Кузина Татьяна Вячеславовна - Астраханский государственный

На правах рукописи
Кузина Татьяна Вячеславовна
ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КРОВИ
ПРОМЫСЛОВЫХ РЫБ ВОЛГО-КАСПИЙСКОГО КАНАЛА
Специальность 03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Астрахань, 2011
Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии, генетики и
биохимии Федерального государственного образовательного учреждения
высшего профессионального образования «Астраханский государственный
университет».
Научный руководитель
Козак Маргарита Федоровна
доктор биологических наук, профессор
Ильинских Николай Николаевич, чл.
корр. АН ВШ РФ, доктор биологических
Официальные оппоненты: наук, профессор, Томск.
Фельдман Бронислав Владимирович
доктор
биологических
наук,
доцент,
Астрахань
Ведущая
Ярославский государственный университет
организация:
им. П.Г. Демидова
Защита состоится «27» мая 2011 года в 10 часов на заседании
диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном
университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, д.1. ауд. 101.
Тел./ факс (8512) 51-82-64
E-mail: sovetei@rambler.ru
Текст автореферата диссертации размещен на официальном сайте
Астраханского государственного университета: http:// www.aspu.ru
Отзыв на автореферат (2 экземпляра, заверенные печатью) просим
направлять по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, д. 1, АГУ, ученому
секретарю диссертационного совета ДМ 212.009.01.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского
государственного университета.
Автореферат разослан «26» апреля 2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук
Ю.В. Нестеров
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальной проблемой современной физиологии и клеточной биологии в
плане определения критериев для раннего прогнозирования изменения
структуры популяций животных и растений является разработка
экспериментальных
моделей,
методов
цитологической
диагностики
нормального или патологического состояния, начала патологического процесса.
Любой патологический процесс, какой бы степенью функциональных
нарушений он не проявился, начинается на уровне структуры и
ультраструктуры клетки. Начальные стадии патологического процесса, как
правило, обратимы и могут быть компенсированы.
Многообразие функций крови ставит ее в ряд ценных индикаторов
состояния отдельной особи и популяции особей данного вида.
Функциональные и структурные изменения форменных элементов крови под
действием различных экзогенных и эндогенных факторов могут быть причиной
нарушения кроветворения на разных этапах онтогенеза рыб, однако
исследования в этой области немногочисленны. Научный и практический
интерес представляет не только изучение различных морфологических и
физиологических нарушений, происходящих при гемопоэзе, в частности при
эритропоэзе. Весьма актуально исследование взаимосвязи патологии этих
процессов с воздействием различных внешних и внутренних факторов.
Различные реакции крови на изменение функционального состояния особи в
ответ на экзогенные и эндогенные воздействия являются неспецифичными и
могут быть использованы как средство ранней диагностики нормального или
патологического состояния. Анализ гематологических показателей является
одним из важнейших аспектов оценки физиологического статуса организма, его
гомеостаза. Изучение морфологических нарушений элементов крови, оценка
цитофизиологических особенностей и изменений является необходимым
элементом наблюдения за состоянием популяций рыб, как в рыбоводной
практике, так и при прогнозировании динамики популяций в естественных
условиях. Решение указанной проблемы позволит использовать ряд
интегративных показателей для оценки физиологического состояния организма
для ранней диагностики развития патологии промысловых рыб.
Цель
работы:
Анализ
цитофизиологических
особенностей
периферической крови, динамики патологических изменений форменных
элементов крови в условиях повышенной антропогенной нагрузки ВолгоКаспийского канала для диагностики изменений, связанных с хроническим
токсикозом особей промысловых видов рыб.
Задачи исследования:
1. Определить состояние гематологических показателей и их изменение по
годам и сезонам года для характеристики физиологического состояния
организма промысловых рыб (судак и лещ) в зависимости от действия
эндогенных и экзогенных факторов.
2. Провести
анализ
цитофизиологических
особенностей
и
типов
патологических изменений форменных элементов крови рыб ВолгоКаспийского канала.
3
3. Оценить характер и частоту возникновения микроядер в эритроцитах
периферической крови, как одного из признаков проявления хронического
токсикоза рыб Волго-Каспийского канала.
4. Выявить корреляционные взаимосвязи частоты возникновения микроядер в
эритроцитах
крови
с
гидрохимической
и
токсикологической
характеристиками воды Волго-Каспийского канала.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
 Впервые в течение ряда лет (2006-2008 гг.) по сезонам года проведены
систематические исследования изменений основных параметров крови
промысловых рыб (судак и лещ) Волго-Каспийского канала с анализом
факторов на них влияющих.
 В динамике лет и сезонов проведён анализ цитофизиологических
особенностей и типов патологических изменений форменных элементов
крови промысловых рыб.
