Васильева З.Ж ., Берсимбаев Р.И. , Бекманов Б.О.

1
Васильева З.Ж1., Берсимбаев Р.И.2, Бекманов Б.О.2, Воробцова И.Е.1
СВЯЗЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ GSTM1 и GSTT1 С УРОВНЕМ
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ У РАБОЧИХ УРАНОВОГО
ПРОИЗВОДСТВА
Исследована связь полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 с уровнем
хромосомных аберраций у рабочих Целинного горно-химического комбината,
которые в результате профессиональной деятельности в течение 1-25 лет
контактировали с производными урана. В исследованных группах рабочих
наблюдалось достоверное, по сравнению с контролем (р<0,001), увеличение
частоты хромосомных аберраций, в основном за счет – парных ацентрических
фрагментов и одиночных фрагментов. Не выявлено взаимосвязи полиморфизма
генов GSTM1 и GSTT1 с уровнем цитогенетических нарушений.
В
процессе
профессиональной
деятельности
человек
подвергается
воздействию различных антропогенных факторов, как химической, так и
физической природы. Ключевая роль в метаболизме поступающих извне
соединений принадлежит системе детоксикации ксенобиотиков. Вариации в
активности ферментов детоксикации и индивидуальная чувствительность к
воздействию
токсических
агентов
обусловлена
полиморфизмом
генов,
кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков. Установлено, что
экспрессия полиморфных вариантов этого семейства генов непосредственно
регулируется
влияниями
средовых
факторов
химической
природы
[1].
Полиморфизм генов GSTM1 и GSTT1 является одним из факторов, влияющих на
2
частоту хромосомных аберраций при воздействии пестицидов, табачного дыма,
ароматических углеводородов и т.д., при этом «нулевой» генотип GSTM1
обусловливает увеличение частоты аберраций хроматидного типа, а полная
делеция по обоим генам: GSTM1 и GSTT1, ассоциируется с повышением частоты
аберраций хромосомного типа [2]. Изучение влияния генных полиморфизмов на
уровень
хромосомных
хроническому
повреждений
воздействию
чувствительность
в
когортах
ионизирующего
цитогенетических
лиц,
излучения
показателей
подвергающихся
может
как
увеличить
биомаркеров
генотоксического воздействия, а также помочь в идентификации групп риска. В
связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение роли
полиморфизма
генов
индивидуальном
глутатион-S-трансферазы
цитогенетическом
ответе
на
(GSTM1
и
хроническое
GSTT1)
в
воздействие
ионизирующей радиации.
Материалы и методы
Обследуемая
группа
состояла
из
100
рабочих
Целинного
горно-
химического комбината (ЦГХК) в г.Степногорск, Северного Казахстана, которые
в процессе профессиональной деятельности контактировали с производными
урана в течение 1-25 лет. В зависимости от профессионального стажа группа
рабочих была разделена на 2 подгруппы: со стажем работы от 1 до 12,5 лет (50
человек); и со стажем работы – от 12,5 до 25 лет (50 человек). Контрольную
группу составили 56 жителей Джамбулского района Алматинской области. Перед
взятием биопроб крови, совместно с медицинскими работниками проводили
анкетирование когорт, регистрируя: возраст, пол, профессиональный стаж,
наличие заболеваний.
Никто
из
терапевтическому
представителей
облучению,
не
контрольной
имел
группы
не
профессионального
подвергался
контакта
с
химическими и радиоактивными веществами. Контрольная и экспонированная
группа были выравнены по возрасту (+/- 5 лет); полу; национальности; в обеих
группах не было зарегистрировано серьезных заболеваний.
3
Пробы крови забирали из локтевой вены в стерильные пробирки с
гепарином для цитогенетического анализа и с ЭДТА - для молекулярногенетического. Пробирки в специальном контейнере, при температуре +4-6ОС,
транспортировали для анализа в диагностическую лабораторию в течение 10 час.
