(4) строение нуклеиновых кислот

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ
УЗБЕКИСТАН
ТАШКЕНТСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
«УТВЕРЖДАЮ»
Проректор по учебной части ТМА
профессор _________ О. Р. Тешаев
«____» ______________ 2008 г.
2009 й
Кафедра: БИООРГАНИЧЕСКОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ
Предмет: БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
ТЕМА:
Строение нуклеиновых кислот
__________________________________________________________________
Учебно-методическая разработка
(Для преподавателей и студентов высших медицинских учебных
заведений)
Ташкент-2009
Составители: доцент М.А.Атаходжаева
профессор А.А.Хожиметов
Рецензенты: профессор Соатов -заведующий кафедрой биохимии ТашПМИ
Шарипова П.А -доцент кафедры нормальной и
патологической
анатомии ТМА
Утверждено на заседании цикло-предметной
комиссии по медико-биологическим
дисциплинам Ташкентской медицинской
академии 19 марта 2009 года(протокол%4)
2
Тема: Строение нуклеиновых кислот
1.Место проведения занятия, оснащение:
-кафедра биоорганической и биологической химии , учебная
аудитория;
-показательные плакаты и баннеры;
-таблицы;
-раздаточные материалы;
-комплект реактивов;
-комплект лабораторной посуды;
-ТВ мультимедиа ,кодоскоп.
2.Продолжительность занятия:
-4часа
3.Цели занятия:
Объяснить студентам строение нуклеиновых кислот ДНК, РНК,
основные нуклеотиды клетки, первичную, вторичную и третичную структуру
нуклеиновых кислот, коэффициент специфичности нуклеиновых кислот,
денатурацию и ренативацию нуклеиновых кислот, ДНК-ДНК, ДНК-РНК
гибридизацию, хроматин ,строение рибосом, нуклеосомы и их значение в
синтезе белка.
Задачи
Студент должен знать:
-строение ДНК, РНК
-основные нуклеотиды клетки
-первичную, вторичную и третичную структуру нуклеиновых кислот
-коэффициент специфичности нуклеиновых кислот
-денатурацию и ренативацию нуклеиновых кислот
-ДНК-ДНК, ДНК-РНК гибридизацию
-хроматин, строение рибосом, нуклеосомы и их значение в синтезе
белка
Студент должен уметь:
Выполнение лабораторной
компоненты нуклеопротеинов
работы:
Качественная
реакция
на
4.Мотивация
Знание строения свойств и значения нуклеиновых кислот, основных
нуклеотидов клетки, необходимы для понимания передачи наследственной
информации , значения обеспечения организма энергией , изучить
биохимические основы развития заболеваний связанных с их нарушением и
методы их лечения. Эти значения очень необходимы для практики врачей
общего профиля для правильной постановки диагноза и их лечения
3
5.Межпредметные и внутрипредметные связи
Знание студентов о строении , свойствах и функции нуклеиновых
кислот основываются на полученных знаниях по биологии и
биоорганической химии .Эти знания нужны для усвоения патологической
физиологии , патологической анатомии, фармакологии, терапии хирургии и
других клинических дисциплин.
6.Содержание занятия:
6.1 Теоретическая часть
Строение нуклеиновых кислот
1. Нуклеиновые кислоты: ДНК, РНК. Основные нуклеотиды клетки
Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) относятся к сложным
высокомолекулярным соединениям, состоят из небольшого числа
индивидуальных химических компонентов более простого строения. Так, при
полном гидролизе нуклеиновых кислот (нагревание в присутствии хлорной
кислоты) в гидролизате обнаруживают пуриновые и пиримидиновые
основания, углеводы (рибоза и дезоксирибоза) и фосфорную кислоту :
В молекуле ДНК углевод представлен дезоксирибозой, а в молекуле
РНК – рибозой, отсюда их названия: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и
рибонуклеиновая (РНК) кислоты. Кроме того, они содержат фосфорную
кислоту, по два пуриновых и по два пиримидиновых основания; различия
только в пиримидиновых основаниях: в ДНК содержится тимин, а в РНК –
урацил. В составе ДНК и РНК открыты так называемые минорные
(экзотические) азотистые основания (строение некоторых из них приводится
далее).
