Количественное определение ГМО и ДНК жвачных в кормах и

Малышева Татьяна Юрьевна
Ведущий специалист отделения Биотехнологии
ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и
стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»
Нормативные документы, регламентирующие ввоз на
территорию РФ и применение продукции, содержащей ДНК
тканей животных
 Указание Департамента ветеринарии №13-8-01/2350 от 11.03.02 г. о
запрете на ввоз на территорию РФ любых видов животных белков
для кормления животных из стран, в которых регистрировалась
губкообразная энцефалопатия КРС;
 Указание №13-3-6/1825 от 24.09.04 г. о порядке импорта в РФ
кормов, кормовых добавок и сырья для их производства;
 Дополнение к указанию от 24.09.04 г. №13-3-6/1825 от 22.10.04 г.
 Приказ №425 от 10.09.08 г. «Об утверждении правил организации
государственного ветеринарного надзора за ввозом кормов»
Государственный контроль и мониторинг сырья и
кормов на ДНК жвачных животных
 Всего на наличие ДНК жвачных животных в 2012 году
проведено 674 исследования
 ДНК жвачных животных обнаружена в 13 образцах, из них:
 ДНК крупного рогатого скота обнаружена в 11 образцах (1,63%)
 ДНК мелкого рогатого скота обнаружена в 2 образцах (0,29%)
3
Государственный контроль и мониторинг сырья и
кормов на ДНК жвачных животных
Разработан метод сканирующей электронной микроскопии (в качестве арбитражного,
письмо Руководителя Россельхознадзора от 16.01.2013 г. № ФС-НВ-2/304 и письмо ФГБУ
«ВГНКИ» от 24.01.2013 г. № 61/4) для системы государственного контроля и мониторинга
кормов, позволяющий подтверждать молочные ингредиенты в рецептуре и проверять
корма с положительным ПЦР-результатом на наличие ДНК жвачных животных.
ЗЦМ
Пшеничная мука
Кукурузная мука
Мясокостная
мука
Соевая мука
Рыбная мука
Определение видовой принадлежности продукции
животного происхождения
В последнее время участились случаи ввоза в РФ контрафактного мяса и продуктов его
переработки, что подвергает опасности здоровье потребителей.
Так же определение видовой принадлежности используется при проведении биологической
судебной экспертизы в случаях браконьерства.

случаи фальсификации мясной продукции, в том числе подвергавшейся термической
обработке ;

Случаи фальсификации рыбной продукции более дешевыми видами;

попытки ввоза в Россию мяса индийского водяного буйвола Bubalus bubalis под видом
говядины

Попытки ввоза в Россию мяса зебу Bos Taurus indicus под видом говядины

Видовое определение принадлежности мяса, изъятого у охотников, подозреваемых в
браконьерстве

Риск заражения животных и человека прионными заболеваниями, относящихся к группе
трансмиссивных губкообразных энцефалопатий
Методы дифференциации мяса
изоэлектрическое
фокусирование
• используются для видовой идентификации сырого мяса, малопригодны
для определения видовой принадлежности животных белков в составе
кормов и продуктов, подвергнутых термической обработке
реакция
иммунодиффузии
(РИД)
• не позволяет определять видовую принадлежность белка уже после
термической обработки при температуре 80С в течение 30минут
ИФА
• низкая чувствительность, выявляет примесь мясокостной муки в рыбной и
куриной муке в концентрации не менее 50%
Традиционными методами идентификации сырого мяса (органолептические, физикохимические и др.) не всегда возможно дифференцировать мясо близкородственных видов
животных, однако эту проблему позволяет решить применение молекулярногенетических методов, основными достоинствами которых являются высокая
чувствительность и специфичность, время исследования 3–4 часа, высокая
воспроизводимость и низкая себестоимость.
Этапы видовой идентификации продукции
Правильный отбор и подготовка проб
Выделение ДНК
Постановка реакции ПЦР со специфическими праймерами на участок гена
цитохрома В митохондриальной ДНК
Определение последовательности фрагмента гена цитохрома В
Сравнение полученной последовательности с находящимися в базе данных NCBI
Построение филогенетического дерева с помощью специальных программ (Mega,
Vector NTI и др.)
Заключение о видовой принадлежности образца
Видовая идентификация мясной продукции в рамках
государственного задания и на договорной основе

