Н.В. Алпатьева, И.Н. Анисимова. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ
advertisement
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЯЧМЕНЯ В ВИРе Н.В. Алпатьева, И.Н. Анисимова отдел генетики ГНУ ВИР Россельхозакадемии Молекулярные исследования генетического разнообразия культурных растений в отделе генетики ВИР I. Структурирование генетического разнообразия, сохраняемого в коллекциях ВИР (зерновые, бобовые, масличные) II. Молекулярный скрининг с целью выявления носителей генов, контролирующих хозяйственно ценные признаки (устойчивость к болезням, ЦМС-Rf и др.) III. Анализ изменчивости генов, кодирующих хозяйственно ценные признаки (анализ аллельного полиморфизма на молекулярном уровне, разработка молекулярных маркеров для проведения скрининга) I. Генотипирование и структурирование генетического разнообразия Молекулярные маркеры, используемые для генотипирования и структурирования генетического разнообразия ячменя и овса: RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA ISSR – Intersimple Sequence Repeat Polymorphic DNA SSR – Simple Sequence Repeats RAMP – Random Amplified Microsatellite Polymorphism STS – Sequence-Tagged Sites DArT – Diversity Arrays Technology SNP – Single Nucleotide Po;lymorphism EST based markers М1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hou et al., 2005; Fernandez et al., 2002 и др. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных с помощью праймера ISSR15: М – маркер молекулярного веса; 1-19 – местные образцы ячменя из Дагестана Фрагмент базы данных: 0 – отсутствие фрагмента, а 1 – его наличие Генотипирование и структурирование генетического разнообразия перспективного для селекции материала с помощью RAPD и ISSR маркеров Объект исследований - коллекция ВНИИ растениеводства имени Н.И. Вавилова, а также материалы экспедиционных сборов в республике Дагестан (более 250 образцов) Работа поддержана РФФИ ( грант 12-04-96503) Кладограмма степени сходства образцов Дагестанского ячменя Р.А. Абдуллаев, Н.В. Алпатьева, О.Н. Ковалева, Е.Е. Радченко, Б.А. Баташева, не опубликовано Отделы генетики и генетических ресурсов овса, ржи, ячменя ВИР Дагестанская опытная станция ВИР МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ СТАРОДАВНИХ ЯЧМЕНЕЙ АЛТАЙСКОГО КРАЯ Н. В. Алпатьева, М. А. Жук, О. Н. Ковалева, И. Г. Чухина, И. Н. Анисимова отделы генетики, агроботаники и in-situ сохранения, генетических ресурсов овса, ржи, ячменя ВИР Гипотезы о путях формирования генофонда алтайских ячменей: 1) 2) 3) 4) Из европейской части с переселенцами Из Средней Азии Из Китая Из ближайших земледельческих районов Восточной Сибири Структурирование молекулярно-генетического разнообразия стародавних сортов из районов предполагаемой миграции культур – эффективный инструмент филогеографического анализа (D. Saisho, M.D. Purugganan Molecular Phylogeography of Domesticated Barley Traces Expansion of Agriculture in the Old World // Genetics, 2007, V. 177, 1764-1776) Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 11-04-01207-а) Изучение стародавних форм ячменя, собранных на территории Русского Алтая, с помощью RAPD и ISSR маркеров Материал: 54 образца (первая половина XX века): 33 - с территории русского Алтая 8 - из Китая 5 -из Тувы 2 - из Казахстана 6 - из европейской части Группы образцов, выделившиеся по результатам кластерного анализа I - многорядные ячмени, в основном алтайского происхождения; II - двурядные ячмени разного происхождения; III - многорядные китайские ячмени (пленчатые, и голозерные) Цель работы - выявить пути формирования местного разнообразия культурных ячменей Результаты исследования выявили генетическую неоднородность ряда стародавних образцов Электрофореграмма продуктов амплификации с праймером ISSR-15 Факторы, оказавшие влияние на пути распространения культуры ячменя (D. Lister et al. 2012): 1) Обеспеченность населения дикорастущими ресурсами 2) Адаптация растений к новым климатическим условиям, прежде всего, длине светового дня (гены PPd, Eam) • В селекции ячменя, адаптированного к условиям короткого вегетационного периода, при продвижении культуры в северные широты, широко использовались мутации eam (early maturity ) • Eam8 = Praematurum-a.8 (Mat-a.8) ячменя - ортолог гена EARLY FLOWERING3 (ELF3) Arabidopsis thaliana, регулирующего чувствительность к фотопериоду (Faure et al., 2012). Белковый продукт гена ELF3 (695 аа) – циркадный регулятор транскрипции • Известно 87 мутантов по гену Eam8 и идентифицировано 20 рецессивных аллелей, отличающихся делециями, инверсиями и заменами нуклеотидов как в смысловой области гена, так и в интронах (Zakhrabekova et al., 2012) Скороспелые нечувствительные к фотопериоду сорта Maja и Maria индуцированные мутанты, а сорта Kinai 5, Kagoshima Gold и Русский ранний – естественные формы ячменя. МУТАЦИЯ eam8 У ОБРАЗЦА ЯЧМЕНЯ К-14891 ИЗ ДАГЕСТАНА Р. А. Абдуллаев, И. А. Звейнек, Н. В. Алпатьева, Е. Е. Радченко отделы генетики и генетических ресурсов овса, ржи, ячменя ВИР Работа поддержана РФФИ ( грант 12-04-96503) МУТАЦИЯ eam8 У ОБРАЗЦА ЯЧМЕНЯ К-14891 ИЗ ДАГЕСТАНА Фенотипический скрининг При 10 часовом фотопериоде, низкой дневной (10°С) и высокой ночной (20°С) температуре ген eam8 (eak) плейотропно влияет на гены, контролирующие желтую окраску проростков ячменя (Yasuda et al., 1965). Молекулярный скрининг M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 13 14 15 16 580 пн Электрофореграммы фрагмента гена eam8 у образцов: 1, 2 – Mona; 3, 4 – Mari; 5, 6 – Белогорский; 7, 8 – Kinai 5; 9, 10 – Bankuti Korai, 11, 12 – к-14891; 13, 14 – к-16377; 15, 16 – к-17429; М – маркер молекулярного веса. Материал к-14891, к-16377, к-17429 - скороспелые староместные образцы, собранные в горных районах Дагестана сорта Mona, Mari, Kinai 5 (генотип eam8eam8) сорт Белогорский (Eam8Eam8) скороспелый сорт Bankuti Korai Bonus_JN180296.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 1302 1302 1302 1302 1302 gtctgattggattggaaaacctagagtagattacaggcatgctgctgggcttagcaacagtgtcagccttagactagcctctgttagtct gtctgattggattggaaaacctagagtagattacaggcatgctgctgggcttagcaacagtgtcagccttagactagcctctgttagtct gtctgattggattggaaaacctagagtagattacaggcatgctgctgggcttagcaacagtgtcagccttagactagcctctgttagtct gtctgattggattggaaaacctagagtagattacaggcatgctgctgggcttagcaacagtgtcagccttagactagcctctgttagtct gtctgattggattggaaaacctagagtagattacaggcatgctgctgggcttagcaacagtgtcagccttagactagcctctgttagtct 1391 1391 1391 1391 1391 Bonus_JN180296.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 1392 1392 1392 1392 1392 tagcagtgtggatgagtttttagttgagacacgactgggcaatttcttcatttctaattgtatatatac----------gactgcttact tagcagtgtggatgagtttttagttgagacacgactgggcaatttcttcatttctaattgtatatatac----------gactgcttact tagcagtgtggatgagtttttagttgagacacgactgggcaatttcttcatttctaattgtatatataccactggtttgaactgcttact tagcagtgtggatgagtttttagttgagacacgactgggcaatttcttcatttctaattgtatatatac----------gactgcttact tagcagtgtggatgagtttttagttgagacacgactgggcaatttcttcatttctaattgtatatatac----------gactgcttact 1471 1471 1481 1471 1471 Bonus_JN180296.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 1472 1472 1482 1472 1472 cacttgtaccttcttcttgtAGATTGGTGGGATCGACAGACCTCTCTTTCCATCATTTTGCGTGCCTTCAAACGAACCCGTGCCTTTGCC cacttgtaccttcttcttgtAGATTGGTGGGATCGACAGACCTCTCTTTCCATCATTTTGCGTGCCTTCAAACGAACCCGTGCCTTTGCC cacttgtaccttcttcttgtAGATTGGTGGGATCGACAGACCTCTCTTTCCATCATTTTGCGTGCCTTCAAACGAACCCGTGCCTTTGCC cacttgtaccttcttcttgtAGATTGGTGGGATCGACAGACCTCTCTTTCCATCATTTTGCGTGCCTTCAAACGAACCCGTGCCTTTGCC cacttgtaccttcttcttgtAGATTGGTGGGATCGACAGACCTCTCTTTCCATCATTTTGCGTGCCTTCAAACGAACCCGTGCCTTTGCC 1561 1561 1571 1561 1561 Bonus_JN180296.