Вакцины против гепатита В
advertisement
Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Кафедра микробиологии Реферат «Особенности вакцин нового поколения против гепатитов В и С» Выполнила: Половинкина В.Э., студентка 2 курса, группы №317 Научный руководитель: Гурина С.В. Санкт-Петербург, 2013 год. Содержание Введение Гепатит – это воспаление печени, вызванное, в основном, вирусной природой. Существует пять основных вирусов гепатита, называемых типами А, В, С, D, Е. Они представляют огромную проблему в связи с их потенциальной возможностью вызывать вспышки болезни и приводить к эпидемическому распространению. В частности, типы В и С приводят к развитию хронической болезни сотен миллионов людей и, в общей сложности, являются самой распространенной причиной цирроза и рака печени. Причиной гепатита А и Е обычно является употребление в пищу загрязненных пищевых продуктов и воды. Гепатиты В и С, рассмотренные в данной работе, обычно развиваются в результате контакта с инфицированными жидкостями организма (в частности, крови). В число самых распространенных способов переачи этих вирусов входит переливание зараженной крови, инвазивные медицинские процедуры с использованием загрязненного оборудования и – в отношении гепатита В – передачи от матери ребенку во время родов (вертикальный путь), от одного члена семьи другому, а также при сексуальных контактах. Ввиду многообразия путей передачи вирусов гепатита В и С, а также большого числа носителей инфекции, наиболее эффективным методом профилактики заболеваний и предупреждения распространения инфекции является вакцинация населения. В работе будет рассмотрено само понятие вакцинации, основные типы существующих в настоящее время вакцин, а также перспективы развития этой области микробиологии, и обстоятельства, препятствующие разработке эффективных вакцин нового поколения против гепатитов В и С. Гепатит В Вирус гепатита В (ВГВ) относится к семейству Hepadnaviridae, роду Orthohepadnavirus. Впервые был обнаружен под электронным микроскопом в 1970 году Д.Дейном и получил название «частица Дейна». Морфология. ВГВ – сложноорганизованный, ДНК-содержащий вирус сферической формы, диаметром 42-47 нм. Он состоит из сердцевины, построенной по кубическому типу симметрии, включающей 180 белковых частиц, и липидной оболочки, содержащей поверхностный HBs-антиген. Внутри сердцевины находятся ДНКполимераза, протеинкиназа и концевой белок HВe-антигена. ДНК-полимераза является полифункциональным ферментом, она вовлекается во многие функции жизненного цикла вируса: синтез новых цепей ДНК на матрице как ДНК, так и РНК, обладая как полимеразной, так и ревертазной активностью. Антигенная стрктура. ВГВ обладает сложной антигенной структурой. В оболочке вируса HBs-антиген, в формировании которого участвуют 3 полипептида в глюкированной форме: PreS1 – большой полипептид, PreS2 - средний, S – малый мажорный. Антигенная специфичность связана с малым мажорным белком, который входит в состав всех трех оболочечных белков. Впервые этот антиген был обнаружен Б.Блумбергом в 1963 году в крови австралийских аборигенов, поэтому получил название австралийского антигена. HBs-антиген обнаруживается в крови не только в составе вириона, но и в виде самостоятельных пустых фрагментов сферической или филаментозной формы, которые неинфекционны, но иммуногенны и индуцируют антиHBs-нейтрализующие антитела. Присутствие данного антигена в крови свидетельствует об инфицированности организма вирусом. HBs-антиген является гетерогенным – то есть подразделяется на 4 подтипа. Защита против одного подтипа обеспечивает защиту и против других за счет наличия общей детерминанты. Сердцевинный HBs-антиген никогда не присутствует в свободной форме в крови, являясь внутренним компонентом вирусной частицы. Его можно обнаружить в зараженных вирусом гепатоцитах. HВe-антиген также является сердцевинным антигеном, производным HBcантигена; его также называют растворимым антигеном. Появление Hbe-антигена в крови связано с репликацией вируса. НВх-антиген – трансактиватор, накопление которого в крови связывают с развитием первичного рака печени. Геном представлен двунитевой ДНК кольцевой формы, у которой плюс-цепь укорочена на 1/3 длины. Вирусный геном записан на минус-цепи, состоит из четырех генов. Полноценная минус-цепь ковалентно связана с ДНК-полимеразой, которая достраивает плюс-цепь до полноценной структуры. Вирус чрезвычайно устойчив к факторам внешней среды. В цельной крови и ее препаратах сохраняется годами. При комнатной температуре антиген в течение нескольких месяцев обнаруживают на постельных принадлежностях, медицинских и стоматологических инструментах, иглах, загрязненных сывороткой крови. Он теряет активность при автоклавировании при 120 0С через 45 минут и при стерилизации сухим жаром при 160 0С в течение 1 часа. Чувствителен к формалину, эфиру. 1-2% раствор хлорамина-Б действует 2 часа. Гепатит В относится к числу повсеместно распространенных инфекционных болезней. Считается, что в мире инфицировано около 2 млрд человек, из которых больны 350 млн, из которых ежегодно умирает 600 тыс человек. В отдаленный период заболевание может переродиться в опухоли и цирроз печени, особенно у лиц, инфицированных еще в детстве. Мир можно разделить на регионы с высокой (Китай, район Амазонки), промежуточной (Ближний Восток, Индийский субконтинент) и низкой (Западная Европа, Северная Америка) эндемичностью. Среди заболевших преобладают лица, подвергавшиеся гемотрансфузии и другим медицинским парентеральным манипуляциям. В группы риска входят медицинские работники, которые в профессиональной деятельности соприкасаются с кровью и ее препаратами (хирурги, стоматологи, работники гемодиализа, лабораторий), наркоманы при пользовании одним шприцем и