Сельскохозяйственная биотехнология как основа повышения урожайности растений и продуктивности животных и птиц

Сельскохозяйственная биотехнология
как основа повышения урожайности
растений и продуктивности животных
и птиц
1
1
1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология.
Принципы и применение. М.: Мир.- 2000.
2. Завертяев Б. П. Биотехнология в воспроизводстве
и селекции крупного рогатого скота.- Л.: «Агропромиздат», 1989.
3. Готтфрид Брем и др. Экспериментальная генетика в
животноводстве.- М.: Россельхозакадемия, 1995.
4. Семенова М.Л. Зачем нужны трансгенные животные
//Соровсовский образовательный журнал.- Т. 7.- № 4.2001.
5. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология.М.: Высшая школа, 2008.
2
Фитобиотехнология
Зообиотехнология
Ветеринарная биотехнология
Биотехнология в кормовой
промышленности
 Биотехнология переработки
с.-х. отходов




3
Фитобиотехнология –
использование
биотехнологических
методов в растениеводстве
4
Этапы развития
фитобиотехнологии:
I период – 1892-1922 гг. нем. Фехтинг,
Рехингер и Габерландт – первые
попытки выращивания каллусной
ткани; выдвинута теория полярности
органов растений и отдельных
клеток; теория о тотипотентности
растительных клеток.
5
II период – 1922-1939 гг. – Уайт, Готре и др.
продемонстрирована способность к
неограниченному росту in vitro
изолированных растительных клеток;
совершенствование питательных сред
6
III период – 1940 – 1960 гг. –изучено
значение микро-и макроэлементов для
поддержания нормальной ростовой
активности растительной ткани; выявлена
потребность в витаминах и стимуляторах
роста; открыт класс фитогормонов –
цитокинины.
7
IV период – 1960 -1975 гг. – предложен метод
получения изолированных протопластов путем
обработки растительных клеток смесью
пектолитических и целлюлолитических
ферментов, а так же найдены условия их
культивирования, при которых они образуют
новую клеточную стенку, делятся и дают
начало новым клеточным линиям; разработан
метод гибридизации соматических клеток при
обработке полиэтиленгликолем (ПЭГ) и
введением в них вирусных РНК, клеточных
органелл, клеток бактерий;
8
V период – с 1976 г – разработан метод
электрослияния изолированных протопластов и
методы селекции гибридных клеток, разработан
способ переноса генов для двудольных растений
на основе Ti- плазмиды Agrobacterium
tumefaciens, предложен метод
биобаллистической трансформации
9
Направления генетической
модификации растений:
• Получение с/ х культ ур с более
высокой урожайнос тью;
• Получение с/ х культ ур , дающих
несколько урожаев в год;
• Создание сор т ов с/ х культ ур ,
т оксичных для некот орых видов
вредит елей (карт офель, лис тья
кот орого содержат прот оксин для
колорадского жука);
10
• Создание с/ х культ ур ,
ус т ойчивых к неблагоприятным
климатическим условиям
(трансгенные рас т ения,
ус т ойчивые к засухе – несу т ген
скорпиона);
• Создание сорт ов рас т ений,
способных синт езировать белки
животного происхождения (
т абак, синт езирующий
лакт оферрин человека).
11
Этапы получения трансгенных растений:
• Выбор гена и его клонирование –
определяется необходимостью передачи
растению определенного хозяйственнополезного признака (большинство генов
выделены из бактериальных геномов,
диких видов растений, реже из геномов
насекомых или животных);
• Подбор генотипа растения-реципиента. В
идеале подбирают растения, имеющие
только одно отрицательное свойство
(слабая устойчивость к засухе) ;
12
• Введение гена и его экспрессия в геноме
растения-реципиента. Для введения гена
применяют трансформацию с помощью векторов,
а также методы прямого переноса генов в геном
растительных клеток.
