Среды для испытания антибиотиков

Среды для испытания антибиотиков
Antibiotic Assay Media
Среды используются в микробиологических исследованиях по определению различных
антибиотиков в продуктах фармации, пищевых продуктах и др. Ниже представлен список
имеющихся сред.
Antibiotic Assay Medium
No36 (M290)
Рост на среде без антибиотиков
1 (М003)
Antibiotic Assay Medium
No. 1 (Seed Agar)
Среда для испытания
антибиотиков N 1
(Посевной, «верхний»,
агар)
2 (М005)
13 (М101)
Antibiotic Assay Medium
No. 4 (Yeast Agar)
Среда для испытания
антибиотиков N 4
(Дрожжевой агар)
Antibiotic Assay Medium
5 (М006) No. 5 (Streptomicin
Assay Agar)
Среда для испытания
антибиотиков N 5
(Стрептомициновый
агар)
Antibiotic Assay Medium
6 (М223)
No. 6
14 (М1141)
Antibiotic Assay Medium
No. 8
Среда для испытания
антибиотиков N 8
Antibiotic Assay
Medium No. 32
Среда для
испытания
антибиотиков N 32
15 (М797)
Antibiotic Assay
Medium No. 34
Среда для
испытания
антибиотиков N 34
16 (М798)
Antibiotic Assay
Medium No. 35
Среда для
испытания
антибиотиков N 35
17 (М290)
Antibiotic Assay
Medium No. 36
Среда для
испытания
антибиотиков N 36
Среда для испытания
антибиотиков N 6
7 (М041)
Antibiotic Assay
Medium No. 19
Среда для
испытания
антибиотиков N 19
Antibiotic Assay Medium
No. 3 (Assay Agar)
Среда для испытания
антибиотиков N 3
(Исследовательский
агар)
4 (М140)
Среда для
испытания
антибиотиков N 13
(Нистатиновый
бульон)
Antibiotic Assay Medium
No. 2 (BaseAgar)
Среда для испытания
антибиотиков N 2
(Основной, «нижний»,
агар)
3 (М042)
Antibiotic Assay
Medium No. 13
12 (М254)
(Nystatin Assay
Broth)
18 (М011)
Antibiotic Assay
Medium No. 37
Среда для
испытания
Antibiotic Assay Medium
8 (М147) No. 9 (Polymyxin Base
Agar)
антибиотиков N 37
19 (М799)
Среда для испытания
антибиотиков N 9
(Полимиксиновый агар,
«нижний»)
Antibiotic Assay Medium
9 (М225) No. 10 (Polymyxin Seed
Agar)
Среда для испытания
антибиотиков N 10
(Полимиксиновый агар,
«верхний»)
Среда для
испытания
антибиотиков N 38
20 (М1142)
Antibiotic Assay
Medium No. 39
Среда для
испытания
антибиотиков N 39
21 (М1143)
Antibiotic Assay
Medium No. 40
Среда для
испытания
антибиотиков N 40
Antibiotic Assay Medium
10 (М004) No. 11 (Neomycin,
Erytromycin Assay Agar)
Среда для испытания
антибиотиков N 11
(Агар для определения
неомицина или
эритромицина )
Antibiotic Assay
Medium No. 38
22 (М1144)
Antibiotic Assay
Medium No. 41
Среда для
испытания
антибиотиков N 41
Antibiotic Assay Medium
11 (М280) No. 12 (Nystatin Assay
Agar)
Среда для испытания
антибиотиков N 12
(Нистатиновый агар)
Состав сред для испытания антибиотиков (грамм/литр)