 Для ранней диагностики развития патологического процесса в условиях
повышенной антропогенной нагрузки Волго-Каспийского канала применен
комплексный подход, включающий методы гематологического и
цитогенетического анализа.
 Дана оценка характера и частоты возникновения микроядер в эритроцитах
периферической крови, как одного из признаков проявления хронического
токсикоза рыб Волго-Каспийского канала.
 Выявлены корреляционные взаимосвязи частоты возникновения микроядер
в эритроцитах крови с гидрохимической и токсикологической
характеристиками воды Волго-Каспийского канала.
Практическая значимость работы.
Установлено, что показатель «частота встречаемости микроядер в
эритроцитах периферической крови рыб» может быть использован в качестве
объективного критерия для дифференциальной диагностики результатов
нормального процесса гемопоэза или патологического его течения.
Микроядерный тест может быть использован в качестве объективного
индикатора для экспресс-оценки состояния популяций рыб, оценки
стабильности их генетического аппарата, а также для оценки состояния среды
обитания, прогнозирования влияния на популяционно-генетическую структуру
рыб негативных факторов среды. Данные, полученные в ходе изучения
морфологических изменений элементов крови, оценки цитофизиологических
особенностей и изменений клеток крови могут применяться для наблюдения за
состоянием популяций рыб, как в рыбоводной практике, так и при
прогнозировании динамики популяций в естественных условиях.
Апробация
работы.
Основные
положения
и
результаты
диссертационной работы докладывались на научных конференциях:
Межвузовской конференции молодых ученых РГПУ «Герценовские чтения»
(Санкт-Петербург, 2005; 2006); XIII Международной молодежной школыконференции (Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина, Рыбинск,
2007); на X Международной научно-практической конференции, посвященной
450-летию Астрахани (Астрахань, 2008); Международной научно-практической
4
конференции «Комплексный подход к проблеме сохранения и восстановления
биоресурсов Каспийского бассейна» (Астрахань, 2008); Международной
научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные
исследования университетов, интеграция в региональный инновационный
комплекс»: доклады молодых ученых в рамках программы «Участник
молодежного научно-инновационного конкурса», (Астрахань, 2010);
Международной конференции «Экокультура и фитобиотехнологии улучшения
качества жизни на Каспии» (Астрахань, 2010).
Публикации. Результаты исследования изложены в 15 статьях, в том
числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. В периферической крови рыб Волго-Каспийского канала установлена
динамика гематологических показателей в зависимости от сезона года, стадии
зрелости гонад, семенников и пола особей.
2. Разнообразие патологических изменений клеток периферической крови рыб,
их общий высокий уровень указывают на наличие постоянного стрессорного
воздействия комплекса внешних и внутренних факторов на организм.
3. Частота возникновения микроядер в эритроцитах крови рыб превышает
уровень, наблюдаемый при спонтанном мутагенезе.
4. Уровень (частота возникновения) клеток с микроядрами имеет устойчивые
взаимосвязи с другими гематологическими показателями, характеризующими
физиологическое состояние рыб, а также с токсикологическими и
гидрохимическими показателями, характеризующими среду их обитания.
Структура и объем работы. Диссертация содержит 181 страницу
печатного текста, 26 таблиц, 29 рисунков, включает введение, четыре главы,
заключение, выводы, список литературы. Список литературы содержит 296
источников, из них 258 отечественных и 38 иностранных.
Декларация личного участия автора. Исследования на тоневом участке
Волго-Каспийского канала, анализ и обобщение результатов, представленных в
диссертации, проведены лично соискателем.
Благодарности. Считаю своим долгом выразить искреннюю
признательность заведующей и сотрудникам лаборатории ихтиопатологии
ФГУП «КаспНИРХ» за помощь в сборе и обработке материалов исследования;
руководителю экологического направления исследований ФГУП «КаспНИРХ»
к.г.н. Д.Н. Катунину.
Особую признательность автор выражает научному руководителю,
доктору биологических наук, профессору Козак М.Ф. за помощь, ценные
советы и рекомендации.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В работе представлен обзор работ отечественных и зарубежных авторов,
включающих данные о клеточных элементах нормального гемопоэза рыб
(Иванова Н.Т., 1983, 1995, 2002; Федорова Н.Н., Грушко М.П., 2008, 2009, 2010;
Головина Н.А., 1989, 2003 и другие), классификацию форменных элементов
крови исследуемых видов рыб Волго-Каспийского бассейна (Иванова Н.А.,
5
1983, 2002), данные о патологических изменениях морфологии клеток крови
рыб (Житенева Л.Д., 1989, 2004 и др.; Микряков В.Р., 1990; Журавлева Г.Ф. и
другие, 1990; Моисеенко Т.И., 1998; Рудницкая О.А. и другие, 2000; Федорова
Н.Н., Ложниченко О.В., 2005, 2008).
