Кубанский государственный медицинский университет
advertisement
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи Породенко Игорь Валериевич ОЦЕНКА ЭФФЕКТОВ ОКТРЕОТИДА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ 03.00.13 – физиология, 14.00.15 – патологическая анатомия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Краснодар – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (КГМУ). Научные руководители: доктор медицинских наук Курзанов Анатолий Николаевич, доктор биологических наук профессор Славинский Александр Александрович. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Сторожук Пётр Григорьевич доктор медицинских наук профессор Ермилов Виктор Владимирович Ведущая организация: Ставропольская государственная медицинская академия. Защита состоится «____» декабря 2009 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д208.038.01 при КГМУ по адресу: 350063, Краснодар, ул. Седина, 4, КГМУ, тел. (861) 262-73-75. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГМУ. Автореферат разослан «____» ноября 2009 года. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор 2 Ю.Р. Шейх-Заде ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Соматостатин нейропептид, вырабатываемый гипоталамусом, поджелудочной железой, а также слизистой оболочкой желудка и кишечника (Chen D. et al., 2006; Raufman J.P. et al., 2009). Этот пептид ингибирует секрецию соматотропного гормона передней доли гипофиза, угнетает желудочную секрецию и секрецию поджелудочной железы, тормозит выделение гастрина и мотилина, уменьшает висцеральный кровоток. В экспериментах на крысах показано, что соматостатин стимулирует активность ретикуло- эндотелиальной и лимфопоэтической систем. Изменение под его влиянием активности клеток-киллеров отмечено у человека (Case C.C., Wirfel K., Vassilopoulou – Sellin R., 2002). Синтетический экзокринную аналог функцию соматостатина поджелудочной октреотид железы, снижает угнетает объем панкреатического секрета, содержание в нем ферментов и концентрацию бикарбонатов. Октреотид оказывает прямое угнетающее действие на экзокринную секрецию поджелудочной железы через специфические мембранные рецепторы. Препарат также обладает противовоспалительным действием, которое связано со стабилизацией клеточных мембран, блокадой цитокиногенеза и продукции простагландинов, антиоксидантной активностью (Ревтович М.Ю., 2003; Леонович С.И. с соавт., 2003). Обнаружено, что подкожно вводимая однократная доза октреотида подавляет секрецию инсулина через 30 минут после инъекции (Antony L.B., Woltering E.A., Espenan G.D., 2002). Эти свойства октреотида послужили основанием для его применения у больных, которым проводятся оперативные вмешательства на поджелудочной железе (Gur R., Meier R., 1996). Существует представление о возможной роли нейропептидов в регуляции деятельности иммунной системы на разных уровнях ее 3 организации – от субклеточного до системного. Накапливается все больше данных, свидетельствующих о роли нейропептидов, в том числе и соматостатина, в обеспечении взаимодействия нервной и иммунной систем (Perry M.D. et al., 2009). Пептиды, взаимодействуя со специфическими рецепторами, расположенными на нейтрофильных лейкоцитах и в центральной нервной системе, способны регулировать механизмы резистентности организма (Kumar U. et al., 2009). Введение пептидов повышает уровень содержания катионных белков в нейтрофильных лейкоцитах. Установлено корригирующее влияние пептидов на поврежденный рецепторный аппарат нейтрофильных лейкоцитов (Andina N. et al., 2009). Существует предположение, что система тканевых нейтрофилов выполняет посредническую роль между центральной нервной системой и соединительной тканью (Третьякова И.Е., Долгушин И.И., 2004). Нейтрофильные лейкоциты получают сигналы по нейросекреторным каналам, реализуют в тканях свой функциональный потенциал и одновременно осуществляют механизм обратной связи. На поверхности нейтрофилов обнаружены рецепторы к различным пептидам, осуществляющим регуляторную функцию (Маянский Д.