ИФА

Компоненты ИФА
• Аналит – определяемое вещество
• Лиганд – вещество избирательно
связывающееся с аналитом
• Метка – легкоопределяемое
соединение, добавляемое в
анлитическую систему для измерения
количества аналита
• Авидность – прочность комплекса АГ-Ат
• Афинность – сродство активного центра
Ig с АГД
Иммуноферментный анализ
• Гомогенный - все 3 стадии ИФА
проходят в растворе и между
основными стадиями нет
дополнительных этапов разделения
образовавшихся ИК от
непрорегировавших компонентов. Для
определения низкомолекулярных
субстанций.
Иммуноферментный анализ
• Гетерогенный – анализ проводится в
•
двухфазной системе с участием твердой фазы
(носителя) и обязательной стадией
разделения ИК от непрореагировавших
компонентов (отмывка).
Гетерогенные методы, в которых
формирование ИК на 1 стадии протекает на
твердой фазе ,называют твердофазными.
Гетерогенный твердофазный
ИФА
По типу реагентов
присутствующих первой стадии:
1.Конкурентный
На первой стадии в системе присутствуют
одновременно анализируемое соединение и
его аналог, меченный ферментом и
конкурирующий за центры специфического
связывания с ним.
2. Неконкурентный – характерно
присутствие в системе на 1 стадии только
анализируемого соединения и специфичных к
нему центров связывания.
Этапы ИФА
• Взаимодействие аналита с
лигандом
• Формирование меченного
комплекса
• Измерение сигнала
Конкурентный ИФА для
определения антигенов
Искомый антиген(1) и меченыйферментом антиген(2)
конкурируют друг с другом за антитела (3),
сорбированные на твердой фазе.
. Определение АТ в сыворотке больного (в
лунках планшеток с сорбированным АГ (прямой ИФА)
Определение АГ в сыворотке больного (в лунках
планшеток с сорбированным АТ)прямой ИФА
Твердая фаза
Полистирол,поливинилхлорид,полипропилен
устойчивость к растворам, используемым в реакциях
наличие высокой специфической емкости, т.е.
способности сорбировать на своей поверхности АГ или
АТ в количествах, необходимых для проведения реакции
низкая неспецифическая сорбция белков из
исследуемых образцов и конъюгатов
Пути решения этой проблемы:
 добавить белок, заполняющий свободные центры
связывания на поверхности пластика «забивка»
развести сыворотку в 10-100 раз
Конъюгат
• Конъюгат – продукт химической
сшивки АТ ( АГ) с ферментным
маркером (вторые АТ).
Используют АТ к Ig того класса,
который мы желаем выявить.
Конъюгат должен обладать следующими
свойствами
• Высоким антительным титром и высокой
афинностью к АГ.
• Достаточной специфичностью в рабочем
разведении
• Преобладанием мономерных форм над
полимерными
• Оптимальным молярным соотношением
между ферментом и АТ (1:1)
• Достаточной ферментативной активностью
Субстрат
• Бесцветное вещество –хромоген
• Ортофенилендиамин
• Тетрамитилбензидин
Основные требования к субстрату
• Обеспечение высокой чувствительности
• Образование хорошо учитываемых
продуктов реакции фермент-субстрат
• Должен быть безопасным, дешевым,
доступным,удобным в применении.
• Чаще используют хромогенные
субстраты, которые разрушаясь
образуют окрашенное вещество
Ферменты и субстраты, наиболее широко используемые в ИФА
Фермент
Пероксидаза хрена
Источник
получения
Хрен
Молек.