Кумулятивный токсикоз (Журавлева Г.Ф., Земков Г.В., 1987, 2003, 2004;
Чеботарева Ю.В., 1996; Алтуфьев Ю.В., 1990, 1999; Моисеенко Т.И., 2005)
рассматривается как следствие накопления в организме рыб стабильных
химических
токсикантов
и
причина
патологических
изменений
физиологического состояния. Явление микроядерности в эритроцитах рыб и
других объектов рассматривается, как признак развития патологических
процессов в периферической крови. Дается анализ причин образования
микроядер (Бродский В.Я., Урываева И.В., 1987; Ильинских Н.Н., 1989; 1992;
Жулева Л.Ю., Дубинин Н.П., 1994; Чеботарева Ю.В., 1996; Аббасова А.Р.,
Палатников Г.М., 2004; Ильин Д.А., 2009 и другие). Приводится
гидрохимическая и токсикологическая характеристика воды ВолгоКаспийского канала (Ежегодник Астраханского ЦГМС, 2007, 2008, 2009, 2010).
Глава 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования - клеточные элементы гемопоэза половозрелых
особей мужского и женского пола: судака обыкновенного (Stizostedion
lucioperca) и леща европейского (Abramis brama).
Таблица 2.1.
Объем материала для исследования
Сезон Промысловая длина, см
Масса, г
исследо
Интервал
Интервал
вания
варьирования M±m варьирования
M±m
(min ÷ max)
(min ÷ max)
Пол
Возраст
Количес
тво
Неполо
Самцы, Самки, возрел 2-3
3-4 клеток
для
шт.
шт.
лые
года года
анализа
особи
Судак обыкновенный
Осень
Лето
Итого
31,0-59,0
36,0-50,0
41,9±0,9
40,5±0,8
570-2200
550-1670
Осень
Весна
Итого
Всего
23,0-32,0
23,0-35,0
28,0±0,5
27,0±0,6
260,0-680,0
250,0-670,0
1106,8±80,4
891,0±57,0
19
13
32
56
37
93
2
2
4
32
43
23
27
55
70
250 особей
2
3
5
73
48
121
75000
51741
126741
Лещ европейский
468,8±21,9
409,3±20,1
73
47
120
75000
50000
125000
251741
Вылов рыб для анализа производился весной и осенью с 2006 по 2008 гг.
на тоневом участке Волго-Каспийского канала. Исследуемые особи не имели
видимых повреждений и внешних проявлений каких-либо заболеваний.
Методы отбора и обработки проб при гематологическом исследовании
Гематологический анализ периферической крови проводили, используя
общепринятые апробированные методики, согласно «Методическим указаниям
по проведению гематологического обследования рыб» (Методические
указания, № 13-4-2 / 1487 от 02.02.1999г.). Периферическую кровь отбирали из
хвостовой артерии методом отсечения хвоста в момент вылова рыб. Цельную
кровь собирали в пробирки, предварительно обработанные раствором
антикоагулянтов, не менее 5 мл. Для каждой особи готовили не менее двух
6
мазков, согласно методике («Изготовление, фиксация и окраска мазков
(тотальные препараты)», Ромейс Б., 1953; Роскин Г.И., Левинсон Л.Б., 1957).
Препараты высушивали на воздухе, фиксировали 960 этанолом.
Гематологические показатели: концентрация гемоглобина, г/л; скорость
оседания эритроцитов, мм; содержание гемоглобина в одном эритроците, пг;
число лейкоцитов ×109 в л.; количество эритроцитов ×1012 в л.; лейкоцитарная
формула (процентное соотношение лейкоцитов на мазках периферической
крови), определялись согласно «Методическим указаниям по проведению
гематологического обследования рыб» (1999). Количество гемоглобина в крови
рыб определяли гемоглобинцианидным (HbCN) методом с помощью
диагностических наборов Гемоглобин-АГАТ, на гемоглобинометре Микролаб540, Юнимед, ФБС-01-2. СОЭ определялась в аппаратах Панченкова. Подсчет
количества эритроцитов проводился с помощью камеры Горяева. Для
выражения степени насыщенности эритроцитов гемоглобином вычисляли
содержание гемоглобина в одном эритроците (СГЭ) в пг (Иванова Н.Т., 1983).
Для определения соотношения лейкоцитов мазки периферической крови
окрашивали азур-эозином по Романовскому (Диахим-ГемиСтейн-Р) (1 капля
основного раствора на 1 см3 дистиллированной воды с рH 6,8-7,0).
Лейкоцитарная формула крови определялась на окрашенных препаратах
при использовании светового микроскопа (Olympus) при увеличении 10×100.