Углеводы (рибоза и дезоксирибоза) в молекулах ДНК и РНК находятся
в β-D-рибофуранозной форме:
4
В составе некоторых фаговых ДНК обнаружена молекула глюкозы,
которая соединяется гликозидной связью с 5-оксиметилцитозином.
Основу структуры пуриновых и пиримидиновых оснований составляют
два ароматических гетероциклических соединения – пиримидин и пурин :
Молекула пурина состоит из двух конденсированных колец:
пиримидина и имидазола.
В составе нуклеиновых кислот встречаются три главных
пиримидиновых основания: цитозин, урацил и тимин.
Два пуриновых основания, постоянно встречающихся в гидролизатах
нуклеиновых кислот, имеют следующее строение:
О локализации и количественном содержании нуклеиновых кислот в
клетках получены определенные данные. Доказано, что количественное
содержание ДНК в клетках одного и того же организма отличается
удивительным постоянством и исчисляется несколькими пикограммами,
однако в клетках разных видов живых организмов имеются существенные
количественные различия в содержании ДНК. Хорошо известно также, что
ДНК преимущественно сосредоточена в ядре, а в митохондриях и хлоропластах содержится только небольшой процент клеточной ДНК. О
количестве РНК нет точных данных, поскольку содержание ее в разных
клетках в значительной степени определяется интенсивностью синтеза белка.
На долю РНК приходится около 5–10% от общей массы клетки. Современная
классификация различных типов клеточной РНК основывается на данных
топографии, функции и молекулярной массы.
2. Первичная, вторичная и третичная структура нуклеиновых кислот
Первичная структура. Под первичной структурой нуклеиновых
кислот
понимают
порядок,
последовательность
расположения
мононуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК и РНК. Такая цепь
стабилизируется 3',5'-фосфодиэфирными связями. Поскольку молекулярная
5
масса нуклеиновых кислот колеблется в широких пределах (от 2•104 до
1010–1011), установить первичную структуру всех известных РНК и
особенно ДНК весьма сложно. Тем не менее во всех нуклеиновых кислотах
(точнее, в одноцепочечной нуклеиновой кислоте) имеется один и тот же тип
связи – 3',5'-фосфодиэфирная связь между соседними нуклеотидами. Эту
общую основу структуры можно представить следующим образом:
Установлено, что в образовании межнуклеотидной связи участвуют
гидроксильные группы в 3'- и 5'-положениях остатков углевода.
К настоящему времени удалось определить первичную структуру
почти всех тРНК, ряда молекул 5S рРНК, 16S рРНК E.coli, вирусных РНК, в
состав которых входят сотни и тысячи нуклеотидных остатков. Ниже
приводится примерная схема последовательности нуклеотидов в молекуле
РНК. Все клеточные РНК в основном состоят из одноцепочечной полинуклеотидной цепи:
5'-Г–У–Г–Ц–А–А–...–У–Ц–Г–Ц–Ц–А–3'
Полинуклеотидная цепь молекулы РНК имеет на одном конце почти
всегда свободный монофосфорный эфир, который принято обозначать как 5'конец; на противоположном конце цепи такой фосфат отсутствует, а
содержится нуклеотид со свободными 2'- и 3'-гидроксильными группами.
Следует особо указать на две существенные особенности первичной
структуры всех тРНК. Первая из них заключается в том, что 5'-концом всегда
является гуаниловая (редко цитидиловая) кислота, несущая свободный
остаток фосфата у С-5'. Вторая особенность – наличие на противоположном
конце молекулы остатков трех мононуклеотидов с одинаковой
последовательностью – ЦЦА, причем остаток адениловой кислоты содержит
свободную 3'-ОН-группу.
Ниже
представлены
три
варианта
схемы
нуклеотидной
последовательности ДНК:
В последнее время о первичной структуре ДНК (точнее, отдельных ее
фрагментов) судят по ряду косвенных данных, например, по степени
сплоченности нуклеотидных звеньев в молекуле ДНК (определение сводится
в конечном счете к выяснению числа и структуры отдельных фракций
6
нуклеотидов, так называемых изоплитов), также по кинетике реассоциации
ДНК (метод позволяет выяснить наличие в молекуле повторяющихся
последовательностей нуклеотидов). О первичной структуре ДНК судят,
кроме того, по распределению минорных оснований (имеются данные о
существовании подобной закономерности).