Культивирование лимфоцитов проводили по стандартной методике [3]. К 200 мкл
гепаринизированной крови добавляли 6,13 мл среды RPMI (Sigma-Aldrich Co.,
Irvine, UK), 0,61 мл сыворотки крупного рогатого скота (Sigma Chemical Co., St.
Loius, USA), 0,06 мл пенициллина-стрептомицина (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK),
0,12 мл глутамина (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK) и
0,07 мл ФГА (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK) и инкубировали в термостате при
370С в течение 72 час. Колцемид в конечной концентрации 0,01мкг/мл (Gibco,
New-York, USA) добавляли за 2 часа до снятия культуры. Через 72 часа
культивирования клетки обрабатывали гипотоническим раствором 0,075 М КСL
в течение 10 мин, трижды фиксировали в смеси метанол-ледяная уксусная
кислота в объемном соотношении 3:1. Готовую суспензию клеток наносили на
чистые охлажденные и влажные стекла. Высохшие мазки окрашивали 6%
красителем Романовского-Гимза в течение 10 мин. Анализ хромосом производили
с помощью светового микроскопа фирмы “Leica” (Germany), при суммарном
увеличении х 1000.
Геномные мутации (анеуплоидия, полиплоидия) не учитывали, поскольку
наиболее информативным показателем влияния мутагенов среды являются
хромосомные аберрации. Пробелы (гэпы) в число аберраций не включали.
Регистрировали все типы хромосомных аберраций, доступные для анализа при
равномерном окрашивании хромосом (дицентрики, центрические кольца, парные
и одиночные фрагменты). При микроскопическом исследовании метафазных
пластинок придерживались критерия отбора и анализа препаратов, изложенных в
работах Бочкова Н.П. и др. и Захарова А.Ф.и др.[3,4]. Всего было
проанализировано
анализировали
по
31200
200
метафазных
метафаз.
пластинок.
Хромосомный
Для
каждого
анализ
зашифрованных препаратах методом “слепого контроля”.
человека
проводили
на
4
Выделение ДНК из клеток крови проводили стандартным методом с фенолхлороформной очисткой. Молекулярно-генетический анализ был проведен в
США (Department of Preventive Medicine and Community Health, The University of
Texas Medical Branch, Galveston). Генотипирование для генов GSTM1 и GSTT1
проводили с помощью мультиплексной ПЦР, используя соответствующие
праймеры:
GSTM1: 5’-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C
5’-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G;
GSTT1: 5’-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC
5’- TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA.
Электорофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 2%-ном
агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Гомозиготность по «нулевым»
аллелям генов GSTM1 и GSTT1 определяли по отсутствию специфических
фрагментов размером 480 п.н. (для GSTT1) и 215 п.н. (для GSTM1).
Полученные
результаты
обрабатывали
традиционными
методами
вариационной статистики [5]. Достоверность различий определяли, используя t критерий Стьюдента, метод 2, дисперсионный анализ.
Результаты и обсуждение
Цитогенетическая характеристика обследованных групп
Результаты цитогенетического обследования групп представлены в таблице
1. Всего в экспонированной группе обнаружено 508 хромосомных аберраций, т.е.
аберрации встречались с частотой 2,54±0,11%. Подавляющее большинство
составляли парные ацентрические фрагменты – 387 (1,93±0,09%). Частота
одиночных
фрагментов
составила
0,29±0,03%.
Также
были
выявлены
нестабильные хромосомные обмены (НХО) (0,31±0,04%), среди которых было 47
дицентриков и 16 центрических колец.
В первой и второй группах рабочих, имеющих профессиональный стаж от 1
до 12,5 лет и от 12,5 до 25 лет, соответственно, выявлено увеличение частоты
хромосомных аберраций, в основном за счет парных ацентрических фрагментов.
5
Уровень НХО в первой группе оказался выше, чем во второй. По-видимому,
уменьшение количества НХО связано с длительным культивированием (72 часа),
которое было предпринято с целью сохранения материала, вследствие длительной
транспортировки крови. Выявлена тенденция к увеличению цитогенетических
нарушений у рабочих, имевших более длительный профессиональный стаж.
