Влияние трансплантации мононуклеаров красного костного

УРАМН НИИ морфологии человека РАМН
Лаборатория роста и развития
Влияние трансплантации мононуклеаров
красного костного мозга на ангиогенез у крыс
Байкова Ю.П., Фатхудинов Т.Х.
Цели и задачи исследования
Цель
исследования
—
изучить
процессы
ангиогенеза в рубцовой зоне постинфарктного миокарда
после трансплантации мононуклеаров красного костного
мозга крыс.
Задачи:
Изучить особенности васкуляризации рубца после
трансплантации мононуклеаров.
Оценить экспрессию генов ангиогенеза во фракции
мононуклеаров красного костного мозга.
Материалы и методы
Экспериментальное
исследование
проводили
на
самцах
аутбредного
стока
линии
Спрейг-Доули
(НПП
«Питомник
лабораторных животных ФИБХ РАН»).
Всего использовали 56 животных в возрасте 8 недель массой тела
180-200 граммов.
Соответствие нормативным документам:
Работа с экспериментальными животными проводилась
соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.
в
Животных содержали в соответствии с GLP-условиями.
На проведение исследования было
получено разрешение
биоэтической комиссии НИИ морфологии человека РАМН (протокол №
4 от 12.03.2008).
Хирургические операции проводили на
биологических испытаний ФИБХ РАН в г.Пущино
базе
Лаборатории
Клеточный трансплантат
Клеточный трансплантат представлял собой 5 млн. клеток в 1 мл
физиологического раствора. Животным контрольной группы вводили 1
мл физраствора.
Клеточный трансплантат маркировали мембранной флуоресцентной
меткой PkH26.
Кол-во животных
Срок выведения из
эксперимента (сут)
Группа
Трансплантат
14
30
Количество
клеток
(млн.клеток
/кг)
Объем
(мл/кг)
Контроль
Физраствор
13
14
0
5
Опыт
Аутологичные
МН
12 + 3*
11 + 3*
25
5
Примечание: * - животные, которым вводили флуоресцентно меченные клетки
RT-PCR
1. Выделение РНК:
фенольный способ
набор RNeasy Mini Kit
2. Проверка чистоты РНК:
электрофорез
спектрофотометрия
3. Синтез кДНК:
набор RT2 First Strand Kit
4. RT-PCR
набор The Rat Angiogenesis
RT² Profiler™ PCR Array.
Морфометрия
Показатели:
количество кровеносных сосудов в поле зрения
площадь кровеносных сосудов в поле зрения
площадь поля зрения
На
проделанных
определяли:
основании
измерений
общее
количество
сосудов на мм2
объемную
плотность
кровеносных сосудов на
мм2
Результаты исследования
В опытной группе не было обнаружено ни одной
PkН26 меченной клетки, входящей в состав внутренней
и средней стенки сосудов.
Меченые клетки отсутствуют в стенке вены (А, В) и венулы (С, D).
Количество кровеносных сосудов на мм2
Объемная плотность сосудов на мм2
Количество капилляров на мм2
Количество артериол на мм2
Количество венул на мм2
А – опыт, 14 суток
В – опыт, 30 суток
С – контроль,
14 суток
D – контроль,
30 суток
Оценка экспрессии генов во фракции
мононуклеаров
3D профиль генной экспресиии
Стабилизация процессов васкуляризации
Поддержание васкуляризации в течение как
минимум 30 суток после трансплантации
Увеличение
калибра
кровеносных сосудов
новообразованных
выводы
Трансплантированные мононуклеары не дифференцируются в
клетки внутреннего и среднего слоя стенок кровеносных сосудов. Ни
одной меченой PkH26 клетки не было обнаружено в сосудах рубцовой
зоны или в неповрежденных сосудах, что исключает механизм
клеточного слияния трансплантированных мононуклеаров.
Трансплантация клеток приводит к стабилизации процессов
ангиогенеза, поддерживая количество артериол и венул на постоянном
уровне, и приводит к увеличению количества капилляров, по сравнению с
контрольной группой, где наблюдается отрицательная динамика.
Во фракции мононуклеаров красного костного мозга наблюдается
повышенная экспрессия ангиогенных факторов (генов семейства Vegf),
факторов роста и дифференцировки (генов семейства Tgf),
хемоаттрактантов и молекул адгезии (Pecam1), за счет которой,
вероятно, и реализуется положительный терапевтический эффект.
Спасибо за внимание!