• Регенерация трансформированных растительных
клеток и отбор трансгенных растений. Зависит
от тотипотентности клеток – способность
регенерации фертильного растения (способного
завязывать семена) из недифференцированных
соматических клеток. Тотипотентность наиболее
выражена у двудольных растений(картофель,
свекла, рапс, томаты, морковь, капуста) , у
однодольных (рис, кукуруза, пшеница)- слабее.
Отбор модифицированных растительных клеток
проводят на селективных средах, содержащих
гербициды.
13
Трансформация растений с помощью
агробактерий
14
Структура Ti-плазмиды
15
Сигналами, обеспечивающими перенос
и стабильную интеграцию генов в
ядерную ДНК растений является virобласть (область вирулентности) Tiплазмид.
Vir-область состоит из семи локусов:
vir-А, vir-B, vir-C, vir-D, vir-E, vir-G,
vir-F.
В определенной последовательности
белковые продукты этих генов
приводят к вырезанию Т-ДНК из
состава Ti-плазмиды и встраиванию ее
в растительный геном.
16
Идеальная векторная система на
основе Ti-плазмиды должна включать:
• Сигналы, необходимые для переноса и
стабильной интеграции в ядерную ДНК
растений;
• Систему для экспрессии чужеродных генов в
растениях (узнаваемый растительными
полимеразами промотор);
• Маркер, необходимый для селекции
трансформированных клеток
• Не содержать онкогенов, подавляющих
дифференцировку растительных клеток
17
В качестве промотора для экспрессии
(функционирования) чужеродных генов в
геноме растения наиболее часто
используют промотор 35S-РНК вируса
мозаики цветной капусты (СаМV),
обеспечивающий постоянную сильную
экспрессию чужеродного гена,
находящегося под его регуляцией, во всех
тканях трансгенного растения.
18
В векторе обязательно должны быть
предусмотрены гены-маркеры (репортерные
гены), на основе которых проводят отбор
модифицированных растений.
Например LuxA и LuxB – это гены, выделенные
из ДНК светлячков, контролирующие синтез
люциферазы, которая обеспечивает переход
люциферинов из окисленной формы в основную,
что обеспечивает свечение
модифицированного растения.
Наиболее часто в качестве генов маркеров
используют гены устойчивости к гербицидам
(хлорсульфорону или фосфинотрицину).
19
• Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью
рестриктаз и встраивают в плазмиду E.coli (pBR322),
которая способна к многократной саморепликации,
что приводит к увеличению числа копий участков Tiплазмиды (клонирование);
• В Т-сегмент встраивают определенный ген и снова
размножают в E.coli;
• Выделяют гибридные плазмиды, а затем вводят в
A.tumefaciens, несущие полную Ti-плазмиду. В
результате обмена идентичными участками
(гомологичная рекомбинация), происходит
встраивание сконструированных Т-сегментов в
нативные Ti-плазмиды, в результате чего получают
Ti-плазмиды со встроенным в Т-сегмент чужеродным
геном;
• Заражают растения модифицированными
агробактериями. Клетки полученных трансгенных
растений будут содержать интегрированную Т-ДНК
со встроенным чужеродным геном.
20
Метод трансформации растительных клеток
путем кокультивации с агробактерией
• Применяется для двудольных растений
(эффективность до 60%).
• В качестве эксплантов для трансформации
используются стерильные листовые диски, корешки,
семядоли, междоузлия. Экспланты инокулируют
жидкой средой, содержащей агробактерию с
векторной конструкцией. После 24-48 часов
кокультивирования в некоторых клетках происходит
встраивание в растительный геном Т-ДНК с
чужеродным геном.
• Экспланты переносят на среду, содержащую
антибиотик (для подавления агробактерий) и
гербициды для селективного отбора
трансформированных клеток.