Н., Маянская С.Д., 2001). Количество и аффинность рецепторов, их способность вызывать различные проявления активации нейтрофильных лейкоцитов изменяются в зависимости от уровня функционального состояния клеток (Prasad V. et al., 2007). Нейтрофильные способны продуцировать пептиды, участвующие лейкоциты в регуляции иммуногенеза, что позволяет рассматривать нейтрофил как регуляторную клетку, связанную с поддержанием постоянства внутренней среды организма (Falanga A. et al., 2000; Femling J.K., 2005). Установлено, что инфильтрация нейтрофилами поджелудочной железы – ключевое событие в развитии панкреатита (Tu W. et al., 2000; 4 Wang X.P. et al., 2003). Ацинарные клетки поджелудочной железы способны нацеливать нейтрофильные лейкоциты на свою поверхность, что может привести к смерти не только клеток, но и самой железы (Hegyi P. et al., 2009). Это свидетельствует о том, что фатальный панкреатит может быть результатом прежде всего избыточной стимуляции нейтрофильных лейкоцитов (Maher O. et al., 1999; Zaninovic V. et al., 2000). Вопрос о влиянии соматостатина и октреотида на функциональную активность нейтрофилов в норме и при развитии патологических состояний остается недостаточно изученным. Цель исследования Оценить влияние октреотида на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов крови в норме и при наличии патологических изменений поджелудочной железы у людей и крыс. Задачи исследования 1. Выявить воздействие октреотида на способность нейтрофилов крови здоровых людей к активации in vitro. 2. Охарактеризовать октреотидиндуцированные эффекты на функционально-метаболическую активность нейтрофильных лейкоцитов больных острым панкреатитом in vivo и in vitro. 3. Определить характер изменений функциональной активности нейтрофилов периферической крови крыс в процессе развития острого экспериментального панкреатита (ОЭП). 4. Оценить влияние октреотида на состояние ткани поджелудочной железы крыс в динамике развития ОЭП. 5. Установить характер воздействия октреотида на функциональнометаболическую активность нейтрофильных лейкоцитов в физиологических условиях и при остром панкреатите. 5 Новизна результатов исследования 1. Представлены новые данные о влиянии октреотида in vitro на способность к активации нейтрофильных лейкоцитов периферической крови здоровых людей в зависимости от концентрации пептида. 2. Выявлена действие in способность vitro на октреотида повышенную оказывать ингибирующее функциональную активность нейтрофилов крови больных с острым панкреатитом. 3. Найдены новые особенности изменения функционально- метаболической активности нейтрофильных лейкоцитов (активность NADPH-оксидазы, миелопероксидазы, щелочной фосфатазы, содержание катионных белков, активационный потенциал ядерного хроматина) при развитии ОЭП. 4. Получены сведения о протекторном действии октреотида на ткань поджелудочной железы и ингибирующем – на функционально- метаболическую активность нейтрофильных лейкоцитов крови крыс с ОЭП. Теоретическая значимость исследования Выявлено модулирующее действие октреотида на функциональнометаболическую активность нейтрофильных лейкоцитов в норме и при патологии (острый панкреатит), что расширяет современные представления о взаимодействии нейроэндокринной и иммунной систем организма. Результаты проведенной работы могут быть использованы в учебном процессе со студентами медицинских специальностей, а также служить основой для дальнейших прикладных исследований. Практическая значимость исследования Обнаруженное ингибирующее влияние октреотида на повышенную функционально-метаболическую активность нейтрофильных лейкоцитов in vitro у людей с острым панкреатитом и in vivo у крыс с острым 6 экспериментальным панкреатитом может быть использовано для иммунокоррекции состояний, сопровождающихся избыточной активацией нейтрофилов крови. