель, являясь как бы синтезом принципа попадания и стохастической концепции, используя сохранившие значение основные положения первого, дополняет последнюю, расширяя диапазон явлений, которые могут быть интерпретированы с позиций биологической стохастичности. Описывая не только качественно, но и количественно (с помощью специальной системы уравнений) различные проявления нарушений репродуктивной способности клеток, вероятностная модель выгодно отличается от классических схем тем, что позволяет предсказать наблюдаемое многообразие радиобиологических эффектов на основе минимума исходных предположений. Первый этап радиационного поражения – осуществление событий попадания, в результате которых формируются первичные потенциальные повреждения. Вероятность образования первичного повреждения на единицу дозы облучения зависит от величины эффективного объема и от величины энергии, необходимой для образования первичного повреждения. Поскольку отнюдь не всякое выделение энергии в эффективном объеме может привести к образованию первичного повреждения, клетка, по-видимому, способна восстанавливаться еще на стадии формирования потенциальных повреждений. Второй этап радиационного поражения – реализация потенциальных повреждений. Так как клетки способны восстанавливаться от лучевых повреждений, то реализованными оказываются не все возникшие потенциальные повреждения, а лишь часть их. Следовательно, радиочувствительность клетки определяется и вероятностью реализации потенциального повреждения. 4 Третий этап радиационного поражения – различные вторичные нарушения нормального протекания внутриклеточных процессов, вызываемые реализацией повреждений. Радиобиологический парадокс несоответствия малых количеств поглощенной энергии с разительным биологическим эффектом с позиций качественных гипотез объясняется наличием различных биологических механизмов усиления первичных поражений. Еще в 50-х годах А. С. Мочалиной и Ю. Б. Кудряшовым в лаборатории Б. Н. Тарусова было обнаружено, что водно-солевые вытяжки из облученной печени при введении интактным животным вызывают гемолиз. В связи с этим было высказано предположение, что под влиянием облучения в печени образуется «гемолитический фактор». В результате его идентификации была установлена липидная природа образующегося цитотоксического агента, названного липидным радиотоксином (ЛРТ). Оказалось, что ЛРТ обнаруживается уже в первые часы после облучения не только в печени, но и в крови, тонком кишечнике, семенниках, почках, желудке и других органах животных, также этот эффект был получен на растениях и микроорганизмах. ЛРТ представляет собой лабильный комплекс продуктов окисления жирных ненасыщенных кислот, гидропероксидов, эпоксидов, альдегидов и кетонов. Показано, что ЛРТ вызывает не только гемолиз, но и другие реакции, характерные для лучевого поражения: торможение клеточного деления, нарушение кроветворения, повреждение хромосомного аппарата некоторых объектов и др. В связи с этим ЛРТ был назван «естественным радиомиметиком», т. е. агентом, имитирующим биологическое действие ионизирующих излучений. Гипотеза липидных радиотоксинов базируется на выдвинутой Б. Н. Тарусовым и Н. М. Эмануэлем концепции о решающей роли в начальных процессах лучевого поражения цепных окислительных реакций свободнорадикального типа, наиболее подходящим субстратом для которых являются липиды. Так как последние представляют собой структурные элементы клеточных мембран, их поражение приводит к нарушению регуляции химизма живой клетки вплоть до уровня, приводящего ее к гибели. Возникновению цепных реакций согласно этой концепции, способствует вызываемое облучением разрушение или ингибирование природных антиокислительных (антиоксидантных) систем; в клетках, необлученных организмов они предохраняют липиды от самопроизвольного окисления. Легко заметить, что концепция ЛРТ и цепных реакций постулирует наличие в клетке мишеней в виде определенных фракций липидов, ибо именно их первичное поражение якобы способствует развитию всех последующих событий, включая и поражение генетического аппарата. Анализ современных, экспериментальных данных не дает, однако, оснований для признания концепции ЛРТ и цепных реакций в качестве универсальной теории летального действия ионизирующих излучений на