Генноинженерные ветеринарные препараты Прокулевич В. А., Потапович М.И., Голенченко С.Г., Кудин

Прокулевич В. А.,
Потапович М.И., Голенченко С.Г., Кудин
К.В., Совгир Н.В., Добровольский С.
Генноинженерные ветеринарные
препараты
Белорусский государственный университет
Минск - Нарочь, 2012 г.
Подпрограмма «Сельскохозяйственная биотехнология
(растениеводство)»,
Раздел «ДНК-технологии для сельского хозяйства и
здравоохранения»
ГП «Инновационные биотехнологии»по заданию № 3/2a
«Создать трансгенные растения рапса с геном птичьего
интерферона»
Белгосуниверситет
Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси
НПЦ НАН Беларуси по земледелию
Научные руководители:
Прокулевич В.А.
Волотовский И.Д.
Привалов Ф.И.
Целью работы явилось получение трансгенных растений рапса,
включивших в свой геном ген куриного интерферона.
При этом необходимо было решить ряд экспериментальных задач:
1. Сконструировать векторы для экспрессии гена куриного интерферона в
растениях – БГУ, Институт биофизики и клеточной инженерии НАН
Беларуси
2. Создать агробактериальные клоны с геном куриного интерферона –БГУ,
Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси
3. Адаптировать агробактериальную систему трансформации in planta для
рапса – БГУ, Институт биофизики и клеточной инженерии НАН
Беларуси, НПЦ НАН Беларуси по земледелию
4. Получить трансгенные растения рапса, включившие в геном ген
куриного интерферона
Решение данных задач позволит получить практический
результат в виде трансгенных растений, продуцирующих и
накапливающих белок куриного интерферона имеющий
лечебные и профилактические (антивирусные и
иммуномодулирующие) свойства. Предполагается, что на
основе таких растений будет создана препаративная форма
для профилактики и лечения болезней кур.
ПЦР продукт (ген куриного интерферона) амплифицировали с
использованием модифицированных праймеров - с добавлением
дополнительного сиквенса (CACC), что позволяет использовать данный
продукт для pENTR Directional TOPO® Cloning и осуществить встраивание
ПЦР продукта в строго заданной ориентации (с эффективностью до 90%),
за счет отжига комплементарного участка вектора (GTGG) и стабилизации
встраиваемого фрагмента катализируемого Topoisomerase I из Vaccinia
virus.
В результате реакции рекомбинации (LR-reaction) αINF-pENTR с
бинарным экспрессионным вектором pB7WG2 были получены
экспрессионые конструкты по интерферону. Более 95% полученных E.
coli
DH5α
клонов
содержали
экспрессионный
конструкт.
Рестрикционный анализ с использованием BamHI показал, что все
тестируемые клоны содержат ген интерферона в правильной
ориентации.
Полученые экспрессионные клоны были трансформированы при
помощи метода электропорации в штаммы Agrobacterium tumefaciens
GV3010 (содержащий хелперную плазмиду pMP90RK) и LBA4404 (с
модификацией pBBR1MCS-5.virGN54D). Данные штаммы наследуют
дополнительные участки, определяющие более эффективное
встраивание фрагментов Т-DNA в геном растений.
Трансформация проводилась методом нанесения поранения
in planta. Проросткам лезвием наносилось поранение между
семядолями через апикальную меристему на 1,5-2 мм до
семядольного
узла
небольшого
утолщения
под
семядольными листьями, состоящего из меристемной ткани,
отвечающей за развитие всех последующих надземных
органов растения.
А
В
А.
Семядольный
узел на проростке
рапса.
Одна
семядоля удалена.
В. Проросток после
поранения Красная
стрелка указывает
на
семядольный
узел
Трансформированные растения рапса после
обработки
селективным
агентом.
Чёрными
стрелками
обозначены
предполагаемые
трансформанты, красными – растения, не
прошедшие селекционный отбор.
Для селекции трансформантов в качестве селектирующего
фактора использовался тотальный гербицид БАСТА.
Проводили трехкратную обработку БАСТА из пульверизатора в
концентрации 0,1 мл/100 мл воды с промежутком в 10 дней
между каждой обработкой.