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования: венозная кровь 25 здоровых людей, 25 больных острым панкреатитом и капиллярная кровь 38 крыс. Экспериментальная часть работы выполнена на стандартизированных аутбредных крысах-самцах породы Sprague Dawley 4-5 месячного возраста массой 420-500 граммов, которые были разделены на 5 групп: 1 группа – ложнооперированые животные (5 крыс) с минимальным хирургическим вмешательством в виде лапаротомии; 2 группа – животные с острым экспериментальным панкреатитом (9 крыс); 3 группа – животные с острым экспериментальным панкреатитом, получавшие инъекции октреотида (9 крыс); 4 группа – ложнооперированые животные (5 крыс), получавшие инъекции октреотида; контрольная группа – интактные, здоровые животные (10 крыс). Моделировали ОЭП путем глубокого охлаждения обеих поверхностей поджелудочной железы хлорэтилом (Малхасян В.А., Симоворян П.Р., 1972). Для подтверждения развития ОЭП проводили морфологическое исследование состояния поджелудочной железы крыс в динамике эксперимента. Функционально-метаболическую активность нейтрофилов исследовали на первые (до манипуляций), третьи (после операции) и седьмые сутки эксперимента. В нейтрофильных лейкоцитах определяли активность NADPH-оксидазы с помощью НСТ-теста (Нестерова И.В., 1980), активность миелопероксидазы оценивали по методу Шафран М.Г. и соавт. (1979), щелочной фосфатазы – по методике М.Г. Шубича (1965). Содержание катионных белков выявляли по методике А.А. Славинского и Г.В. Никитиной (1999). Активационный потенциал ядерного хроматина оценивали поляризационно-оптическим методом А.А. Евглевского (2000). 7 Компьютерную морфометрию изображения нейтрофильных лейкоцитов выполняли при помощи цветной телевизионной системы для микроскопических исследований «CitoW» (Диаморф, Москва). Результаты оценивали с использованием интегрального цитохимического показателя ИЦП (Славинский А.А., 2000). Оценку значимости различий между средними значениями двух сравниваемых исследуемых дисперсионного анализа, показателей вычисляли выполняли критерий с помощью Стьюдента (t) и доверительную вероятность различий (p) (Гланц С., 1999). Диапазон, ограниченный ±2 S (стандартное отклонение от средней величины), использовали при характеристике границ нормы как наиболее приемлемый для гематологических показателей (Воробьев А.И., 2002). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние октреотида на функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови здоровых людей in vitro Изучение влияния нейропептида на функционально- метаболическую активность нейтрофильных лейкоцитов производили в опытах in vitro с помощью постановки НСТ-теста, отражающего изменение активности NADPH-оксидазы, по которой можно судить о способности нейтрофилов к активации. В контрольной группе без инкубации с октреотидом средние значения ИЦП составили 4,90±0,3 отн. ед. Воздействие пептида в диапазоне концентраций от 5∙10 -4 М до 5∙10-7 М способствовало постепенному снижению активности NADPH-оксидазы. Наибольшее уменьшение показателей получено в результате использования октреотида в концентрации 5∙10-7 М. При этом значения ИЦП составили 1,92±0,2 отн. ед., что ниже в 2,5 раза по сравнению с контролем (рис.1). Инкубация крови с раствором пептида в более низких концентрациях (5∙10-9 М и 5∙10-14 М) не вызывала такого выраженного 8 угнетения функционально-метаболической активности нейтрофилов, как действие октреотида в концентрации 5∙10-7 М. Влияние октреотида на функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови больных острым панкреатитом in vitro При постановке НСТ – теста ИЦП нейтрофильных лейкоцитов на первые сутки наблюдения превышал аналогичный показатель нейтрофилов здоровых людей и составил 8,76±0,3 относительных единиц, что по сравнению с группой здоровых людей без инкубации с октреотидом было выше в 1,8 раза (p<0,05). Этот же показатель нейтрофилов на первые сутки наблюдения оказался меньше, чем в нейтрофилах образцов крови, не подвергавшихся инкубации с октреотидом, но при