масса(к
Да)
40
Субстрат (рекоменд.длина
Конъюгирующий
реагент
волны при фотометр.,нм)
1.Глутаральдегид
Oфенилендиаминдигидрохлор
ид
β -галактозидаза
(Armoracia
(ОФД,492 нм),
2.Мета-периодат
натрия
Rusticana)
5-аминосалициловая
кислота(450 нм),
диаминобензидин, одианизидин
3.N-сукцинимидил 3 пропионат
О-нитрофенил-β-D-галактозид
Метамалеимидобензо
л-Nгидроксисукцин
имидный эфир
Escherichia
540
(420 нм)
Coli
Щелочная
форфатаза
E.coli,слизистая
кишечника
теленка
84-150
Р-нитрофенилфосфат(405нм)
5-бромо-4-хлоро-3-индолил
фосфат
Глутаралдегид
Этапы проведения ИФА
Положительный
результат
• Отрицательный
результат
Добавление аналита
Добавление конъюгата
• Положительный
результат
• Отрицательный
результат
Схема взаимодействия активного
центра АТ и антигенной
детерминанты
Определение АТ
• Сероконверсия
• первая сыворотка отрицательная
• Вторая -положительная
Метод «парных сывороток»
• Сравнение двух последовательных
анализов, причем повторный анализ
рекомендуется делать через 10-14 дней
Иммуноглобулин G
• Строение
Иммуноглобулины
• IgM определение АТ этого класса
•
необходимо для диагностики острого
периода заболевания
IgG появляются в период
реконвалесценции и у переболевших
сохраняются 10 лет и более.Используется
для оценки напряженности
поствакцинального иммунитета и
определение инфекции в анамнезе.
Определение специфических
IgE
специфический
АГ
на бумажном
диске
IgE
Определение специфических
IgE
HPR
развитие
цветной
реакции
СА-242 («сэндвич» вариант ИФА)
Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-АТ
Твердая фаза –МАТ против р24 ВИЧ 1
Конъюгаты -1. Биотил.анти-р24
Твердая
фаза
2.Авидин-пероксидазный
Коньюгат
Сыворотка/плазма
Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-АТ
Твердая фаза-gp160, gp36, композ.пептид
Конъюгат – gp41,gp36 и пероксидаз. конъюгаты
Твердая
фаза
Коньюгат
Сыворотка/плазма
IgG, IgA, IgM
Тест полоски
- Иммунодот
Комбинация АГ на полосках
1
Название
1
набора
MONO IgG
+
(инфекционный
Мононуклеоз)
2
2
EBV
3
4
3
EBNA
VCA G 1G
5
6
4
5
6
CMVG Toxo O
G
Преимущества ИФА
• Высокой чувствительностью, позволяющей
•
•
•
•
•
•
определять концентрации до 0,05 нг/мл
Минимальные объемы исследуемого материала
Стабильностью при хранении всех
ингредиентов
Простотой проведения реакции
Наличием как инструментального, так и
визуального учета
Возможностью автоматизации всех этапов
реакции
Относительно низкой стоимостью
диагностических наборов
Полезные советы
• Выбор фирмы поставщика
o
o
o
o
o
Цена не должна быть приоритетом
Желательно комплектация 1-3 уровнями контр.кач.
Совместимость с международ. контр.материалами
Стабильность реагентов после открытия набора
Срок годности тест-системы
Неправильная форма
калибровочной кривой
• Не правильно приготовлен раствор стандарта
• Стандарт не был разбавлен разбавителем
•
•
•
стандарта или рабочим буфером
Неправильная промывка
Ошибка при внесении стандарта или последующих
шагах
Использование реагентов из других наборов или
наборов другого лота
Полезные советы
• Точность пипетирования ( от ячейки к ячейки не > 2%)
• Не хранить реагенты в саморазмораживающимся
•
•
•
•
•
холодильнике
Не используйте инкубаторы с конвективным нагревом
Оптимальное промывание
Регулярно проверять точность работы обрудования
Рекомендуется, чтобы все сыворотки анализ. в дублях
(разброс для 1 образца не > 5%)
Проблемы ИФА
• Повышенный фон
o Недостаточная промывка
o Контаминация субстрата ионами металлов или
o
o
o
o
o
o
окисляющими реагентами
Загрязнение дозатора или субстрата конъюгатом
стрептовидина с ПХ
Неправильное разведение конъюгата Стреп.сПХ
Хромоген. субстрат находился на свету
Неправиьное время/ или Т0 инкубации
Испарение содержимого во время инкубации
Неправильное количество ФК или ХС
Повышенные оптические
плотности образцов/стандартов
• Не правильно разбавлены стандарты,
•
•
•
•
•
конъюгаты
Микропланшет накрыт пленкой во время
инкубации с субстратом
Превышение времени инкубации
Нарушение Т0 режима
Контаминация наконечника, субстрата Ф.К.