заражении дрг друга половым путем. Характерна семейная заболеваемость, при которой наиболее активно реализуются половой и контактный пути заражения. В высокоразвитых странах с благоприятной эпидемиологической обстановкой более 50% новых случаев заражения гепатитом В приходится на передачу его половым путем. Подростки, в силу их активной половой жизни, составляют группу риска. В регионах с низкой эндемичностью вирус передается, в основном, парентерально или чрезкожно. В регионах с высокой эндемичностью обычным путем передачи инфекции является перинатальное заражение ребенка матерью. Приблизительно 5-17% беременных женщин являются носителями вируса гепатита В. Россия относится к регионам с относительно высоким уровнем распространенности ГВ, причем наблюдается устойчивая тенденция к росту заболеваемости: от 22 на 100 тыс. населения в 1992 году, до 36 в 1998 году. Увеличивается также и число выявленных носителей вируса: в 1997 году – 123 978 человек, в 1998 – 134 591. За шесть последних лет, по данным Министерства здравоохранения РФ, заболеваемость гепатитом В увеличилась в 2,5 (учитываются только желтушные формы). В 2000 г., по сравнению с 1998 – на 15,6%. В эпидемический процесс вовлекается молодое трудоспособное население: среди заболевших преобладают лица в возрасте от 15 до 30 лет (около 90%); заражение происходит в основном половым путем (43%) и при внутривенном введении наркотиков (30%). Наркомания – одна из причин роста заболеваемости, что превращает проблему вирусного гепатита из медицинской в социальную. Молодые люди в возрасте до 30 лет, употреблявшие наркотики, составляют 80% больных, умерших от ГВ. Ежегодно в России от цирроза печени погибает 700 тыс. человек, от первичного рака печени – 300 тыс. Клинические проявления гепатита В полиморфны. В инкубационном периоде, длящемся 60-180 дней, вирус размножается в клетках печени. Заболевание начинается с появления слабости, быстрой утомляемости, снижения аппетита. Симптомы начального (преджелтушного) периода могут быть слабо выражены и остаются незамеченными. В данный период важным диагностическим критерием служит появление темной мочи и обесцвечивание кала. Иногда симптоы начальной стадии могут быть выражены: отмечается тошнота, повторная рвота, головокружение, сонливость, отвращение к пище, боли в животе, субфебрильная температура тела. При осмотре наблюдается общая астения, увеличение, уплотнение и болезненность печени. Начальный период составляет обычно 5-7 дней, может удлиняться до 2-3 недель или укорачиваться до нескольких часов. Следующий период – желтушный (период разгара): появляется иктеричность склер, затем – кожных покровов. В течение 5-10 дней желтуха постепенно нарастает, увеличивается и уплотняется печень. Возожно увеличение селезенки и появление на коже пятнисто-папулезных высыпаний, болей в суставах и мышцах. Общая продолжительность этой фазы – от 7 дней до 1,5-2 месяцев. С исчезновением желтухи состояние больного постепенно улучшается, жалобы исчезают, размеры печени, а иногда и селезенки, остаются увеличенными. В крови продолжает наблюдаться нарушение функциональных печеночных проб. В остром периоде возможно развитие легких, среднетяжелых и злокачественных форм. Преобладают легкие, включая стертые и субклинические формы ГВ, с незначительно выраженными симптомами. Тяжелые формы течения ГВ с еще более выраженной клинической симптоматикой и биохимическими сдвигами представляет собой реальную угрозу для жизни больного, особенно если возникает злокачественная, т.н. фульминантная форма, в основе которой лежит остро фозникший массивный некроз печени. Злокачественные формы в большинстве случаев возникают при заражении человека во время гемотрансфузий. У половины таких больных обнаруживается смешанная В и дельта-инфекции (коинфекция). Наиболее тяжелым осложнением ГВ является острая печеночная энцефалопатия, спровоцированная цитолизом гепатоцитов. Инфекция, вызванная вирусом гепатита В, может привести к развитию хронического гепатита, циррозу печени или развитию гепатоцеллюлярной карциномы, особенно у больных, инфицированных в детском возрасте. Химиотерапевтическое лечение гепатита В зависит от скорости репликации вируса. По данным проспективных контролируемых испытаний, в репликативной стадии гистологически подтвержденного компенсированного хронического гепатита В с повышением активности аминотрансфераз независимо от гистологической картины эффективен альфа-интерферон в дозе 5 млн МЕ/сут или 10 млн ME 3 раза в неделю в течение 16 нед. У 40% больных инфекция переходит в интегративную стадию и наступает сероконверсия (исчезает HbeAg и появляются антитела к нему), уменьшаются морфологические изменения, а у 10% больных перестает выявляться HBsAg . При успешном лечении обычно наблюдается кратковременное повышение активности аминотрансфераз, как при остром гепатите; по-видимому, это связано со стимуляцией клеточного иммунитета и разрушением зараженных гепатоцитов. Рецидивы возникают редко, всего в 1-2% случаев. Эффективность интерферона-альфа выше при уровне вирусной ДНК в сыворотке ниже 0,2 нг/мл или значительном повышении активности аминотрансфераз (по меньшей мере до 100-200 МЕ/л). Вероятность элиминации HBsAg во время лечения выше при небольшой продолжительности заболевания (в среднем - около полутора лет). Длительное наблюдение показало, что в течение 5 лет после исчезновения маркеров репликации вируса у 60-70% больных исчезает и HBsAg, то есть не остается никаких серологических маркеров инфекции. Больным с иммунодефицитом и детям, зараженным в перинатальном периоде, препарат не помогает. Осложнения лечения включают гриппоподобный синдром , угнетение кроветворения, эмоциональные нарушения (разрдражительность , реже депрессию ), аутоимунные заболевания , алопецию , сыпь, понос . Все осложнения, кроме тиреоидита, исчезают при снижении дозы или отмене препарата. Длительное лечение глюкокортикоидами не только неэффективно, но и может принести вред, однако в ряде случаев их все же назначают коротким курсом. Они угнетают клеточный иммунитет, активируют репликацию вируса и экспрессию его антигенов на мембране гепатоцитов. Теоретически после их отмены активность лимфоцитов CD8 должна восстановиться, и они должны разрушить гепатоциты, экспрессирующие антигены вируса. И действительно, при этом повышается активность аминотрансфераз, а репликация вируса замедляется и может даже прекратиться. Показано, что при хроническом гепатите В, особенно при незначительном повышении аминотрансфераз, эффективен 6-недельный курс преднизона (60, 40 и 20 мг/сут по 2 нед) в сочетании с альфа-интерфероном (по 5 млн МЕ/сут в течение 4 мес). На практике такую схему лечения применяют редко. Противовирусную терапию не проводят при носительстве, а также при печеночной недостаточности (из-за опасности ее прогрессирования). Таких больных следует направлять в специализированные центры, в которых проводят клинические испытания противовирусных препаратов, например аналогов нуклеозидов. Выявлена эффективность фамцикловира и ганцикловира , но наиболее многообещающим представляется нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы ламивудин (2'-дезокси3'-тиацитидин), действующий на ДНК-полимеразу вируса гепатита В и лучше других препаратов подавляющий его репликацию. Единственная возможность спасти больного на терминальной стадии хронического гепатита В - это трансплантация печени . При этом рецидив гепатита почти неизбежен, но активность его бывает различной. Большинство больных становятся носителями с высокой концентрацией вирусной ДНК в крови. К сожалению, возможны и быстрое прогрессирование хронического гепатита В с развитием тяжелого поражения печени, и даже молниеносный гепатит, причем предсказать подобный исход нельзя. Для профилактики рецидива используют иммуноглобулин против гепатита В и аналоги нуклеозидов; последние успешно применяют и для лечения посттрансплантационного гепатита В. Гепатит С Развитие методов серологической диагностики позволило установить, что до 5-8% случаев посттрансфузионного гепатита не связано с типом В, так как его маркеры не выявляли ни в препаратах крови, ни у больных. Было показано, что заболевание распространено повсеместно и эпидемиологически близко к гепатиту В, и в 1978 оно было названо посттрансфузионный «ни А, ни В» гепатит. В настоящее время вирус гепатита С отнесен к тогавирусам рода Flavivirus, и с 1990 года в развитых странах ведется контроль за наличием антигена ВГС в препаратах крови. Морфология. ВГС является сложноорганизованным РНК-содержащим вирусом сферической формы, диаметром 55-65 нм. Капсид построен по кубическому типу симметрии, содержит структурный белок сердцевины (core), НСс-антиген и неструктурные белки (NS), которые являются ферментами, необходимыми для репродукции вируса. Капсид окружен липопротеиновой оболочкой с гликопротеиновыми шипами gpE1, gpE2. Антигенная структура. Антигенами вируса являются: сердцевинный НСсантиген, неструктурные белки, гликопротеины оболочки gpE1 и gpE2. Геном представлен плюс-цепью РНК. Геном выскоизменчив. Особой гипермутабельностью обладает район, детерминирующий синтез гликопротеинов Е1 и Е2, обладающих антигенной детерминантой, на которую вырабатываются вируснейтрализующие антитела. Замена аминокислот в гликопротеинах изменяет антигенные свойства вируса, позволяя ему избегать нейтрализующего действия антител. Известно около 14 генотипов вируса. Наибольшее распространение получили генотипы 13, наиболее вирулентен генотип 1b. Вирус относительно нестабилен при хранении при комнатной температуре. Чувствителен к крови, детергентам, формальдегиду, УФ-лучам; нагревание при 60 0С инактивирует вирус в течение 10 часов, а 100 0С – в течение 2 минут. Ежегодно 3-4 миллиона человек инфицируются вирусом гепатита С. Около 150 миллионов хронически инфицированы и подвергаются риску развития цирроза или рака печени. Ежегодно более 350 000 человек умирают от связанных с гепатитом С болезней печени. Резервуаром и источником инфекции являются больные хроническими и острыми формами гепатита С, протекающими как с клиническими проявлениями, так и бессимптомно. Механизм передачи инфекции аналогичен таковому при гепатите В, однако структура путей заражения имеет свои особенности. Это связано с относительной неустойчивостью вируса во внешней среде и довольно большой инфицирующей дозой, необходимой для заражения. Изучение эпидемиологии гепатита С стало возможным после разработки надежных серологических методов определения инфицированности населения. В США антитела к вирусу обнаружены у 1,4% населения и у 0,1-0,7% здоровых доноров. Распространенность вируса значительно выше в развивающихся странах. В отдельных регионах Африки (Египет), Ближнего и Среднего Востока (Пакистан) она достигает 4-6%. Вирус гепатита С передается прежде всего через зараженную кровь и в меньшей степени через другие биологические жидкости человека. РНК вируса обнаружена в слюне, моче и асцитической жидкости. К группам повышенного риска относят больных, которым многократно переливали кровь и ее препараты, а также лиц, имеющих в анамнезе массивные медицинские вмешательства, пересадку органов от ВГС-положительной реакцией и многократные парентеральные реакции. Однако у 40-50% больных выявить парентеральные факторы риска не удается, и способ передачи вируса в данных условиях остается неизвестным. Описана передача вируса гепатита С при внутривенном введении зараженного иммуноглобулина. В среднем 20% больных, которым постоянно проводится гемодиализ, инфицированы вирусом гепатита