этом он был достоверно (p<0,05) больше соответствующего показателя у здоровых людей (рис. 2). На третьи сутки наблюдения ИЦП нейтрофилов в пробах крови, инкубированных in vitro с октреотидом, в 2 раза уменьшился как по сравнению с результатами в первые сутки наблюдения, так и, хотя в меньшей степени, по сравнению с соответствующим показателем у здоровых лиц (в 1,2 раза). На седьмые сутки наибольшие изменения в данной серии исследований отмечены по параметрам ИЦП в нейтрофилах образцов крови больных острым панкреатитом после инкубации с октреотидом. Он оказался в 5,5 раз меньше этого показателя функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов по сравнению со здоровыми испытуемыми, а также в 4,3 раза меньше соответствующих значений, зафиксированных в тех же условиях у исследуемых пациентов на третьи сутки наблюдения. 9 отн.ед 9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 4,9 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1,92 контроль 10-7 Рис. 1 отн.ед 8,76 9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,19 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 сутки 4,75 4,58 1,52 0,35 3 сутки 7 сутки Рис. 2 Рис. 1. Влияние октреотида на функционально-метаболическую активность нейтрофилов здоровых людей. Активность NADPH-оксидазы (отн. ед.): – кровь здоровых людей без инкубации с октреотидом (контроль); – кровь здоровых людей, инкубированная с октреотидом в концентрации 5∙10-7 М в течение 60 минут. Рис. 2. Влияние октреотида на функционально-метаболическую активность нейтрофилов больных острым панкреатитом. Активность NADPH-оксидазы (отн. ед.): – кровь больных острым панкреатитом без инкубации с октреотидом; – кровь больных острым панкреатитом, инкубированная с октреотидом в концентрации 5∙10-7 М в течение 60 минут. ВЛИЯНИЕ ОКТРЕОТИДА НА СОСТОЯНИЕ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫС ПРИ ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПАНКРЕАТИТЕ Проведено моделирование ОЭП у 38 крыс-самцов. В качестве групп сравнения служили ложнооперированные животные без моделирования ОЭП, часть из которых получала инъекции раствора октреотида, а также животные, у которых выполняли моделирование ОЭП, но лечение октреотидом не проводили. В селезеночном сегменте поджелудочной железы уже на 3-и сутки заболевания отмечались крупные масштабы незавершенного некроза 10 ацинарной ткани и дольки с неполноценной протоковой регенерацией, а также жировые некрозы с нагноением. К 7-м суткам поврежденные дольки поджелудочной железы подвергались склерозу с сохраняющимся воспалением. Незавершенная регенерация жировых интерстициальных некрозов приводила инфильтратов, к формированию отграниченных крупных фиброзной воспалительных капсулой, спаянной с окружающими органами (рис. 3). Лечение ОЭП октреотидом тормозило прогрессирование ацинарного некроза во всех отделах поджелудочной железы, приводило к быстрому (3-и сутки) отграничению атрофирующихся путем протоковой трансформации долек от неповрежденной ацинарной ткани. Мелкие интерстициальные жировые некрозы под влиянием миграции лейкоцитов подвергались разобщению, элиминации детрита под воздействием макрофагов и заместительному склерозу. При этом крупные жировые некрозы инкапсулировались, отделяясь от ткани поджелудочной железы фиброзной капсулой. Вокруг таких инкапсулированных некрозов в результате перипроцесса формировался воспалительный инфильтрат с вовлечением окружающих органов. Таким образом, можно заключить, что при лечении ОЭП октреотидом морфологически выявлены положительные эффекты влияния на течение заболевания по сравнению с контрольной серией без лечения. Они состоят в уменьшении масштабов ферментного некроза ацинарной и жировой ткани, ранних процессах репарации поврежденных тканей без нагноения. Репарация ацинарной ткани протекает по типу неполноценной протоковой трансформации с последующим склерозом и убылью в большей или меньшей степени ацинарной ткани. Заживление жировых некрозов