Оценка константы связывания фермент

Энзимология
и
Молекулярная Механика.
Ферменты
A

B
Фермент направляет реакцию по более
«бстрому» пути, одинаково ускоряя прямую
и обратную реакции.
Принципы ферментативного
катализа:
Специфические вз-ия
Ковалентные взаимодействия
 Электростатические взаимодействия
 Образование водородных связей
 Координация с металлами
 p-катионные взаимодействия
…

Принципы ферментативного
катализа
Сближение и ориентация
Y
Раствор
X
Принципы
ферментативного катализа
Сближение и ориентация
Принципы ферментативного
катализа
Индуцированное соответствие
Количественная мера сродства
субстрата к ферменту
связывание
[ ES ]

[ E ] [S ]

Константа связывания
K bind

Константа диссоциации
K diss 

Энергетический
эквивалент констант
Gbind   RT ln Kbind  RT ln K diss
[ E ] [S ]
[ ES ]
Молекулярная механика
Атомы в молекулах представляются материальными
точками (сферами) определенной массой и зарядом
(радиусом)
 Энергия системы равна сумме энергий всех парных
взаимодействий атомов
 Сила, действующая на атом, = - градиент энергии
взаимодействия данного атома со всеми остальными
 Движение каждого атом описывается ньютоновским
уравнением

Молекулярная механика
H
H
С
С
H
Координаты
атомов
в молекуле
Структурная
формула
соединения
H
H
H
H2N
S
N
CH3
CH3
O
COOH
Выражение
потенциальной
энергии
U ( R, Const )
Молекулярно механические
потенциалы

Ковалентно связанные
атомы
– Валентные связи
r 0ij
Ebonds 
0 2
K
(
r

r
 bond ij ij )
bonds
Молекулярно механические
потенциалы

Ковалентно связанные
атомы
– Валентные углы
ijk
Eangle 
0
2
K
(



)
 angle ijk ijk
angles
Молекулярно механические
потенциалы

Ковалентно связанные
атомы
– Торсионные (двугранные)
углы
f0
Etors
Vtors

(1  cos( n   0 ))
2
tors
Молекулярно механические
потенциалы

Ковалентно несвязанные
атомы (атомы разных
молекул, или удаленные
атомы одной молекулы)
– Кулоновское взаимодействие
qi
Rij
qj
ECoul  
i j
qi  q j
4p0 Rij
Молекулярно механические
потенциалы

Ковалентно несвязанные
атомы (атомы разных
молекул, или удаленные
атомы одной молекулы)
– Ван дер ваальсово
взаимодействие
Rij
C6
C12
V (ri  j )  12  6
ri  j
ri  j
Молекулярная механика

Межмолекулярное взаимодействие: универсальные
 Aij
потенциалы
qi q j 
   12  6 

R
R

E
i j 
ij
ij 
 ij

– Электростатическое взаимодействие
– Ван дер Ваальсово

Bij
Внутренние степени свободы: малые отклонения от
Etotal   K r (rij  rijeq ) 2 
равновесной геометрии
bonds
– Валентные связи

– Валентные углы
 K
eq 2
(



) 
ijk
ijk
ijk
angles
– Торсионные степени свободы

Vn
1  cos(nf   ) 

2
dihedrals
Характерные молекулярные
системы в науках о живом
пенициллин
30 атомов
10000 атомов
пенициллинацилаза
Какие взаимодействия
возникают / исчезают ?
связывание

Фермент-субстрат (+)

Фермент-вода (-)

Субстрат-вода (-)
найди 10 отличий!
Оценка константы связывания
фермента с субстратом
Gbind = Gbindvacuum + Gsolvation(ES) - Gsolvation(E+S)



Сольватация
компонентов
Сольватация
комплекса
Взаимодействие
фермент-субстрат
Фермент-субстратное взаимодействие
Gbind = Gbindvacuum + Gsolvation(ES) - Gsolvation(E+S)

Межмолекулярное

Кулоновское
(электростатическое)

Ван дер Ваальсово

Специфические вз-ия
– водородные связи
– ...

Внутримолекулярное
Внутренняя энергия
 Потеря степеней свободы

Фермент-субстратное взаимодействие:
меж-молекулярное
vacuum
Gbind
Rij
qA

Кулоновское
А
(электростатическое)

rA-B
В
s
Ван дер Ваальсово


Специфические вз-ия
–
водородные связи
– ...
V (rA B )  k
qB
q A  qB
D  rA B
Электростатическое взаимодействие

На коротких расстояниях микрогетерогенность среды
оказывает сильное влияние на электростатические
взаимодействия
1
2
3
q A  qB
V (rA B )  k
D(rA B )  rA B
4
1.
2.
3.
4.

Вода
Степень погруженности <0.3
Степень погруженности <0.7
Степень погруженности >0.7
«Экранированный» кулоновский потенциал
учитывает зависимость диэлектрической
проницаемости от расстояния
Фермент-субстратное взаимодействие:
меж-молекулярное
vacuum
Gbind


Кулоновское (электростатическое)
s
Ван дер Ваальсово
Rij
rA-B
А
В


Специфические вз-ия
–
водородные связи
– ...
V (rA B ) 
C12
12
A B
r

C6
rA B
6
Ван дер Ваальсово взаимодействие
V (rA B ) 
C12
rA B
12

C6
rA B
6
  s 12  s 6 
  
 
 4 A B   
  rA B 
 rA B  

 AB   A A   BB
req , A B  1  (req , A A  req , B  B )
2

1
req , A B  2 6  s A B
C6  2 AB  req6 , AB
C12   AB  r
12
eq , A B
Параметры ван дер Ваальсова взаимодействия
достаточно определить для каждого типа атомов, а
не для каждой из всех возможных пар атомов
Фермент-субстратное взаимодействие:
меж-молекулярное
vacuum
Gbind