Среды для испытания антибиотиков (N)
Ингреди
1
енты
Коды
I.P.>
2
3
4
A B C
5
E
6
8
9 10 11 12 13 19 32 34 35 36 37 38 39 40 41
F H
Пептиче
ский
6, 6, 5, 6, 6,
6,
перевар
–
–
0 0 0 0 0
0
животно
й ткани
D
–
G
–
–
–
17
17 17 4,
–
–
,0
,0 ,0 0
Папаино
вый
гидролиз –
ат соевой
муки
–
–
–
3,
3, 3,
–
–
0
0 0
Дрожжев
3, 3, 1, 3, 3,
3,
ой
–
–
0 0 5 0 0
0
экстракт
–
J
6, 10 10 9, 6, 10 10
0 ,0 ,0 4 0 ,0 ,0
Гидроли
4,
зат
–
0
казеина
–
I
4,
0
15 17
,0 ,0
2, 9,
5 0
5, 3, 5,
0 0 0
–
3, 5,
0 0
15 5, 2,
,0 0 5
4, 3,
7 0
1, 20 5,
5 ,0 0
Мясной 1, 1, 1, 1, 1,
1,
–
–
экстракт 5 5 5 5 5
5
–
1, 2,
5 5
2, 1, 10 10
4 5 ,0 ,0
Глюкоза
1,
1, 1,
2,
2, 2, 1, 10 20 10 1,
–
–
–
0
0 0
5
5 5 0 ,0 ,0 ,0 0
Натрия
хлорид
–
–
3,
–
5
–
5,
5, 5,
10
–
–
0
0 0
,0
Натрия
гидрофос –
фат
–
3,
–
68
–
2,
2, 2,
–
–
5
5 5
10
,0
1,
5
5, 2, 5, 1, 10 20
0 5 5 0 ,0 ,0
3, 3,
0 0
5, 4, 3,
0 0 5
–
Натрия
цитрат
10
,0
Натрия
сульфит
0,
2
Калия
гидрофос
фат
Калия
дигидро
фосфат
2,
5
–
–
1,
–
32
–
–
–
–
–
–
–
Марганц
а
–
сульфат
–
–
–
–
0,
–
03
–
–
–
–
Твин-80
(полисор –
бат)
–
–
–
–
–
–
10
–
,0
–
Агарагар
–
15 15
15 15
15 20 12 15 25
–
–
,0 ,0
,0 ,0
,0 ,0 ,0 ,0 ,0
1,
0
1, 2, 1,
32 0 0
0,
3
0,
1
23 15
,5 ,0
17 15
,0 ,0
15
,0
10
,0
0,
7
Lцистеин
Глицери
н
3,
68
10 10
,0 ,0
Значение
6, 6, 7, 6, 7, 7, 5, 7, 7, 8, 6, 5, 6, 6, 7, 7, 7, 7, 7, 7, 6, 6,
рН
6 6 0 6 9 0 9 2 2 3 0 6 1 6 0 0 3 3 0 9 7 8
(25°С)*
Навеска 30 25 17 26 25 30 25 50 52 30 62 30 60 30 33 50 40 30 45 17 47 46
(г/л)
,5 ,5 ,5 ,5 ,5 ,0 ,5 ,0 ,0 ,5 ,5 ,0 ,0 ,8 ,0 ,0 ,0 ,0 ,4 ,5 ,1 ,0
Примечание: * допустимые отклонения от указанного значения ± 0,2
Приготовление:
Размешать соответствующее количество порошка (см.таблицу) в 1000 мл
дистиллированной воды. Подогреть до полного растворения частиц. Стерилизовать
автоклавированием при 1 атм (121°С) в течение 15 мин или следовать указаниям,
изложенным на этикетке соответствующей среды.
Принцип и оценка результата:
Указанные среды используются для проведения исследований с антибиотиками. Суть и
детали этих исследований изложены в исчерпывающем труде Grove и Randall (1).
Исследования с применением жидких сред ранее описаны Schmidt и Moyer (2). Среды для
испытания антибиотиков готовятся согласно указаниям, приведенным в американской
Фармакопее (3, 4) и других официальных документах (5). Среду N 19 готовят по прописи
Kirshbaum и Areet (6). Применение данных сред гарантирует получение соответствующих
зон задержки роста у референс-штаммов. При этом необходимо тщательно соблюдать все
условия проведения исследований. Применение стандартных питательных сред является
одним из важнейших условий для получения адекватных результатов.
