Блестящая идея Чалфи - Институт фундаментальной биологии
advertisement
Федеральное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Кафедра биофизики РЕФЕРАТ Нобелевская премия по химии 2008 года за открытие и развитие зеленого флуоресцентного белка, GFP. Студент ББ11-03М _______________ Красноярск 2012 И.М.Бородина Содержание Зелёный флуоресцентный белок ............................................................................................................... 3 Как зеленый свет медузы перевернул бионауку...................................................................................... 4 Зеленая флуоресценция в УФ излучении .................................................................................................. 5 Блестящая идея Чалфи ................................................................................................................................ 6 Неожиданное открытие .............................................................................................................................. 7 Тсиен создает палитру со всеми цветами радуги..................................................................................... 8 Мозговая луковица ..................................................................................................................................... 9 Опухоль в окружении питательных кровеносных сосудов ..................................................................... 9 GFP датчики для мышьяка и тяжелых металлов ....................................................................................10 Какие тайны еще предстоит решить ........................................................................................................10 Список используемых источников: ..........................................................................................................11 Шведская королевская академия наук решила присудить Нобелевскую премию по химии за 2008 год совместно Осаму Симомура, Мартину Чалфи и Роджеру У. Тсиен "За открытие и развитие зеленого флуоресцентного белка, GFP". Зелёный флуоресцентный белок (англ. green fluorescent protein, GFP) — белок, выделенный из медузы Aequorea victoria, который флуоресцирует в зелёном диапазоне при освещении его синим светом. В настоящее время ген белка широко используется в качестве светящейся метки в клеточной и молекулярной биологии для изучения экспрессии клеточных белков. Замечательный ярко светящийся зеленый флуоресцентный белок, GFP был впервые обнаружен в красивой медузе Aequorea Victoria в 1962 году. С тех пор, этот белок стал одним из наиболее важных инструментов, используемых в современных биологических науках. С помощью GFP, исследователи разработали способы, чтобы посмотреть процессы, которые ранее были невидимы, таких, как развитие нервных клеток в головном мозге или распространение раковых клеток. Десятки тысяч различных белков находятся в живом организме, контролируя важные химические процессы в мельчайших деталях. Если это неисправностей белка машин, болезни и болезни часто следуют. Вот почему было необходимо для биологических наук на карте роли различных белков в организме. В этом году Нобелевской премии по химии удостоились начальное открытие GFP и ряд важных событий, которые привели к его использованию в качестве пометки инструментом в биологических науках. С помощью ДНК-технологии, исследователи теперь могут связать GFP с другими интересными, но в остальном невидимыми белками. Этот светящийся маркер позволяет им смотреть движения, позиции и взаимодействия отмеченных белков. Исследователи также могут следить за судьбой различных клеток с помощью GFP: повреждение нервных клеток во время болезни Альцгеймера или как производящие инсулин бета-клетки, созданные в поджелудочной железе растущего эмбриона. Осаму Симомура впервые выделил GFP из медузы Aequorea Victoria, который дрейфует с токами от западного побережья Северной Америки. Он обнаружил, что этот белок светился яркозеленым под ультрафиолетовым светом. Мартин Чалфи показал значение GFP в качестве световойгенетической метки для различных биологических явлений. Роджер У. Тсиен внес вклад в наше общее понимание того, как GFP флуоресцирует. Он также расширил цветовую палитру, позволяющую исследователям дать различные белки и способность окрашивать клетки разными цветами. Это позволяет ученым одновременно прослеживать несколько различных биологических процессов. Как зеленый свет медузы перевернул бионауку В 1960-х гг. японский ученый Осаму Шимомура начал изучать