Институт экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно- производственного комплекса
advertisement
Институт экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научнопроизводственного комплекса Московская гимназия на Юго-Западе № 1543 Повреждение и активация эндотелиальных клеток человека при гипоксии / реоксигенации Н.М. Бибиков Д.М. Федорова Научный руководитель н.с. О.А.Антонова Москва 2012 Введение • Гипоксия – недостаток кислорода в крови. • Реоксигенация – восстановление нормальной концентрации кислорода. Введение Введение • ФФВ – маркер начала активации эндотелия. • В взаимодействии участвует ICAM 1. • Гипоксия и реоксигенация ЭК стимулируют апоптоз, маркером которого является каспаза-3. Цель • Изучить влияние гипоксии и реоксигенации на эндотелиальные клетки пупочной вены человека. Задачи • Получить культуру эндотелиальных клеток из пупочной вены человека. • Создать модель in vitro, приближенную по условиям к клиническому случаю ишемии/реоксигенации. • Изучить влияние рН среды на ЭК в условиях гипоксии/ реоксигенации. Задачи • Определить методом ПЦ уровень ICAM 1 на поверхности эндотелия в процессе эксперимента. • Определить методом ПЦ активность каспазы-3, как маркера апоптоза. • Определить с помощью ИФА концентрацию фактора фон Виллебранда в ростовой среде клеток. Эндотелий - это однослойный плоский эпителий, выстилающий внутренние поверхности сердца и сосудов. Фактор фон Виллебранда • ФФВ- гликопротеид, синтезирующийся в клетках костного мозга и эндотелии. • Он участвует в тромбообразовании, способствуя агрегации тромбоцитов. МКАД • Молекулы клеточной адгезии - это трансмембранные белки, отвечающие за взаимодействие клеток друг с другом или с элементами межклеточного пространства. МКАД • ICAM-1 – молекула клеточной адгезии • Для усиления экспрессии ICAM-1 требуется стимуляция цитокинами, выделяемыми активированными тромбоцитами Взаимодействие МКАД с лейкоцитами • Стадия непрочного прикрепления (роллинга) • Стадия остановки лейкоцитов • Трансмиграция. Апоптоз Три этапа: • Индукторный (запуск системы апоптоза, активация проапоптотических белков) • Эффекторный (каскад каспаз) • Деградационный (разрушение органелл) Каспазы • семейство ферментов, мишенями которых являются ДНК-зависимые протеинкиназы инициаторные -2, -8, -9 и -10 эффекторные -3, -6 и -7 Апоптотические пути • Путь рецепторов смерти • Митохондриальный путь Материалы и методы • Выделение ЭК из пупочной вены человека Материалы и методы • Создание условий гипоксии и реоксигенации с заменой среды, действие ФНО и стауроспорином. Материалы и методы • ПЦ • ИФА ФФВ ICAM-1 Каспаза-3 рН парадокс • При гипоксии происходит ацидоз • При реперфузии миоциты теряют жизнеспособность. Почему? • Кислотный рН играет защитную роль при гипоксии (?) Выводы • Гипоксия стимулирует выделение ФФВ из ЭК, а также вызывает активацию каспазы и экспрессию ICAM-1. • Реоксигенация вызывает активацию каспазы-3 и экспрессию ICAM-1. Выводы • При гипоксии/реоксигенации возникает "pH-парадокс", из-за которого наблюдается наибольшая концентрация молекул клеточной адгезии и активированной каспазы-3 наблюдается при нейтральном рН. Благодарности • Мы благодарим нашего научного руководителя Ольгу Александровну Антонову за чуткое руководство и сотрудников лаборатории клеточной адгезии за помощь в выполнении нашей работы, Сергея Менделевича Глаголева за организацию практики и наставления по выполнению работы, Евгения Яковлевича Парнеса и Виталия Дмитриевича Арнольда за помощь в совершенствовании нашей работы. Список литературы (1) • • • • • • • • • • Antonova O. A., Loktionova S. A., Golubeva N. V., Romanov Yu. A., Mazurov A. V. Damage and activation of endothelial cells during in vitro hypoxia. Jr. Bull. Exp. Biol. Med., 2007, Vol. 144, № 4, р. 504-506. Бажанов Н.Н., Волков Б.П., Воловская М.Л. и др. Справочник фельдшера. М. : Медицина, 1993. 496 с. Davies M.J. Pathology of arterial thrombosis. Br Med Bull., 1994, Vol. 50, №4, p. 789802. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.:Медицина, 1995. 688 с. Vapaatalo H., Mervaala E. Clinically important factors influencing endothelial function. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 2001, Vol. 7, № 5, p. 75-85. Заварзин А.А., Румянцев А.В. Курс гистологии. М.: МЕДГИЗ , 1946, 723 c. Goon P. K. Y., Lip G. Y. H., Boos C. J., Stonelake P. S., Blann A. D. Circulating Endothelial Cells, Endothelial Progenitor Cells, and Endothelial Microparticles in Cancer. Neoplasia, 2006, Vol. 8, № 2, p. 79-88. Weibel E. R., Palade G. E. «New cytoplasmic components in arterial endothelia». J. Cell Biol., Vol. 23, № 1, p. 101–112. Бобрик И. И., Шевченко Е. А., Черкасов В. Г. Развитие кровеносных и лимфатических сосудов. Киев: Здоровья, 1991, 206 с. Nilsson I. M. Commentary to Erik von Willebrand's original paper from 1926 «Hereditär pseudohemofili». Haemophilia, 1999, Vol. 5, № 3, p. 220-221. Список литературы (2) • • • • • • • • • • • Лупинская З.А. Эндотелий сосудов - основной регулятор местного кровотока. Вестник Кыргызско-Российского Славянского университета. Бишкек: КРСУ, 2003, т. 3, № 7, 69-75. Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов. М.: Литерра, 2011, 480 c. Lemasters J.J., Bond J.M., Chacon E., Harper I.S., Kaplan S.H., Ohata H., Trollinger D.R., Herman B., Cascio W.E. The pH paradox in ischemia-reperfusion injury to cardiac myocytes. Experientia Supplementum, 1996, Vol.76, p. 99-114. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме. Патол.физиол.эксп. терап., 1998, № 2, 38-48. Henn V., Slupsky J. R, Gräfe M., Anagnostopoulos I., Förster R., Müller-Berghaus G., Kroczek R.A. CD40 ligand on activated platelets triggers an inflammatory reaction of endothelial cells. Nature, 1998, Vol. 391, № 6, p. 591-594. Онищенко Г.Е. Варианты программированной гибели клеток. Доклады РАН, 2004, 399: 507509. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J., 1997, Vol. 326, № 1, p. 1-16. Karaman M.W., Herrgard S., Treiber D.K. A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity. Nat. Biotechnol., 2008, Vol.21, №6, p. 127–132. Chae H.J., Kang J.S., Byun J.O. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research, 2000, Vol. 42, № 4, p. 373–381. Gaur U., Aggarwal B.B. Regulation of proliferation, survival and apoptosis by members of the TNF superfamily. Biochem. Pharmacol., 2003, Vol. 66, № 8, p. 1403–1408. Antonov A.S., Nikolaeva M.A., Klueva T.S., et al. Primary culture of endothelial cells from atherosclerotic human aorta. Part 1. Identification, morphological and ultrastructural characteristics of two endothelial cell subpopulations. Atherosclerosis, 1986, Vol. 59 №1, p.1-19. Приложение 1 Условия инкубации Нормоксия 24 ч + ФНО Нормоксия 24 ч + стауроспорин Нормоксия 24 ч Гипоксия 24 ч Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 + нормоксия 5 ч Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 + нормоксия 5 ч Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 + нормоксия 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 + реоксигенация 5 ч Фактор Виллебранда, % 176.21 55.08 100 246.88 127.17 83.06 53.33 128.28 70.09 78.18 Приложение 2 Условия инкубации Нормоксия 24 ч + ФНО Нормоксия 24 ч Гипоксия 24 ч Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 + нормоксия 5 ч Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 + нормоксия 5 ч Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 + нормоксия 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 + реоксигенация 5 ч ICAM-1, % 4884.43 100 133.58 105.23 140.52 100.41 139.42 244.49 168.91 Приложение 3 Условия инкубации Нормоксия 24 ч + стауроспорин Нормоксия 24 ч Гипоксия 24 ч Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 + нормоксия 5 ч Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 + нормоксия 5 ч Нормоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 + нормоксия 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 6.4 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.0 + реоксигенация 5 ч Гипоксия 24 ч с заменой среды pH 7.4 + реоксигенация 5 ч Каспаза-3, % 573.88 100 193.48 115.89 124.47 128 75.272 276.86 147.11 Приложение 4 Приложение 5 Эндотелий • Регуляция тонуса кровеносных сосудов • Миграция лейкоцитов • Участие в свертывании крови • Представление антигенов