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 1562 1562 1572 1562 1562 ACAACACATCAATACCAACTCAAGTGGGCATGCTACCTCTGGGAGGCTTTCCACACAGCTTAAGAGCAAGGATGCCTATGCTGCCGGATC ACAACACATCAATACCAACTCAAGTGGGCATGCTACCTCTGGGAGGCTTTCCACACAGCTTAAGAGCAAGGATGCCTATGCTGCCGGATC ACAACACATCAATACCAACTCAAGTGGGCATGCTACCTCTGGGAGGCTTTCCACACAGCTTAAGAGCAAGGATGCCTATGCTGCCGGATC ACAACACATCAATACCAACTCAAGTGGGCATGCTACCTCTGGGAGGCTTTCCACACAGCTTAAGAGCAAGGATGCCTATGCTGCCGGATC ACAACACATCAATACCAACTCAAGTGGGCATGCTACCTCTGGGAGGCTTTCCACACAGCTTAAGAGCAAGGATGCCTATGCTGCCGGATC 1651 1651 1661 1651 1651 Bonus_JN180296.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 1652 1652 1662 1652 1652 GACTGCTGAGTGTACTAGTTCACACGGCAGAGACAACAACGCCAAGAATTCTTCTGGGAACAAGTTGACTAACGATGATGATTTTACGGT GACTGCTGAGTGTACTAGTTCACACGGCAGAGACAACAACGCCAAGAATTCTTCTGGGAACAAGTTGACTAACGATGATGATTTTACGGT GACTGCTGAGTGTACTAGTTCACACGGCAGAGACAACAACGCCAAGAATTCTTCTGGGAACAAGTTGACTAACGATGATGATTTTACGGT GACTGCTGAGTGTACTAGTTCACACGGCAGAGACAACAACGCCAAGAATTCTTCTGGGAACAAGTTGACTAACGATGATGATTTTACGGT GACTGCTGAGTGTACTAGTTCACACGGCAGAGACAACAACGCCAAGAATTCTTCTGGGAACAAGTTGACTAACGATGATGATTT-ACGGT 1741 1741 1751 1741 1740 Bonus_JN180296.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 1742 1742 1752 1742 1741 TCCTTCCGTCTTCTGCTCTGGAGTGCGTCCTCGTTCTAACCATGAGGAAGCGAGGATCCAAGAGAATTCCACACACTTACCAGCTACAAG TCCTTCCGTCTTCTGCTCTGGAGTGCGTCCTCGTTCTAACCATGAGGAAGCGAGGATCCAAGAGAATTCCACACACTTACCAGCTACAAG TCCTTCCGTCTTCTGCTCTGGAGTGCGTCCTCGTTCTAACCATGAGGAAGCGAGGATCCAAGAGAATTCCACACACTTACCAGCTACAAG TCCTTCCGTCTTCTGCTC-GGAGTGCGTCCTCGTTCTAACCATGAGGAAGCGAGGATCCAAGAGAATTCCACACACTTACCAGCTACAAG TCCTTCCGTCTTCTGCTCCGGAGTGCGTCCTCGTTCTAACCATGAGGAAGCGAGGATCCAAGAGAATTCCACACACTTACCAGCTACAAG 1831 1831 1841 1830 1830 Bonus_JN180296.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 1832 1832 1842 1831 1831 TCCATATAAGAGTGGGCCTACGGTGTCCAAACCAACTGCAAAATTTCCCA TCCATATAAGAGTGGGCCTACGGTGTCCAAACCAACTGCAAAATTTCCCA TCCATATAAGGGTGGGCCTACGGTGTCCAAACCAACTGCAAAATTTCCCA TCCATATAAGAGTGGGCCTACGGTGTCCAAACCAACTGCAAAATTTCCCA TCCATATAAGAGTGGGCCTACGGTGTCCAAACCAACTGCAAAATTTCCCA 1881 1881 1891 1880 1880 Нуклеотидные последовательности ампликонов местных дагестанских сортов к-14891, к-16377 и к-17429, фрагмента гена Eam8 сорта Bonus (GenBank: JN180296.1) и рецессивной аллели eam8 у индуцированного мутанта mat-a.11 сорта Bonus (Zakhrabekova et al., 2012). Прописными буквами обозначен фрагмент интрона, заглавными – экзона. Bonus_AEZ53982.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 85 85 85 85 85 IGGIDR ...... ...... ...... ...... PLFPSFCVPS .......... .......... .......... .......... NEPVPLPQHI .......... .......... .......... .......... NTNSSGHATS .......... .......... .......... .......... GRLS .... .... .... .... 124 124 124 124 124 Bonus_AEZ53982.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 125 125 125 125 125 TQLKSK ...... ...... ...... ...... DAYAAGSTAE .......... .......... .......... .......... CTSSHGRDNN .......... .......... .......... .......... AKNSSGNKLT .......... .......... .......... .......... NDDD .... .... .... .... 164 164 164 164 164 Bonus_AEZ53982.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 165 165 165 165 165 FTVPSV ...... ...... ...... LRFLPS FCSGVRPRSN .......... .......... ...ECVLVLT SAPECVLVLT HEEARIQENS .......... .......... MRKRGSKRIP MRKRGSKRIP THLPATSPYK .......... .......... HTYQLQVHIR HTYQLQVHIR SGPT .... G... V.LR V.LR 204 204 204 204 204 Bonus_AEZ53982.1 k-17429 k-16377 Bonus_mat-a.11 k-14891 205 205 205 205 205 VSKPTA ...... ...... CPNQLQ CPNQLQ KFP ... ... N.. N.. 213 213 213 213 213 Предполагаемые аминокислотные последовательности ампликонов образцов к-14891, к-16377 и к-17429 из коллекции ВИР, фрагмента белка, кодируемого геном Eam8 сорта Bonus (GenBank: AEZ53982.1) и рецессивной аллелью eam8 индуцированного мутанта mat-a.11 (Zakhrabekova et al., 2012). СПАСИБО за внимание!