Субстрат находился на свету перед
использованием
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Отсутствие или слабое развитие
окраски
Реагенты не достигли комнатной Т0 (25±20)
Не правильное хранение набора
Инкубация с Ф.К. при 370 вместо комнатной Т0
Пропущена одна из инкубаций
Высыхание ячеек в ходе проведения анализа
Использование неподходящего субстрата или стоп-реагент.
Низкая Т0 в помещении <220
Истечение срока годности реагентов
Не соответствующая длина волны считывания
Не правильное разбавление Ф.К.
Советы
• Спектрофотометр перед измерением
прогреть
• 1 включение = 40 минут работы
лампы
• Увеличение сигнала при
использовании марли обработанной
хлорамином
• Дистиллированная вода комн.Т. Не
хранить воду более 2-3 дней.
• Планшет для предварит. Разведения
использовать однократно.
Советы
• Не сокращать время инкубации с ОФД
• Не допускать подсыхания лунок
• При промывке лунки заполняются до
самого верха
• Особенно тщательно промывать после
инкубации с конъюгатом
• При отказе спектрофотометра –
добавить стоп-реагент и быстро
заморозить
Сомнительный результат
• Ошибка дозирования 5%
• Ошибка измерения спектрофотометра
10%
• Серая зона
Сыворотки, оптическая плотность
которых отличается не более 15% от
ОПкрит следует признать сомнительными
Сut off
• Пороговое значение, превышение
которого является положительным
результатом
ОФД, ТМБ
• Отдельная посуда и наконеники
• Обработка 50% спиртом
• Промыть дистиллированной водой
• Измерять оптическую плотность не
позже 30 мин
Автоматические пипетки
• Погрешность пипеток не должна
превышать 5%
• 1мкл Н20 =1мг
• Дозирование объема менее 10 мкл
Сбор, подготовка и транспортировка образцов
для исследования на наличие антител к вирусу
краснухи класса IgM и IgG
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Материал для исследования - сыворотка крови.
Тестированию подлежит сыворотка, не содержащая примеси эритроцитов, бактериальной
контаминации, хилеза, гемолиза.При наличии любого из указанных признаков сыворотка
уничтожается и назначается повторный забор крови.
Приготовление сыворотки.
Венозная кровь берется без антикоагулянта. Отстаивается при комнатной температуре (1520град) в течении 30 минут до полного образования сгустка. По окончании образования
сгустка пробирки открывают и осторожно проводят тонкой стеклянной палочкой по
внутренним стенкам пробирки для стделения сгустка от стенок пробирки.Сыворотку
сливают в другую центрифужную пробирку, придерживая сгусток стеклянной палочкой, и
центрифугируют, либо центрифугируют в тех же, первичных, пробирках.
После центрифугирования отделяют сыворотку от сгустка и клеток крови и помещают в
холодильник при +2-+8 град. При необходимости более длительного хранения ее
необходимо хранить при - 20 град. Допускается замораживать сыворотку только 1 раз.
Условия транспортировки.
Правильно собранная сыворотка должна быть своевременно доставлена в лабораторию.
Сыворотка крови стабильна при +2-+8 град в течении 12 часов.
Во время транспортировки пробирки с сывороткой должны быть соответствующим образом
защищены от вредного воздействия окружающей среды и погодных условий. Пробирки
должны быть промаркированы, упакованы и плотно закрыты.
Минимальное количество сыворотки, необходимое на 1 исследование - 200 мкл.
Для определения динамики антителообразования сыворотку исследуют дважды.
Интервал между исследованиями 1-2 недели. ( метод "парных" сывороток)
Спектрофотометры
Спектрофотометры
• Спектрофотометры
• Обычно требуют длительного времени прогрева (указано в
инструкции). Поэтому если ожидается измерение оптической
плотностичерез 30 мин после очередного измерения, прибор
лучше оставить включенным ( 1 включение равносильно 40 мин
работы лампы).