светящиеся медузы Aequorea Victoria, что в последствии привело к перевороту в науке. Тридцать лет спустя, для изучения мельчайших строительных блоков, клеток, Мартин Шалфи использовал зеленый флуоресцентный белок медузы Aequorea Victoria. Сегодня же ученые способны изучить ранее невидемые биологические процессы с помощью белков Роджера Тсиена, которые светятся всеми цветами радуги. Когда ученые разрабатывают методы, чтобы помочь им увидеть то, что были когдато невидимым, исследования всегда имеет большой скачок вперед. Например, когда в 17 мвеке Антон ван Левенгук изобрел микроскоп - открылся новый мир. Ученые могли видеть бактерии, спермы и клетки крови. Вещи, о существовании которых раньше даже не подозревали. В 2008 году Нобелевской премии по химии удостоился подобный эффект в науке. Зеленый флуоресцентный белок, GFP функционирует в последнее десятилетие, как путеводная звезда для биохимиков, биологов, ученых-медиков и других исследователей. При возбуждении белка синим ультрафиолетовым светом можно наблюдать сильное зеленое свечение. С помощью GFP можно увидеть растущую раковую опухоль; развитие болезни Альцгеймера в мозге или рост патогенных бактерий. Еще более интересно использование GFP - исследователи могут исследовать процессы внутри отдельных клеток. Чем больше ученые знают о типе клеток, как она развивается и функций, тем больше шансов, что ученые могут разработать эффективные препараты с минимальными побочными эффектами. Изучение этого механизма очень сложно в маленьких клетках 0,02 мм. Наблюдения за строительными клетками: белками, жирными кислотами, углеводами и другими молекулами не под силу обычным микроскопам. Сложней прослеживать химические процессы в клетке, но именно на этом детальном уровне, ученые и должны работать. Когда исследователи поняли, как клетки начинают строительство новых кровеносных сосудов, например, они могут остановить раковые опухоли, приобретая питание и кислород в сосудистую систему. Это позволит предотвратить их рост. Химические процессы в клетках, как правило, регулируется белками. Есть десятки тысяч различных белков, каждый с различными функциями. При подключении GFP к одному из этих белков, исследователи могут получить жизненно важную информацию: могут видеть сами клетки, в частности белки, следить за их движениями, а так же прослеживать взаимодействия с другими белками. Сегодня, GFP является стандартным инструментом для тысячи исследователей во всем мире. История его открытия начинается в Японии в годы после Второй мировой войны. Осаму Симомура работал над казалось бы, невозможным проектом - выяснить, что остатки измельченных моллюсков Cypridina, смоченных водой испускают свечение. В дальнейшем Осаму Симмомура работал с белком, который в 37000 раз светился ярче, чем измельченные моллюски. Этот белок содержится в медузе Aequorea Victoria, внешний край которой светится синим светом. Медуза Aequorea victoria обитает в море у западного побережья Северной Америки (а). Биолюминесцентный орган медузы находится на краю "зонтик" (B и C). В 1961 г. Симомура и Джонсон собрали медуз в гавани на западном побережье Северной Америки. Они отрезали края медузы и прижали их через фильтр, чтобы получить то, что они называли "squeezate. Однажды, когда Симомура налил “squeezate” в раковину, она ярко вспыхнула. Он понял, что морская вода в раковине, содержит ионы кальция, которые вызвают химическую реакцию. Медуза вспыхнула зеленым светом, а края медузы светились синим светом. Джонсон и Shimomura в течение лета собрали сырье (голубую люминесцентную жидкость) из 10.000 медуз. Этот белок они назвали “Экворин”. Зеленая флуоресценция в УФ излучении В 1962 г. в научных публикациях Симомура и Джонсон впервые описали процесс, посредством которого был получен Экворин, они также отметили, что белок был изолирован, который имел слегка зеленоватый свечение в солнечном свете, желтоватое свечение от лампочки и флуоресцентный зеленый свет в УФ-излучении. Это был первый раз, когда кто-то описал GFP. Симомура и Джонсон назвали его зеленым белок, но позже он был назван зеленым флуоресцентным белком. В 1970-х гг. Симомура изучал флуоресценцию GFP. И обнаружил, что GFP содержит специальные хромофоры, химические группы, которые поглощают и излучают свет. При облучении УФ-светом, синий свет медузы попадает на хромофор GFP, который в свою очередь преобразует энергию в свет. В следующем этапе, хромофор уменьшает энергию - излучает зеленое свечение. Зеленый флуоресцентный белок, GFP состоит из 238 аминокислот, связанных вместе в