Вторичная структура. В соответствии с моделью Дж. Уотсона и Ф.
Крика, предложенной в 1953 г. на основании ряда аналитических данных, а
также рентгеноструктурного анализа молекула ДНК состоит из двух цепей,
образуя правовращающую спираль, в которую обе полинуклеотидные цепи
закручены вокруг одной и той же оси. Удерживаются цепи благодаря
водородным связям, образующимся между их азотистыми основаниями. Обе
цепи поли-нуклеотидов в биспиральной молекуле ДНК имеют строго
определенное пространственное расположение, при котором азотистые
основания находятся внутри, а фосфорильные и углеводные компоненты –
снаружи.
Схематическое изображение двойной спирали ДНК. а - по Уотсону и
Крику : с - остаток дезоксирибозы, р - остаток фосфорной кислоты; б - Афор-ма ДНК; в - В-форма ДНК.
Обе цепи в молекуле ДНК имеют противоположную полярность. Это
означает, что межнуклеотидная связь в одной цепи имеет направление 5'–>3',
а в другой – 3'–>5'. Подобная направленность цепей имеет важное
биологическое значение при репликации и транскрипции молекулы ДНК.
Менее охарактеризована вторичная структура матричных и
рибосомных РНК. Относительно вторичной структуры тРНК наиболее
вероятной представляется модель, предложенная Р. Холли, плоское
изображение которой напоминает клеверный лист:
7
В настоящее время, когда известна первичная структура большинства
тРНК, последовательность всех или почти всех природных тРНК как будто
бы укладывается в эту схему «клеверного листа». При сравнении этих
структур выявляется ряд закономерностей, несомненно, имеющих
определенный биологический смысл. Во всех тРНК есть участки,
взаимодействующие с рибосомами, места для связывания с аминокислотами
и ферментами, а также специфическая последовательность трех нуклеотидов
(триплет), называемая анти-кодоном, которая оказывается комплементарной
тринуклеотидной последовательности мРНК (кодону), кодирующей
включение в белковую молекулу определенной аминокислоты.
Независимо от типа РНК синтезированный в клетке продукт
транскрипции всегда представлен единственной цепью, упакованной во
вторичную структуру не случайно, а в соответствии с программой ДНК.
Поскольку в составе РНК имеются свободные 2'-оксигруппы рибозы, не
связанные со стандартным крик-уотсоновским спариванием азотистых
оснований, появляются дополнительные возможности образования
вторичной и третичной структур, содержащих выпуклости, шпильки, или
крестообразные структуры. Особенности структуры тРНК имеют прямое
отношение к процессу трансляции.
Третичная структура. Образование кольцевой формы молекулы ДНК
у бактерий или в митохондриях клеток животных часто вызвано
ковалентным соединением их открытых концов. Известно, что
суперспиральная (суперскрученная) структура обеспечивает экономную
упаковку огромной молекулы ДНК в хромосоме: вместо 8 см длины,
которую она могла бы иметь в вытянутой форме, в хромосоме человека
молекула ДНК настолько плотно упакована, что ее длина составляет 5 нм.
Обычно в ДНК встречаются положительные и отрицательные супервитки,
образованные за счет скручивания по часовой (правосторонней) или против
8
часовой стрелки двойной спирали. Образование подобных супервитков
катализируется специфическими ферментами, получившими название
топоизомераз. Подобные суперспирали соединяются с белками (гистонами),
упакованными в бороздках, обеспечивая тем самым стабильность третичной
структуры ДНК. Степень суперспираль-ности (наличие супервитков)
молекулы ДНК обычно устанавливают по изменению константы
седиментации в определенных условиях. Суперспи-рализация ДНК может
быть нарушена разрывом в одной из цепей или в обеих цепях двойной
спирали под действием ДНКазы или при обработке интеркалирующими
соединениями. Под интеркаляцией подразумевают встраивание плоских
ароматических колец между стопками пар азотистых оснований ДНК.