С, но частота их заражения зависит от региона и используемых диагностических методов. У медицинского персонала, контактирующего с инфицированной кровью, обнаруживают не чаще, чем в общей популяции. Вертикальная передача вируса гепатита С от матери ребенку возможна при наличии высоких титров вируса у матери или при сопутствующей ВИЧ-инфекции. Гепатит С не передается с грудным молоком, через пищевые продукты или воду и при безопасных контактах, таких как объятия, поцелуи или совместное употребление в пищу продуктов и напитков с инфицированным человеком. Инкубационный период гепатита С длится от 2 недель до 6 месяцев. После первоначального инфицирования примерно 80% людей не испытывают каких-либо симптомов. Люди с острыми клиническими проявлениями могут иметь повышенную температуру, усталость, сниженный аппетит, тошноту, рвоту, боли в области живота, темную мочу, кал серого цвета, боли в суставах и желтуху. Примерно у 75-85% недавно инфицированных людей развивается хроническая болезнь, а у 60-70% хронически инфицированных развивается хроническая болезнь печени. У 5-20% - цирроз, а 1-5% умирают от цирроза или рака печени. У 25% пациентов с раком печени основополагающей причиной является гепатит С. Хроническое течение болезни развивается у 90% взрослых и 20% детей. В случае заболевания ГС лечение требуется не всегда. Существует 6 генотипов гепатита С, которые могут по-разному реагировать на лечение. Прежде чем начать лечение, необходимо провести тщательный скрининг для определения наиболее подходящего для пациента препарата. В основе лечения гепатита С лежит комбинированная противовирусная терапия на основе интерферона и рибаверина. К сожалению, на глобальном уровне интерферон не является широкодоступным, не всегда хорошо переносится, не все генотипы реагируют на него одинаково эффективно и многие принимающие его люи не доводят лечение до конца. Это означает, что несмотря на то, что гепатит С, в основном, является излечимой болезнью, для многих людей он остается неизлечим. Критерием эффективности лечения в настоящее время является стойкая биохимическая ремиссия (нормализация уровня АЛТ – аланинаминотрансферазы – в течение длительного времени после ПВТ) и отсутствие виремии (неопределяемый уровень РНК после 6 месяцев и более после завершения лечения). В настоящее время гепатологами России разработан «Протокол диагностики и лечения больных вирусными гепатитами В и С», являющийся руководством для практических врачей, осществляющих ведение и лечение пациентов с острыми и хроническими вирусными заболеваниями печени и подлежащий ежегодному уточнению и пересмотру. Однако эффективность стандартного лечения не превышает 50%, поэтому активно ведутся разработки новых препаратов и схем лечения. В частности, самые новые лекарства (на начало 2013 года) достигают эффективности 75-80%. Фармакологическая компания Janssen, разработавшая и производящая новое эффективное лекарство от гепатита С – INCIVO (Телапревир), по результатам 2012 года получила за разработку этого лекарства престижный приз международного исследовательского конкурса-фонда Галена. Новый ингибитор протеазы боцепревира – VICTRELIS (Боцепревир), разрабатывался компаниец Schering-Plough, и далее исследования продолжила компания Merck. В России Телапревир был зарегистрирован в конце 2012 года. Профилактика ГС в настоящее время базируется на своевременном выявлении больных с острым и хроническим ГС (с использованием для этого ИФА-тест-систем последнего поколения), их полноценного лечения, что ведет к уменьшению источников ВГС-инфекции. Важное значение имеет дальнейшее совершествование работы по преупреждению внутрибольничного заражения гепатитом С, все более активная борьба с наркоманией, улучшение санитарного просвещения населения. Необходимо расширение работы по созданию вакцины против ГС. Поверхностные гликопротеиды Е1 и Е2 являются потенциальным источником получения вакцины. Повторная иммунизация шимпанзе экспериментальной рекомбинантной вакциной привела к образованию антител, уровень которых был выше в сравнении с уровнем людей-носителей ВГС. Вероятно, при конструировании вакцин необходимо учитывать генотип вируса. Возможно, придется разрабатывать препараты применительно к территориям и континентам, среди которых доминирует тот или другой генотип вирса или создавать универсальню вакцину. Это позволило бы совершить прорыв в борьбе с «ласковым убийцей». Получение высокопродуктивного варианта вируса, вызывающего цитопатогенный эффект на клеточных линиях, перспективно для разработки культуральной вакцины, что, в свою очередь, повлияло бы на снижение заболеваемости первичным раком печени. Вакцины против гепатита В Приобретенный иммунитет имеет два уникальных признака: специфичность и иммунологическую память. Память отражает способность организма реагировать на повторный контакт с антигеном вторичным ответом, который протекает быстрее, сильнее и более длительно по сравнению с первичным ответом. Вся вакцинопрофилактика основана на феномене иммунологической памяти. С помощью правильно сконструированной вакцины удается получить длительный, иногда пожизненный, антиинфекционный иммунитет. В большинстве же случаев продолжительность иммунитета мала даже при условии многоразового введения одной и той же вакцины. Главным элементом иммунологической активности являются клетки памяти, которые представляют собой длительно живущую субпопуляцию антигенспецифических клеток, готовых реагировать на повторное введение вакцины. Клетки памяти образуются из так называемых наивных клеток, которые еще не встречались с антигеном и не обладают антигенной специфичностью. Для формирования иммунологической памяти необходимо участие дендритных клеток, представляющих антиген наивным клеткам. Различают Т- и