Получение рекомбинантных белков как этап создания лечебно
advertisement
Получение рекомбинантных белков как этап создания лечебнопрофилактических препаратов М. И. Потапович БГУ, Минск 2011 г. Биофармацевтический рынок (C.L. Barton, 2010) Мировой рынок биофармацевтической продукции в 2010 г. составил около $100 млрд. К 2015 г. – более $170 млрд. (65% - рекомбинантные белки) В сегменте негликозилированных рекомбинантных белков первую позицию занимает интерферон ($4 млрд. к 2014 г., из них альфа-интерферон – $1,5 млрд.) Количество биотехнологических компаний 225 335 1200 400 Франция Великобритания Германия Остальная Европа США 540 Этапы создания препаратов на основе рекомбинантных белков Получение продуцента Создание лекарственной формы Культивирование (ферментация) Определение специфической активности Отделение целевого продукта Очистка рекомбинантного белка Характеристики различных типов экспрессионных систем Характеристика Бактери Дрожжи и Клетки насекомы х Клетки млекопитающ их Образование телец включения +/- (+)/- - - Секреция +/- + + + Гликозилирование - + + + Протеолитическа я деградация +/- +/- - - Другие посттрансляцион ные модификации - + + + Накопление свиного (A) и куриного (B) ИФН-α в клетках E. coli BL21 (λDE3) и E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL A. B. A. B. A. Структурная часть гена куриного ИФН-α B. Структурная часть гена свиного ИФН-α Цветом выделены редко встречающиеся в E. coli аминокислотные кодоны. AGG/AGA/CGA – аргинин, CTA – лейцин, CCC – пролин, GGA – глицин Посадка праймеров при замене редких кодонов в структурной части гена свиного ИФН-α Схема синтеза гена свиного ИФН-α при замене редких кодонов agg aga ccc gga → → → → cgt cgt ccg ggc Стадия 1 (матрица – тотальная ДНК, выделенная из крови) Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4 A. B. A. Структурная часть гена лошадиного ИФН-α B. Структурная часть гена бычьего ИФН-γ Цветом выделены редко встречающиеся в E. coli аминокислотные кодоны. AGG/AGA – аргинин, CTA – лейцин, CCC – пролин, GGA – глицин Codon Adaptation Index (CAI) CAI – величина, показывающая частоту использования кодонов в данном гене относительно частоты использования кодонов в референсном наборе генов Ген куриного ИФН-α: CAI = 0,435 Ген свиного ИФН-α: CAI = 0,330 Ген свиного ИФН-α с заменой редких кодонов = 0,544 Ген лошадиного ИФН-α: CAI = 0,340 Синтетический ген бычьего ИФН-γ: CAI = 1,0 (Расчет с использованием программы CodonW (J. Peden)) Накопление лошадиного ИФН-α (A) и бычьего ИФН-γ (B) в клетках E. coli BL21 (λDE3) A. В. А. В. С. А. Тельца включения в клетках E. coli (S. Betts, 1998) В. Электронная микрофотография клеток E. coli BL21-CodonPlus(DE3)RIPL-pIP2403 (трансмиссионный электронный микроскоп Philips CM120 BioTwin), выращенных без индукции ИПТГ С. Электронная микрофотография клеток E. coli BL21-CodonPlus(DE3)RIPL-pIP2403 после индукции 0,5 ммоль/л ИПТГ в течение 3 часов Бычий ИФН-α (А) после очистки из телец включения (5 стадий) и бычий ИФН-γ (B), очищенный из супернатанта после разрушения клеток (1 стадия) A. В. Видоспецифичность интерферонов Интерферон птиц ≠ Интерферон КРС Рекомбинантные α-интерфероны Субстанция интерферона рекомбинантного Вирусные заболевания Иммуномодулятор Стрессовые состояния Интерферон + витамины Гиповитаминозы Вирусные заболевания Иммуномодулятор Интерферон + антибиотики (Гентаферон, Линкоферон и др.) Смешанные инфекции Иммуномодулятор Действие ИФН в составе препаратов 1 - противовирусный эффект; 2 - подавление роста и развития внутриклеточных инфекционных агентов невирусной природы (хламидии, риккетсии, бактерии, простейшие); 3 - увеличение лизоцимной активности сыворотки крови; 4 – увеличение бактерицидной активности сыворотки крови; 5 – антитоксическое и антистрессовое действие; 6 – радиопротективный эффект; 7 – стимуляция макрофагов и усиление фагоцитоза; 8 – усиление продукции антител; 9 – активизация естественных киллерных клеток; 10 – усиление синтеза простагландинов; 11 – стимуляция освобождения гистамина базофилами; 12 – усиление формирования антигенов ГКГ; 13 – подавление гиперчувствительности замедленного типа; И, возможно, самое главное! 14 – многократное усиление антибактериального действия антибиотиков, снимая при этом их иммунодепрессирующий эффект на организм животного Спасибо за внимание