Интеркаляция может быть вызвана антибиотиками и красителями; в
интактных клетках она может быть обусловлена ароматическими кольцами
амнокислот, что имеет, очевидно, определенный биологический смысл в
проблеме белково-нуклеинового узнавания.
Третичная структура ДНК (схема).
1 - линейная одноцепочечная ДНК - бактериофаг φХ174 и другие
вирусы; 2 - кольцевая одноцепочечная ДНК вирусов и митохондрий; 3 кольцевая двойная спираль ДНК.
Данные о структуре тРНК свидетельствуют о том, что нативные
молекулы тРНК имеют примерно одинаковую третичную структуру, которая
отличается от плоской структуры «клеверного листа» большой
компактностью за счет складывания различных частей молекулы. При
физиологических значениях рН среды, ионной силы и температуры
создаются условия для образования в одно-цепочечных матричных и
рибосомных РНК множества участков с двойной спиралью («шпильки») и
дальнейшего формирования комплементарных участков, определяющих в
известной степени жесткость их третичной структуры
9
Третичная структура РНК в растворе в зависимости от ионной силы,
температуры и рН среды (схема) (по А.С. Спирину и Л.П. Гаври-ловой). а компактная палочка, б - компактный клубок; в - развернутая цепь.
3. Коэффициент специфичности нуклеиновых кислот
Исследуя нуклеотидный состав нативных ДНК различного
происхождения, Чаргафф обнаружил следующие закономерности.
1. Все ДНК независимо от их происхождения содержат одинаковое
число пуриновых и пиримидиновых оснований. Следовательно, в любой
ДНК на каждый пуриновый нуклеотид приходится один пиримидиновый.
2. Любая ДНК всегда содержит в равных количествах попарно аденин
и тимин, гуанин и цитозин, что обычно обозначают как А=Т и G=C. Из этих
закономерностей вытекает третья.
3. Количество оснований, содержащих аминогруппы в положении 4
пиримидинового ядра и 6 пуринового (цитозин и аденин), равно количеству
оснований, содержащих оксо-группу в тех же положениях (гуанин и тимин),
т. е. A+C=G+T. Эти закономерности получили название правил Чаргаффа.
Наряду с этим было установлено, что для каждого типа ДНК суммарное
содержание гуанина и цитозина не равно суммарному содержанию аденина и
тимина, т. е. что (G+C)/(A+T), как правило, отличается от единицы (может
быть как больше, так и меньше ее). По этому признаку различают два
основных типа ДНК: А-Т-тип с преимущественным содержанием аденина и
тимина и G-C-тип с преимущественным содержанием гуанина и цитозина.
Величину отношения содержания суммы гуанина и цитозина к сумме
содержания аденина и тимина, характеризующую нуклеотидный состав
данного вида ДНК, принято называть коэффициентом специфичности.
Каждая ДНК имеет характерный коэффициент специфичности, который
может изменяться в пределах от 0,3 до 2,8. При подсчете коэффициента
специфичности учитывается содержание минорных Оснований, а также
замены основных оснований их производными. Например, при подсчете
коэффициента специфичности для ЭДНК зародышей пшеницы, в которой
содержится 6% 5-метилцитозина, Последний входит в сумму содержания
10
гуанина (22,7%) и цитозина (16,8%). Смысл правил Чаргаффа для ДНК стал
понятным после установления ее пространственной структуры.
4. Денатурация и ренативация нуклеиновых кислот
Денатурация и ренативация нуклеиновых кислот
5. ДНК-ДНК, ДНК-РНК гибридизация - соединение in vitro
комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу.
При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в
случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что
позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация
ДНК-ДНК и ДНК-РНК.
6. Строение хроматина, рибосом, нуклеосомы и их значение в синтезе
белка.
Новые технологические технологии, используемые на занятии:
«Мозговой штурм»
Сценарий: Для дискуссии выбирается одна тема. Студенты
высказывают свои мнения по данной теме. Выбирают секретаря. Похожие
мнения объединятся. Используется 5-7минут.
Неудовлетворительно ответы не оцениваются. Этот метод развивает
речь, усиливает воображения и расширяет у студента кругозор мышления.