В-клетки памяти, центральные и эффекторные Т-клетки памяти. Вклетки памяти образуются в зародышевых центрах, а Т-клетки памяти – в тимусзависимых зонах лимфоидных органов. Центральные Т-клетки памяти накапливаются в местах их образования и являются источником формирования эффекторных клеток памяти. Последние концентрируются в периферической ткани и выделяют большое количество цитокинов при контакте с антигенами вакцины. Развитие иммунологической памяти зависит от свойств вакцины, ее дозы, пути введения, адъювантов, состояния иммунной системы, генотипа и других факторов. Антиинфекционный иммунитет складывается из клеточных и гморальных факторов иммунитета, которые регулирются разными субпопуляциями Т-хелперов с помощью разных видов цитокинов. Существующие в практике вакцины, обеспечивающие формирование гуморального иммунитета, облаают высокой эффективностью. Полисахаридные вакцины приобретают способность вызывать длительню иммунологическую память после их конъюгирования с белковыми носителями. Механизмы развития поствакцинальной памяти слабо изучены. С точки зрения клеточной и молекулярной иммунологии, вакцина должна активировать вспомогательне клетки, легко подвергаться процессированию, содержать эпитопы антигенов для Т- и Влимфоцитов, индуцировать образование Т-хелперов, эффекторных клеток и клеток памяти. Дискуссионным является вопрос о роли антигена в развитии иммунологической памяти. По одной из теорий, предполагается, что память сохраняется длительное время благодаря присутствию антигена в организме. Действительно, более устойчивая иммунологическая память развивается при введениях корпускулярных, особенно живых, вакцин. Вместе с тем длительность существования иммунологической памяти всегда больше периода расщепления вакцины в организме. Память сохраняется, хотя антигены вакцины уже не обнарживаются иммунологическими методами. Однако был делан вывод о том, что вспомогательные клетки, прежде всего, дендритные, являются своеобразным хранилищем для антигена, связанного с продуктами генов гистосовместимости. Эта связь препятствет полному расщеплению антигена, не позволяет обнаружить антиген иммунологическими методами, но обеспечивает длительное образование клеток иммунологической памяти. Генно-инженерные (рекомбинантные) вакцины (R-вакцины). Достижения молекулярной биологии и генетики позволили целенаправленно манипулировать фрагментами нуклеиновых кислот и получать различные комбинации наследственного материала. В основе этих достижений лежат универсальность генетического кода, возможность получать в изолированном виде фрагменты генов и нуклеиновых кислот, синтезировать ex vivo фрагменты нуклиновых кислот и объединять их в единое целое. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение его в реципиентный организм, создание условий для его функционирования и стабильного наследования. А создание генно-инжереных вакцин сводится к целенаправленному получению рекомбинантных бактерий или вирусов, безвредных для макроорганизма, обладающих высокой иммуногенностью и активирующих лительный иммунитет. Возможна обратная ситуация – искусственное аттенуирование, когда из генома бактерии или вируса удаляют фрагменты ДНК, определяющие их вирулентность и патогенность. При сохранении протективных свойств искусственно аттенуированные бактерии и вирусы могут быть вакцинными препаратами или служить основой для получения рекомбинантных вакцин. Кроме того, генноинженерная технология позволяет получать рекомбнантные субъединичные вакцины, выделяемые во внешнюю сред штаммами-продуцентами – дрожжевыми клетками или E.coli. Существет несколько методов получения генно-инженерных конструкций. Наибольшее распространение получили плазмидная технология клонирования и фаговый метод. При клонировании генов целевой фрагмент ДНК , контролирующий образование определенных белков, выделяют, вводят в различные бактерии и размножают (амплифицируют). Благодаря клонированию генов появилась возможность вырабатывать в больших количествах белки, определяющие вакцинную конструкцию. Эта технология основана на следующем принципе: помимо своей собственной кольцевой хромосомы, бактерии часто содержат дополнительные кольцевые молеклы ДНК, называемые плазмидами. Плазмидную ДНК можно выделить и расщепить соответствующей рестриктазой только в одном случае: превратив ее в линейную, с «липкими» концами. Далее фрагменты любой чужеродной ДНК с такими же концами можно сшить с плазмидной с помощью лигазы. Рекомбинантную конструкцию вводят затем в бактерию, где она реплицируется. При получении рекомбинантных вакцин в качестве источника экзогенной ДНК можно использовать бактериальную, вирусную ДНК, а также ДНК, синтезированную из клеток человека. Кроме бактериальных плазмид в качестве векторов (носителей ДНК) используют фаги. Часть его генома не обязательна для его размножения в бактерии. Вместо него можно ввести чужеродную ДНК, которая будет размножаться вместе с фаговой после инфицирования бактерий. Для создания векторных живых вирусных вакцин используют аттенуированный ДНК-содержащий вирус, в геном которого встраивается необхоимый клонированный ген. Вирус – носитель вектора – активно размножается, а продукт встроенного гена обеспечивает формирование иммунитета. Вектор может соддержать несколько всроенных генов, отвечающих за транскрипцию и трансляцию соответсвующих чужеродных антигенов. По принципам конструирования и носителю вектора рекомбинантные вакцины могут быть разделены на следующие группы: 1. Генно-инженерные белковые рекомбинантные конструкции 2. Гетерологичные бактерии или вирусы, используемые как носители соответствующих векторов 3. Искусственно аттенуированные, высокоиммуногенные штаммы, содержащие протективные антигены, из генома которых удалены гены, определяющие