Обнаружены достоверные различия по частоте хромосомных аберраций между
двумя экспонированными группами и контролем (р<0,001).
При обследовании контрольной группы среднегрупповая частота клеток с
аберрациями составила 0,56±0,07%, из них доля НХО составляла 0,17±0,04%,
парных фрагментов - 0,39±0,05%, одиночных фрагментов – 0,06±0,02%.
Полученные нами результаты по частоте хромосомных аберраций в контрольной
группе согласуются с аналогичными данными других исследователей [6-8].
Авторами было показано, что при обследовании 437 взрослых здоровых жителей
г. Москвы, (проанализировано более 70 тысяч клеток), частота спонтанных
хромосомных аберраций в культивированных лимфоцитах периферической крови
человека составила 1,16%, при этом выявленные нарушения хроматидного типа, в
основном одиночные фрагменты, составили более 50% всех аберраций [6].
Согласно данным Снигиревой с сотр., при цитогенетическом анализе 48124
метафаз от здоровых доноров доля НХО составила 0,02% [7]. В аналогичной
работе других авторов, было обнаружено 36 НХО из 51893 проанализированных
метафаз, что составило 0,07% [8]. Опираясь на эти результаты можно утверждать,
что колебания частоты спонтанных аберраций хромосом у здоровых доноров, не
подвергавшихся прямому радиационному воздействию, находятся в пределах 12%.
Известно, что в горнодобывающей промышленности, в частности, урановой,
рабочие подвергаются хроническому влиянию ионизирующей радиации, в
основном за счет радона и его дочерних короткоживущих продуктов [9].
Выявленное нами увеличение хромосомных нарушений у профессиональных
рабочих подтверждается данными других исследователей, показавших, что у
шахтеров уранодобывающих предприятий наблюдалось увеличение клеток с
6
хромосомными аберрациями по сравнению с контролем [10,11,12]. Также
показано, что увеличение числа аберрантных клеток по сравнению с контролем
наблюдалось не только у лиц, занятых на переработке и добыче урана, но и у
населения, проживающего вблизи уранодобывающих предприятий [13].
Таким образом, опираясь на наши собственные данные и результаты
исследований
других
авторов
можно
заключить,
что
воздействие
производственных факторов уранового производства на рабочих вызывает
генотоксический эффект, выражающийся в увеличении частоты хромосомных
аберраций. Цитогенетический анализ показал как увеличение частоты аберраций
хромосомного типа – парных ацентрических фрагментов, дицентрических
хромосом
и
центрических
колец,
являющихся
известными
маркерами
радиационного воздействия, так и аберраций хроматидного типа – одиночных
фрагментов, образование которых может быть вызвано комбинированным
воздействием радиации и химических мутагенов.
Связь цитогенетических показателей с генотипом
Глутатион-S-трансферазы (GSTs) — полигенное суперсемейство изоферментов,
включающее 7 семейств: α, μ, π1, σ, , κ, ξ [14]. Синтез глутатион-S-трансфераз
контролируется
различными
генами,
в
которых
выявлены
полиморфизмы,
приводящие к изменению активности фермента. Наибольший интерес представляют
члены семейств μ и . Известно, что члены семейства μ (GSTM) - GSTM1, GSTM2,
GSTM3, GSTM4, GSTM5, GSTM6, локализованы на хромосоме 1р13 [15]. Для гена
GSTM1 установлены две мутации: точковая замена, не имеющая функциональных
проявлений [16], и протяженная делеция гена (10 т.п.н.), которая приводит к полному
отсутствию синтеза белкового продукта [17]. Член семейства  - ген GSTT1
локализован на хромосоме 22q11.2. Полиморфизм этого гена, обусловлен наличием
двух аллелей — функционально активной (GSTT1*1) и неактивной (GSTT1*0)
7
(нулевой).
Аллель GSTT1*0 соответствует частичной
или
полной делеции,
приводящей к снижению или отсутствию ферментативной активности [18].
