Регистрация в реальном времени отклика опухолевых клеток на

УДК 535(06)+004(06)
И.В. КЛЕМЯШОВ, В.П. ТЫЧИНСКИЙ
Московский государственный институт радиотехники, электроники и
автоматики (технический университет)
РЕГИСТРАЦИЯ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ОТКЛИКА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК НА ВНЕШНИЕ
ФАКТОРЫ ПО ПАРАМЕТРАМ ИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ НА КОГЕРЕНТНОМ ФАЗОВОМ
МИКРОСКОПЕ
Ядрышки – внутриядерные компартменты, в которых осуществляется биогенез рибосом, в частности,
транскрипция генов, кодирующих рибосомальные белки. Ядрышки – динамичные образования: их
структурно-функциональная организация изменяется в ответ на разнообразные воздействия. Эти изменения
составляют важный компонент реакции клеток на стресс – совокупности процессов, обусловливающих их
адаптацию к внешним воздействиям или гибель. Использована линия трансформированных клеток
человека: HCT116 (рак толстой кишки).
Ранее в работах совместно с лабораторией д.м.н. А.А. Штиля (ГУ Российский онкологический научный
центр им. Н.Н. Блохина РАМН) была показана принципиальная возможность изучения методом
когерентной фазовой микроскопии (КФМ) “ядрышкового стресса” – совокупности структурнофункциональных изменений ядрышек при действии на клетки фармакологических соединений, являющихся
непосредственными ингибиторами генной транскрипции – актиномицина Д и оливомицина [1, 2]. Метод
КФМ регистрирует изменения оптических параметров ядрышек уже в первые минуты воздействия
указанных ингибиторов.
Принцип КФМ состоит в измерении локального значения оптической разности хода (оптической
толщины ОТ) h(x, y) в нормированных на длину волны численных значениях, которая связана с
показателями преломления объекта n(x,y,z) и внешней среды n0 соотношением:
h(x, y) = [n(x,y,z) - n0]dz
При сдвиге осмотического равновесия (рис. 1) на выбранной нативной клетке проводились непрерывные
измерения фазовых изображений до и после добавления 20% воды к модифицированной Дальбекко
питательной среде Игла. В течение 30 мин произошла диссоциация ядрышка (Я) (рис. 1а). Интенсивные
флуктуации ОТ (соответствуют активному процессу) наблюдались в виде расходящегося от центра Я
сферического фронта (рис. 1б), причем максимум соответствует центральной части, куда в момент
активного процесса сегрегации за счёт осмотического давления начинала поступать вода. Проведенные
расчёты показали, что на месте Я образовалась водная вакуоль.
Рис. 1. Динамика структурных изменений ядрышка при гипотонической реакции: трёхмерные фазовые
изображения части опухолевой клетки (а), увеличенные в масштабе области флуктуаций оптической
толщины, соответствуют 20 и 30 мин (б)
Изучение оптических параметров [3] проведено при действии на клетки прямых фармакологических
блокаторов транскрипции и в результате опосредованного влияния на ядрышки - при нарушениях
энергетического метаболизма, разборке микротрубочек, снижении пула внутриклеточного АТФ (таблица 1).
Снижение ОТ ядрышка есть проявление общей реакции клетки на разнообразные нарушения ее
метаболизма. Из этого следует, что неинвазивный метод КФМ выявляет важную связь физических
параметров и морфо-функционального состояния микрообъектов: эти параметры количественно описывают
УДК 535(06)+004(06)
совокупность процессов, составляющих “ядрышковый стресс”. Контролем служили данные, полученные на
электронном микроскопе JEM-1200 EX-II (Япония).
Таблица 1
Линия клеток HCT116
Параметры
ядрышка
Ротенон
Афидиколин
Винкристин
50 мкМ +SF
10 мкМ
1 мкМ
Контроль
Олигомицин
10 мкМ
5 мкМ
Средняя оптическая
толщина
<Δh>, нм
80
45
50
20
40
Средняя рефрактерность
<Δn>
0,040
0,025
0,025
0,020
0,015
Эксперимент при темновой
излучении He-Ne лазера (НИЛИ
показал,
что
ядрышко
и
первые минуты начала облучения.
возросла на 60 нм и вернулась к
течение 20 мин. (Этот эффект
скручивания-раскручивания
фибрилллярной части Я). Фазовая
20 нм. Это можно объяснить
НИЛИ)
оптических
свойств
служил дефект на подложке,
паузе
в
низкоинтенсивном
около 0,5 мВт/мм2) с λ=633 нм
цитоплазма среагировали уже в
Фазовая
высота
ядрышка
первоначальному значению в
возможно связан с процессом
хромосом,
уплотнением
высота цитоплазмы менялась на
изменением
(энергизацией
митохондрий.
Контролем
высота которого не менялась.
Список литературы
1. Тычинский В.П.,
Кретушев А.В., Клемяшов И.В.
и др. Когерентная фазовая микроскопия – новый подход к исследованию физиологического состояния
ядрышка // Докл. РАН, серия Биофизика, Биохимия и Мол. Биология, 405(4), 2005.
2. Тычинский В.П., Кретушев А.В., Клемяшов И.В. и др. Исследование оптических параметров ядрышек
при действии ингибиторов транскрипции методом когерентной фазовой микроскопии // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины, 142(10), 465-470 (2006).
3. Tychinsky V.P., Kretushev A.V., Klemyashov I.V., et.al. Quantitative Real Time Analysis of the аnalysis of
the ‘Nucleolar Stress’ by Coherent Phase Microscopy 2008, J. Biomed Opt, 2008; 13(6),1205-1214.