Источниками необходимых питательных веществ и факторов роста в средах служат такие
ингредиенты, как пептический перевар животной ткани, гидролизат казеина и/или
папаиновый перевар соевой муки, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и др. Натрия
хлорид обеспечивает необходимое осмотическое давление, фосфаты – буферность
(противодействие сдвигу рН). В некоторых средах в качестве источника углерода и
энергии присутствует глюкоза. Такие ингредиенты, как сульфат марганца, сульфит
натрия, L-цистеин, твин-80, добавлены в некоторые среды в соответствии с
питательными потребностями культивируемых микроорганизмов.
Методы исследования
1. Метод цилиндров.
Впервые метод был предложен Abraham и соавт. (7), а затем модифицирован Schmidt и
Moyer (2). Суть метода заключается в том, что антибиотик диффундирует из стальных
полых цилиндров, установленных вертикально на поверхность засеянного агара. В
результате вокруг цилиндра формируется зона задержки роста, величина которой
пропорциональна концентрации антибиотика. Обычно этот метод используют для
испытания фармпрепаратов пенициллина и других антибиотиков. Для испытания
применяют круглые чашки Петри размером 20 х 100 мм и полые стальные или
фарфоровые цилиндры длиной 10 мм, имеющие внешний диаметр 8 мм и внутренний
диаметр 6 мм (± 0,1 мм). Цилиндры должны быть абсолютно чистыми. При исследовании
двухслойным методом посевной (верхний) агар, содержащий тест-культуру, надо вносить
после полного затвердевания агаровой основы (нижнего слоя). В большинстве случаев
для формирования нижнего слоя требуется 21 мл среды, посевного слоя – 4 мл. На 1
чашку обычно устанавливают до 6 цилиндров, на одинаковом удалении друг от друга и
от края чашки.
2.Метод лунок.
В засеянном агаре специальным устройством вырезают лунки, в которые затем вносят
растворы антибиотиков. Технология испытания подобна методу цилиндров.
3.Метод бумажных дисков.
Бумажные диски диаметром 9 мм пропитывают раствором антибиотика и накладывают
на засеянную питательную среду. Антибиотик можно также нанести на диск, уже
помещенный на питательную среду. Для данных исследований можно использовать
чашки с толщиной агара 2 мм. Последующие этапы подобны описанным в методе
цилиндров. В зависимости от требуемого значения рН можно использовать либо среду N
2, либо среду N 5.
4.Метод серийных разведений.
Антимикробную активность антибиотика можно определять количественно через
минимальную ингибирующую концентрацию (МИК). Для этого надо использовать тесткультуру с известной чувствительностью к определенному антибиотику (величиной
МИК). Из испытуемого раствора антибиотика готовят серийные (например, двукратные)
разведения в одной из указанных жидких сред. Затем в каждое разведение вносят
определенное количество тест-культуры. Пробирка с последним разведением, где
наблюдается отсутствие мутности (подавляется рост тест-культуры), указывает на
активность антибиотика в концентрации, соответствующей величине МИК.
5.Турбидиметрический метод.
Метод основан на измерении мутности в среде с определенной концентрацией
антибиотика, что зависит от степени подавления роста тест-культуры. Преимущество, по
сравнению с методом цилиндров, состоит в более коротком инкубировании (3-4 ч). Для
испытаний используют абсолютно чистые пробирки размером 18 х 150 мм. В них готовят
рабочие разведения стандартных («эталонных») препаратов антибиотиков в
определенных концентрациях. Затем к 1 мл каждой концентрации добавляют 9 мл
засеянного бульона. Одновременно тестируют таким же образом приготовленные
растворы испытуемого препарата. Инкубирование пробирок ведут в водяной бане при
соответствующей температуре в течение 3-4 ч. Затем останавливают рост добавлением в
пробирку 1 капли формалина и измеряют на спектрофотометре степень прозрачности
растворов. Концентрацию антибиотика в пробе определяют после сравнения с
результатами испытания «эталонного» препарата.
Выбор питательной среды и референс-штаммов: данные представлены в таблице (см.
ниже).