Результаты генотипирования полиморфизма генов (GSTT1 и GSTM1) у рабочих
Целинного горно-химического комбината и в контрольной группе представлены в
таблице 2. Гены GSTT1 и GSTM1 анализировались на наличие или отсутствие
делеции, т.е. «+/+» - нормальная аллель гена, наличие делеции по одному гену «+/-»,
«-/+»соответственно, «-/-» - полная делеция. Частоты гомозигот по делециям генов
GSTT1 и GSTM1 среди рабочих составили 19% и 62%, соответственно. Полная
делеция по двум генам GSTМ1 и GSTТ1 была выявлена у 8% рабочих. Полученные
нами результаты по распространенности нулевого генотипа GSTT1 и GSTM1
согласуются с аналогичными литературными данными [4, 5].
В таблице 3 приведены результаты по связи полиморфизма генов GSTM1 и
GSTT1
с
цитогенетическими
нарушениями
(хромосомные
аберрации)
у
обследованных лиц. Из полученных данных видно, что для отдельно взятых
«плюсовых» и «минусовых» локусов генов GSTM1 и GSTT1, не было выявлено
достоверно значимых различий по частоте хромосомных аберраций. Вместе с тем, у
индивидуумов, как с делецией по отдельно взятым локусам этих генов, так и с полной
делецией по двум генам GSTM1 и GSTT1, наблюдалась тенденция к увеличению
частоты хромосомных аберраций, однако эти различия не достоверны. Результаты,
полученные нами, согласуются с данными других авторов. В научном исследовании,
проведенном
совместно
несколькими
европейскими
лабораториями
(Италия,
Норвегия, Дания, Финляндия), по взаимосвязи между частотой хромосомных
аберраций, риском рака и генетическом полиморфизмом GSTM1 и GSTT1, не было
установлено ассоциации между полиморфизмом генов (GSTM1 и GSTT1) и уровнем
хромосомных аберраций, однако была выявлена зависимость между хромосомными
нарушениями и риском рака [19]. В работе Сальниковой с соавторами также не
выявлено взаимосвязи между частотой хромосомных аберраций с генотипами по
отдельно взятым локусам (GSTM1, GSTT1, GSTP1 и MTHFR) у ликвидаторов
последствий аварии на Чернобыльской АЭС [20].
8
Известно, что многие химические вещества, как эндогенные, так и поступающие
из окружающей среды, обладают способностью усиливать синтез ферментов
биотрансформации
ксенобиотиков,
что
существенным
образом
определяет
чувствительность организма к действию токсикантов. К числу сильных индукторов
ферментов принадлежат и многие промышленные яды. Установлено, что индукция
происходит за счет повторного попадания соединения в организм. Добыча и
переработка урановой руды сопряжена с комбинированным воздействием на
контингент профессиональных рабочих ряда потенциально вредных факторов: 1)
радиоактивных элементов (урана, радия, тория и др.), входящих в виде аэрозолей в
состав пылевой фракции воздуха; 2) радиоактивных газов радона и торона с
дочерними продуктами распада; 3) внешнего - и -излучения урановой руды; 4)
технологическим применением в урановом производстве активных реагентов с
токсическими свойствами (паров кислот и щелочей) и присутствующих в руде
химических соединений (пятиокиси фосфора, свободной двуокиси кремния, свинца,
мышьяка и др.), многие из которых являются канцерогенами [9]. Таким образом, в
результате хронического воздействия выше перечисленных соединений уранового
производства
происходит,
по-видимому,
постоянная
индукция
фермента
глютатионтрансфераза, что приводит к истощению запаса глютатиона в клетках.
Показано, что при поступлении токсикантов, в организме одновременно протекают
процессы детоксикации и репарации. При однократном поступлении данных
соединений в организм, интенсивность этих процессов может быть достаточной для
компенсации ущерба, связанного с образованием реактивных метаболитов, однако при
повторном воздействии, защитные механизмы могут оказаться несостоятельными, что
приведет к развитию токсического процесса. Возможно, вследствие перечисленных
выше причин, не обнаружено различия по частоте хромосомных аберраций между
индивидуумами имеющими «плюсовой» и «минусовой» генотипы (таблица 3).
