Задания для самостоятельной работы.

Научно-образовательный курс «ДНК-белковые взаимодействия
in vivo и in vitro»
Практикум. Изучение ДНК-белковых взаимодействий in vitro
Предполагается, что слушатели в полном объеме владеют методами
молекулярного клонирования, экспрессии и очистки белков, выделения и
очистки молекул ДНК и РНК, полиакриламидный вертикальный гельэлектрофорез.
Программа.
Для изучения ДНК-белковых взаимодействий in vitro существует метод
торможения ДНК-белковых комплексов в геле. Данный метод позволяет
характеризовать ДНК-связывающую активность белка, изучать его сайт
узнавания на молекуле ДНК с целью исследования механизмов его действия.
Для постановки торможения в геле ДНК-белковых комплексов (EMSA)
необходимо иметь препарат изучаемого белка и меченый участок ДНК, с
которым изучаемый белок предположительно связывается. Эта техника
основана на том факте, что ДНК-белковые комплексы в нативном
полиакриламидном или агарозном геле мигрируют значительно медленней
свободной ДНК, что в результате приводит к формированию «шифта» в
области меченой полоски ДНК на геле. Исторически наиболее распространен
вариант метода с использованием радиоактивно меченых молекул ДНК.
Однако
в
последнее
время
все
более
популярными
становятся
нерадиоактивные подходы. Поэтому при выполнении данного практикума
молекулы ДНК будут мечены биотином. Для постановки эксперимента
используют различные белковые препараты: грубые клеточные экстракты, in
vitro синтезированные и рекомбинантные очищенные белки. В рамках
выполнения данной задачи будет использован заранее экспрессированный и
очищенный белок, для которого известен сайт связывания. Тестируемый
участок ДНК будет также заранее подготовлен. При выполнении данной
задачи будет поставлена реакция связывания белка с участком ДНК, затем
проведен вертикальный полиакриламидный гель-электрофорез в нативных
условиях, ДНК из геля будет перенесена на мембрану и энзиматически
детектирована на ней.
Список оборудования и материалов:
Материалы:
1) Препарат белка EBNA
2) ДНК-фрагмент, меченый биотином, 10 фмоль/мкл в 10 мМ трис,
1мМ ЭДТА; рН 7.5
3) немеченый ДНК-фрагмент, 2 пмоль/мкл в 10 мМ трис, 1мМ ЭДТА;
рН 7.5
4) Набор реактивов для мечения ДНК: концевая деоксинуклеотидилтрансфераза, 20U/ мкл; 5x буфер для мечения (500 мМ какодилат, 10 мМ
CoCl2, 1мМ ТСЕР, рН 7.2); Биотин-11-дУТФ, 5мкМ; хлороформ.
5) poly (dIdC), 1мкг/мкл в 10 мМ трис, 1мМ ЭДТА; рН 7.5
6) Растворы: 50% глицерол, 1% NP40, 1М KCl, 100 мМ MgCl2, 200 мМ
ЭДТА рН8, 5xбуфер для нанесения на гель (0,25% бромфеноловый синий;
0,25% ксиленцианол; 10mM ЭДТА (pH 8,0); 50% глицерол).
7) 10хбуфер для связывания: 100мМ трис, 500 мМ KCl, 10 мМ DTT, рН
7.5
8) конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена
9) субстрат для хемилюминесцентной детекции ДНК на мембране
10) буфера для блокирования и промывания мембраны
2
11) положительно заряженная найлоновая мембрана
12) 5хтрис-боратный буфер (ТВЕ)
13) компоненты полиакриламидного геля: акриламид, бис-акриламид,
персульфат аммония, ТЕМЕД.
Оборудование:
1) Кросс-линкер;
2) Камера для вертикального гель-электрофореза;
3) Прибор для полусухого переноса;
4) Источник питания;
5) Водяная баня;
6) Система для детекции хемилюминесцентного сигнала на мембране
Протокол:
1. Подготовка геля и пре-форез.
Приготовить 5% нативный полиакриламидный гель в 0,5хТВЕ, залить между
стеклами, вставить гребенку на нужное количество образцов и дать гелю
заполимеризоваться в течение 10 – 15 мин. Гель закрепить в камеру,
наполнить ее 0,5хТВЕ. В течение 30-60 мин проводить пре-электрофорез при
напряжении 100 V. Во время пре-электрофореза заняться подготовкой проб.