происходит по типу полноценной завершенной регенерации: сначала острого демаркационного воспаления с завершенным протеолизом липолитического некроза без нагноения, затем сменой воспалительного 11 инфильтрата на макрофагальный с элиминацией некротического детрита и завершается заместительным склерозом и липоматозом без остаточных признаков интерстициального склероза. а б в г Рис. 3. Патогистологические изменения в селезеночном сегменте поджелудочной железы на 3 и 7 сутки ОЭП у крыс без лечения (а, б) и при лечении октреотидом (в, г): а – атрофия и склероз дольки, макрофагальное воспаление вокруг жирового некроза (х125); б – незавершенный краевой некроз ацинусов с миграцией лейкоцитов в некротизированнные ткани (х400); в – краевая атрофия долек с воспалением интерстиция (х125); г – фиброзная капсула вокруг жирового некроза, спаянная с печенью (х125). Окраска гематоксилином и эозином. 12 ВЛИЯНИЕ ОКТРЕОТИДА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ КРЫС ПРИ ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПАНКРЕАТИТЕ NADPH-оксидаза. В течение первых суток эксперимента не наблюдалось существенных изменений активности NADPH-оксидазы нейтрофильных лейкоцитов крови у подопытных животных всех групп. На третьи сутки эксперимента средние значения ИЦП нейтрофилов в 1-й группе ложнооперированных животных не имели статистически достоверных отличий по сравнению с группой интактных животных и с группой крыс, которой проводилась лапаротомия на 1-е сутки эксперимента. Во 2-й группе крыс с ОЭП значения ИЦП достигали значений 2,09±0,44 относительных единиц, что говорит о достоверном (p<0,05) повышении активности NADPH-оксидазы нейтрофилов в 4 раза по сравнению с активностью этого фермента у животных 1-й группы и более чем в 3,6 раза превышает соответствующий показатель у животных этой же группы на 1-е сутки наблюдения (рис. 4). Это свидетельствует о том, что развитие ОЭП сопровождается резким повышением активности NADPH-оксидазы нейтрофилов крови крыс. Значения ИЦП в 3-й группе животных с ОЭП и введением октреотида составили 0,86±0,12 относительных единиц, что по сравнению со 2-й группой животных с ОЭП ниже в 2,4 раза (р<0,01). Таким образом, введение октреотида достоверно уменьшило повышение активности этого фермента на фоне ОЭП. В 4-й группе ложнооперированных животных введение октреотида привело к снижению активности NADPH-оксидазы нейтрофилов до 0,41±0,01, что по отношению к группе животных с лапаротомией на 3-и сутки эксперимента ниже в 1,3 раза (р<0,05), а по сравнению с группой ложнооперированных животных, получавших инъекции октреотида, меньше в 1,1 раза (p>0,05). На седьмые сутки эксперимента в 1-й группе крыс различия не были статистически достоверными в сравнении с группой интактных 13 животных, а также в сравнении со значениями ИЦП нейтрофилов в группе ложнооперированных животных на 1-е и 3-и сутки наблюдения. Во 2-й группе животных с ОЭП значения ИЦП превышали в 3 раза этот показатель в группе ложнооперированных крыс и составили 1,68±0,04 относительных единиц (р<0,01). Активность NADPH-оксидазы нейтрофилов у крыс с ОЭП в этот период наблюдения в 2,9 раза превышала показатель активности этого фермента на 1-е сутки наблюдения, но по сравнению с 3-ми сутками оказалась в 1,2 раза меньше (p<0,05). Значения ИЦП в 3-й группе животных с ОЭП и введением октреотида снижались до 0,48±0,02, что по сравнению со 2-й группой крыс с ОЭП меньше в 3,5 раза (р<0,01) и в 1,8 раза меньше (p<0,05) того же показателя в 3-й группе животных на 3-и сутки наблюдения. Таким образом, введение октреотида ложнооперированным крысам не вызвало заметных изменений нейтрофильных лейкоцитах. активности NADPH-оксидазы в Развитие ОЭП привело к достоверному увеличению активности этого фермента, в то время как введение животным октреотида существенно уменьшило, а к концу периода наблюдения фактически нормализовало уровень активности NADPHоксидазы нейтрофилов крови. отн.