Эффективность трансформации рапса «Прамень»
Используемые клоны
A. tumefaciens
A
Обработано проростков
B
C
436 163 399
D
1
2
3
Всего/в
среднем
120
800
650
515
3083
Получено трансгенных растений
8
31
18
13
107
95
16
288
Среди них стерильных
0
2
0
0
3
1
1
7
1,8
19
4,5
10,8
13
14,6
3,1
9,5
Эффективность трансформации, %
Для трансформации использовались 7 клонов агробактерий,
4 клона GV3010 (А и С - pB7WG2, и В и D - pB7WG2 с Nтерминальным эпитопным StrepII-3xHA тагом) и 3 клона
LBA4404 (с дополнительной модификацией VirGN54D Tiплазмиды) – 1, 2 и 3
1 2
3 4 5
6
7 8 9 10
Верхний ряд:
1-5 - ДНК, выделенная из
листьев клонов рапса №№ 167171,
6,7 – клетки Agrobacterium,
используемые
для
трансформации,
8 – положительный контроль
(используемая плазмида с геном
куриного интерферона),
9 – отрицательный контроль,
10 – ladder.
Нижний ряд:
1-9 – ДНК, выделенная из
листьев клонов рапса №№ 94-99,
164-166,
10 – ladder (снизу вверх: 100,
200, 300, 400, 500 п. н. и т.д.);
Достигнутые результаты:
1. Сконструированы плазмиды:
- pB7WG2 – экспрессионный вектор с геном куриного интерферона,
предназначенный для трансформации в растения.
-pB7WG2 StrepII-3xHA – экспрессионный вектор, где ген куриного
интерферона, модифицированный таговой последовательностью,
позволяющей отслеживать уровень синтеза целевого белка и
осуществлять его очистку из растительного материала.
2. Получено 7 клонов агробактерий: 4 клона GV3010 (А и С pB7WG2, и В и D - pB7WG2 с N-терминальным эпитопным StrepII3xHA тагом) и 3 клона LBA4404 (с дополнительной модификацией
VirGN54D Ti-плазмиды)
3. Получено 288 трансгенных растений рапса сорта «Прамень»,
устойчивые к селективному агенту гербициду «БАСТА» и 14
растений, показавших положительный ответ в ПЦР-анализе.
Цирковирус свиней типа 2
(ЦВС-2)
синдром
мультисистемного
истощения
отъемышей
(СМИО)
энтерит
репродуктивная
дисфункция
некротический
дерматит
нефропатический
синдром
пневмония
субклиническая ЦВС-2
инфекция
синдром свиного
дерматита и
нефропатии
Генотипы ЦВС-2
a
«американский» генотип
b
«европейский» генотип
(представлен в Беларуси)
Направления работы
1. Разработка вакцины
2. Разработка диагностических наборов
a. ИФА
b. ПЦР
Стандартная ПЦР
ПЦР в реальном времени
Свойства лизирующих ферментов
бактериофагов
Высоко специфичны
Действуют только против одного или нескольких
близкородственных видов бактерий, не затрагивая
нормальную микрофлору.
Высоко активны
Рабочие дозы – несколько мкг/кг. Действуют
быстро, за минуты.
Действуют на консервативную
мишень – клеточную стенку
Нет различий в чувствительности у различных
штаммов одного вида. Низка вероятность
возникновения устойчивых штаммов.
Обладают бактерицидным
действием
Идеально подходят для пациентов с
иммунодепрессивными состояниями
Вещества белковой природы
Не токсичны, легко метаболизируются и
выводятся. Производство не связано с крупными
экологическими издержками.
Обладают выраженной
доменной структурой
Удобно для создания не существующих в природе
химерных энзимов с заданным спектром
антибактериальной активности.
