Центрифугирование

Выполнила: Бучкова А.Э., студентка ЕГФ 4 курса гр.5102
Проверил: Сазонов В.Ф., к.б.н., доцент
Дифференциальное
центрифугирование
(differential
centrifugation) [лат. differentia — различие; лат. centrum
средоточие, центр и fuga — бегство, бег] — метод разделения
субклеточных частиц по их коэффициентам седиментации,
которые приблизительно пропорциональны размерам.
Начало методу было положено в 1926 г.,
когда
Теодор
Сведберг
изобрел
аналитическую
центрифугу
и
использовал
ее
для
определения
молекулярной массы гемоглобина. После
этого разделение клеточных компонентов
стало вполне реальным.
Теодор Сведберг (1884 – 1971 гг.) –
шведский химик
Центрифуга
Центрифуга предназначена для разделения
веществ в центробежном поле. Роторы
(центрифужные
пробирки)
разгоняются
автоматически до заданной скорости. Имеется
система защиты роторов от превышения
максимально
допустимой
скорости.
Погрешность измерения скорости ±1%. Время
работы центрифуги может быть задано до 6 ч с
точностью ±5 мин.
Роторы
Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию,
необходимо разрушить жесткий каркас клеточных оболочек.
Существуют следующие методы:
1. Применение гипотонического солевого раствора: при набухании
клеток мембраны лопаются, при этом повреждаются мембраны
клеточных органелл;
2. Применение гомогенизатора Поттера-Эльвеймана: клетки лопаются
под влиянием разрывающих сил во время многократного
прохождения между стенкой пробирки и вращающимся пестиком,
клеточные органеллы остаются целыми;
3. Французский пресс: клетки сначала подвергают высокому давлению в
камере с азотом, при резком снятии давления пузырьки газа
разрывают клеточную мембрану, органеллы клетки не подвергаются
воздействию.
Этапы центрифугирования
1) Гомогенизированную ткань центрифугируют при малой скорости, что
приводит к осаждению ядерной фракции (содержащей ядро и
неразрушенные клетки) и отделению супернатанта (1).
2) Супернатант
осторожно
сливают
(декантируют)
и
проводят
центрифугирование
при
более
высокой
скорости,
разделяются
митохондриальная фракция (содержащая митохондрии, лизосомы и
пероксисомы) и супернатант (2).
3) Последний декантируют и центрифугируют при высокой скорости,
формируется микросомная фракция (содержащая смесь свободных рибосом
и фрагментов гладкого и шероховатого ЭПР) и отделяется чистый
прозрачный раствор — конечный супернатант (3).
4) Супернатант (3) представляет собой цитозоль, или клеточный сок.
Схема, иллюстрирующая последовательные этапы центрифугирования
клетки
№ п/п
Скорость
(где g – ускорение силы
тяжести )
Время
Полученная фракция
1.
Низкая (600 g)
10 мин
Ядра, цитоскелет
2.
Средняя (1000g)
15 мин
Хлоропласты
3.
Высокая (10000g)
30-60 мин
4.
Очень высокая (150000g)
60 мин
Митохондрии,
микротельца
Рибосомы
ризосомы,
Заключение
Работая с фракциями внутриклеточных структур,
можно установить детальный молекулярный механизм
биологических процессов, так как в этом случае механизм
исследуется без помех, создаваемых происходящими в
клетке побочными реакциями.
Чистые фракции внутриклеточных структур можно
подвергать любым видам анализа.