ед. 2,5 2 1,5 1 0,5 0,54 0,58 0,58 0,52 0,47 0,55 2,09 0,86 0,41 0,53 1,68 0,48 0,54 0 1 сутки 3 сутки 7сутки Рис. 4. Влияние октреотида на динамику активности NADPH-оксидазы нейтрофилов крыс при моделировании острого экспериментального панкреатита: – интактные животные; – лапаротомия; – ОЭП; – ОЭП с введением октреотида; – лапаротомия с введением октреотида. 14 Миелопероксидаза. Колебания активности фермента в 1й группе ложнооперированных крыс на третьи и седьмые сутки эксперимента были статистически не достоверны (рис. 5). На третьи сутки эксперимента во 2й группе животных с ОЭП введение октреотида привело к увеличению активности миелопероксидазы в 2 раза по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Важно, что активность миелопероксидазы нейтрофилов на 3-и сутки эксперимента достоверно снизилась (p<0,05) по сравнению с 1-ми сутками наблюдения и в группе животных с острым экспериментальным панкреатитом, и в группе животных с этой же экспериментальной моделью патологии поджелудочной железы, которые получали инъекции октреотида. На седьмые сутки эксперимента во 2й группе животных с ОЭП активность миелопероксидазы несколько повысилась (в 1,2 раза), но была существенно ниже того же показателя на 1-е сутки наблюдения (в 1,5 раза; p<0,05). отн.ед. 1 0,5 0,67 0,67 0,68 0,69 0,65 0,72 0,39 0,42 0,78 0,75 0,46 0,83 0,82 0 1 сутки 3 сутки 7сутки Рис. 5. Влияние октреотида на динамику активности миелопероксидазы нейтрофилов крыс при моделировании ОЭП: – интактные животные; – лапаротомия; – ОЭП; – ОЭП с введением октреотида; – лапаротомия с введением октреотида. Сопоставление уровня активности миелопероксидазы нейтрофильных лейкоцитов на этом этапе эксперимента с аналогичным показателем во 15 всех группах животных на 1-е и 3-и сутки наблюдения показало, что наиболее значимое изменение активности фермента имело место в группе подопытных животных с острым экспериментальным панкреатитом, которые получали инъекции октреотида. Введение октреотида ложнооперированным животным сопровождалось заметным увеличением активности миелопероксидазы нейтрофилов по сравнению с 1-и сутками. Щелочная фосфатаза. На третьи сутки во 2й группе животных значения ИЦП достигали 7,06±0,18 относительных единиц, что свидетельствует о повышении активности щелочной фосфатазы по сравнению с 1-й группой в 2,1 раза (рис. 6). Значения активности щелочной фосфатазы в 3-й группе крыс с ОЭП и введением октреотида по сравнению со 2-й группой животных с ОЭП, не получавших препарат, были меньше в 1,4 раза (5,18±0,06, р<0,05). В 4-й группе животных (ложнооперированные, получавшие инъекции октреотида) активность щелочной фосфатазы составила 3,43±0,17. отн.ед. 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 3,52 3,36 3,49 3,73 3,34 1 сутки 3,28 7,06 5,18 3,43 3 сутки 3,42 6,14 4,74 3,40 7сутки Рис. 6. Влияние октреотида на динамику активности щелочной фосфатазы нейтрофилов крыс при моделировании острого экспериментального панкреатита: – интактные животные; – лапаротомия; – ОЭП; – ОЭП с введением октреотида; – лапаротомия с введением октреотида. 16 На седьмые сутки активность фермента несколько снизилась, но при этом значения активности фермента достоверно (p<0,05) превышали соответствующие показатели как интактных животных, так и у крыс с ОЭП в 1-е сутки наблюдения. Введение октреотида в течение 7 суток крысам с ОЭП оказало достоверное (p<0,05) влияние на активность щелочной фосфатазы. Активность фермента под влиянием аналога соматостатина была существенно ниже и на 3-и, и на 7-е сутки наблюдения по сравнению с группой животных с ОЭП, не получавших инъекции октреотида, хотя к концу эксперимента все же несколько превышала этот показатель в группе ложнооперированных интактных животных животных. значимых В обеих изменений группах активности щелочной фосфатазы нейтрофильных лейкоцитов крови на протяжении всего периода наблюдения не отмечено. Неферментные катионные белки. Содержание катионных белков в 1й группе ложнооперированных крыс