Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт фундаментальной биологии и биотехнологии
Кафедра биофизики
Применение ферментативной системы
светящихся бактерий для анализа
микробного загрязнения
Кириллова Мария Александровна
Руководитель: к.б.н. Есимбекова Е. Н.
Красноярск 2012
Микробная загрязненность - показатель
санитарного качества продуктов питания, воды,
чистоты поверхностей
Методы определения
микробного загрязнения:
1. Микробиологические
2. Биолюминесцентный метод,
основанный на измерении АТP
3. Биолюминесцентный метод,
основанный на измерении FMN
http://biotest-by.com/
2
Цель
• Разработать метод анализа микробного
загрязнения с использованием
биолюминесцентной системы
светящихся бактерий, основанный на
определении количества FMN в
образце.
3
Материалы и методы
Исследуемый объект
Реакционная смесь
•
•
•
•
•
0,05 М фосфатный буфер
комплекс ферментов
люцифераза - оксидоредуктаза
0,0025% тетрадеканаль
5*10-5 ÷10-3 М NADH
5*10-8÷10-6 М FMN
NADH:FMN-oxidoreductase (R)
NAD(P)H +
H+
+ FMN 
NAD(P)+
•
•
•
+ FMNH2
Escherichia Coli (BL21 codon Plus
(DE3) RIPL), выращенные в
лаборатории Фотобиологии ИБФ СО
РАН на среде LB без антибиотиков в
течение 18 часов при 30ºС.
Образцы бактерий исследовали в
стационарной фазе роста.
Оптическая плотность при λ=590 нм
D=6,4; 1 ед.опт.пл.=5*108 клеток/мл
Luciferase (L)
FMNH2 + RCHO + O2  FMN + RCOOH + H2О + h
h
Колонии E. coli
Люминометр Lumat LB9507
4
Калибровочная кривая для
определения FMN
140000
120000
I отн.ед
100000
80000
60000
40000
20000
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
1.3
[FMN]*10^7, M
Максимальная чувствительность биферментной системы 1,2*10-9 М FMN
5
Анализируемые образцы
Escherichia Coli (штамм BL21)
 Образец №1.
Интактные клетки
 Образец №2.
Клетки, разрушенные
ультразвуковым дезинтегратором
при частоте 44 кГц
 Образец №3.
Надосадочная жидкость после
центрифугирования разрушенных
клеток (5000 об/сек, 12 мин)
6
Зависимость интенсивности свечения от
количества бактериальных клеток (образец 2)
300000
I, отн. ед.
250000
200000
150000
100000
50000
0
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
клетки, млн / мл
Максимальная чувствительность биолюминесцентной системы
составляет 3,9 млн. бактериальных клеток
7
Зависимость интенсивности свечения от количества
бактериальных клеток (образец 3)
90000
80000
I,отн. ед.
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
клетки, млн/ мл
Максимальная чувствительность биолюминесцентной системы
составляет 5 млн. бактериальных клеток
8
Сравнение с АТР-системой
Система светлячков
Бактериальная система
• Предел обнаружения
АТР – 10 -14 М.
• Предел обнаружения
ФМН -1,2 ·10 -9 М
• Предел обнаружения
бактериальных клеток –
1000 кл / мл
• Предел обнаружения
бактериальных клеток –
3,9 млн. кл /мл
9
Санитарные правила и нормы
Группа продуктов
Количество бактерий, КОЕ/г не
более
Вода минеральная
100
Молоко
3*105
Мясо
103
Рыба свежая
5*104
Овощи
104– 5*105
Пиво
500
Мороженное
105
Масло сливочное
103 - 105
10
Выводы
• Для анализа бактериальной загрязненности
образец достаточно подвергнуть разрушению
ультразвуковым дезинтегратором
• Предел обнаружения бактериальных клеток –
3,9 млн. кл /мл
• Чувствительность метода ниже
чувствительности АТР-системы на 3 порядка
11
Перспективы
• Возможна разработка биолюминесцентного метода
анализа бактериальной загрязненности, основанного
на измерении NADH
• Предварительно полученные результаты указывают на
высокую чувствительность биолюминесцентного
метода к NADH (до 1·10-13 М), что сравнимо с
чувствительностью люциферазы светляков к АТФ
• В дальнейшем планируется для упрощения процедуры
проведения анализа разработка иммобилизованного
ферментного препарата
12