ЦМС

Лекция 10.
ЦМС растений – самая доходная
митохондриальная мутация
1. Феномен ЦМС и восстановления фертильности
пыльцы
2. Связь ЦМС с митохондриями
3. Химерные гены в митохондриях и происхождение
ЦМС
4. Экспрессия ЦМС – генов
5. Механизм действия ядерных генов-восстановителей
фертильности
6. Ядерно-плазменный конфликт при ЦМС у пшеницы
7. Природа дефектов, возникающих при ЦМС
Мужская стерильность растений (МС)
стерильность пыльцы
ГМС
Генная
(гены ядра)
генетически
контролируемое
нарушение развития
пыльцы у растений
ЦМС
Цитоплазматическая
(гены органелл)
ЦМС описана более чем у 150 видов высших растений
47 родов
20 семейств
По некоторым данным, ЦМС найдена более чем
у 300 видов высших растений
ЦМС широко используется в семеноводстве для
получения гибридных семян – это самая «доходная»
цитоплазматическая мутация, ежегодно приносящая
многомиллионные прибыли
Как возникают растения с ЦМС?
1. Спонтанно - обнаруживаются обычно при анализе больших
популяций различных с/х культур. Нередко ЦМС-формы
обнаруживаются у диких родичей культивируемых с/х растений
2. Наиболее часто формируются ЦМС-растения так называемой
«гибридной природы». Цитоплазматической стерильность
пыльцы возникает как результат ядерно-плазменной
несовместимости при некоторых отдаленных скрещиваниях.
Классические примеры стерильности второго типа:
- аллоплазматические пшеницы Triticum aestivum на цитоплазме Aegilops ovata
или Triticum timopheevi,
линии подсолнечника Helianthus annuus на цитоплазме Helianthus petiolaris ,
- серия стерильных линий табака Nicotiana tabacum на цитоплазме N. repanda ,
- ЦМС-формы у различных видов рода Brassica.
Как возникают растения с ЦМС?
(продолжение)
3. ЦМС может возникнуть и в результате некоторых
внутривидовых скрещиваний а также при соматической
гибридизации
4. У самоопыляющихся растений (бобовые), ЦМС-мутация
сохраняется у множества диких форм в субстохиометрических
количествах, а при определенных ядерно-плазменных
комбинациях количество ее копий в митохондриях может
возрасти в 1000-2000 раз и проявиться фенотипически.
5. Искусственное получение новых мужски стерильных форм
производится также с использованием сомаклональной
изменчивости, характерной для культур in vitro. Так были
отобраны ЦМС-формы табака, риса, кукурузы, сорго.
Гены-восстановители фертильности
В природных популяциях растений разных видов выявлены и
продолжают выявляться ядерные гены Rf (restoration of fertility),
восстанавливающие полностью или частично фертильность пыльцы
В случае доминантных Rf генов фертильность восстанавливается
уже в гибридах F1:
rfrf(Sцит) x RfRf(Nцит)
цмс
ферт
Rfrf (Sцит)
ферт
В некоторых случаях ЦМС восстанавливается с
помощью не одного, а нескольких Rf генов
Почему причину ЦМС искали в митохондриях?
Признак передавался по материнской линии
Признак представлялся связанным с нарушением
энергетических процессов в пыльниках (митохондрии???)
Уже ранние цитохимические и электронно-микроскопические
исследования, посвященные ЦМС, свидетельствовали о
серьезных нарушениях в митохондриях стерильных растений
Предположения о мутации в митохондриальной ДНК были
сделаны на основе этих данных (60-е 70-е гг.)
В следующее десятилетие (1976-1985) были получены
первые данные об отличии митохондриальных ДНК
стерильных растений кукурузы от нормальных
Было показано, что каждый тип стерильности – T, C и S
- характеризовался своим уникальным спектром
фрагментов мтДНК при эндонуклеазной рестрикции
Химерные гены в митохондриях и происхождение ЦМС
При исследовании митохондриальной ДНК кукурузы с Т-типом
ЦМС с помощью геномной библиотеки была обнаружена
область, экспрессирующаяся во всех тканях стерильных
растений иначе, чем у нормальных
Так был впервые локализован ЦМС-ген T-urf13 и его продукт –
белок 13 кД
Химерный ген в митохондриях стерильных растений
кукурузы Т-типа (техасского)
30н
444н
atp6
T-atp6
291 кодон
56н
318 н
N-rrn26
26S рРНК
T-ЦМС
?
