20_ Ìåõàíèêà ìàêðîìîë - Учебный центр молекулярной биологии

Оптический
твизер
В оптическом твизере сильно
сфокусированный лазерный
луч является оптической
ловушкой, которая втягивает
в фокус маленькие
коллоидальные частицы.
Радиационное давление
несколько смещает частицу
вдоль оптической оси.
1
Манипуляция одиночными макромолекулами
Бусинка с высоким
показателем преломления
преломления располагается
в центре интенсивного
лазерного пучка.
Типичное видео
изображение магнитной
бусинки (Ø 2.9 микрон)
и микропипетки в
оптическом
микроскопе.
В типичном эксперименте
острие укосины вдавливается в слой белка, привязан
ного к золотой подложке.
Затем подложка опускается
вниз под действием пьезоэлектрической силы.
2
Укосина (удочка) в AFM методе в режиме измерения силы.
Типичный эксперимент по растягиванию одиночной молекулы в методе АФМ
«Полибелок» состоит из множественных копий белка.
3
Белковая архитектура и механическая стабильность
Human cardiac titin immunoglobulin
Single C2 domain
Rat calmodulin (CaM4
)
60 ± 20 pN
204 ± 26 pN
20 ± 20 pN
Артефакт
кристаллизации
Красные линии указывают топологию критических H-связей, разрывающихся при приложении
силы.
4
Растягивание ДНК
Скручивание ДНК
Природные
конфигурации ДНК
B→S
«Искусственные»
конфигурации ДНК
(Cлева S-DNA), полученная
растяжением B-DNA с помощью
оптического твизера (диаметр
на 30% меньше исходной)
(Cправа P-DNA), полученная
скручиванием B-DNA с
помощью магнитного твизера.
Примечательно, что в такой ДНК
основания смотрят наружу.
Величина сила для перехода
ДНК из B- в S- форму ~ 65 pN
B→P
Величина силы для перехода
ДНК из В- в P- форму ~ 20 pN
5
Разворачивание одиночной фибриллы хроматина
17 нуклеосом
Одиночные фибриллы хроматина из DNA λ-фага и яичного экстракта Xenopus laevis. собраны
непосредственно в кювете, содержащей два оптических твизера. Очевидно укорочение длины
молекулы ДНК при сборке хроматина.
17 пиков !!!!!
«Голая ДНК»
Золотые
результаты
молекулярной
биологии
6
Деформация полисахаридов
Дехтран
Целлюлоза
700 pN
Амилоза
Пектин
7
Таблица 1. Шкала сил для биологических макромолекул
•Разрыв ковалентных связей
1000-2000 пН
•Деформация сахарного кольца
~ 700 пН
•Разрыв двойной спирали ДНК
400-580 пН
•Структурный переход в двуспиральной ДНК при растяжении 60-80 пН
•Структурный переход двуспиральной ДНК при торзионном
скручивании
~20 пН
•Разрушение индивидуальных нуклеосом
20-40 пН
•Разворачивание тройной спирали молекулы спектрина
25-35 пН
•Сила, необходимая для остановки мотора РНК-полимеразы
14-27 пН
•Структурный переход в шпильке РНК при растяжении
~14 пН
•Разделение комплементарных цепей ДНК (T = 20oC, 150 мМ NaCl)
(зависит от конкретной нуклеотидной последовательности)
10-15 пН
•Сила, необходимая для остановки мотора миозина
3-6 пН
•Сила, генерируемая при полимеризации белка в растущих
микротрубочках
3-48пН