Вопросы интерактивного метода:
1. Строение ДНК, РНК
2. Основные нуклеотиды клетки
3. Первичная, вторичная , третичная структура нуклеиновых кислот
4. Коэффициент специфичности нуклеиновых кислот
5. Денатурация и ренативация нуклеиновых кислот
6. ДНК-ДНК, ДНК-РНК гибридизация
7. Хроматин, строение рибосом, нуклеосомы и их значение в синтезе
белка
6.2Аналитическая часть
Ситуационные задачи:
1. Могут ли входить в состав ДНК и РНК нуклеиновые основания в
виде окси- и метил пиримидинов?Вчем заключается их биологическая
функция?
11
2. При участии каких химических связей образуются первичная ,
вторичная и третичная структура нуклеклеиновых кислот?
3. Под действием сильного химического вещества одной из цепочек
ДНК укорочена на одно азотистое основание. Репарирующая система может
исправить это изменение? А если обе цепочки укорочены на одно азотистое
основание?
6.3. Экспериментальная часть
Выполняемая лабораторная работа по теме:
№
Мероприятие
Не
Выполнено
выполнено полностью
(0 баллов) и правильно
Гидролизат готовится лаборантом. При гид
0
15
ролизе нуклеопротеидов образуется: белки,
пуриновые и пиримидиновые основания ,
фосфорная кислота, рибоза и дезоксирибоза
Наличие белка определяется биуретовой
0
15
реакцией. В пробирку наливаем 5 капель
гидролизата и 10 капель биуретового
реактива. Раствор приобретает
синефиолетовую окраску.
На нуклеиновые основания проводится реак
0
15
ция серебряного зеркала. В пробирку поме
щаем 10 капель гидролизата и добавляем 1
каплю концентрированного раствора аммиа ка
и 5 капель 1%-ногораствора гидрата сереб ра.
При стоянии выпадает осадок серебрян ых
соединений нуклеиновых оснований
На рибозу и дезоксирибозу проводят реак
0
15
цию Троммера. К 5 каплям гидролизата
добавляют 10 капель 30%-ного раствора
NaOH и 1-3 капли 7%-ного раствора сульфа та
меди. Жидкость перемешиваю
Молибденовая проба на H3PO4 . К 20 каплям
0
15
молибденового реактива добавляют 2-3 капли
гидролизата и кипятят несколько минут. В
присутствии фосфорной кислоты . Жидкость
окрашивается в лимонно-желтый цвет.
Итог к выводу исследования
40
Качественная реакция на компоненты нуклеопротеидов в гидролизате
дрожжей
10. Контрольные вопросы.
1. Из каких составных частей состоят нуклеиновые кислоты?
2. Как связаны между собой составные части нуклеиновых кислот?
12
3. Что является мономерным звеном нуклеиновых кислот?
4. Как связаны между собой мономерные звенья нуклеиновых кислот?
5. Какое значение имеют для организма моно-, ди- и трифосфаты
нуклеозидов?
6. Значение коэффициента специфичности нуклеиновых кислот для
организмов?
7. Денатурация и ренативация нуклеиновых кислот?
8. ДНК-ДНК, ДНК-РНК гибридизация и их значение для организмов?
9. Хроматин, строение рибосом , нуклеосомы и их значение в
биосинтезе белка?
11.Литература.
Основная:
1.А.Я.Николаев «Биологик киме» - Ташкент, 1992й.
2.Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин «Биологическая химия» - Москва 1990г.
3.Р.А.Собирова ва бошкалар. Биологик Киме – Т., 2006 (лотин)
Дополнительная:
1.А.Ленинжер и другие «Основы биохимии» 1,2,3 том, Москва 1985г.
2.А.Уайт и другие «Основы биохимии» 1,2,3 том, Москва 1981г.
3.Л.С.Страйер «Биолхимия» 1,2,3 том, Москва 1985г.
4.Д.Мецлер «Биолхимия» 1,2,3 том, Москва 1980г.
5. Ж.Крю «Биолхимия», Москва 1979г
6. Е.А.Строев «Биологическая химия» - Москва 1986г
7.А.Хорст «Молекулярные основы патогенеза» Москва 1992г
13
14
15
16