В соответствии с Приказом Россельхознадзора № 17
от 18.01.2013 г. подведомственный Россельхознадзору
лабораторный центр ФГБУ «ВГНКИ» провел
мониторинг готовых мясных продуктов:
 сосиски «Франкфуртские» (производитель: LANDHOF
GmbH&Co KG, Австрия; импортер: ООО «МИТТРЕЙД»,
Россия). В результате испытаний в данной продукции
выявлена ДНК лошадей, кур, крупного рогатого скота и
сои, что не соответствует составу, заявленному на
этикетке.
 Сосиски
Хельсинкивурст АУРА/Helsinkiwurst Aura
(производитель Pajunlemi Oy, Финляндия). В результате
испытаний в данной продукции выявлена ДНК лошадей.

8
При проведении мониторинга готовых мясных
продуктов в результате молекулярно-генетических
исследований образцов сосисок ИКЕА (ТУ 9213001-51069329-07, дата изготовления 06.01.2013) и
сосисок Бистро (ТУ 9213-202-01597945-06, дата
изготовления 07.02.2013) производства ООО «МПЗ
Ремит» (юридический адрес: 129221, г. Москва,
Полярная улица, д. 14), а так же в колбасах
производства ООО «Мортадель» и ОАО
«Мясокомбинат Клинский» обнаружена ДНК
лошадей.
Видовая идентификация рыбной продукции в рамках
государственного задания и на договорной основе
 В ходе мониторинга пищевой
продукции, проводимого по указанию
Россельхознадзора, при исследовании
поступивших 6-ти образцов рыбного филе от
разных производителей в образце трески
филе б/к производства ООО «Талдом-рыба»
ТУ 9258-001-48811305-03, изготовленного
20.02.2013 г., вместо атлантической трески
(Gadus morhua) и тихоокеанской трески
(Gadus macrocephalus) обнаружена рыба рода
минтай (Theragra) семейства тресковых.
9
 Разработаны и унифицированы качественные и количественные методы
по идентификации ГМО
и ДНК животных в
кормах и
сельскохозяйственной
продукции,
которые
гармонизированы
с
методиками, рекомендованными международными организациями
(ФАО/ВОЗ) и применяются во всех странах, где осуществляется
регулирование данной продукции;
 Разработан метод для установления видовой принадлежности мяса
близкородственных видов животных с помощью полимеразной цепной
реакции и секвенирования ПЦР-продукта. Данный метод позволяет
исследовать образцы, содержащие однокомпонентное мясо, но непригоден
для дифференциации образцов, содержащих два и более вида мяса;
 Установление пищевой и кормовой безопасности, являются гарантией
уверенности потребителя в их безвредности для здоровья человека и
животных.
Малышева Татьяна Юрьевна
Ведущий специалист отделения Биотехнологии
ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и
стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»
Организационная работа по подготовке
межлабораторных сличительных испытаний для
подразделений Россельхознадзора
 В соответствии с распоряжением Россельхознадзора № ФС-ЕН-
2/14387 от 30.10.2012 года организованы межлабораторные
сравнительные испытания (МСИ) по определению генетическимодифицированных организмов (ГМО) и ДНК жвачных животных, в
рамках государственного задания в период с 06.11.2012 по 12.01.2013 г.
 Всего подготовлено 760 контрольных проб для прохождения МСИ по определению
генетически-модифицированных организмов для 38 лабораторий;
 Всего подготовлено 520 контрольных проб для прохождения МСИ по определению
ДНК жвачных животных для 26 лабораторий.
12
Подготовка стандартизированных панелей для МСИ по
определению ГМО и ДНК жвачных животных
 При подготовке стандартизированной панели для
определения ДНК жвачных животных используются
образцы контрафактной продукции из архива отделения
Биотехнологии, а так же смоделированные пробы,
полученные путем лиофилизации мясных продуктов;
 Для подготовки панелей по определению ГМО
используются стандарты , предоставленные фирмамипроизводителями генетических линий, на
конфиденциальной основе, а так же образцы, содержащие
ГМО, выявленные при проведении государственного
мониторинга.
 Каждый образец стандартизированной панели перед
отправкой участнику МСИ проверяется в 3-х параллелях.
Сводная таблица эффективности исследований лабораторий по результатам
межлабораторных сличительных испытаний на содержание ДНК жвачных в кормах,
кормовых добавках и сельскохозяйственной продукции за 2008-2013 гг.
2008 г.
Федеральные государственные
бюджетные и другие
ФС-НВ-2/9178 от
государственные учреждения 10.09.08 (23образца/46
позиций)
№п
п
1Калининградская МВЛ
2Брянская МВЛ
3Краснодарская МВЛ
4Ленинградская МВЛ
5Челябинская МВЛ
6Приморская МВЛ
7Московская ГВЛ
8Новосибирская МВЛ
9Камчатская МВЛ
10Магаданская МВЛ
11Татарская МВЛ
12Иркутская МВЛ
13Саратовская МВЛ
14Ставропольская МВЛ
15Белгородская МВЛ
16Тверская МВЛ
17Сахалинская МВЛ
18Тульская МВЛ
19Белветцентр
20Кемеровская МВЛ
21ГНУ Уральский НИВИ
22Томская ОВЛ
23Орловский РЦ
24ЦНМВЛ
25ВНИИЗЖ
26ГНУ ВНИИ мясной пром. им. В.М.
Горбатова Россельхозакадемии
27Мурманская ОВЛ
28Хабаровский РЦ
29Башкирский РЦ
30Забайкальский РЦ
31Ростовский РЦ
32Оренбургский РЦ
33Красноярский РЦ
34ЦНПВРЛ
14