2. Мечение ДНК биотином
Подготовить компоненты реакции мечения (разморозить и поместить в лед,
развести
концевую
деоксинуклеотидил-трансферазу
(далее
TdT)
до
концентрации 2U/мкл в 1х буфере для мечения). Смешать компоненты
реакции в следующей последовательности:
3
Компонент
Вода mQ
Количество
конечная
в реакции
концентрация
28 мкл
5х буфер для 10 мкл
1х
мечения
Немеченый
2,5 мкл
100нМ
5 мкл
0.5 мкМ
5 мкл
0.2U/мкл
ДНК-фрагмент,
2мкМ
Биотин-11дУТФ
TdT, 2U/мкл
Инкубировать при 37С 30 минут, добавить 1 мкл 0.5М ЕДТА для остановки
реакции. Добавить 50 мкл смеси хлороформ:изоамиловый спирт, перемешать
на вортексе, центрифугировать 1 мин на максимальных оборотах. Отобрать
водную фазу. Перед использованием развести до 10 фмоль/мкл.
3. Постановка реакции связывания.
Все компоненты реакции связывания поместить в лед. Смешать все
компоненты реакций в соответствии с таблицей. Проба №1 – контроль,
демонстрирующий
расположение
свободной
меченой
ДНК,
белок
отсутствует; проба №2 – эксперимент, содержащий контрольный меченый
ДНК-фрагмент и белок; проба №3 – эксперимент, содержащий меченый в
предыдущем эксперименте ДНК-фрагмент и белок; проба №4 – контроль,
4
доказывающий специфичность реакции связывания, к меченой ДНК и белку
добавлен 200-кратный избыток немеченой ДНК.
Компонент
Количество Проба Проба Проба
в пробе
Вода mQ
10х буфер для 1х
№1
№2
№3
12
11
9 мкл
мкл
мкл
2 мкл
2 мкл
2 мкл
связывания
50% глицерол
2,5 %
1 мкл
1 мкл
1 мкл
100 мМ MgCl2
5 мМ
1 мкл
1 мкл
1 мкл
1мкг/мкл
50 нг/мкл
1 мкл
1 мкл
1 мкл
1% NP40
0,05%
1 мкл
1 мкл
1 мкл
Немеченый
4 пмоль
poly(dIdC)
2 мкл
ДНК-фрагмент
Меченый
20 фмоль
2 мкл
2 мкл
2 мкл
1 мкл
1 мкл
20
20
20
мкл
мкл
мкл
биотином ДНКфрагмент
Белковый
экстракт
Общий объем
5
Инкубировать реакции в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем
добавить в каждую пробирку по 5 мкл буфера для нанесения на гель.
4. Электрофорез и перенос проб на мембрану.
После пре-электрофореза промыть лунки в геле. Затем нанести по 20 мкл
каждой пробы на дорожки. Проводить электрофорез при напряжении 100 V
до тех пор пока бромфеноловый синий не пройдет ¾ геля.
Найлоновую мембрану перед переносом на 10 мин замочить в 0,5хТВЕ. В
приборе для полусухого переноса разместить смоченную в буфере
фильтровальную бумагу, мембрану и гель. Используемый для переноса
0,5хТВЕ предварительно охладить до 10 °С. Перенос проводить в течение 30
мин при 380 мА. После переноса мембрану пробами вверх разместить в
кросс-линкере и пришить ДНК при параметрах 120 мДж/см2 в течение 60 сек.
5. Детекция меченой ДНК.
Блокирующий и Отмывочный буфера заранее нагреть до 50 °С в водяной
бане. К мембране добавить 20 мл Блокирующего буфера, и инкубировать на
шейкере при комнатной температуре в течение 15 мин. Подготовить раствор
конъюгата, смешав 66,7 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена и 20
мл Блокирующего буфера. Поместить в этот раствор мембрану и
инкубировать на шейкере при комнатной температуре в течение 15 мин.
Затем мембрану промыть 4 раза 20 мл порциями Отмывочного буфера на
шейкере при комнатной температуре по 5 мин. После отмывок мембрану
уравновесть в 30 мл буфера для субстрата на шейкере при комнатной
температуре в течение 5 мин. Перенести мембрану в чистый контейнер,
проследив, чтобы сторона с пробами располагалась сверху, и нанети на
мембрану раствор субстрата, инкубировать 5 мин. Затем с мембраны удалить
6
остатки раствора, завернуть в пленку. После этого можно проводить
детекцию
при
помощи
CCD
камеры
в
системе
для
детекции
хемилюминесценции.
Список обретаемых навыков:
1)
постановка
реакции
связывания
для
получения
ДНК-белковых
комплексов;
2)
метод
разделения
макромолекул
нативным
полиакриламидным
электрофорезом;
3) метод переноса молекул ДНК на мембрану;
4) метод хемилюминесцентной детекции меченых молекул ДНК на
мембране.