Кулоновское (электростатическое)
r
Ван дер Ваальсово
резкая зависимость потенциала
от расстояния r и угла 
Специфические вз-ия
– водородные связи
– ...
V (rA B ) 
C12
12
A B
r

C10
10
A B
r
Фермент-субстратное взаимодействие:
изменение внутренней энергии
Gbindvacuum
Внутренняя
энергия
напряжение валентных
и торсионных углов

изменения в
нековалентных вз-иях

Потеря
степеней свободы
искажение планарности протопорфирина
в активном центре феррохелатазы
Фермент-субстратное взаимодействие:
изменение внутренней энергии

Напряжение валентных
и «фиксированных»
двугранных углов
f0
E, kJ/mol
f
f0 равновесное значение угла
f  отклонение от равновесного угла
f, 0
V ( )  1 k  ( ) 2
2
«фиксированные» двугранные углы
Фермент-субстратное взаимодействие:
изменение внутренней энергии
Напряжение «подвижных»
двугранных (торсионных) углов
H
H
H
Энергия, ккал/моль

8
H
7
N
6
5
H
4
3
N
2
H
H
H
O
1
0
0
120
240
угол поворота
360
Энтропийные потери при связывании
Gbindvacuum
Внутренняя
энергия
Потеря
степеней свободы Genthropy  0.31[ kcal / mol]  N
Поступательных
N – число поступательно-
Вращательных:
вращательных степеней свободы
субстрата
молекулы
как целого
внутренние
вращений
Энтропийные потери при связывании:
теоретические подходы к их оценке
S  k ln W
Gýíòðîï
W2
 TS  kT ln
W1
W = статистичекий вес (~число способов
реализации данного состояния)
раствор
комплекс с
ферментом
раствор
комплекс с
ферментом
Энтропийные потери при связывании:
теоретические подходы к их оценке
S  k ln W  k ln  exp(  H ( p, q) kT )d pd q
H ( p, q)  Eêèí ( p)  V (r , )
Кинетическая
энергия молекулы
Потенциал трансляций и вращений
молекулы как целого
S  1 2 k
При потере одной степени свободы
Энтропийные потери при связывании:
теоретические подходы к их оценке

Субстрат может связываться с
ферментом несколькими способами

Субстрат обладает некоторой
подвижностью в комплексе с
ферментом

Эти факторы вносят вклад в
энтропийную составляющую при
связывании

Можно оценить эти вклады,
перебрав все возможные способы
связывания субстрата с ферментом
и оценив подвижность субстрата в
каждом из комплексов
Различные способы
связывания
«Малоподвижные»
способы связывания
Локально «лучшие»
способы связывания
Энергетический профиль
образования различных ферментсубстратных комплексов
Фермент-субстратное взаимодействие:
сольватация
Gbind = Gbindvacuum + Gsolvation(ES) - Gsolvation(E+S)
связывание
Gsolvation(E+S) = Gsolvation(E) + Gsolvation(S)
Gsolvation(ES) - Gsolvation(E)  -Gsolvation(BindingSite)
сайт связывания
(Binding Site)
Gbind  Gbindvacuum - Gsolvation(BindingSite) - Gsolvation(S)
Фермент-субстратное взаимодействие:
сольватация

Почему сольватационные эффекты
рассчитать сложнее, чем взаимодействие
фермент-субстрат?

Подходы к расчету сольватации:
 инкременты
сольватации аминокислотных
остатков
 атомные инкременты сольватации
 «полуэмпирические» расчеты
Фермент-субстратное взаимодействие:
сольватация
а.к.
заряд
Gsolv,
kcal/mol *
Инкременты сольватации
аминокислотных остатков

Gsolvation(BindingSite) =
=
 Gsolv,i *СтепеньДоступностиi
Остатки
Сайта Связывания
*Wimley W.C. et al, 1996, Biochemistry, 35, 5109-5124
Фермент-субстратное взаимодействие:
сольватация
тип атома*
Gsolv,
kcal/mol **

Aтомные инкременты
сольватации
Gsolvation(BindingSite) =
=
 Gsolv,I*Доступная Площадьi(Å )
Атомы
Сайта Связывания
* cиловое поле CHARMM 19
** Lazaridis K. and Karplus M. 1999, Proteins: Structure, Function and Genetics, 35, 133-152
2
Фермент-субстратное взаимодействие:
сольватация

Полуэмпирические модели
Gsolvation(BindingSite) = Gelectrostatic +
вода, 1
фермент, 2
q1
q2
Gnon-polar
q1
q3
Gelectrostatic=1/2
q2
 qi*(
q3
P.L. Privalov
1
- 2 )
электростатическая работа по переносу системы зарядов
из одной среды в другую
«Объемная» модель сольватации
Сольватационный
параметр
Объем атома
Межатомное расстояние
Gsol   Si  V j  exp(  rij2 2s 2 )
i, j
Атомы белка
Атомы субстрата

Степень перекрывания атома
Модель удобна тем, что в расчетах фигурирует только
межатомное расстояние, которое в отличие от площади
молекулы можно быстро, а главное, надежно рассчитать
Характерные вклады отдельных
взаимодействий в энергию
связывания
Межатомный контакт 0.2 ккал/моль
 Солевой мостик
1 ккал/моль
 Водородная связь
0.2 ккал/моль
 Сольватация атома0.2 ккал/моль

Примеры расчетов*
Фермент:
нейраминидаза
эксперимент:
-15.2
-13.2
-6.9
-2.8
*Kevin Musakawa, method: Molecular Mecahnics/Poisson-Boltzmann Surface Area (MM/PBSA)