Авторы выражают глубокую признательность профессору У. Ау за
предоставление результатов генотипического анализа, а также Амиргалиевой А. и
Ибраимовой Ж. за помощь в культивировании лимфоцитов.
9
Научно-исследовательская работа проведена в рамках Международного
гранта - «Мониторинг населения Северного Казахстана, проживающего вокруг
урановых рудников» Грант CRDF КВ2-2289 (США).
Таблица 1. Частота хромосомных аберраций у рабочих Целинного
горно-химического комбината и в контрольной группе
Группа
Количество
метафаз
(человек)
Количество
аберраций,
%
I
10000(50)
2,410,15а-***
II
10000 (50)
2,670,16 а-***
Всего
Контроль
20000 (100)
11200 (56)
2,540,11 а-***
0,560,07
НХО
(дицентрики +
центр.кольца),
%
0,36 0,06
Парные
фрагменты,
%
Одиночные
фрагменты,
%
1,790,13 а-**
0,260,05 а-**
0,270,06
2,080,14 а-**
0,320,05 а-**
0,310,04
0,170,04
1,93 ± 0,09а-**
0,390,05
0,290,03 а-**
0,060,02
Примечание: а- отличие от контрольной группы,** - p< 0,01; *** - p< 0,001
Таблица 2. Частоты генотипов GSTM1 и GSTT1 у рабочих Целинного
горно-химического комбината и в контрольной группе
GSTT1
GSTМ1
Генотип
Локус
Рабочие ЦГХК, %
Контроль, %
+/+
38
59
-/-
62
41
+/+
81
73
-/-
19
27
10
11
Генотип
II группа
(стаж 12,5-25 лет, n=50)
Контроль
(n=56)
Количество
аберраций
Частота
аберраций
Количество
метафаз
(людей)
Количество
аберраций
Частота
аберраций
Количество
метафаз
(людей)
Количество
аберраций
Частота
аберраций
+
4200 (21)
88
2,10±0,22
3400 (17)
70
2,05±0,24
6600
36
0,54±0,08
-
5800 (29)
127
2,20±0,19
6600 (33)
163
2,47±0,19
4600
20
0,43±0,09
+
7800 (34)
157
2,01±0,16
8400 (42)
185
2,20±0,16
8200
44
0,53±0,07
-
2200 (11)
58
2,63±0,34
1600 (8)
48
3,00±0,43
3000
12
0,4±0,07
-/ -
1000 (5)
32
3,20±0,56
600 (3)
22
3,60±0,77
1600
4
0,25±0,01
+/ -
1200 (6)
26
2,16±0,42
1000
26
2,60±0,50
1400
8
0,57±0,02
-/ +
4800 (24)
95
1,97±0,20
6000
141
2,35±0,19
3000
16
0,53±0,01
+ /+
3000 (15)
62
2.06±0,26
2400
44
1,83±0,27
5200
28
0,53±0,09
GSTM1 / GSTT1
Количество
метафаз
(людей)
GSTM1
I группа
(стаж 1-12,5 лет, n=50)
GSTT1
Локус
Таблица 3. Распределение хромосомных аберраций в зависимости от генотипа (GSTM1 и GSTT1)
у рабочих Целинного горно-химического комбината и в контрольной группе
12
GSTM1
Генотип
Локус
Таблица 4. Распределение хромосомных аберраций в зависимости
от генотипа (GSTM1 и GSTT1) по квартилям
I квартиль
III квартиль
IV квартиль
N
(человек)
Частота
аберраций
N
(человек)
Частота
аберраций
N
(человек)
Частота
аберраций
N
(человек)
Частота
аберраций
21
0.16±0.06
18
0.80± 0.14
16
1.65± 0.22
16
3.28±0.31
0.16± 0.06
3600
21
0.85± 0.14
3200
23
1.78± 0.19
3200
23
4.04±0.29
0.14± 0.05
4200
32
0.84± 0.11
4600
34
1.72± 0.15
4600
28
3.69±0.25
0.22± 0.09
6400
7
0.78 ±0.23
6800
5
1.80± 0.42
5600
11
3.81±0.40
0.10± 0.09
1400
5
0.70± 0.26
1000
1
2.5±1.10
2200
5
4.5±0.65
0.10 ±0.05
1000
16
0.78± 0.15
200
12
1.60±0.25
1000
10
3.3±0.39
+
4200
18
3600
28
GSTT1
II квартиль
+
5600
11
2200
5
GSTM1 /
GSTT1
-/ 1000
15
+ /+
3000
3200
2400
2000
13
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном
человека и гены «предрасположенности»; Введение в предиктивную
медицину. СПб.:Интермедика, 2000.271 с.
