Использование методов культуры клеток и тканей растений in vitro для преодоления межвидовых

Использование методов культуры клеток
и тканей растений in vitro для
преодоления межвидовых
репродуктивных барьеров



Наиболее эффективным методом расширения
генетической базы селекционного материала
является гибридизация его с дикими и
примитивными культурными родственными
видами (отдаленная гибридизация).
В селекции нашло отражение два основных
направления использования отдаленной
гибридизации:
с целью расширения генетической базы
соответствующего культурного вида (расширения
аллельного разнообразия)
для интрогрессии в селекционный материал
отдельных ценных генов.
Выделяют следующие основные факторы,
обеспечивающие обособление видов:
- внешние экологические барьеры: физическое
разделение популяций видов в пространстве и
времени (несовпадение периода цветения),
обусловленное их адаптацией к специфическим
экологическим нишам;
- геномные различия между видами;
- различия в плоидности;
- внутренние барьеры, препятствующие
гибридизации (пре- и постзиготные
репродуктивные барьеры).
Презиготная несовместимость
Презиготные барьеры
(несовместимость)
проявляются между
опылением и
оплодотворением в виде:
непрорастания пыльцы на
рыльце пестика;
прорастания, но не
сопровождающегося
проникновением
пыльцевой трубки в ткани
пестика; проникновения
трубки в ткани пестика, но
при котором имеет место
ингибирование роста
пыльцевой трубки в разной
степени и в разных частях
столбика или в завязи
Постзиготные барьеры

Постзиготные межвидовые барьеры проявляются
в ходе или после оплодотворения, в течение
процесса роста и развития, цветения растений F1,
или даже позднее в расщепляющихся поколениях
F2 и BC1
Группировка видов Solanum в соответствии с их
плоидностью и EBN (по Hermsen 1994)
Плоидность
EBN
Виды Solanum
2х
1
2x
2
4х
2
4х
4
6х
4
blb, brd, cap, chn, clr, cph, cmm, crc,
etb, frn, jam, lgl, mrf, pld, pnt, trf,
амфимоноплоиды
аллотетраплоидных видов
chc, chm, ifd, tar, sect. Megistacroloba
и Tuberosa, за исключением chn,
дигаплоиды
естественных
и
искусственных автотетраплоидов
Все аллотетраплоиды: acl, agf,col,
fen, hjt, opl, plt, pta, scr, sto, tuq;
все удвоенные 2х, 1 EBN виды
tbr subsp. tbr и adg; все удвоенные
2х, 2 EBN виды (автотетраплоиды)
Sect. Demissa; acl subsp. albicans
Опыление in vitro для преодоления межвидовой
несовместимости
Впервые этот метод был успешно применен индийскими
учеными [Kanta et al., 1962] для получения
самоопыленного потомства у самонесовместимого мака
Papaver somniferum
Метод включает:
- обнажение семяпочки или семяпочек путем удаления
тканей пестика и завязи,
- нанесение на них пыльцы
- культивирование оплодотворенных семяпочек на
питательной среде до образования зрелых семян
Варианты метода: опыление и культивирование
- изолированных завязей,
- семяпочек, прикрепленных к плаценте,
- семяпочек без плаценты
Применение эмбриокультуры для устранения
последствий постгамной межвидовой
несовместимости


Первым продемонстрировал возможности
использования культуры изолированных
зародышей для целей преодоления межвидовых
репродуктивных барьеров у льна Laibach (1925,
1929)
Зародыши вычленяют в стерильных условиях из
гибридных семян, помещают их на питательную
среду и при культивировании на свету добиваются
регенерации из них растений. Эффективность
регенерации растений в культуре зародышей в
значительной степени зависит от размера
эксплантата и стадии развития зародыша: чем
больше эксплантат и чем более зрелый зародыш,
тем выше вероятность регенерировать из него
растение
Получение межвидовых гибридов путем слияния
протопластов для интрогрессии ценных генов в
селекционный материал