Д ЛП
41 4
45 1
31 15
41 5
45 1
29 17
ЛО
1
0
0
0
0
0
43 3
45 1
42 4
32 13
44 2
46 0
16 7
45 1
43 3
26 20
45 1
37 9
36 10
0
0
0
1
0
0
23
0
0
0
0
0
0
2012 г.
2013 г.
2009 г.
2010 г.
2011 г.
2-03/40;2-03/39 от 2-03/549 от
2-03/361 от
БК-16-2/169 от 01.03.11
письмо б/н от
ФС-ЕН-2/14387 от
03.02.09
14/10/09$2-03/600 от 16.03.10(20образцов/4
(20образцов/40
05.03.12(20образцов/4
30.10.2012 г
(20образцов/40
30.10.09
0 позиций)
позиций)
0 позиций)
позиций)
(20образцов/40
позиций)
Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%)
20
0
0 100
89
29 5
6
72,5 30 4
6
75
31 5
4
77,5 38 2
0
95
20
0
0 100
98
37 3
0
92,5 40 0
0
100
40 0
0
100 20
0
0 100
67
35 5
0
87,5
36 4
0
90
36 4
0
90
40 0
0
100 20
0
0 100
89
39 0
1
97,5
36 4
0
90
35 5
0
88
20
0
0 100
98
36 4
0
90
38 0
2
95
40 0
0
100
63
38 0
2
95
39 1
0
97,5 36 4
0
90
35 4
1
88
38 2
0
95
20
0
0 100
93
38 2
0
95
19
1
0
95
98
26 2
12
65
36 4
0
90
91
26 0
14
65
26 2
12
65
70
36 0
4
90
33 0
7
82,5
40 0
0
100 20
0
0 100
96
36 4
0
90
20
0
0 100
100
38 2
0
95
38 1
1
95
20
0
0 100
35
39 1
0
97,5
20
0
0 100
98
37 3
0
92,5 40 0
0
100
32 6
2
80 20
0
0 100
93
38 2
0
95
40 0
0
100
56
38 1
1
95
20
0
0 100
98
36 3
1
90
40 0
0
100
80
78
31 6
3
77,5
36 4
0
90
20
0
0 100
36 2
2
90
39 1
0
97,5
39 1
0
97,5
20
0
0 100
36 4
0
90
40 0
0
100 19
1
0
95
35 5
0
87,5 36 1
3
90
18
1
1
90
38 1
1
95
37 0
3
92,5
32
7
1
80
40
0
Д-количество достоверных результатов ЛО - количество ложноотрицательных результатов ЛП - количество
ложноположительных результатов Э - эффективность
0
100
19
16
17
20
20
16
19
1
4
2
0
0
2
0
0
0
1
0
0
2
1
95
80
85
100
100
80
95
Сводная таблица эффективности исследований лабораторий по результатам
межлабораторных сличительных испытаний на содержание ГМО в кормах, кормовых
добавках и сельскохозяйственной продукции за 2008-2013 гг.
Федеральные государственные
бюджетные и другие государственные
учреждения
№пп
1Брянская МВЛ
2Краснодарская МВЛ
3Ленинградская МВЛ
4Челябинская МВЛ
5Приморская МВЛ
6Московская ГВЛ
7Новосибирская МВЛ
8Камчатская МВЛ
9Магаданская МВЛ
10Татарская МВЛ
11Иркутская МВЛ
12Саратовская МВЛ
13Ставропольская МВЛ
14Белгородская МВЛ
15Тверская МВЛ
16Сахалинская МВЛ
17Калининградская МВЛ
18Тульская МВЛ
19Белветцентр
20Оренбургский РЦ
21Кемеровская МВЛ
22ГНУ Уральский НИВИ
23Томская ОВЛ
24Орловский РЦ
25Центр оценки качества зерна
26ЦНПВРЛ
27ЦНМВЛ
28ВНИИЗЖ
ГНУ ВНИИ мясной пром. Им. В.М.
29 Горбатова Россельхозакадемии
30Нижегородский РЦ
31Мурманская ОВЛ
32ЦОКЗ Ростовский филиал
33 ЦОКЗ Новороссийский филиал
34 ЦОКЗ Ставропольский филиал
35ЦОКЗ Воронежский филиал
36Башкирский РЦ
37ЦОКЗ Курский филиал
38ЦОКЗ Приморский филиал
39Хабаровский РЦ
40Забайкальский РЦ
41Самарский РЦ
42Ростовский РЦ
43Красноярский РЦ
15