длинную цепочку. Эта цепочка складывается в форме бочонка. Внутри бочонка находится 65, 66 и 67 аминокислотные остатки - хромофор, который поглощает УФ-ый синий свет, и флуоресцирует зеленым светом. В медузе, хромофор GFP просто преобразует синий свет от Экворина в зеленый. Вот почему медуза и Экворин светятся разными цветами. Революция GFP заключается в том, что белок не нуждается каких-либо добавках для свечения, в отличие от Экворина и других светящихся белков, которые требуют непрерывной подачи энергии от богатых молекул. Блестящая идея Чалфи Вторым удостоился Нобелевской премии по химии, Мартин Чалфи. Который в первый раз услышал о зеленом флуоресцентном белке в 1988 году на семинаре, посвященном светящимся организмам в Колумбийском университете в Нью-Йорке. В своей повседневной работе, Чалфи рассматривает по миллиметру аскариды Caenorhabditis elegans, это один из наиболее часто изучаемых организмов в мире. Оскарида состоит всего из 959 клеток, имеет мозг, стареет, а треть генов нематоды являются связанными с генами человека. C. Elegans – прозрачный организм и это свойство делает его важным для исследователей, чтобы изучать его органы под обычным микроскопом. В 1988 Чалфи понял, что зеленый флуоресцентный белок был бы фантастическим инструментом для отображения аскариды. Он будет выступать в качестве светящегося зеленого сигнала для различных видов деятельности в клетках аскариды. Чтобы в полной мере оценить идею Чалфи, необходимо знать некоторые основные факты о клеточной биологии. Как упоминалось ранее, различные белки выполняют почти все работы в клетках и существуют десятки тысяч белков в нашем организме. Хотя они выполняют очень много различных функций, все белки имеют одинаковое строение. Они состоят из 20 различных типов аминокислот, которые связаны друг с другом в длинные цепи. Длина цепи, последовательность аминокислот и структура отличают один белок от другого. Каждый ген описывает белок. Когда в клетке необходит тот или иной белок, активируется определенный ген, в результате чего клетка производит необходимые белки. Геном, вся наша ДНК, хорошо защищены внутри ядра клетки. Когда ген активирован, его информация копируется. Эта копия представлена в виде молекулы РНК. Копия гена осуществляется в цитоплазме, секция клетке, где сложные структуры, рибосомы, считывают информацию шаг за шагом. На основе того что "считает" рибосома соединяются аминокислоты в форме белка. Копия гена инсулина передается из ядра клетки в секцию клетки, цитоплазму. Тогда копия гена используется как образец для образования белка инсулина аминокислотами. Инсулин выделяется в кровоток, где прилипает к мышцам и жировым клеткам, которые поглощают и хранят сахар из крови. Идея Чалфи заключается в том, что при подключении гена GFP к различным переключателям гена или генов из других белков, он сможет активацию переключателей клеточных генов и сможет увидеть где различные белки были произведены Зеленый свет будет выступать в качестве маяка для проведения различных экспериментов. Неожиданное открытие Для того чтобы проверить свои идеи, Чалфи нужно было найти ген GFP в геноме Aequorea victoria . После нескольких исследований, Чалфи узнал, что исследователь Дуглас Прашер в ВудсХоле океанографического института в Массачусетсе уже начал искать ген GFP. Чалфи связался с Прашером и попросил его клонировать ген. Исследователь выделяет ген из генома организма и, с помощью ДНК-технологии, помещает его в одноклеточный организм, которым легче управлять. Обычно исследователи используют обычные кишечные бактерии, кишечную палочку. Они могут затем преобразовать бактерии в протеиновый завод по активации чужеродного гена. Пару лет спустя, Прашер послал ген GFP Чалфи. Затем Чалфи поручил аспиранту, Ойскирхену попытаться получить кишечную палочку для получения GFP. Около месяца спустя, Ойскирхен связывается с Чалфи. Она удалось! Они могли видеть в микроскоп, что бактерии светился зеленым, когда они разошлись с ультрафиолетовым светом. Это открытие лежит в основе революционных использований сегодняшнем GFP. Однако само открытие было весьма неожиданным. В начале 1990-х, ученые обычно предполагали, что естественно флуоресцирующие молекулы и пигменты (которые определяют цвет цветов, рыб и др. организмов) были произведены в клетках в несколько этапов. Каждый из этих шагов требует определенный белок для контроля химического производства. Многие эксперты считают, что несколько различных белков, необходимы для производства хромофора в GFP, но эксперимент Чалфи и Ойскирхена показали, что