Первая методика слияния протопластов,
основанная на применении нитрата натрия, была
разработана в лаборатории Э. Кокинга в
Ноттингемском университете [Power et al., 1970,
Evans, Cocking, 1975]. С помощью этой методики в
США в 1972 г были получены первые растения
соматических гибридов между разными видами
табака (Nicotiana glauca+N. langsdorffii) [Carlson et
al. 1972]
Соматическая гибридизация
Технология соматической гибридизации включает
следующие этапы:
- получение суспензий протопластов двух видов
растений, гибриды между которыми предполагается
получить,
- получение смешанной суспензии протопластов двух
видов и использование экспериментальных воздействий
(химических или электрических), обеспечивающих
слияние протопластов,
- отбор продуктов слияния,
- получение из них каллюсной культуры и регенерация
растений соматических гибридов,
- подтверждение гибридности растений-регенерантов
Соматическая гибридизация
Химическое слияние:
в качестве первого «фьюзогена» использовали NaNO3
[Power et al., 1970]. Позднее были предложены менее
токсичные и более эффективные воздействия.
Наибольшее распространение получили следующие
системы слияния протопластов:
- высокая концентрация в среде ионов Ca2+ (около 50
мМ) и высокая рН (9-11) при 37оС [Keller, Melchers,
1973];
- добавка в среду полиэтиленгликоля (ПЭГ) [Kao,
Michayluk, 1974; Wallin et al. 1974];
- сочетание ПЭГ + высокая концентрация ионов Ca2+ и
высокая рН.
Полиэтиленгликоль используют молекулярной массой 15006000 в концентрации 15-45%, продолжительность воздействия
15-20 мин. Его применение обеспечивает высокую частоту
слияния протопластов (выше 30%) большого числа видов
растений.
Соматическая гибридизация



Метод электрослияния протопластов растений впервые
был предложен Zimmermann, Scheurich (1981).
Электрослияние осуществляют в специальной кювете
прибора с двумя электродами, расстояние между ними
0,2 мм. Через питательную среду, в которую помещают
суспензию протопластов двух видов, пропускают
высоковольтные импульсы (синусоидальная волна;
расстояние между пиками 5-10 В; частота 500 кгц;
напряжение от 200 В до 350 В, длительность импульса
~50 мс;).
Под действием тока на электродах образуются агрегаты
из 2-3 протопластов, либо цепочки из 5÷6 протопластов
между электродами. В это время на электроды подают
единичные импульсы постоянного тока, которые
приводят к образованию пор в сильно сжатых
мембранах протопластов. В результате происходит
перемешивание цитоплазмы контактирующих
протопластов и образуются гибридные протопласты.
Соматическая гибридизация





Методы отбора продуктов слияния протопластов:
Механическая изоляция
Генетическая комплементация
Физиологическая комплементация
Инактивация протопластов одного из родителей
до слияния протопластов
Физическое обогащение
Соматическая гибридизация



Симметричные соматические гибриды
Асимметричные соматические гибриды
Цибриды.
Подтверждение
гибридности
регенерантов,
полученных
после
протопластов:





растенийслияния
исследование морфологических признаков
оценка селекционной ценности гибридов
анализ изоферментов
анализ ДНК-маркеров, в том числе видоспецифичных
маркеров отдельных хромосом, генов родительских
видов
цитогенетические методики
Проблемы беккроссирования соматических
гибридов культурным родителем
- Сильные геномные различия родительских видов
(соматические гибриды – аллополиплоиды)
- Различия в плоидности соматических гибридов и
культурного родителя
- Презиготная несовместимость соматических
гибридов с культурным родителем
- Постзиготные репродуктивные барьеры при
гибридизации соматических гибридов с
культурным родителем
Проблемы беккроссирования соматических
гибридов культурным родителем

При использовании соматических гибридов в
качестве материнской формы беккроссирование
не может быть успешным, так как в пестиках таких
гибридов присутствуют РНКазы, которые являются
продуктами S-генов обоих родительских видов). SРНКазы дикого вида не могут быть
дезактивированы ингибиторами РНКаз,
присутствующими в пыльцевых трубках S.
tuberosum, что приводит к развертыванию реакции
несовместимости
Расщепление по S-локусу в результате мейоза у
соматических гибридов
S. tuberosum +S. pinnatisectum (tbr+pnt)


S-локус
соматического гибрида
Гаметы
Spnt
Spnt
Stbr
Stbr
Spnt Spnt
Spnt Stbr
Stbr Stbr





мейоз
Подходы к преодолению презиготной
несовместимости и культурного родителя
- Использование соматических
беккроссах в качестве опылителя
гибридов
- Получение дигаплоидов соматических
гибридов с помощью гаплопродюсера
- Получение удвоенных дигаплоидов
соматических гибридов с помощью культуры
пыльников
в
Дигаплоиды соматических гибридов (2n=2x=24)
S.tuberosum+S.pinnatisectum
Образование каллюса в культуре пыльников
соматических гибридов (2n=4x=48)
S.tuberosum+S.bulbocastanum
Регенерация растений в культуре пыльников
соматических гибридов (2n=4x=48)
S.tuberosum+S.bulbocastanum
Соматические гибриды tbr+blb (слева) и андрогенетические
растения-регенеранты соматических гибридов (удвоенные
дигаплоиды (2n=4x=48)