Показания:
Лизоцимы применяется для лечения и профилактики гнойных
инфекций кожи, слизистых, висцеральных органов, вызванных
стафилококками или стрептококками, а также при дисбактериозах
•
•
•
•
•
•
•
•
заболевания уха, горла, носа, дыхательных путей и легких (синусит, отит,
ангина, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония, плеврит);
хирургические инфекции (гнойные раны, инфицированные ожоги, абсцесс,
флегмона,
фурункул,
карбункул,
гидраденит,
панариций,
инфильтрированный и абсцедировавшийся стафилококковый сикоз,
парапроктит, мастит, бурсит, тендовагинит, остеомиелит);
урогенитальная патология (уретрит, цистит, пиелонефрит, кольпит,
эндометрит, сальпингоофорит);
энтеральная патология (гастроэнтероколит, холецистит, дисбактериоз
кишечника);
генерализованные септические заболевания;
гнойно-воспалительные
заболевания
новорожденных
(омфалит,
гастроэнтероколит, сепсис);
другие заболевания стафилококковой или стрептококковой этилогии;
профилактика гнойных процессов при свежеинфицированных ранах
(операции брюшной и грудной полости, уличный и производственный
травматизм и др.); для профилактики внутрибольничных инфекций по
эпидемическим показаниям.
Лизирующий фермент
стафилококкового бактериофага К
Доменная структура LysK
Пептидогликан
Staphylococcus aureus
Фотография бактериофагов
семейства Myoviridae
CHAP –
cysteine,
histidinedependent
amidohydrolase/
peptidase
(наиболее
активный
домен)
Активность
LyzK 174
S. aureus 141 ОП600 контроль
S. aureus 141 ОП600 50U Lyz174
T1/2 = 0,8’
T1/2 = NA
Исследованные
штаммы:
S. aureus 141
S. aureus 142
S. aureus 143
S. aureus 144
S. aureus 367
S. aureus 388
Не различались по
чувствительности
КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА АНТИМИКРОБНОГО БЕЛКА
ЭСКУЛЕНТИНА В СОСТАВЕ ГИБРИДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI
 Катионный АМП
эскулентин-1b (Esc-1b) из кожных секретов прудовой
лягушки (Rana esculenta), состоит из 46 аминокислотных остатков и
характеризуется наличием семичленного С-терминального кольца, которое
стабилизируется дисульфидным мостиком между Cys40 и Cys46.
 Анализ данного пептида показал, что его активность в отношении
грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов обусловлена
линейной N-концевой областью с первой аминокислотной позиции по
восемнадцатую (GIFSKLAGKKLKNLLISG-NH2) - Esc (1-18), которая обладает
таким же положительным зарядом (+5) как полноразмерный пептид.
Действие Esc (1-18) в МИК 32мкМ на
клетки E. coli ATCC 25922 (4×107
КОЕ/мл) по данным просвечивающей
электронной микроскопии.
A – контроль (клетки не обработанные
Esc (1-18)),
B – результат действия через 5 мин,
C – результат действия через 20 мин
(Marcellini et al., 2009)
 Ген, кодирующий белок Esc-1b, был клонирован в клетках
E. coli BL21CodonPlus(DE3)-RIPL.
Однако последующая экспрессия гена и
проведенный электрофоретический анализ белков в Tricine-SDS-PAGE не
выявил накопления целевого продукта по массе равного 4,8 кДа.
 Согласно литературным данным экспрессия АМП в клетках E. coli связана с
рядом трудностей: во-первых, они могут деградироваться клеточными
протеазами, а во-вторых, токсичны для клеток, в которых экспрессируются.
 В качестве партнера Esc-1b был выбран пептидазный домен лизирующего
фермента бактериофага К длиной 165 аминокислотных остатков (LyzK) и
массой 18,6 кДа, который хорошо экспрессируется в клетках E. coli и
формирует тельца включения, а также известен своей выдающейся
антистафилококковой активностью.
 Экспрессия
клонированной
гибридной
последовательности,
предположительно, должна приводить к образованию белка, на N-конце
содержащего Esc-1b, на С-конце – LyzK165.
 Индукцию экспрессии клонированного гена проводили в среде ZYM-5052 для
автоиндукции. Проведенный электрофоретический анализ белков в SDSPAGE показал образование продукта N-Esc-1b-LyzK165-C массой 23,4 кДа.
Дорожки:
1, 2, 3 – pET-24b(+)-Esc-1b/LyzK165
(штаммы 1, 2, 3 соответственно)
4 – pET-24b(+)-LyzK165
(положительный контроль)
5 – pET-24b(+) (отрицательный
контроль)
6 – белки-стандарты молекулярных
масс Fermentas SM0431 (сверху вниз:
116 кДа, 66,2 кДа, 45 кДа, 35 кДа, 25
кДа, 18,4 кДа, 14,4 кДа)