2.
Scatpato R., Hirvonen A., Migliore L. et al // Mut.Res. 1997. 389. Р. 227235.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Бочков Н.П., Демин Ю.С., Лучник Н.В. // Генетика. 1972, Т. 8, № 5,
С.133-141.
Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы
человека: Атлас. Москва: Медицина. 1982. 264с.
Рокицкий П.Ф. Введение в статистическую генетику. Минск:
Вышейшая школа. 1978. 448с.
Бочков Н. П., Чеботарев А. Н. Наследственность человека и мутагены
внешней среды. Москва: Медицина.1989. 272с.
CнигиреваГ.П., Новицкая Н.Н., Хазинс Е.Д., Вилкина Г.А.// Матер.
Межд. конф. «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков».
Москва. 2000. С.331.
Горбунова И.Н., Иванов К.Ю., Нагиба В.И. // Матер. Межд. конф.
«Проблемы радиационной генетики на рубеже веков». Москва
.2000.С.259.
9.
10.
11.
Андреева О.С., Бадьин В.И., Корнилов А.Н. Природный и обогащенный
уран. Радиационно-гигиенические аспекты. Москва. Атомиздат. 1979.
212с.
Берсимбаев Р.И., Шарипов И.К., Какабаев А.А. // Биотехнология.
Теория и практика. 2000. № 3-4. С.18-21.
Meszaros G., Bognar G., Koteles G.J. // Journal of occupational health.2004.
V.46.P.310-315
12.
Smerhovsky Z, Landa K, Rössner P, Juzova D, Brabec M, Zudova Z, et al.//
Mutat Res. 2002. 514. Р.165-176.
13.
14.
15.
16.
Аu W.W., Lane R.G., Legator M.S., Whorton E.B., Wilkinson G.S.,
Gabehart G. J. // Environ. Health Persent.1995. № 5. Р.466-470
Landi S. // Mutat. Res. 2000. 463. P. 247-283.
Pearson W.R., Vorachek W.R., Xu S.J. et al. // Am.J.Human
Genet.1993.53.P. 220-233.
De Long J.L., Chang T.M., Whang-Peng J. et al. // Nucleic. Acid Res. 1988.
V. 16. P.8541-8554.
14
17.
Seidegard J., Vorachek W.R., Pero R.W. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.
1988.V. 85.P. 7293-7297.
18.
Pemble S., Schroeder K.R., Spencer S.R. et al. // Biochem J. 1994. V. 300.
P. 271-276.
19.
20.
Rossi A.M, Hansteen I-L., Skjelbred C.F., Ballardin M. et al.
//Environ.Health.Perspect. 2009. February. 117. (2). P.203-208.
Сальникова Л.Е., Фомин Д.К., Елисова Т.В., Акаева Э.А., Кузьмина
Н.С., Лаптева Н.Ш., Нилова И.Н., Иофа Э.Л., Костина Л.Н., Кузнецова
Г.И., Куликова Т.А., Панушкина О.Г., А.В. Рубанович. // Радиац.
биология. Радиоэкология. 2008. Т.48 №3. С. 303-312.