вирулентность и токсичность 4. Вирусоподобные конструкции, лишенные генома 5. Генетические конструкции, включающие иммуногенню составляющую и компонент, определяющий другие свойства. Сложности получения и ограничения использования генно-инженерных вакцин. Факторы, влияющие на стоимость разработки. В характеристике вакцины существует параметр, который во многом определяет ее использование – это стоимость. Она зависит от многих факторов, но прежде всего – от сложности получения. Многие инфекционные агенты сложно культивировать и масштабировать. Технологии производства большинства применяемых сегодня вакцин чрезвычайно разнообразны и во многом зависят от особенностей возбудителя заболевания, против которого разработана вакцина. Однако даже специально разработанные методы получения конктретной вакцины не гарантируют размножения бактерий и репликации целевого фрагмента, определяющего иммунный ответ. А если этого удалось добиться, то необходимо еще индуцировать экспрессию гена, трансляцию и транскрипцию синтезируемой молекулы. Получать эффективную векторную вакцину на основе бактерий достаточно трудно из-за нестабильности трансфекции генного материала, токсичности чужеродного антигена для бактерий, малого количества экспрессированного антигена. Кроме того, нативные молекулы антигена и генно-инженерный целевой продукт могут иметь различный профиль гликозилирования, что критическим образом может влиять на иммуногенность. В совокупности решение указанных задач существенным образом влияет на стоимость разработки вакцины. Сложности хранения и транспортировки. Серьезной проблемой использования аттенуированных r-вакцин является непрерывность «холодовой цепочки» - фактически неукоснительное исполнение температурного режима от производства до конечной точки употребления. Сложность ситуации усугубляется тем, что в современных условиях в снижении инфекционной заболеваемости нужается население развивающихся стран Юго-Восточной Азии, Центральной и Южной Африки, и в них на поддержание «холодовых цепочек» приходится около 80% стоимости одной вакцинации. Недостаточная активация клеточного иммунного ответа. Для активации протективного иммунитета, обусловленного специфическими антителами, использют рекомбинантные вакцины в сочетании с различными (в некоторых случаях специально разработанными адъювантами). Действительно, современные генноинженерные конструкции демонстрируют эффективную способность индуцировать антителообразование и препятствуют развитию развернутой картины инфекционных заболеваний, в патогенезе которых есть стадии, прерываемые остаточным количеством антител. Также очевидна роль антител в патологии, связанной с продукцией инфекционным агентом различных токсинов. Между тем современные генно-инженерные вакцины в предотвращении патологии, при которой протективный эффект обусловлен клеточным иммунитетом, малоэффективны, а если быть до конца объективным – неэффективны. И связано это с самой сутью реакций клеточного иммунитета, которые обусловлены не только эффекторами клеточного иммунитета или различными популяциями цитотоксических клеток, но и рекрутированными клетками. По существу, клетки, определяющие специфический иммнный ответ, являются центрами привлечения и активации неспецифических эффекторов клеточного иммунитета. Из этого следует, что разработка генно-инженерных вакцин, обусловливающих клеточный иммунный ответ, является задачей ближайшей перспективы. Вакцины против гепатита В В России зарегистрированы и применяются следующие вакцинные препараты: 1. Вакцина гепатита В рекомбинантная дрожжевая жидкая фирмы Комбиотех, Россия. 2. Вакцина протитв гепатита В ДНК рекомбинантная, ФГУП НПО «Вирион», Россия. 3. Энджерикс В, ООО СмитКляйнБичем-Биомед, Россия. 4. Энджерикс В фирмы ГлаксоСмитКляйн, Англия. 5. H-B-Vax II фирмы Мерк, Шарп и Доум, США. 6. Эувакс В фирмы LG Кемикал ЛТд., Корея (производится под контролем фирмы Авентис Пастер, Франция) Комбиотех. Вакцина зарегистрирована в РФ, выпускается с 1994 года, разработана в 1992 г. Представляет собой поверхностный антиген (подтип ayw) вируса гепатита В, выделенный из штамма продуцента Saccharomyces сerevisiae. Сорбент – алюминия гидроксид, консервант – мертиолят в концентрации 0,005%. Отечественный препарат Комбиотех изготавливается с учетом того, что в России наиболее распространен (95-98%) ВГВ с субтипом “ayw”. Антиген синтезирован рекомбинантными клетками пекарских дрожжей, выделен из дрожжевого экстракта и очищен при использовании различных видов хроматографии и ультрацентрифугирования в градиенте плотности. Степень чистоты вакцины превышает 98%. В 1 мл препарата содержится 20 мкг HbsAg (для лиц старше 19 лет), в 0,5 мл – 10 мкг (для детей и подростков 19 лет). При иммунизации 234 человек в возрасте 20-22 лет клинико-лабораторное наблюдение за привитыми не выявило отклонений от физиологической нормы показателей периферической крови и мочи, частоты и характера интеркуррентных заболеваний при практически полном отсутствии местных реакций. При иммунизации 952 человек в возрасте 20-22 лет у привитых не было жалоб на нарушение самочувствия. Отсутствовали местные реакции на введение вакцины, температурных реакций выше 37,5 0 С не было. У 92,5% серонегативных лиц через месяц после иммунизации по схеме 0-1-2 мес. и у 97,5% вакцинированных по схеме 0-1-6 мес. были выявлены антитела в титрах выше защитных (10 МЕ/л). При вакцинации по схеме 0-1-6 мес. высокие титры антител (более 1000 МЕ/л) имели 66,6% привитых. Авторы полагают, что высокие титры специфических антител обеспечат защиту от ГВ 90% привитых в течение 7-10 лет. Результаты применеия вакцины у новорожденных и детей в возрасте от 6 мес. до 4,5 лет подтвердили низкю реактогенность и высокую иммуногенность вакцины (серопротекция