urf13
N-urf25
последовательност
ь неизвестного
происхождения
табак тРНКarg
К образованию такого
химерного гена
привели не менее 7
рекомбинаций
urf25
221 кодон
urf25
219 кодонов
5’-фланкирующая
последовательность перед
геном T-urf13 гомологична 5’фланкирующей области atp6
гена – вероятно, промотор
гена T-urf13 появился в
результате дупликации
участка мтДНК – промотора
гена atp6 и дальнейшей
рекомбинации
У кукурузы выявлено 3 различных типа ЦМС, при всех
этих типах обнаруживаются разные химерные гены
Химерный ген мтДНК при С-типе стерильности составлен из
«кусков» митохондриальных и пластидных ДНК
coxII-
atp6- -atp9
141 кодон
У митохондрий кукурузы S-типа также были обнаружены мтДНК
реорганизации, результатом которых явились два химерных гена
orf355
orf77
Структура R -области мтДНК при ЦМС S-типа
???
последовательности
R повтор (1060 пн)
– сходство с R1 плазмидой
Сходство с
ntp9 геном
Сходство с
atp9 геном
У Petunia c ЦМС связан участок мтДНК, называемый S-pcf локус
состоит из трех
котранскрибируемых
генов: pcf , nad3 и rps12
ЦМС-локус S-pcf у петунии
Хп atpB
фертильный
nad3
rps12
S-atp9
Urf S
S-pcf
сox2-1
Последовательности
обоих экзонов coxII
присутствуют без интронов
Структура pvs – локуса у фасоли с ЦМС
orf98
pvs
Гомология с
3’-концом cox2
orf239
Гомология с
Гомология с
хлоропластным 3’-концом cob гена
тРНКАla интроном
Область размером 3 kb содержит несколько открытых рамок
считывания, образованных при рекомбинациях мтДНК
Структура ЦМС-локуса у подсолнечника
atpA orf873
cob
Ферт
Стер
Инсерция
5 тпн
atpA orf522
Стрелки указывают
направление транскрипции
инверсия
11 тпн
orf873
cob
Не выявлено
транскриптов
Как осуществляется транскрипция при ЦМС?
Химерные гены часто котранскрибируются вместе с нормальными
pcf с nad3 и rps12 (Petunia)
orf224 с atp6 (pol-Brassica)
orf222 с участком гена nad5 и
orf139 (nap-Brassica)
orf105 c atp6 (редис)
orf 522 с atpA (Helianthus)
В других случаях у химерных генов оказались
собственные сайты инициации транскрипции
переместились из других orf в
результате реорганизаций мтДНК
Например, промотор гена atp6 инициирует транскрипцию
urf13 кукурузы и химерной orf риса с ЦМС-Bo
Транскрипция ЦМС-локусов происходит по общим законам,
с промоторов, уже существовавших в митохондриальных геномах
РНК-эдитинг и ЦМС
T-urf13 является единственным известным в настоящее время
у высших растений белок-кодирующим митохондриальным
геном, не подвергающимся РНК-эдитингу
В химерных генах, состоящих из фрагментов разных генов,
эдитинг происходит в позициях, точно соответствующих
точкам редактирования полных транскриптов этих генов
Феномен транскрипт-специфической утраты РНК-эдитинга
Описан только
у сорго
В митохондриях пыльников линии
Sorghum bicolor A3Tx398 (ЦМС) было избирательно
подавлено редактирование транскрипта atp6
Подавление atp6 РНКэдитинга наблюдалось
как в спорофитных, так
и в гаметофитных
тканях пыльника, но ни
в каких других
Феномен явно зависит от ядерного генома: у одних линий с такой же
цитоплазмой atp6 пыльников нормально редактировались, у других - нет
При этом транскрипты atp9, nad3, nad4, rps12 нормально редактировались
как в пыльниках, так и в этиолированных проростках
Трансляция ЦМС-генов
ЦМС
Изолированные
митохондрии
фертильн
Синтез in vitro
Белок 13 кД
-
Идентифицирован еще до описания гена urf13.