• Через 2-5 недель на трансформированном экспланте
развиваются побеги модифицированных растений. 21
Методы прямого переноса генов
(перенос осуществляется в протопласты растительных
клеток)
• Микроинъекция ДНК – аналогично
микроинъекциям в животные клетки (эффективность
10-15%);
• Электропорация – на протопласты, находящиеся в
растворе, содержащем ДНК-векторы действуют
высоковольтными импульсами (напряжение 200-350
В). При этом обратимо образуются поры в мембране,
через которые клетки поглощают молекулы ДНК;
• Биобаллистическая трансформация -
растительные клетки помещают в чашку Петри и
выстреливают по ним из вакуумной пушки потоком
мельчайших частичек вольфрама, платины или золота
(d – 0,4 -1,2 мкм) с напылёнными на них молекулами
ДНК.
22
Получение трансгенных растений:
а-метод биобаллистики;
б-кокультивация с агробактерией
23
Доказательство трансформации
растительных клеток
Проводят выявлением генов-маркеров
(например генов устойчивости к
антибиотикам канамицину (nptII) или
гигромицину (hptII) и др.)
- С использованием ПЦР (полимеразно-цепной
реакции) и молекулярного анализа;
- На основании блот-гибридизации
хромосомной ДНК трансгенного растения с
использованием в качестве радиоактивного
зонда фрагмента Т-ДНК.
24
Возможные негативные эффекты использования
генетически-модифицированного сырья
• В настоящее время методы генной инженерии
технически несовершенны, исследователи не в
состоянии управлять процессом встраивания нового
гена и возникающие впоследствии эффекты его
проявления;
• В результате искусственного добавления чужеродного
гена непредвиденно могут образоваться опасные
вещества (токсины, аллергены и т.д.);
• Не существует совершенно надежных методов
проверки полученных растений на безвредность (более
10% серьезных побочных эффектов новых лекарств
невозможно выявить, несмотря на тщательные
исследования);
25
• Знания о действии на окружающую среду модифицированных организмов недостаточны. Имеется
множество возможностей для неконтролируемого
распространения потенциально опасных генов, в том
числе и передача генов бактериями и вирусами;
• Знания о наследственном носителе ДНК – очень
неполны. На настоящее время известно о функции
лишь трех процентов ДНК. Рискованно манипулировать сложными системами, знания о которых неполны. Обширный опыт в области биологии, экологии и
медицины показывает, что модификация организмов
может вызвать серьезные непредсказуемые
проблемы.
26
Цель зообиотехнологии:
1. Увеличение продуктивности
животных
2. Повышение оплодотворяемости
животных и воспроизводства стада
3. Улучшение качества
животноводческой продукции
4. Получение животных, устойчивых
к заболеваниям
27
1. Трансплантация эмбрионов
2. Получение трансгенных
животных
3. Клонирование животных
4. Получение химер
28
Трансплантация эмбрионов - это метод
биотехнологии, позволяющий ускоренно
размножать высокоценных племенных животных
1. Отбор доноров.
2.
3.
4.
5.
Суперовуляция.
Осеменение коров-доноров.
Извлечение и оценка эмбрионов.
Кратковременное культивирование и
хранение эмбрионов.
6. Пересадка эмбрионов реципиентам.
7. Криоконсервация эмбрионов.
29
Трансгенные животные
(Transgenic animals)
– это животные, несущие
встроенный генно-инженерным
способом ген другого
организма, способный
экспрессировать
специфические для этого
организма продукты
30
Технология получения
трансгенов
1. Микроинъекция чужеродной
ДНК в оплодотворенную
яйцеклетку – зиготу
2. Метод эмбриональных
стволовых
клеток (ЭСК)
31
32
Этапы получения трансгенных
животных
33
Доение трансгенной мыши
34
Применение трансгенных животных
•
•
•
•
•
Трансгенные животные – биореакторы
Модели наследственных болезней
Источник органов для пересадки человеку
Получение гормона роста
Повышение количества и качества
продукции сельскохозяйственных животных
• Получение животных, устойчивых к
различным заболеваниям
35
это популяция клеток или организмов,
произошедших от общего предка путём
бесполого размножения, при котором
потомок генетически идентичен своему
предку
это точное воспроизведение того или
иного живого объекта в каком-то
количестве копий, имеющих
идентичный набор генов
36
Cхема получения клонированной овцы
Долли
20
37
(мозаичные животные или
генетический мозаик) - это искусственно
созданные организмы, не известные в
природе, состоящие из генетически
различных клеточных популяций и
происходящие более чем от одной
оплодотворенной яйцеклетки.