это предположение неправильное. Необходим только GFP. На следующей стадии, Чалфи помещал ген за промоутер, активнй в шести косательных рецепторах нейронов в C. Elegans. Результаты были опубликованы Чалфи и его коллегами в научном журнале Наука в феврале 1994 года. На титульной странице читатели могли увидеть образ C. Elegans, в котором нейроны сенсорного рецептора светились ярко-зеленым светом. Использование ДНК-технологий: Чалфи помещал ген GFP за ген переключатель, активный в шести касательных рецепторах нейронов в C. Elegans. А затем вводил ДНК-конструктор в гонады зрелых червей (а). Червь является гермафродитом и может оплодотворить себя. Ген GFP присутствует во многих из яйц червя (b). Яйца делятся, образуя новые особи, при этом касательные рецепторы нейронов светится зеленым в УФ-свете (с и d). На рисунке показаны два из этих нейрона (е). Тсиен создает палитру со всеми цветами радуги Роджер Тсиен внес наибольший вклад в революцию GFP тем, что он расширил палитру новыми цветами, которые дольше излучали свет и с большей интенсивностью. Начнем с того, Тсиен заметил как хромофорар GFP образуется химически в белок с длиной 238аминокислот. Ранее исследователи показали, что три аминокислоты в положении 65-67 вступают в химическую реакцию друг с другом в форме хромофора. Тсиен показал, что в этой химической реакции есть кислород и объяснил, как это может произойти без помощи других белков. С помощью ДНК-технологии, Тсиен сделал следующий шаг - обмен различными аминокислотами в разных частях GFP. Это привело к тому, что белок поглощал и излучал свет в других частях спектра. Экспериментируя с аминокислотным составом, Тсиен смог разработать новые варианты GFP, которые светят сильнее и разными цветами (голубым, синим и желтым). Именно так сегодня ученые могут выделить различные белки разными цветами, чтобы увидеть их взаимодействия. Однако ему так и не удалось произвести любой из оттенков красного цвета. Красный свет проникает в кожу и другие биологические ткани легче, чем другие и поэтому особенно полезен для исследователей, которые хотят изучать клетки и органы внутри тела. На данный момент, Михаил Матц и Сергей Лукьянов - два русских исследователя, стали участвовать в революции GFP. Они искали белки, подобные GFP в люминесцентных кораллах и обнаружил еще шесть белков: красный, синий и остальные зеленые. Желаемый красный белок, DsRed, к сожалению, больше и тяжелее, чем GFP. DsRed состоит из четырех аминокислотных цепочек вместо одной и менее используемый в качестве флуоресцентной связки в биологических процессах. Исследовательская группа Тсиена решила проблему реорганизации DsRed так, что белок в настоящее время стабилен и флуоресцирует в качестве одной аминокислотной цепи, которая легко может быть связана с другими белками. Исследовательская группа Тсиена также разработала белки с аппетитными названиями вроде mPlum, mCherry, mStrawberry, mOrange и mCitrine, в зависимости от цвета они светятся. Несколько других исследователей и компаний, также способствовали созданию новых цветов на этот растущей палитре. Так что сегодня, спустя 46 лет после Шимомуры, который писал о зеленом флуоресцентном белке, имеется калейдоскоп белков, подобных GFP, которые сияют всеми цветами радуги. Мозговая луковица Три из этих белков были использованы исследователями в захватывающем эксперименте. Мыши были генетически изменены производить различное количество желтого, голубого и красного цветов в нервных клетках их мозга. Это сочетание цветов похоже на то, как компьютер печатает принтером. В результате мозг мышей светился всеми цветами радуги. Исследователи могут послеживать нервные волокна из отдельных клеток в густую сеть в головном мозге. Исследователи назвали этот эксперимент "brainbow". Опухоль в окружении питательных кровеносных сосудов Ученые выкрасили три флуоресцентных белка в голубой, желтый и красный цвета, аналогичные тем, которые используются компьютером в принтере. Различные нейроны случайно производят разное количество белков. Мы можем различать отдельные нейроны в густой сети мышц мозга. Цветная опухоль молочной железы с DsRed и окружающие кровеносные сосуды с GFP. В этом эксперименте ученые обнаружили два белка, которые помогают груди распространять раковые клетки. Если ученые смогут нейтрализовать эти белки, то они также смогут остановить клетки от разрушения в области опухоли. GFP датчики для мышьяка и тяжелых металлов Зеленый флуоресцентный белок может также использоваться для биотехнических приложений, в том числе выявления мышьяка в воде