клетку. Во-первых, аналогия в действии ЛРТ и ионизирующих излучений ограничена лишь определенным кругом явлений, но установлены и принципиальные различия: различаются структурные повреждения хромосомного аппарата, отсутствует мутагенное действие ЛРТ. Во-вторых, цепные разветвленные реакции in vivo пока еще не зарегистрированы, а возможность их развития и длительного протекания без обрыва в живой метаболизирующей многокомпонентной структурированной системе вообще маловероятна. В-третьих, накопление ЛРТ количественно не связано с ЛПЭ, а последняя в основном определяет ОБЭ ионизирующих излучений. В-четвертых, отсутствуют четкие количественные временные характеристики зависимости эффекта поражения биосистем от интенсивности образования ЛРТ при различных дозах 5 облучения, не говоря уже о других «радиотоксинах». В этой связи гипотезу липидных радиотоксинов и цепных реакций следует рассматривать лишь как попытку объяснить одно звено в сложном патогенетическом комплексе лучевых реакций, удельную роль которого в лучевой гибели клетки еще предстоит оценить. В основе теории, активно разрабатываемой А. М. Кузиным с 1965 г., лежит идея о том, что под действием ионизирующего излучения в клетке возникают не только чисто радиационно-химические повреждения, но благодаря биохимическим механизмам усиления в организме синтезируются и высокореакционные продукты, приводящие к дополнительному повреждению биологически важных макромолекул и образованию низкомолекулярных токсических метаболитов. В качестве токсических метаболитов особая роль, как и в предыдущей гипотезе, придается опять же первичным радиотоксинам (ПРТ), которыми теперь «... называют вещества, образующиеся в клетках облученных организмов тотчас или в ближайшие часы после облучения и обладающие свойством вызывать основные радиобиологические эффекты при действии на клетки или организмы» (А. М. Кузин. 1970, 1986). Множество «радиотоксинов», образующихся на поздних стадиях лучевого поражения, в отличие от ПРТ имеют в рамках этой гипотезы вторичное происхождение. Хотя им и отводится важная роль в исходе поражения организма, они не существенны для понимания первичных процессов. Полагают, что ПРТ – комплекс веществ, которые обладают близкими свойствами, хотя и относятся к различным классам химических соединений. Одни из них всегда существуют и в нормальной клетке, но в меньшем количестве, чем после облучения. Работами А. М. Кузина и его сотрудников показано, что в водных или спиртововодных вытяжках из облученных растительных объектов увеличивается содержание веществ, которые идентифицированы как хиноны или ортохиноны. По данным этих авторов, введение экстрактов из облученных объектов (например, картофеля) приводит к снижению массы животных, угнетению клеточного деления и возникновению хромосомных аберраций в клетках корешков растений, подавлению роста клеточных культур, увеличению числа уродств личинок вьюна и частоты мутаций у Е. coli. Те же изменения, но значительно менее выраженные, появляются при введении экстрактов из необлученных растений. Нарастание концентрации хинонов в клетках после облучения носит экспоненциальный характер, что в совокупности с данными токсикологических исследований, где также наблюдается линейная зависимость между временем воздействия яда и логарифмом выживаемости (например, гибель микроорганизмов в растворе фенола), используется А. М. Кузиным для критики классической теории мишени, отвергающей роль ядов в радиобиологическом эффекте. В монографии «Структурно-метаболическая теория в радиологии» (1986) сделана попытка анализа многочисленных фактов, накопленных радиобиологией за текущие десятилетия. В этой книге автор приходит к заключению, что «структурнометаболическая теория является общей теорией действия радиации на биологические объекты, начиная с клеточного уровня и кончая высокоорганизованными многоклеточными организмами». Эта теория «рассматривает механизмы как поражающего действия сублетальных и летальных доз радиации, так и стимулирующего действия малых доз радиации. Она применима и при исследовании синергизма действия ионизирующей радиации с другими физическими и химическими факторами». Радиобиологические эффекты – это результат целого комплекса взаимосвязанных и взаимообусловленных изменений, протекающих