• Спектрофотометры имеют допустимую погрешность измерения
до 10%.Проверить это можно, промеряя дважды один и тотже
планшет и вычисляя различие в величине оптической плотности
в одинаковых лунках. При этом планшет разворачивают так,
чтобы лунка А1 заняла место Н12.
• При оптической плотности выше 1,5 о.е. погрешность
спектрофотометра может возрастать.
Марля или фильтровальная
бумага
• При многократном использовании
марли, обработанной хлорамином,
возможно повышение сигнала (при
попадании хлорамина в лунки)
Дистиллированная вода
• Не хранить более 2-3 дней. Не
добавлять азид натрия в качестве
консерванта.. Он является ингибитором
пероксидазы. Если вода хранилась в
холодильнике, необходимо прогреть до
комнатной t°.
Планшет для
предварительного
разведения сывороток
• Использовать однократно.
Инструкции по применению
–
–
–
–
–
–
–
–
–
При получении новой серии наборов даже хорошо знакомой тест-системы – необходимо прочитать
инструкцию.
Сознательные нарушения инструкции – сокращение времени инкубации с р-ром субстрата.Такие
изменения протокола ИФАмогут существенно снизить выявляемость слабоположительных образцов,
т.е. привести к ложноотрицательным результатам.
Перед вскрытием пакета с планшетом его следует выдержать при комнатной Т° для предотвращения
конденсации влаги на планшете если планшет разборный и используются не все стрипы сразу,то
после вскрытия оставшиеся стрипы следует поместить в пакет, край покета завернуть и зажать
скрепками.Не следует удалить покетик с влагопоглотителем.
Для предотвращения загрязнения не следует трогать верхнюю часть стрипов пальцами.
Перед использованием убедитесь, что растворы и реагенты гомогенны.
В случае необходимостидлительного перерыва следует положить планшет вверх донышками на
смоченную водой марлю или фильтровальную бумагу.
Реакция связывания АТ с АГ начинается сразу после внесения сыворотки в лунку, поэтому
желательно уменьшить период между внесением первой и последней сыворотки в планшет.
Рабочий раствор конъюгата желательно готовить непосредственно перед применением.
Особенно тщательно следует промывать планшет после инкубации конъюгата.
Отказ спектрофотометра
• Быстро заморозить планшет после
добавления серной кислоты с последующим
быстрым оттаиванием перед измерением
оптической плотности.Следует учмтывать,
что о.п. все-таки возрастает, а относительный
прирост сигнала более высок для небольших
значений о.п.
Отказ термостата
• Универсальных рецептов нет
Ошибки при постановки ИФА
• Инкубация при комнатной t° (18-25°)
• На практике t° в помещениях лабораторий варьирует
•
от 12-30°. Общих формул оценки влияния
соотношения t° и времени инкубации на оптическую
плотность не существует.Единственный способ
избежать ошибки – установка планшета в термостат,
настроенный на комнатную t°.
Перед постановкой тест-системы концентраты р-ров
необходимо развести дистиллированной водой. Вода
должна иметь комнатную t°. Особенно это важно для
разведения конъюгата и сывороток. Вероятность
получения неправильного результата выше, если
продолжительность инкубации мала (30мин)
Относительная влажность
воздуха
• Относительная влажность воздуха
• Длительная инкубация при комнатной
t°, при сухом воздухе(зимой) может
вызвать подсыхание р-ра с
образованием «ободка» на боковой
поверхности лунки, который при
промывки может сохраниться. Лучше
использовать влажную камеру.
Промыватели планшетов
• Засорение каналов промывателей.недостаточная
•
промывка приводит к завышению
сигнала.Обнаружить это просто – при использовании
рядного промывателяповышенный сигнал имеет
один из рядов, при использовании 96-канального –
одна и таже лунка разных планшетов
Менее частовстречается засорение пространства
между иглами промывателя кусочками марли или
ваты.Это приводит к заносу растворов из одной
лунки в другие.