Методы определения констант равновесия

CH3
N
Физическая химия биополимеров
Лаврик О.И.
НГУ-2012
O
2. Комплексы биополимеров с лигандами.
Специфические взаимодействия.
Методы определения констант равновесия
Простейшая модель взаимодействия
биополимера с лигандом
(модель двух состояний)
P+L
kасс
PL (P – полимер, L – лиганд, PL – комплекс)
kдисс
kасс – константа скорости ассоциации, [M]-1[t] -1
kдисс – константа скорости диссоциации, [t]-1
Касс = kасс/ kдисс термодинамическая константа ассоциации, [М]-1
Кдисс = 1/Касс = kдисс/ kасс термодинамическая константа диссоциации, [М]
(Кдисс или КD характеризует сродство лиганда к полимеру)
КD ?
[P]?
[L]?
Pt=[P]+[PL]
Lt=[L]+[PL]
[PL]?
Lb
Lf
Определение Касс в координатах Скечерда
Lb (bound) – связанный в комплекс лиганд
Lf (free) – свободный лиганд
Lb
Касс=
L f (Pt - L b )
Lb
= PtКасс- КассLb
Lf
Если полимер имеет несколько одинаковых и невзаимодействующих
центров связывания n (например, в случае, когда белок состоит из
нескольких идентичных субъединиц):
Lb
= nPtКасс - КассLb
Lf
При предельном количестве связанного лиганда (Lb∞) выражение
можно записать в виде:
Lb
= Касс(Lb∞ - Lb)
Lf
Вместо величин Lb, Lb∞ можно использовать любое свойство
системы, пропорциональное концентрации комплекса.
В случае реакций, катализируемых ферментами (Е), процесс
превращения лиганда-субстрата (S), происходит в комплексе
фермент-субстрат (ES), и выражение для скорости превращения
субстрата можно написать в виде:
v
= Касс(v∞ - v)
Sf
Если лиганд в избытке, то концентрация свободного лиганда равна
полной концентрации лиганда Pt, и можно записать:
Lb
= Касс(Lb∞ - Lb) или Lb= K асс L b L 0
L0
1 K асс L 0
Методы определения констант равновесия
• метод гель-фильтрации (t разделения [мин]),
• метод задержки в геле,
• фильтрование через нитроцеллюлозные мембраны
(миллипоровые фильтры) (t разделения [сек]).
Определение KD в случае, когда у свободного биополимера или
лиганда какое-либо измеряемое физическое свойство (Ф)
достаточно изменяется при комплексообразовании:
Для полимера: Ф = αРФР + αPLФPL
Для лиганда: Ф = αLФL + αPLФPL
где αР, αPL, αL – соответствующие мольные доли
ФР или ФL находят измерением в отсутствие второго партнера.
ФPL – находят путем измерения при избытке второго партнера:
проводят серию измерений при возрастающей концентрации второго
партнера до тех пор, пока зависимость измеряемой величины от
концентрации этого партнера не выйдет на плато.
Если обозначить значение измеряемой величины в
отсутствие второго партнера через Ф0, а предельное
значение через Ф∞,
то для величины αPL нетрудно получить выражение:
Ф - Ф0
αPL =
Ф∞- Ф0
Концентрация комплекса PL находится как:
PtαPL,если измеряется характеристика полимера,
LtαPL, если измеряется характеристика лиганда.
Методы определения констант равновесия
Спектрофотометрические методы
Закон Бугера-Ламберта-Бера
А=εсl
А – оптическая плотность (поглощение) раствора,
ε – коэффициент экстинкции,
с – концентрация вещества,
l – оптический путь в растворе.
Оптическая плотность
А=lg(I0/I)
I0 – интенсивность падающего света,
I – интенсивность света, прошедшего через образец
Методы определения констант равновесия
Метод спектрофлуорометрии
Методы определения констант равновесия
Метод спектрофлуорометрии
F – суммарная флуоресценция:
[PL]
[P]
F = FP
+ FPL
P0
P0
FP – флуоресценция полимера, не связанного с лигандом,
FPL – флуоресценция полимера, связанного в комплекс,
FP0=FP[P]+FPL(P0-[P])
F  FP
[P]=P0
FPL  FP
F  FPL
[PL]=P0
FP  FPL
(L 0 - [PL] )[ P]
Константа диссоциации: Kd =
[PL]
Определение констант равновесия
на приборах Biacore, основанное на явлении
поверхностного плазмонного резонанса (ППР)
В ферментативной кинетике: определение концентраций участников
реакции, изучение взаимодействия типов белок-белок, белокнизкомолекулярный лиганд и белок-нуклеиновая кислота.
Достоинства метода
• Позволяет исследовать быстро протекающие процессы, в частности
кинетику ферментативных реакций
• Не требует мечения реагентов химическими, флуоресцентными или
радиоактивными метками.
• Используется без сопряженных реакций или введения в систему
дополнительных компонентов, облегчающих детекцию.
• Для определения равновесных параметров взаимодействия биомолекул
не требуется разделения свободных и связанных форм.
• Позволяет работать с минимальным объемом образцов в пределах 10
мкл.
• Часть образца, не связавшаяся с поверхностью, может быть собрана во
время опыта и вновь использована в дальнейшем.
• Связанные с детектором молекулярные комплексы можно анализировать
соответствующими способами, например, масс-спектрометрическими
методами.
Определение констант равновесия
на приборах Biacore
Принцип работы приборов Biacore
Свет лазера фокусируется на сенсорной поверхности и связывание
«аналита» (свободного партнера в растворе) регистрируется по изменению
резонансного угла (эффект ППР).
Определение констант равновесия
на приборах Biacore
• Изучение функций белков, механизмов молекулярного
узнавания;
• Экспериментальная проверка компьютерных предсказаний
межмолекулярных взаимодействий;
• Селекция антител и аптамеров;
• Скрининг прототипов лекарств и физиологически активных
веществ;
• Анализ маркеров заболеваний;
• Определение следового количества гормонов, антибиотиков,
анаболиков и др.;
• Анализ качества фармацевтических препаратов;
• Разработка диагностических тест-систем;
• Разработки вакцин.