Список литературы:
1. Garner M.M., Revzin A. "A gel electrophoresis method for quantifying the
binding of proteins to specific DNA regions: application to components of
the Escherichia coli lactose operon regulatory system". Nucleic Acids Res.,
1981, 9 (13): 3047–60.
2. Fried M., Crothers D.M. "Equilibria and kinetics of lac repressor-operator
interactions by polyacrylamide gel electrophoresis". Nucleic Acids Res.,
1981, 9 (23): 6505–25.
3. Current protocols in molecular biology , 1994, pp. 12.2.1–11.
4. Smith A.J., Humphries S.E. Characterization of DNA-binding proteins
using multiplexed competitor EMSA". J. Mol. Biol. , 2009, 385 (3): 714–7.
7
Задания для самостоятельной работы.
Задание 1
Рис.1
белок
0
0.05 0.25 1.25 мг/мл
неспецифичная
ДНК
специфичная ДНК
На рисунке 1 показан результат эксперимента по задержке в геле
комплекса белка с молярной массой 90 кДа, специфично связывающегося с
фрагментом
ДНК длиной 90 п.н., содержащей один сайт узнавания для
данного белка, в присутствии меченой ДНК, не содержащей специфичного
сайта связывания данного белка и избытка Poly[dI-dC]. Концентрация
специфичной ДНК 0.02 мкг/мл. Оцените равновесную константу связывания
данного препарата белка со специфичной ДНК. Рассчитайте соотношение
количества белка и ДНК в образцах. Объясните наблюдаемый результат.
Решение.
Комментарии
8
Свойства ДНК-белкового комплекса характеризуются константами
образования комплекса или ассоциации (К+1), его диссоциации (К-1), в
упрощенном виде:
DP
K
1


 

K
1
DP
где D – ДНК, а Р – белок.
Отношение К-1/К+1 получило название равновесной константы
диссоциации (KD). Иначе она выражается формулой:
KD 
[ D][ P]
[ DP ]
KD 
[ D0  D1 ][ P0  P1 ]
(2), где P0 и D0 – исходные концентрации белка и
[ D1 P1 ]
(1), или
ДНК, а P1 и D1 – концентрации белка и ДНК в составе комплекса.
Однако, наблюдаемые в эксперименте величины часто не точны из-за
присутствия неспецифических конкурирующих субстратов или сайтов
связывания. Наблюдаемое в эксперименте значение равновесной константы
связывания называется кажущейся константой связывания (Kapp), оно
описывается формулой:
Kapp= KD+ NNSKNS , где KNS – равновесная константа связывания с
неспецифическим субстратом, а NNS – число неспецифических сайтов
связывания.
Для упрощения расчетов принято оценивать концентрацию белка в
точке, где наблюдается связывание 50% фрагмента ДНК. В этом случае
[D]=[DP] и уравнение (2) упрощается до вида KD = [P0-P1], в случае если P0 >>
D0, а P1=D1 (в случае присутствия только одного сайта связывания данного
белка на молекуле ДНК), то KD ≈ [P0].
Рассмотрим задачу 1:
В данном случае не наблюдается неспецифическое связывание с ДНК,
поэтому
кажущаяся
константа
равновесия
9
соответствует
расчетной
равновесной константе диссоциации. ДНК содержит лишь один сайт
связывания данного белка, визуально связывание 50% ДНК-фрагмента
наблюдается при концентрации белка 0.1 мг/мл.
Концентрация белка 0.1 мг/мл соответствует 1.1 мкМ (
[0.1 г/л ]
).
[90000г/моль ]
Молярная масса фрагмента ДНК длиной 90 п.н. соответствует
приблизительно 60 кДа (средняя масса пары нуклеотидов составляет 660Да),
таким образом, молярная концентрация фрагмента ДНК в реакции составляет
около 300 пМ (
[0.02 мг/л ]
).
[60000г/моль ]
Поскольку в данной точке связывается 50% фрагмента ДНК,
концентрация комплекса составляет 150 пМ, что существенно ниже
концентрации белка, которая составляет 1.1 мкМ, таким образом, значение
равновесной константы диссоциации в этом случае составляет KD = [P0] =
1.1мкМ.
Для большинства ДНК-связывающих белков характерны низкие значения
равновесной константы диссоциации, например, для Lac-репрессора эта
величина составляет 1.3×10-12 М. Очень высокое значение константы в
данном случае в сочетании со значительным (порядка 4000:1) избытком
молярной концентрации белка может говорить о низкой концентрации
исследуемого белка в смеси, либо о плохом качестве препарата белка.