составила 100%). Вакцина Комбиотех была применена в целях комплексной терапии 55 больных хроническим гепатитом В и носителей вируса в возрасте от 16 до 55 лет. Первая группа больных хроническим гепатитом В умеренной степени активности (20 чел.) получала на фоне традиционной патогенетической терапии вакцину Комбиотех. Вторая группа аналогичных больных (10 человек) получала вакцин и нуклеинат натрия в качестве иммномодулятора. Третья группа носителей HbsAg (15 чел.) была привита вакциной Комбиотех, четвертая группа носителей (10 чел.) получала вместе с вакциной нуклеинат натрия. Контрольные грппы состояли из 10 больных хроническим ГВ и 8 носителей поверхностного антигена. Вакцину – 1 мл – вводили внутримышечно в область дельтовидной мышцы плеча один раз в месяц в течение 3 месяцев. Крс терапии нутклеинатом натрия по 0,5 г 3 раза в день составлял 5 дней. Введение вакцины способствовало постепенному снижению активности АлАТ в первой группе больных, получавших одну вакцину. Более заметно показатели АлАТ снизились во второй грппе больных, получавших дополнительно нуклеинат натрия. Уже после введения последней дозы вакцины процент больных с высокими титрами HBs-антигена уменьшился в 1,4 раза. Аналогичный эффект оказала вакцина в группе хронических носителей антигена. Авторы считают, что нуклеинат натрия усиливает иммуногенные свойства. После окончания лечения вакциной с адъювантом у отдельных больных и носителей вируса гепатита В были обнаружены антитела к HbsAg. В результате лечения черз месяц после введения вакцины была отмечена активация иммунологической реактивности у больных и носителей антигена. Однако второе введение Комбиотеха привело к подавлению иммунологической активности, а после третьего введения уровень Т-супрессоров, Тхелперов, нулевых лимфоцитов, IgG практически не отличался от исходного. Полученные результаты позволяют надеяться, что с помощью вакцинотерапии можно значительно уменьшить процент носителей поверхностного антигена и разработать методы эффективной терапии больных хроническим ВГВ. Энджерикс В. Разрешена к применению в 185 странах мира. С 1999 года российский производитель поставляет вакцину для Российской Федерации. Поверхностный антиген вмруса гепатита В экспрессирован дрожжевыми клетками Sacchromyces cеrevisiae. Слабые местные реакции были зафиксированы у 4-13% привитых, слабые общие реакции – 1-4% привитых. Специфические антитела в защитных титрах через месяц имели 92,% привитых медицинких работников, 96-97,8% детей от матерей-носительниц HBs-антигена, исключение составили только больные гемодиализа, среди которых только 76% были сформированы протективные титры антител. Через полтора года у этих больных анти-HBs сохранились только у 53% привитых, заболеваемость меньшилась только в 2,3 раза, что свидетельствует о необходимости ревакцинации для данного контингента больных. Вместе с тем высказывается мнение о целесообразности ревакцинации для медицинских работников. На основании 10-летнего опыта вакцинации против ГВ с использованием вакцины Энджерикс В авторы делают вывод о безвредности, высокой иммуногенной активности и слабой реактогенности вакцинного препарата. Маркеры вируса гепатита В обнаруживаются у онкологических больных: при солидных опухолях, гемобластозе и гемофилии, однако считается, что вакцинацию онкологических больных можно проводить без дорогостоящего лабораторного обследования на наличие HbsAg, так как ополнительная доза оказывает бстерный эффект, а побочные реакции практически отсутствуют. Отмечается также, что при введении вакцины Энджерикс В через 24-48 час. после рождения и последующей вакцинации на 4-7 сутки против туберкулеза взаимообусловленные явления отсутствуют. Вакцинация против ГВ является показанной при наличии хронических заболеваний печени. Обооснованием к этому служит широкое распространение среди населения микстинфекции вирсами гепатита В и С, суперинфекция другим гепатотропным вирусом усиливает тяжесть поражения печени и риск развития цирроза и первичного рака печени. Частота сероконверсии на введение вакцины Энджерикс В у лиц с наличием анти-ВГС сходна с показателями, полученными у лиц без анти-ВГС. Через 3 мес. после завершения полного курса вакцинации против ГВ частота сероконверсии составила 96,4% в обеих группах привитых. Однако интенсивность выработки анти-HBs у лиц с наличием антиВГС была ниже после второго и третьего введения вакцины. Антитела к вирусу ГВ в титре 10-1000 МЕ/л и больше 1000 МЕ/л достоверно реже определялись у лиц, имеющих анти-ВГС по сравнению с группой здоровых людей. Для преодоления гипореактивности больных хроническими заболеваниями печени и ВГС-инфицированных лиц рекомендуется увеличить доз вакцины о 40 мг. И применить ускоренную (0-1-2-12 мес.) схему иммунизации. Декомпенсированный цирроз печени является абсолютным противопоказанием к вакцинации. Вакцина Энджерикс применяется в 75 регионах РФ, использовано более 6 млн доз. Она является препаратом выбора для программ массовой иммунизации как наиболее изученная и широко применяемая вакцина в мире. Эувакс В Представляет собой высокоочищенные неинфекционные полипептиды HbsAg, продуцированного дрожжами Saccharomyces Cerevisiae. Адсорбированы на солях алюминия (адъювант), консервант – мертиолят 0,01%. В 1 мл вакцины содержится 20 мкг антигена (доза для лиц старше 16 лет), детская доза содержит 10 мкг в 0,5 мл. Вакцинация оказана детям любого возраста и взрослым. При вакцинации группы здоровых людей (по схеме 0-1-2- мес.), не болевших гепатитом и не содержавших в крови маркеров гепатита В, у 90-96% температура тела не повышалась, слабо выраженные температурные реакции, длительность которых не превышала 24 часов, регистрировали у 3,1-10% человек. Местную реакцию (болезненность в месте