презентацию

ФГУ «Московский НИИ педиатрии и
детской хирургии» Минздравсоцразвития
И.С. Мамедов, И.В. Золкина, В.С. Сухоруков
Основные типы нарушений обмена веществ,
определяемые методом MS/MS
 Нарушения обмена отдельных
аминокислот
 Нарушения обмена
органических кислот
 Нарушения окисления
жирных кислот
В качестве основных маркеров заболеваний используются
концентрации аминокислот и ацилкарнитинов с различными
заместителями
Нарушения обмена отдельных аминокислот
и основные маркеры заболеваний
Аргининсукцинилацидемия ASA
Повышение уровня цитруллина ≥
100 μмоль/л
Цитруллинемия (CIT)
Повышение уровня цитруллина ≥
100 μмоль/л
Гомоцистеинемия (HCY)
Повышение уровня метионина ≥
140 μмоль/л
Синдром кленового сиропа
лейциноз (MSUD)
Повышение уровня лейцинаизолейцина ≥ 460 μмоль/л
Фенилкетонурия (PKU)
Повышение уровня фенилаланина
≥ 280μмоль/л
Тирозинемия
Повышение уровня тирозина ≥
500μмоль/л
Нарушения обмена органических кислот и основные
маркеры заболеваний.
Метилмалоновая ацидемия (MMA)
С3 пропионил ≥ 8μмоль/л
Дефицит бета-кетотиолазы (BKT)
C5:1 Тиглил/триметилкротонил ≥
1,0μмоль/л
Глутаровая ацидемия 1-го типа
(GAI)
C5-DC глутарил ≥ 0,3μмоль/л
3-гидрокси-3-метилглутаровая
ацидемия (HMG)
C5-OH гидроксиизовалерил ≥
2,0μмоль/л
Изовалериановая ацидемия (IVA)
C5 изовалерил ≥ 1,62μмоль/л
Дефицит 3-метилкротонил-СоА
карбоксилазы
C5-OH гидроксиизовалерил ≥
2,0μмоль/л
Множественный дефицит
карбоксилаз (MCD)
С3 пропионил ≥ 8,0μмоль/л
Пропионовая ацидемия
С3 пропионил ≥ 8,0μмоль/л
Нарушения обмена жирных кислот
Дефект распознавания
карнитина (CUD)
Свободный карнитин
С0 ≤ 3.0 μмоль/л
Дефицит гидроксиацетил-СоАдегидрогеназы длинных
цепей(LCHADD)
C16-OH гидроксипальмитоил
≥ 0.19 μмоль/л
C18-1OH гидроксиолеил
≥ 0.5 μмоль/л
Дефицит ацетил-СоАдегидрогеназы средних
цепей(MCADD)
C8 (октаноил) ≥ 1.0 μмоль/л
C6 (гексаноил) ≥ 1.0 μмоль/л
Дефицит трифункционального
протеина (TFPD)
C16-OH (гидроксипальмитоил)
< 0.10 μмоль/л
Дефицит ацетил-СоАдегидрогеназы очень длинных
цепей (VLCADD)
C14:1 (тетрадеценоил)
≥ 1.5 μмоль/л
C14 (тетрадеканоил)
≥ 0.92 μмоль/л
Отбор образцов крови
 Кровь собирается на стандартную карточку-фильтр




(№903 Whatman), который применяют для скрининга
новорожденных на ФКУ.
Кровь может быть как капиллярная (из пальца, пятки),
так и венозная.
Необходимо хорошо пропитать выделенную область на
фильтре!
На карточке-фильтре обязательно должно быть четко
указаны ФИО, кем и откуда направлен пациент, дата
рождения и телефон лечащего врача.
Образец высушивается 2-3 часа на воздухе. Желательно
приложить выписку из истории болезни.
Этапы пробоподготовки
 Экстракция
 Упаривание
 Дериватизация
Экстракция определяемых компонентов
Упаривание и дериватизация пробы
Дериватизация аминокислот и ацилкарнитинов
O
O
10% HCl
H2N
H2N
OH
OBu
n-butanol
R
R
Bu = бутил
аминокислота
O-
H3C
+
N
H3C
CH3
OR'
O
R’ = H или ацил
Карнитин или ацилкарнитин
10% HCl
H3C
n-butanol
H3C
OBu
N+
CH3
OR'
Bu = бутил
O
QQQ Agilent
Схема ТМС
MS1
Ячейка
соударений
Газ аргон
MS2
Products
Precursor
MS/MS в
пространстве
Типы масс-анализаторов
N2 Inlet
RF
Ion Guide
Q1
Q2
Collision Cell
Q3
Detector
MS/MS во времени
Все ионы из источника
поступают в ловушку
• ионы вещества
• ионы фона
Детектор
МЕТОДЫ
ИОНИЗАЦИИ
Электронная
ионизация
(EI)
Химическая
ионизация
(CI)
Жесткая ионизация,
сильная фрагментация
Бомбардировка
Быстрыми атомами
(FAB)
ИАД (ЭС,ХИАД,ФИАД)
API (ESI, APCI, APPI)
Мягкая ионизация,
низкая фрагментация
Преимущества метода тандемной
масс-спектрометрии:
• повышенная диагностическая чувствительность и
специфичность;
• получение структурной информации об изучаемых
молекулах;
• высокая скорость анализа (42 вещества за 3 минуты)
• высокая селективность анализа в сложных
многокомпонентных смесях
• низкая себестоимость анализа
Масс – спектр образца крови
Пример типичной хроматограммы
биологического образца
Параметры метода анализа хроматограмм
Масс-спектр пробы с повышенным содержанием
ацилкарнитинов
Масс-спектр пробы с повышенным содержанием
аминокислот
Обработка массива результатов анализа при
помощи программного обеспечения MassHunter
Индивидуальный отчет,
выдаваемый программой жидкостного хромато-масс-спектрометра
Сравнение фенилкетонурии и нормы
d3-Leu
100
Ala
d4-Ala
Normal
d5-Phe
Leu
Phe
Tyr
%
Met
d6-Tyr
d3-Met
0
Phe
100
PKU
Увеличение пика фенилаланина
%
0
140
160
180
200
220
240
260
m /z
280
Сравнение нормы и дефицита среднецепочечного
ацилкарнитина
Normal
100
C16
carnitine
%
C3 carnitine
0
C8 carnitine
100
MCAD Deficiency
%
C6
carnitine
0
225
250
275
300
325
C10:1
carnitine
350
375
400
425
450
475
500
m/z
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Применение новых высокотехнологичных методов
лабораторной диагностики наследственных
болезней метаболизма позволяет облегчить и
ускорить трудный путь практического врача к
правильному диагнозу.