Размер продукта гена urf13 соответствовал уже
известному белку 13 кД
На основе первичной последовательности гена urf13
были синтезированы полипептиды
Антитела к полипептидам реагировали с 13 кД
белком в ЦМС линиях
Аналогичным образом был найден ЦМС-белок у Petunia
полипептид
25 кД
отсутствовал у
фертильных аналогов
синтезировался изолированными
митохондриями ЦМС-линий
ЦМС-белки кукурузы, петунии, подсолнечника
выявляются во всех органах стерильных растений
Белок фасоли pvs-ORF239 оказался специфичным только
для репродуктивных тканей: семяпочек, материнских
клеток пыльцы и микроспор мужски стерильных растений
Модуляция экспрессии гена orf239 – первый известный случай
посттранскрипционной регуляции в митохондриях растений
Модуляция экспрессии гена orf239 фасоли
Репродуктивные
ткани
ORF239
мРНК orf239
Вегетативные
ткани
ORF239
Митохондриальная протеаза
ORF239
Ген orf239 фасоли вызывает стерильность
при встраивании в ядерный геном табака
несколько трансформантов характеризовались мужскистерильным или полустерильным фенотипом
иммуноцитохимический анализ обнаруживал белок
ORF239 в клеточной стенке аномальных микроспор
Ядерные гены – восстановители
фертильности: механизм действия
Нарушение развития пыльцы у растений с мутантной
цитоплазмой также может быть откорректировано
специальными ядерными генами Rf – восстановителями
фертильности
Эта коррекция происходит на разных этапах – от
репликации ДНК до взаимодействия с ЦМС-белками
1. Эффект генов Rf на митохондриальный геном
Ген-восстановитель фасоли Fr приводит к изменению
структуры митохондриальной ДНК: из генома митохондрий
исчезает pvs последовательность
Для полного исчезновения pvs – локуса и полного
восстановления фертильности ген Fr должен быть в
гомозиготном состоянии (FrFr)
Одна доза гена (Frfr) инициирует процесс элиминации pvs –
локуса и проявляется в полустерильном фенотипе:
продуцируется как стерильная, так и фертильная пыльца
Вероятно, продукт гена Fr избирательно элиминирует те
митохондрии, которые содержат pvs–локус
Но откуда у ЦМС растений нормальные митохондрии?
Скорее всего, в незначительном количестве они
сохраняются даже при ЦМС
Органеллы, содержащие pvs-локус, у фертильных
ревертантов сохраняются в субстохиометрическом
количестве – менее одной копии на 100 клеток
Модифицирует структуру митохондриального
генома ген- восстановитель Rf3 S-типа
стерильности кукурузы
Ген Rf3
кукурузы
S2
мтДНК
S1 S2
S1 и S2- репликоны в
митохондриях исчезают как
самостоятельные ДНКмолекулы
но в митохондриальном
геноме обнаруживаются
S -последовательности
2. Эффект генов Rf на экспрессию ЦМС-локусов
Присутствие гена Rf1
незначительно подавляет
транскрипцию мРНК urf13,
но изменяет процессинг
пре-мРНК urf13
Т-тип ЦМС кукурузы
Rf1
мРНК urf13▲
urf13▲
Уменьшено число
полных матриц
мРНК urf13
количество 13 кД
«стерильного»
белка снижено
основным у растений с Rf1-аллелем
становится «укороченный»
транскрипт, содержащий неполную
последовательность urf13
Растения кукурузы с Т-типом цитоплазмы и геном Rf1 в ядре, несмотря
на уменьшение количества 13 кД белка, остаются мужски стерильными
Для восстановления фертильности при Т-типе цитоплазмы
необходимо два гена: Rf1 и Rf2
Лишь в присутствии доминантного аллеля второго генавосстановителя – Rf2 восстанавливается нормальный
процесс формирования жизнеспособной пыльцы.
Ген Rf2 кодирует белок, чрезвычайно сходный с
митохондриальной альдегид дегидрогеназой
Каков механизм действия гена Rf2, неизвестно.
Rf3 у кукурузы с ЦМС-S также приводит к появлению более
коротких транскриптов митохондриальных генов cob, atp6,
orf355, orf77 в пыльце восстановленных растений по
сравнению со стерильной пыльцой
У петунии под действием генов-восстановителей также
происходит снижение уровня 25 кД белка, кодируемого
S-pcf локусом
Восстановление фертильности у подсолнечника
Связано с тканеспецифическим уменьшением количества
молекул транскриптов химерного цистрона atpA-orf522
происходит только в мужских цветках
восстановленных растений
Механизм действия гена –
восстановителя в данном случае
– полиаденилирование РНКматриц, что вызывает их
ускоренную деградацию
Ген-восстановитель Brassica действует тканеспецифически
Ген изменяет полученный orf224/atp6 транскрипт:
У стерильных линий
обнаруживаются два
полноразмерных
транскрипта размером
2.2 и 1.9 т.п.н
У восстановленных линий
появляются более
короткие, прошедшие
процессинг транскрипты
1.4 и 1.3 т.п.н
такие транскрипты обнаруживаются в лепестках,
тычинках, плодолистиках, но не в чашелистиках
Итак, на стадии транскрипции основные механизмы
действия Rf-генов:
– укорочение транскриптов (процессинг);
- уменьшение числа матриц мРНК
(полиаденилирование с ускоренным распадом).