на молекулярном, надмолекулярном, биоструктурном, физиологическом и генетическом уровнях живой клетки и целого 6 организма этом причиной тех или иных изменений, связанных с действием излучения, может быть как прямое действие радиации на различные компоненты биосубстрата, так и косвенное действие через реакции с продуктами радиолиза. Тем не менее можно наметить некоторую последовательность в развитии процесса биологического действия радиации. На первой стадии – физической – происходят ионизация и возбуждение как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных соединений субстрата клетки. При ионизации и возбуждении образуются ионы и свободные радикалы в результате диссоциации молекул воды, неорганических и органических соединений. Предполагается, что поглощенная при возбуждении энергия может мигрировать по макромолекулам и локально реализовываться в наиболее «уязвимых» местах. На второй стадии – химической – происходят реакции взаимодействия первичных продуктов радиолиза с ненарушенными молекулами, включая макромолекулы различных биоструктур. Образуются, в частности, органические перекиси, и протекают реакции окисления, приводящие к появлению множества новых химических соединений, в том числе токсического действия – радиотоксинов. Третья стадия развития действия радиации на живую клетку – собственно биологическая стадия. Радиационно-химические превращения в биосубстрате клетки ведут к нарушениям в биологической организации клетки. Так, органические высокомолекулярные радикалы, образующиеся в слоях упорядоченно расположенных белковых молекул в результате взаимодействия могут «сшиваться», что приводит к нарушению структур биологических мембран. Нарушения в биоструктурах приводят к высвобождению из связанного состояния некоторых ферментов. В результате может быть изменена их активность. Предполагается, что нарушение процессов окислительного фосфорилирования происходит в результате выхода ряда ферментов из митохондриальных структур. Следствием этого процесса является, в частности, угнетение синтеза аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), что существенно влияет на большинство биохимических превращений, в том числе и синтез белков. Проникающие в ядра клеток через нарушенные мембраны гидролитические ферменты разрушают нуклеопротеидный комплекс, ДНК и белки. В результате как прямого, так и косвенного действия ионизирующих излучений происходит разрыв хромосом, появляются хромосомные аберрации и перестройки в ДНК. Следствием этих процессов, может быть нарушение процесса клеточного деления, возникновение таких изменений в хромосомном аппарате, которые передаются по наследству – возникают мутации. Таким образом, действие радиации на клетки приводит к нарушениям не только метаболизма и физиологических функций живого организма, но и к генетическим последствиям. При больших, так называемых летальных дозах ионизирующих излучений нарушения в метаболизме, биоструктурах клетки могут быть настолько значительными, что клетка погибает. Такова в общих чертах приближенная картина биологического действия радиации на клетки живого организма. Еще более сложный характер имеет биологическое действие ионизирующих излучений на целостный многоклеточный живой организм, у которого имеются различные органы со специализированными тканями и функциями. В результате межклеточного обмена, регулярных механизмов радиационные повреждения в одних клетках или органах могут индуцировать повреждения в других клетках или органах. Вследствие этого может произойти общее расстройство функциональной, физиологической деятельности всего организма. Существует два типа биологического действия радиации: физиологическое и генетическое. Физиологическое действие радиации – такое биологическое действие, при котором 7 наблюдаются изменения в обмене веществ, в физиологических функциях живого организма, но эти изменения не передаются по наследству, т. е. они не затрагивают генетический (наследственный) аппарат живого организма. Физиологическое действие радиации называют иногда соматическим. Генетическое действие радиации – такое действие, которое приводит к изменениям в генетическом аппарате живого организма, в результате эти изменения передаются по наследству – появляются формы организмов с новыми признаками. 8