введения) наблюдали у 3,1% привитых. При использовании короткой схемы иммунизации вакцина Эувакс В обладает выраженной иммуногенной активностью и низкой реактогенностью. Полученные результаты позволили рекомендовать ее для регистрации в России. У детей, вакцинированных в первые 24 часа с момента рождения, отсутствовали общие реакции, частота местных реакций (эритема в месте введения от точечной до 0,5 см в первые сутки продолжительностью до 48 часов) составила 2,2%. Также имеются данные об иммунизации детей, тредеющих неврологическими и соматическими заболеваниями: детей прививали по схеме 0-1-6 мес. Наблюдения показали, что после каждого из трех введений вакцины клинические проявления общих и местных реакций отсутствовали. Сероконверсия после полного курса вакцинации была зарегистрирована в 100%, у большинства детей – в титрах выше защитных. Таким образом, вакцина является слабореактогенной и высокоиммуногенной для детей с хроническими соматическими и нервными заболеваниями. То есть, данные патологии не являются противопоказаниями у вакцинации против гепатита В. У вакцинированных медработников необычных реакций замечено не было. Часть привитых предъявляло жалобы на кратковременное головокружение и скоропреходящую слабость. Сделан вывод о безопасности введения вакцины и актуальности вакцинопрофилактики. Вакцина Эувакс В зарегистрирована в 36 странах мира. В России реализовано более 1,5 млн доз препарата (в мире - более 30 млн доз). По обобщенным данным, регистрируется около 3,1% местных реакций. Выработка анти-HBs в защитных титрах происходит у 97,9% привитых. Использование вакцины в различных регионах РФ подтвердило безопасность, хорошю переносимость и иммунологическю эффективность препарата Эувакс В. H-B-Vax-II (НВ-Вакс) Первая в мире зарегистрированная генно-инженерная вакцина. Содержит поверхностный антиген вируса ГВ, продциремый дрожжевыми клетками, консервант – мертиолят. Доза вакцины для взрослых – 1 мл содержит 10 мкг антигена; 0,5 мл для подростков старше 10 лет – 2,5 мкг, в настоящее время не выпускается. Новорожденным от матерей-носителей вводится доза 5 мкг. С целью регистрации препарата в России в условиях строго контролируемого испытания были проведены оценки его реактогенности, безопасности, иммунологической эффективности и и целесообразности введения вакцинации против гепатита В в иммунологический календарь. Для вакцинации было отобрано 274 здоровых человека, без противопоказаний, не имеющих в крови маркеров ГВ. Препараты вводили внутримышечно одноразовыми шприцами,. Частоту и характер местных реакций на вакцинацию читывали ежедневно на протяжении недели. У привитых были отмечены лишь слабые температурные реакции: 6,9% привитых – после первого введения, 3,5% - после второго, после третьей инъекции повышения температры не наблюдалось. Местная реакция – незначительная болезненность – была зарегистрирована у 9,5% привитых. Клинико-лабораторные исследования не выявили отклонений от физиологических показателей периферической крови и мочи, биохимических тестов на активность печеночных трансфераз, уровня билирубина. С целью проверки переносимости иммунизации вакцин НВ-Вакс вводили детям в объеме 0,25 мл, содержащем 2,5 мкг антигена. Наблюения показали, что при одновременном введении вакцины против ГВ с другими вакцинными препаратами необычных реакций не наблюдается; вакцинация против ГВ не влияет на иммуногенность других вакцин при сочетанном их введении. Т.о., вакцинацию против ГВ можно проводить одновременно с вакцинами календаря профилактических прививок. Отмечено также, что по показателям иммунологической эффективности она не уступает другим дрожжевым рекомбинантным вакцинам и может с успехом применяться для широкого охвата вакцинацией «групп риска» заражения вирусом ГВ целях снижения заболеваемости и носительства вируса, а также сокращении таких заболеваний как цирроз печени и первичный рак печени. Специальными исследованиями была показана стерильность препарата, которая сохранялась в условиях многократного забора вакцины из флаконов, содержащих несколько прививочных доз, а также при хранении оставшихся объемов в режиме 2-8 0С. Было показано, что степень специфического иммунного ответа к препарату НВВакс зависит от кратности введения вакцины и исходного уровня Т-лимфоцитов: при низких показателях сила иммунного ответа была ниже, чем при высоких. Отмечается, что введение вакцины H-B-Vax-II в сочетании с вакцинами против кори, эпидемического паротита, АКДС и полиомиелита нормализует показатели Тлимфоцитов, оказывает неспецифическое иммуномодулирующее влияние; имеется тенденция к нормализации изначально сниженного уровня IgG. Совместное применение живой полиомиелитной вакцины с НВ-Вакс усиливало специфический иммунный ответ к HBsAg. Заключение. Литература. 1. Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики и лечения инфекционных заболеваний: Справочник / [Министерство здравоохранения Российской Федерации, Федеральное гос. унитарное предприятие «Янтер СЭН»; Сост. Ю.К. Зацепин и др.]. – М.; ФГУП «Янтер СЭН», 1998. – 320 с. 2. Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 105-летию Пермского научно-производственного объединения «Биомед», 17-18 июня 2003 г. / [Pедкол.: Онищенко Г.Г. – акад. РАМН, д.м.н. (отв. ред.) и др.]. – Пермь: Б.Л., 2003 (ИПК Звезда). – 370, [1] с.: ил. 3. Петров, Рэм Викторович. Иммуногены и вакцины нового поколения – Р.В. Петров, Р.М. Хаитов. – Москва: Гэотар-Медиа, 2011. 4. Кржечковская, Валерия Владимировна. Лекарственные средства и иммунная система. Вакцины: учебное пособие для студентов образоват. учр. средн. проф. обр-я, обуч. в медколледжах. – Ростов-на-Дону 5. Костинов, Михаил Юрьевич, Гурвич Э.Б. Вакцины нового поколения в профилактике инфекционных заболеваний. - Москва