3. Эффект генов Rf на посттрансляционную регуляцию
В присутствии генов Rf отмечается снижение
количества белка ORF138 у рапса с типом ЦМС ogura
Эффект сильнее всего
выражен в пыльниках
на той стадии, на
которой обычно
экспрессируется
стерильный фенотип
Транскрипция и трансляция
гена orf138 как стерильных,
так и восстановленных
растений осуществляются с
равной эффективностью
Rfо ген рапса действует на посттрансляционном уровне,
уменьшая стабильность белка ORF138 и восстанавливая
фертильность
Эффект генов Rf на РНК-редактирование
Rf3 ген у риса действует
на процессинг
от аtp6 гена отщепляется аномальный
дицистрона:
3' участок (причина ЦМС), после чего
проходит нормальный эдитинг
Rf3 ген у сорго
облегчает процессинг
на 75% уменьшается количество
прошедших эдитинг
длинных транскриптов гена orf107
транскриптов
(1110, 870 пн), накапливаются короткие
380 пн, которые у стерильных форм
были в следовых количествах
(
(
У петунии удалось выделить и
клонировать ген, который
прямо влияет на экспрессию
Эффект ядерных геноввосстановителей фертильности может
быть двух типов:
если ЦМС возникает в
результате потери или
инактивации какого-то
фактора, то генвосстановитель должен
обеспечить растение
комплементарно
действующим субстратом
если ЦМС возникает в
результате синтеза новым
химерным геном какогото токсического продукта,
ген-восстановитель должен
каким-то образом
инактивировать этот ген
либо его продукт
Большинство исследованных к настоящему времени
ЦМС-систем и генов-восстановителей представляют
пример второго типа
Восстановители фертильности разных ЦМС-систем могут:
- снижать количество полноразмерных транскриптов
ЦМС-генов, влияя на РНК-процессинг и РНКэдитинг;
- изменять число копий митохондриальных хромосом,
несущих ЦМС-ген
- уменьшать количество продукта ЦМС-генов,
действуя посттрансляционно
Системы восстановления фертильности, вероятно, не
менее разнообразны, чем ЦМС-системы
Природа дефектов, возникающих при ЦМС
Первые признаки аномального развития пыльников
часто, хотя и не всегда, наблюдаются на стадии мейоза
материнских клеток пыльцы
???
тапетум
В клетках тапетума количество
митохондрий увеличено в 20-40 раз по
сравнению с другими тканями растений
Прямые доказательства критической роли тапетума в
развитии пыльцы были получены на трансгенных растениях:
Чужеродный рибонуклеазный ген, экспрессирующий
токсический продукт под действием специфического для
ткани тапетума промотора, вызывал формирование
стерильных пыльников
Действительно ли orf239-ген фасоли виновен в
формировании стерильности пыльцы???
Ген был введен в
ядерный геном
табака
orf239
Трансформанты, получившие orf239, имели стерильную
или полу-стерильную пыльцу
При этом их митохондрии не несли никаких мутаций!
Растения с Т-типом ЦМС у кукурузы высокочувствительны
к токсину, вырабатываемому
грибом Helminthosporium maydis
к пестициду
метомилу
Ген urf13 ЦМС-T кукурузы была введен в экспрессируемом
векторе в E. сoli
Трансформированные бактериальные штаммы отличались
морфологическими изменениями и/или замедленным ростом и,
так же, как ЦМС-T растения, были чувствительны к
грибному токсину
Если ген urf13 изменялся в результате мутации,
все перечисленные эффекты исчезали
Токсин H. maydis связывается с белком URF13
в митохондриях
это приводит к увеличению проницаемости
мембран митохондрий
и нарушению дыхания
В отсутствие токсина растения с Т-цитоплазмой абсолютно не
проявляют фенотипической депрессии, лишь развитие пыльцы
останавливается
Гипотеза:
пыльники продуцируют какое-то вещество, которое
действует аналогично Т-токсину или метомилу, что и
приводит к их аномалии
Природа данного вещества и сам факт его
существования пока не установлены
ЦМС – еще одна загадка эволюционного процесса
В ядерном геноме некоторых образцов присутствуют
гены, подавляющие весьма тонким образом экспрессию
строго определенного локуса чужого митохондриального
генома, с которым эти образцы никогда возможно ранее не
контактировали
эти гены оказываются эффективными уже при
первой встрече со стерильной цитоплазмой
У некоторых видов растений ЦМС- гены митохондрий
имеют гомологичные нуклеотидные последовательности –
горизонтальный перенос???
Разгадывайте
загадки
природы