2008 г.
ФС-НВ-2/9178 от
10.09.08(23 образца)
Д
19
20
19
20
19
20
19
17
18
20
20
20
19
19
13
20
18
19
20
ЛП
1
2
4
3
1
3
4
5
3
3
1
0
2
2
4
1
1
2
0
ЛО
3
1
0
0
3
0
0
1
2
0
2
3
2
2
6
2
4
2
3
20
0
3
2009 г.
2-03/40;2-03/39 от 03.02.09 2-03/549 от 14/10/09$2(20 образцов)
03/600 от 30.10.09 (20
образцов)
Э (%) Д ЛП
ЛО
Э (%) Д ЛП
ЛО
Э (%)
83
19 1
0
95
87
17 3
0
85
83
87
18 2
0
90
83
18 2
0
90
87
18 0
2
90
20 0
0
100
83
17 3
0
85
20 0
0
100
74
18 2
0
90
18 2
0
90
78
18 2
0
90
87
20 0
0
100
19 1
0
95
87
14 6
70
87
83
83
56
87
78
83
87
15 0
5
75
87
19 0
1
95
20 0
0
100
17 3
0
85
2010 г.
2011 г.
2012 г.
2-03/361 от 16.03.10 (20 БК-16-2/169 от 01.03.11 (20 письмо б/н от 05.03.12 (20
образцов)
образцов)
образцов)
Д
20
20
20
20
20
20
19
20
ЛП
0
0
0
0
0
0
1
0
ЛО
0
0
0
0
0
0
0
0
Э (%)
100
100
100
100
100
100
95
100
20
20
20
20
20
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
20
20
20
20
20
20
20
20
16
20
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
0
100
100
100
100
100
100
100
100
80
100
20
0
0
100
Д
20
18
20
20
20
ЛП
0
2
0
0
0
ЛО
0
0
0
0
0
Э (%)
100
90
100
100
100
20
0
0
100
20
0
0
100
Д
15
19
20
1
0
0
0
95
100
20
0
0
100
20
20
20
19
0
0
0
1
0
0
0
0
100
100
100
95
19
20
20
1
0
0
0
0
0
95
100
100
20
0
0
100
10
20
5
0
5
0
50
100
13
ЛП
0
0
Д-количество достоверных результатов ЛО - количество ложноотрицательных результатов ЛП - количество
ложноположительных результатов Э - эффективность
ЛО
5
7
Э (%)
75
65
2013 г.
ФС-ЕН-2/14387 от
30.10.2012 г
Д
20
20
20
20
20
ЛП
0
0
0
0
0
ЛО
0
0
0
0
0
Э (%)
100
100
100
100
100
20
20
0
0
0
0
100
100
20
18
20
20
20
20
20
20
20
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
1 90
100
100
100
100
100
100
100
20
20
20
0
0
0
0
0
0
100
100
100
20
20
20
20
20
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
20
0
0
100
20
20
0
0
0
0
100
100
20
0
0
100
20
20
20
20
20
20
20
20
18
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
2 90
1
0
Спасибо за внимание!