ВЛИЯНИЕ ФИБРИЛЛЯРНЫХ АГРЕГАТОВ И ОЛИГОМЕРОВ ЛИЗОЦИМА НА СТУКТУРНОЕ СОСТОЯНИЕ И СВОЙСТВА

Касторная Анна Петровна
ВЛИЯНИЕ ФИБРИЛЛЯРНЫХ
АГРЕГАТОВ И ОЛИГОМЕРОВ
ЛИЗОЦИМА НА СТУКТУРНОЕ
СОСТОЯНИЕ И СВОЙСТВА
МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАН
Научный руководитель:
доктор физ.-мат. наук, профессор
Горбенко Галина Петровна
Актуальность
 Множество
патологий
(болезни
Альцгеймера,
Паркинсона, диабет II типа и др.) обусловлены
отложением в различных органах и тканях
упорядоченных агрегатов специфических белков
(амилоидных фибрилл)
 В основе цитотоксического действия амилоидных
белков лежат взаимодействия этих соединений с
мембраной.
Выяснение молекулярных
механизмов, лежащих в основе
самосборки белковых агрегатов и их
биологической активности.
Амилоидные фибриллы
Chamberlain et al. (2000)
Biophys. J. ,79, 3282-3293.
Цель работы
Исследование влияния
фибриллярных агрегатов и
олигомеров лизоцима на
структуру и физикохимические свойства
модельных липидных
мембран (липосом)
Амилоидные фибриллы - упорядоченные
агрегаты неправильно свернутых белков
Образование неспецифических ионных каналов
Изменение внутриклеточного уровня
свободного кальция
Захват липидов в растущие фибриллы
Однослойные липосомы
Гидрофобный
хвост
Фосфатидилхолин (ФХ)
Кардиолипин (КЛ)
CH3
H3C
H2
O
C
O
P
N
CH3
CH2
Полярная
голова
100 нм
O
O
H
C
O
OH
P
O
CH2
O
O
H
C
H2C
CH2
O
O
C
C
H2C
H
C
O
O
O
O
C
H2C
CH2
C
P
O
O
O
O
O
H2C
O
O
H
C
CH2
O
O
C
C
O
Флуоресцентные зонды
1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен
(ДФГТ)
Лаурдан
Пирен
N
Локализуются в гидрофобной области мембраны
4-диметиламинохалкон (ДМХ) 3-метоксибензантрон (МБА)
O
O
CH3
CH3
N
CH3
O
Располагаются на границе раздела липид-вода
O
I. Изучения действия фибриллярного
лизоцима на липидный бислой
1. Анализ спектров флуоресценции Лаурдана
Интенсивность GP
флуоресценции, отн. ед.
Параметр обобщенная поляризация (GP) содержит информацию
о процессах релаксации диполей растворителя, происходящих за
то время, пока Лаурдан находится в возбужденном состоянии, и,
следовательно, отражает степень гидратации
бислоя.
Концентрация липида, мкМ
700
-0.05
I
I
GP  440 490
I
I
440 490
ФХ
ФХ/КЛ (10 %)
600
0
9.9
19.7
29.4
39.0
48.5
58.0
-0.06
500
400
-0.07
300
-0.08
200
100
-0.09
Амилоидные фибриллы вызывают
уменьшение полярности (уровня
гидратации) бислоя и увеличение
плотности упаковки липидов.
0
-0.10 400
425
0
450 475 500 525
Длина волны, нм
0.19
550
575
0.38
Концентрация лизоцима, мкМ
1.33
600
2. Измерение анизотропии
флуоресценции ДМХ, МБА и ДФГТ
Анизотропия флуоресценции характеризует
степень вращательной диффузии зонда, которая
зависит от вязкости микроокружения зонда в
мембране.
0.08
0.07
0.06
0.05
0
0.4
0.8
1.2
3.1
Концентрация лизоцима, мкМ
350
ФХ
ФХ/КЛ (10 %)
7
Увеличени анизотропии, %
ДФГТ
Увеличение анизотропии, %
Анизотропия
0.09
ФХ
ФХ/КЛ (10 %)
6
ДМХ
5
4
3
2
1
0
0.4
0.8
A
1.2
Концентрация лизоцима, мкМ
3.1
200
I  2I
ФХ
ФХ/КЛ (10 %)
300
250
I  I
МБА
150
100
50
0
0.4
0.8
1.2
3.1
Концентрация лизоцима, мкМ
Возрастание анизотропии флуоресценции свидетельствует об
уменьшении подвижности зонда в липидном бислое в присутствии
амилоидных фибрилл и, следовательно, об увеличении жесткости
мембраны.