составило 0,68±0,01 относительных единиц (рис. 7). На третьи сутки в группе крыс с ОЭП значения достигли 2,90±0,05 относительных единиц, что указывает на повышение содержания неферментных катионных белков по сравнению с группой ложнооперированных крыс в 4 раза (р<0,01), и в сравнении с группой животных с ОЭП на первые сутки эксперимента в 4,1 раза (p<0,05). На седьмые сутки содержание катионных белков в нейтрофилах достоверно (p<0,01) возросло у животных с ОЭП как не получавших октреотид, так и получавших его инъекции. Однако у животных с ОЭП, получавших инъекции октреотида, увеличение названного показателя было достоверно (p<0,05) меньшим. Следует отметить, что в динамике экперимента наиболее значимые изменения содержания неферментных катионных белков в нейтрофильных лейкоцитах крыс отмечены в группах животных с моделированием острого экспериментального панкреатита. 17 отн.ед. 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0,76 0,68 0,7 0,78 0,91 0,71 2,9 1,97 0,95 0,8 1,93 1,51 1,00 0 1 сутки 3 сутки 7сутки Рис. 7. Влияние октреотида на динамику содержания катионных белков нейтрофилов крыс при моделировании острого экспериментального панкреатита: – интактные животные; – лапаротомия; – ОЭП; – ОЭП с введением октреотида; – лапаротомия с введением октреотида. Ядерный хроматин. В 1й группе ложнооперированных животных и во 2й группе крыс, получавших инъекции октреотида, статистически достоверных изменений показателя активационного потенциала ядерного хроматина нейтрофилов не выявлено (рис. 8). отн.ед. 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 1,91 1,91 1,91 1,88 1,92 1,93 2,04 3,42 2,46 1,94 2,00 2,81 2,16 0 1 сутки 3 сутки 7сутки Рис. 8. Влияние октреотида на активационный потенциал ядерного хроматина нейтрофилов крыс при моделировании острого экспериментального панкреатита: – интактные животные; – лапаротомия; – ОЭП; – ОЭП с введением октреотида; – лапаротомия с введением октреотида. 18 На третьи сутки эксперимента моделирование ОЭП в 3й группе животных вызвало повышение показателя активационного потенциала хроматина нейтрофилов в 1,8 раза по сравнению с показателем контрольной группы (р<0,01). Инъекции октреотида животным 4й группы с ОЭП снизили активационный потенциал хроматина нейтрофильных лейкоцитов в 1,4 раза (р<0,01), по сравнению с группой животных с ОЭП без лечения. На седьмые сутки эксперимента у крыс 3й группы с ОЭП показатель активационного потенциала хроматина нейтрофильных лейкоцитов был выше значения контрольной группы в 1,1 раза (р<0,01). Однако это значение было ниже, чем показатель, полученный на третьи сутки эксперимента, в 1,2 раза (р<0,01). В 4й группе животных с ОЭП, на фоне лечения октреотидом, наблюдалось снижение показателя активационного потенциала ядерного хроматина нейтрофилов в 1,3 раза по сравнению с 3й группой животных (р<0,01). ВЫВОДЫ 1. Синтетический аналог соматостатина нейропептид октреотид у здоровых людей угнетает функционально-метаболическую активность нейтрофильных лейкоцитов, о чем свидетельствует снижение активности NADPH-оксидазы. Наиболее выраженное действие пептид оказывает в концентрации 5∙10-7М. 2. У больных острым панкреатитом октреотид снижает повышенную функционально-метаболическую активность нейтрофильных лейкоцитов венозной крови in vitro, что проявляется уменьшением активности NADPH-оксидазы в цитоплазме клеток. 3. Моделирование острого экспериментального панкреатита у крыс приводит к повышению функционально-метаболической активности нейтрофильных лейкоцитов. Воспалительно-деструктивным изменениям в поджелудочной железе сопутствует увеличение в нейтрофилах крови 19 активационного потенциала ядерного хроматина, активности NADPHоксидазы, щелочной фосфатазы и содержания неферментных катионных белков со снижением активности миелопероксидазы. 4. Репаративные изменения в поджелудочной железе крыс при остром экспериментальном панкреатите сопровождаются спонтанным снижением активационного потенциала ядерного хроматина, активности NADPHоксидазы и щелочной неферментных фосфатазы, катионных белков и уменьшением содержания увеличением активности миелопероксидазы в нейтрофилах. 