скважин. Это огромная проблема в некоторых частях ЮгоВосточной Азии, где естественный мышьяк отравляет много тысяч людей. Исследователи генетически изменили мышьяк - резистентные бактерии, чтобы они светились зеленым светом в присутствии мышьяка. Ученые также изменили другие организмы, чтобы они светились зеленым при наличии взрывного тринитротолуола (ТНТ) или тяжелых металлов, такие как кадмий или цинк. В настоящее время есть даже GFP в игрушках, которые светятся в темноте. Какие тайны еще предстоит решить Когда Осаму Симомура начал изучать свечение организмов в море, он хотел понять, что заставило их светиться. Это типичный пример того, как фундаментальные исследования могут привести к неожиданному перевороту в науке. Однако одну тайну еще предстоит разгадать. Почему светится Aequorea victoria? Многие организмы, живущие в море, используют биологическое свечение, чтобы запутать своих врагов, привлечь пищу или соблазнять партнера. Но никто не знает, что заставило Aequorea victoria развить экворин и GFP. Осаму Симомура Мартин Чалфи Роджер У. Тсиен Японский гражданин. Родился в 1928 г. в Киото, Япония. Почетный профессор Морской биологической лаборатории (MBL), штат Массачусетс, США, и Бостонского университета Медицинской школы, Массачусетс, США. Гражданин США. Родился 1947 году в Чикаго, штат Иллинойс, США. Профессор биологических наук в Колумбийском университете, Нью-Йорк, США. Гражданин США. Родился 1952 году в Нью-Йорке, США. Профессор и исследователь Медицинского института Ховарда Хьюза, Университет Калифорнии, Сан-Диего, ЛаХойя, Калифорния, США. Список используемых источников 1) Сайт нобелевской премии. Код доступа: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ 2) Wikipedia, the free encyclopedia: свободная общедоступная многоязычная универсальная интернет-энциклопедия, поддерживаемая некоммерческой организацией «Фонд Викимедиа». Электрон. дан. (более 17 миллионов статей Википедии, на русском языке — 651 260 статей). режим доступа: http://en.wikipedia.org/wiki/Green_fluorescent_protein 3) Pieribone, V. A Glow in the Dark / V. Pieribone, D. F. Gruber // Cambridge, Massachusetts, and London, England, The Belknap Press, Harvard University Press. - 2005 4) Zimmer, M. Glowing Genes / M. Zimmer // Amherst, New York, Prometheus Books. – 2005 5) Более подробная информация о Нобелевской премии по химии за 2008 год. Код доступа: www.kva.se , http://nobelprize.org , www.nobelmuseet.se 6) SHIMOMURA, O. The discovery of aequorin and green fluorescent protein, Journal of Microscopy / O. SHIMOMURA // Journal of Microscopy. - January 2005. - Volume 217. - Issue 1. - pp.3–15. DOI: 10.1111/j.0022-2720.2005.01441.x 7) Shaner, N.C. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins / N.C. Shaner, M.Z. Lin, M.R. McKeown, P. A. Steinbach, K.L. Hazelwood, M.W. Davidson, R.Y. Tsien // Nature Methods. – 2008. - №5, pp.545 – 551. doi:10.1038/nmeth.1209 8) Фильм, показывающий как клетка производит GFP-меткой ВИЧ. Код доступа: www.nature.com/nature/journal/v454/n7201/suppinfo/nature06998.html 9) Сайт, описывающий переворот в изучении GFP. Код доступа: http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm 10) Shimomura, O. DISCOVERY OF GREEN FLUORESCENT PROTEIN, GFP / O. Shimomura// Nobel Lecture.8 December 2008. - Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA 02543, USA. Код доступа: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/shimomura_lecture.pdf 11) MLA style: "Osamu Shimomura - Autobiography". - Nobelprize.org. 22 Jan 2011. Код доступа: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/shimomura.html 12) MLA style: "Martin Chalfie - Autobiography". - Nobelprize.org. 22 Jan 2011. Код доступа: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/chalfie.html 13) Chalfie, M. GFP: LIGHTING UP LIFE / M. Chalfie // Nobel Lecture. - 8 December 2008. - Department of Biological Sciences, 1012 Fairchild, Columbia University, New York, NY 10027, USA. Код доступа: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/chalfie_lecture.pdf 14) MLA style: "Roger Y. Tsien - Autobiography". - Nobelprize.org. 22 Jan 2011. Код доступа: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/tsien.html 15) Tsien, R.Y. CONSTRUCTING AND EXPLOITING THE FLUORESCENT PROTEIN PAINTBOX / R.Y. Tsien // Nobel Lecture. - 8 December 2008. - Howard Hughes Medical Institute, University of California San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA 92093-0647, USA. Код доступа: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/chalfie_lecture.pdf