3. Анализ вибронной структуры спектров
флуоресценции и степени эксимеризации пирена
Интенсивность флуоресценции, отн.ед.
Спектры флуоресценции пирена в
Экспериментально показано, что
липосомах ФХ:КЛ (10%)
700
600
500
400
300
Концентрация лизоцима, мкМ
0
0.2
0.39
0.58
0.77
0.96
200
100
0
400
450
500
550
Длина волны, нм
Состав липосом
ФХ
ФХ:КЛ (10%)
600
отношение вибронных полос пирена II/IIII
зависит от полярности микроокружения
зонда.
Отношение интенсивностей
флуоресценции эксимеров к интенсивности
флуоресценции мономеров (Е/М) отражает
степень эксимеризации пирена и зависит от
частоты столкновений молекул зонда.
Контроль
В присутствии лизоцима 0.96 мкМ
II/IIII
Е/М
II/IIII
Е/М
0.95 ± 0.05
0.39 ± 0.02
0.94 ± 0.05
0.37 ± 0.02
0.96 ± 0.05
0.52 ± 0.03
0.96 ± 0.05
0.50 ± 0.03
Неизменность величин II/IIII и Е/М при добавлении фибриллярного
лизоцима свидетельствует об отсутствии влияния амилоидных
фибрилл на структурное состояние гидрофобной области мембраны.
II. Исследование влияния олигомерных
форм лизоцима на модельные мембраны
1. Обобщенная поляризация флуоресценции Лаурдана
как функция от концентрации олигомеров лизоцима
А
0.16
День инкубации лизоцима
в этаноле
4
0.12
GP
-0.05
7
10
0.08
0.04
0.24
-0.07
-0.09
0
1.04
2.07
3.09
4.1
Концентрация лизоцима, мкМ
В
День инкубации
лизоцима в этаноле
0
4
7
10
0.20
0.12
3.09
4.1
Г
0.16
GP
0.16
1.04
День инкубации
лизоцима в этаноле
0.12
4
7
10
0.08
0.08
0.04
0.04
0
1.04
2.07
3.09
Концентрация лизоцима, мкМ
А: ФХ – 6 мкМ,
Б: ФХ – 58 мкМ,
В: ФХ/КЛ (20%)
– 6 мкМ,
Г: ФХ/КЛ (20%)
– 58 мкМ.
Концентрация лизоцима, мкМ
0.20
GP
День инкубации
лизоцима в этаноле
4
7
10
-0.08
0.00
-0.04
Б
-0.06
GP
0.20
0
1.04
2.07
3.09
4.1
Концентрация лизоцима, мкМ
Наблюдается
зависимость эффекта от
состава мембран и
молярного соотношения
липид-белок.
2. Исследование влияния олигомеров
лизоцима с помощью измерения
анизотропии флуоресценции ДФГТ
Результаты измерения при молярном соотношении
липид-белок ≈ 1.5
Состав
липосом
ФХ
ФХ/КЛ (20%)
День
инкубации в
этаноле
А ± ∆А
А ± ∆А
Контроль
В присутствии
лизоцима 4.1 μМ
Контроль
В присутствии
лизоцима 4.1 μМ
4
0.093 ± 0.002
0.179 ± 0.008
0.084 ± 0.002
0.196 ± 0.002
7
0.091 ± 0.001
0.178 ± 0.003
0.098 ± 0.002
0.231 ± 0.003
10
0.098 ± 0.003
0.180 ± 0.003
0.125 ± 0.004
0.301 ± 0.006
Во всех случаях наблюдается возрастание
анизотропии флуоресценции ДФГТ
Результаты измерения при молярном соотношении
липид-белок ≈ 14.5
Состав
липосом
ФХ
ФХ/КЛ (20%)
День
инкубации в
этаноле
А ± ∆А
А ± ∆А
Контроль
В присутствии
лизоцима 4.1 μМ
Контроль
В присутствии
лизоцима 4.1 μМ
4
0.076 ± 0.002
0.094 ± 0.004
0.085 ± 0.005
0.105 ± 0.003
7
0.096 ± 0.006
0.094 ± 0.004
0.103 ± 0.005
10
0.096 ± 0.005
0.098 ± 0.003
0.148 ± 0.002
!
0.136 ± 0.003
0.226 ± 0.002
При больших концентрациях липида анизотропия
увеличивается только в липисомах, содержащих КЛ, а в
ФХ липосомах остается постоянной. Возрастание
анизотропии при добавлении олигомеров лизоцима
свидетельствует о том, что амилоидный белок
вызывает уменьшение вязкости микроокружения ДФГТ.
