Биотехнологические методы получения иммуноглобулинов и
advertisement
Биотехнологические методы получения иммуноглобулинов и применение их в научных исследованиях и медицине. IgG Гибридомная технология. • Методика получения лимфоидных гибридом, позволяющая получать моноклональные антитела практически на любой антиген в необходимых количествах. • Технология лимфоидных гибридом была разработана в 1975 году Мильштейном и Келлером • 1984 году Келлер и Мильштейн были удостоены Нобелевской премии. Гибридомная технология. Гибридомная технология строилась на основе следующих разработок: • 1) имелись линии миеломных клеток мышей balb/c (дефектные по некоторым ферментам метаболизма нуклеиновых кислот) • 2) Линии этих раковых клеток-носителей, имели дефект гена кодирующий одтн из ферментов (тимидинкиназе (ТК) или гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ)) • 3) Технология слияния клеток с помощью вирусов (вирус Сендай) и полиэтиленгликоля Гибридомная технология. Гибридомная технология. Фаговый дисплей. Конструирование комбинаторной библиотеки Натуральные библиотеки антител - наивные библиотеки (naïve library) - иммунные библиотеки (immune library) Light Chain genes Collect RNA Convert RNA to DNA PCR amplify antibody genes Heavy Chain Genes • Фаговый дисплей Конструирование комбинаторных библиотек Линкер Ser(Gly4Ser)2AlaArgGlySerGly4Ser Ori M13PlacZ RBS Vh pHEN2 Vl His Apr E.coli TG1 E.coli TG1 E.coli TG1 E.coli TG1 E.coli TG1 pIII ColE1 Фаговый дисплей. • Фаг M13 Фаговый дисплей Получение индивидуальных одноцепочечных C-myc Vh Vl антител Несупрессорные штаммы E.coli: 6×His pIII C-myc 6×His VhVh Vl Vl pIII TAG аминокислота TAG Gln стоп-кодон Vh Vl Одноцепочечное антитело ковалентно связано с белком рIII фаговой частицы amber Фаговый дисплей Фагмида Фаг-помощник Геном фага Фагмида Фагмида Инфицирование E.coli фагом-помощником Фаговый дисплей Аффинная селекция (биопеннинг) Элюция V V V V Следующий раунд V V антиген V V V V антиген Амплификация в E.coli Фаговый дисплей. Ренатурирование in vitro Плазмида Цит. тельце включения Агрегировавшие АТ Секреция Функциональное scFv Частичный лизис внешней мембраны Функциональное scFv Продукция антиген-связывающих фрагментов антител в E.coli