10
Задание 2
Рис.2
белок
0
10 100 нМ
А
белок
Б
0 10
20 40
80 160 320
нМ
На рисунке 2 изображены результаты экспериментов по задержке в
геле. Предложите объяснение наблюдаемых результатов: образование белком
А и ДНК комплекса с высокой молярной массой, и образование белком Б и
ДНК множества комплексов с разной молекулярной массой. Оцените
константу связывания белка Б с ДНК. Можно ли рассчитать константу
связывания белка А с ДНК? почему?
Решение
Комментарии
11
В эксперименте с белком А наблюдается резкое увеличение массы ДНКбелкового комплекса при повышении концентрации белка, что может
говорить о том, что молекулы белка А могут взаимодействовать между
собой, образуя сложный комплекс, включающий несколько молекул ДНК.
Масса комплекса, таким образом возрастает кратно массе исходного ДНКбелкового комплекса. В случае белка Б наблюдается ступенчатое увеличении
молекулярной массы комплекса, что говорит о том, что фрагмент ДНК
содержит несколько сайтов связывания данного белка (по всей видимости
ДНК содержит четыре сайта, так как наблюдается четыре комплекса
различной массы). В этом случае масса комплекса возрастает лишь на
значение массы одной молекулы белка. Связывание 50% ДНК-фрагмента
визуально наблюдается в точке с концентрацией белка 20 нМ. Предполагая,
что концентрация ДНК=фрагмента достаточно низка, чтобы ей можно было
пренебречь, равновесную константу диссоциации данного комплекса можно
оценить как 20 нМ. В случае белка А мы можем заключить лишь то, что
равновесная константа имеет значение меньше 10 нМ, а в диапазоне 10-100
нМ находится значение равновесной константы взаимодействия между
молекулами белка А.
12
Задание 3
Рисунок 3
белок
А
0
1
10
10*
белок
мкМ
0
0.5
1
2
2*
Б нМ
На рисунке 3 показаны результаты исследования различных ДНКбелковых комплексов. В образце, помеченном звездочкой (*) после
образования комплекса белка указанной концентрации со специфичной
меченой ДНК был добавлен 100кратный избыток немеченого фрагмента
ДНК, после чего смесь инкубировали 1 час перед нанесением. Сравните
поведение различных ДНК-белковых комплексов в этих условиях, сделайте
вывод об их стабильности.
Решение.
Комментарии
Другой характеристикой взаимодействия белка с ДНК является
устойчивость комплекса DP, выражаемая временем полужизни комплекса в
присутствии избытка субстрата.
В эксперименте с белком А очевидно, что за 1 час наблюдается почти
полный распад комплекса, в случае белка Б наоборот, очевидно, что
комплекс стабилен как минимум в течение одного часа. Расплывчатая форма
13
комплекса белка А с ДНК также говорит о низкой стабильности комплекса
(во время электрофореза комплекс начинает разрушаться вследствие сдвига
равновесия
DP
характерно
K
1


 

K
1
также
DP
в левую сторону). Для белка Б, по всей видимости,
более
низкое
значение
равновесной
константы
диссоциации.
Результаты практического задания.
При выполнении участниками практического задания планировалось
воспроизвести следующий результат:
биотин-EBV-ДНК, 10
+
+
fmol
+
+
EBV-ДНК, 1pmol
+
+
белок EBNA
ДНК-белковый
комплекс
Свободная ДНК
В данном эксперименте наблюдается взаимодействие белка EBNA
(Eppseit-Barr nuclear antigen) с участком ДНК вируса Эпштейна-Барра в
присутствии неспецифического конкурента (Poly[dI-dC]). При добавлении
избытка специфической немеченой ДНК связывание пропадает.
14
В результате выполнения практического задания были получены следующие
результаты:
биотин-EBV-ДНК, 10
+
+
+
+
+
+
+
+
fmol +
EBV-ДНК, 1pmol
+
белок EBNA
+
+
+
+
№ дорожки +
1
2
3
4
5
6
7
9
биотин-EBV-ДНК, 10
+
+
+
+
+
fmol +
белок EBNA
+
+
№ дорожки +
10
11
15
15
12
13
14
8
При этом в дорожках 1-3 показаны результаты эксперимента с
контрольной ДНК, а в дорожках 4-15 – с ДНК, меченной участниками на
первом этапе выполнения практического задания.
Видно, что результаты контрольного эксперимента воспроизвелись, в
экспериментах
с
ДНК,
меченной
участниками,
также
наблюдается
образование ДНК-белкового комплекса, однако эффективность мечения
ниже, свободная ДНК плохо наблюдается из-за слишком продолжительного
электрофореза.
16