Выводы
1. Методом флуоресцентной спектроскопии исследовано влияние
олигомерных агрегатов и зрелых амилоидных фибрилл
лизоцима на разные области липидного бислоя. Измерение
анизотропии флуоресценции ДФГТ, а также анализ вибронной
структуры спектров флуоресценции пирена и оценка степени
эксимеризации пирена показали
отсутствие влияния
фибриллярного белка на жесткость и полярность бислоя в
области углеводородных цепей, независимо от состава
мембран.
2. Структурная модификация модельных мембран на границе
раздела липид-вода под влиянием амилоидных фибрилл
лизоцима была изучена с помощью флуоресцентных зондов
Лаурдана, ДМХ и МБА. Как в чисто ФХ липосомах, так и в
липосомах, содержащих КЛ, наблюдалось возрастание
обобщенной поляризации флуоресценции Лаурдана на ряду с
увеличением анизотропии флуоресценции ДМХ и МБА, что
было объяснено уменьшением уровня гидратации бислоя и
увеличением плотности упаковки липидов в мембране.
3. Влияние олигомеров лизоцима было исследовано с помощью
флуоресцентных зондов с различной локализацией в бислое
– Лаурдана и ДФГТ. В присутствии олигомеров лизоцима
обнаружено увеличение анизотропии флуоресценции ДФГТ, а
также возрастание GP флуоресценции Лаурдана в ФХ
липосомах только при низких значениях молярного
соотношения липид-белок, равном 1.5, в отличие от липосом,
состоящих из ФХ и 20 мол. % КЛ, в которых описанные
эффекты были обнаружены и при более высоком значении
этого соотношения, равном 14.5.
Получение липосом
методом экструзии
Поликарбонатный
Мультиламеллярные фильтр с диаметром Униламеллярные
пор 100 нм
везикулы
везикулы
Фотоориентированные
флуорофоры
Случайно
ориентированные
флуорофоры
Вращательная
диффузия
Поляризованное
поглощение
Поляризованное
излучение
Неполяризованное
излучение
Флуорофоры преимущественно поглощают те фотоны, электрические векторы
которых направлены параллельно моменту перехода флуорофора. При
возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются те молекулы
флуорофора, для которых дипольный момент перехода при поглощении
параллелен электрическому вектору возбуждающего света. Излучаемый зондом
квант флуоресценции также поляризован. Измерения поляризации или
анизотропии выявляют среднее угловое смещение флуорофора, которое
происходит между поглощением и последующим испусканием фотона. Оно
зависит от скорости и степени вращательной диффузии за время жизни
возбужденного состояния. Диффузионные движения в свою очередь зависят от
вязкости микроокружения зонда в мембране.
Факторы, способствующие
агрегации белка:
• Изменение рН,
температуры, смена
растворителя
• Специфические мутации
• Взаимодействия с ионами
металлов
• Химические модификации
(окисление, протеолиз)
Амилоидные фибриллы
Chamberlain et al. (2000)
Biophys. J. ,79, 3282-3293
Белок в нативном
состоянии
Упорядоченные
префибриллярные
агрегаты
Структура амилоидных
фибрилл
Структура протофиламентов образована
бета-листами, параллельными продольной
оси фибриллы, в то время как бета-шпильки
перпендикулярны этой оси. Фибриллы
обычно состоят из переплетенных между
собой протофиламентов, каждый из которых
2-5 нм в диаметре.
Исследование
эксимеризации пирена
При столкновении двух молекул пирена – возбужденной и
невозбужденной образуются эксимеры, которые обладают
собственной флуоресценцией в области 470 – 480 нм.
П + hνп
П* + П
(ПП*)
Cтепень эксимеризации пирена характеризуется
отношением Е/М = I466/I391, которое зависит от
наличия свободного объема бислоя.
Изучение спектральных свойств пирена является
информативным методом исследования изменения
плотности упаковки липидов в мембране.
ФХ
КЛ
CH3
CH3
H3 C
N
H3C
CH3
H 3C
P
O
H3 C
O
N
P
H
H
O
O
Локализация зонда в бислое
полярность
O
O
O
O
CH3
O
O
O
N
O
O
O
O
O
O
Монохроматор
возбуждения с двумя
решетками
Источник света
(ксеноновая дуговая
лампа)
ФЭУ
ФЭУ
Монохроматор
испускания
Ячейка
сравнения
оптический
модуль
Затвор
Держатель
фильтра
Поляризатор
Кюветное отделение
Управляющее
устройство для
монохроматора
Компьютер
Вывод данных