5. Инъекции октреотида животным с острым экспериментальным холодовым панкреатитом оказывают протективное действие на поджелудочную железу. При репаративных изменениях в поджелудочной железе после применения октреотида метаболической активности показатели функционально- нейтрофильных лейкоцитов крови нормализуются. 6. Октреотид проявляет модулирующее действие на функциональнометаболическую активность нейтрофильных лейкоцитов, снижая её при избыточном исходном уровне. Эффекты октреотида проявляются in vitro и in vivo в норме и при остром панкреатите как у экспериментальных животных, так и у людей. РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Породенко И.В. Влияние октреотида на активность нейтрофильных лейкоцитов при остром панкреатите // Кубанский научный медицинский вестник. – 2008. – № 1-2. – С. 79-83. 2. Породенко И.В., Курзанов А.Н., Славинский А.А. Октреотидиндуцированные изменения патоморфологических проявлений острого экспериментального панкреатита // Вестник хирургической гастроэнтерологии. – 2006. – № 1. – С. 127-128. 3. Породенко И.В., Курзанов А.Н. Лиганды соматостатиновых рецепторов в экспериментальной и клинической панкреатологии. Сообщение 3. Октреотид и соматостатин в хирургической панкреатологии 20 и онкопатологиии поджелудочной железы // Успехи современного естествознания. – 2006. – № 8. – С. 15-17. 4. Породенко И.В., Курзанов А.Н. Лиганды соматостатиновых рецепторов в экспериментальной и клинической панкреатологии. Сообщение 1. Базисные предпосылки использования в гастроэнтерологии // Успехи современного естествознания. – 2006. – № 10. – С. 14-16. 5. Породенко И.В., Курзанов А.Н. Лиганды соматостатиновых рецепторов в экспериментальной и клинической панкреатологии. Сообщение 2. Соматостатин и его аналоги в лечении острого и хронического панкреатита // Успехи современного естествознания. – 2006. – № 10. – С. 17-20. 6. Породенко И.В. Иммунотропные эффекты лигандов соматостатиновых рецепторов // Открытое образование. – 2006. – № 3 – С. 248-250. 7. Породенко И.В., Беспалова Ж.Д., Славинский А.А., Курзанов А.Н. Морфологические изменения в поджелудочной железе при лечении экспериментального панкреатита октреотидом // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, 2007. Материалы ХIV международной конференции и дискуссионного научного клуба. – Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая – 9 июня 2007. – С. 225-227. 8. Породенко И.В., Славинский А.А., Балачевский Б.В., Курзанов А.Н. Октреотидиндуцированная оптимизация функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов // Конгресс «Человек и лекарство. Краснодар – 2008». – 2008. – С. 72. 9. Славинский А.А., Балачевский Б.В., Породенко И.В. Функционально-метаболическая активность нейтрофильных лейкоцитов при остром панкреатите // Тез. докл. ХII международного конгресса «Парентеральное и энтеральное питание». – 2008. – С. 28-29. 10. Курзанов А.Н., Славинский А.А., Породенко И.В., Балачевский Б.В. Пептидергическая модуляция функциональнометаболической активности нейтрофильных лейкоцитов // Науч. труды II Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». МоскваКишинев. – 2008. – С. 160. 11. Курзанов А.Н., Славинский А.А., Породенко И.В., Балачевский Б.В. Пептидергическая модуляция функциональнометаболической активности нейтрофильных лейкоцитов как компонент их панкреатопротекторного действия // Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань, 23-27 июня 2009 г. – 2009. – С. 60. 21 22 Породенко Игорь Валериевич ОЦЕНКА ЭФФЕКТОВ ОКТРЕОТИДА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ автореферат Подписано в печать 02.11.2009. Формат А5. Ризография. Усл.печ.л.1,3. Тираж 100 экз. Заказ 90, МУ «Краснодарский медицинский информационно-вычислительный центр» 350059, г. Краснодар, ул. Дунайская, 62. 23