- это продукт объединения
двух и более ранних эмбрионов,
вследствие чего они обладают сложным
комбинированным генотипом.
38
Методика создания химер
• выделяют яйцеклетки из доноров с
различающимися генотипами;
• культивируют эмбрионы на стандартных
питательных средах (основа-солевой буфер, ПВК
и лактат, глюкоза, альбумин) до стадии 8
бластомеров;
• агрегируют морулы (8-кл.) (агрегационный метод)
и культивируют in vitro до стадии бластоцисты;
• имплантируют химерный эмбрион в матку самкирецепиента
39
Создание аллофенных мышей
2 линии мышей,
отличающихся по окраске и
характеру волосяного
покрова
HRS/J – линия, мыши которой несут
рецессивный ген hairless (hr ) –
обусловливающий полное отсутствие
волосяного покрова
линия С57BL/6 – черная окраска
шерсти
40
Для гомозигот линии
HRS/J характерно
нарушение
формирования
волосяного покрова.
До 10 дневного
возраста развивается
нормальный покров,
который начинает
выпадать, в результате
трехнедельные мыши
полностью его
теряют.
На рисунке слева направо показан характер
волосяного покрова у 12,15 17 и 21-дневных мышат
41
Гомозигота hr/hr в 4-х недельном возрасте.
У человека обнаружен ортолог этого гена (некоторые палестинские
племена), он также приводит к отсутствию волосяного покрова и
узелковую атрихию (эффекты этого гена у человека начинают
проявляться в 7-летнем возрасте), ортологи этого гена найдены и у
42
др. млекопитающих (крысы, обезьяны).
При половом скрещивании нормальных и мутантных линий образуется
потомство с нормальной шерстью.
При получении химер возможны различные варианты распределения
волосяного покрова и его окраса:
8-дневные химеры
19-дневные химеры
Распределение волосяного покрова зависит от % мутантного компонента у
химеры
43
2-месячные химерные мыши.
У крайней правой мыши 51% мутантного компонента и наблюдаются четкие чередующиеся
полосы с шерстью и без, эти данные указывают, что ген действует в эпидермальных
клетках волосяного фолликула. Клоны эпидермальных клеток кожи зародышей в
эмбриогенезе мигрируют в латерально-вентральном направлении когерентно, не
перемешиваясь друг с другом. В случае, если ген действует в мезодерме, распределение
мутантных и нормальных клеток в шерстном покрове будет мозаичным.
44
22
45
Биотехнология в кормовой промышленности
Использование различных видов микроорганизмов, в
первую очередь, дрожжей, для получения кормового
белка, витаминов, кормовых добавок с целью
повышения питательной ценности кормов, а также
переработка отходов молокоперерабатывающих
заводов и мясокомбинатов с целью получения
белково-витаминных препаратов и др.
46
Схема получения
кормовых
дрожжей
47
Целью биотехнологии переработки
сельскохозяйственных отходов является не
только охрана окружающей среды от
загрязнения, но и получение веществ и
продуктов, полезных для человека и животных
Наиболее перспективные направления:
1. Переработка навоза сельскохозяйственных
животных и куриного помета методом анаэробной
ферментации с целью получения биогаза и
органических удобрений.
2. Переработка отходов растениеводства с целью
получения биогумуса.
48