На мазках подсчитывали 200 лейкоцитов по общепринятой методике
(Методические указания…, 1999). Общее число лейкоцитов учитывали
косвенным методом. Определяли число лейкоцитов, встречающихся при
подсчете на 1000 эритроцитов в мазке крови и пересчитывали их количество на
1 мкл по формуле: Х=(A*B)/1000, где Х-общее количество лейкоцитов в 1 мкл
крови, A-число эритроцитов в 1 мкл крови, определенное в камере Горяева, Bчисло лейкоцитов, определенное при подсчете 1000 эритроцитов на мазке
крови. Патологические изменения форменных элементов крови рыб определяли
согласно рекомендациям Л. Д. Житеневой с соавторами (1989). В процессе
исследования учитывалась инвазированность рыб паразитами. Определение
паразитов проведено совместно с научными сотрудниками лаборатории
ихтиопатологии ФГУП «КаспНИРХ».
Методы отбора и обработки проб при исследовании микроядер в клетках
периферической крови рыб
Исследование микроядер в клетках крови рыб выполнено
микроскопическим методом на репрезентативных выборках тестовых объектов
и клеток: эритроциты периферической крови судака (S. lucioperca) и леща (A.
brama). Мазки периферической крови готовили согласно методике
«Изготовление, фиксация и окраска мазков (тотальные препараты)» Ромейс Б.
(1953), Г. И. Роскин, Л. Б. Левинсон (1957), в момент вылова рыб, высушивали
на воздухе, фиксировали 960 этанолом. Для выявления микроядер в
эритроцитах периферической крови судака (S. lucioperca) и леща (A. brama)
мазки окрашивали сначала красителем азур-эозином по Романовскому (1 капля
основного раствора на 1 см3 дистиллированной воды с рH 6,8-7,0) в течение 20
мин. Затем окрашивали красителем Giemsa-Solution Microscopy grade
7
(AppliChem, Germany) (2 капли красителя на 1 мл. дистиллированной воды с рH
6,8-7,0) в течение 15 минут. Патоморфологические нарушения структуры ядра
определяли согласно рекомендациям Л.Д. Житеневой с соавторами (1989).
Анализ препаратов проводили путем микрокопирования окрашенных мазков с
помощью микроскопа «Olympus» при увеличении 10×100. На препаратах
проводился учет эритроцитов с микроядрами и другими фенотипическими
отклонениями от нормальной конфигурации интерфазного ядра. Микроядра
определяли, пользуясь следующими критериями, разработанными доктором
Дж. Мерч и другими авторами (Mersh J. и др., 1996):
 Микроядра представляют собой сферические цитоплазматические
включения хроматина, имеющие четкий контур.
 Диаметр МЯ варьирует от одной десятой до одной трети диаметра ядра.
 Микроядра «похожи» на ядро по структуре и окраске.
 Микроядра не связаны с ядром.
Долю клеток с микроядрами (МЯ %) определяли отношением количества
клеток с микроядрами к общему количеству проанализированных эритроцитов.
Аналогично оценивали долю клеток с другими типами патологии ядра.
Полученные
данные
подвергались
статистической
оценке
с
использованием пакета лицензионных программ Microsoft Office Excel 2003,
Statistica 6.0. Установление зависимостей между исследуемыми показателями
проведено методом корреляционного анализа с помощью программы Microsoft
Office Excel 2003 на основе операционной системы Windows XP Professional.
Для оценки достоверности разности средних и выборочных долей между
показателями использовался критерий Стьюдента и альтернативный анализ.
(Лакин Г.Ф., 1973; Козак М.Ф., 1995; Рокицкий П.Ф., 1973; Glantz S.A., McGraw
Hill, 1998; Стентон Г., 1999 и другие).
Условные сокращения и обозначения, принятые в дальнейшем
Hb – гемоглобин, СГЭ – среднее содержание гемоглобина в одном эритроците. Эр –
эритроциты, Мн – моноциты, Пбф – псевдобазофилы, Пэф – псевдоэозинофилы, Эф –
эозинофилы, Нф – нейтрофилы, Лф – лимфоциты, МЯ – микроядра, М - среднее значение
показателя, m – ошибка репрезентативности среднего, n – объем выборки, σ – стандартное
отклонение, р – уровень значимости (вероятность ошибки репрезентативности), mp –
ошибка доли, lim: min ÷ max – интервал варьирования: распределение данных по области
значений, СЗГ – стадия зрелости гонад, В-К канал - Волго-Каспийский канал.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Анализ физиологического состояния рыб в зависимости от
состояния гематологических показателей и инвазированности паразитами
3.1. Типы патологических изменений форменных элементов
периферической крови промысловых рыб Волго-Каспийского канала
При анализе мазков крови среди нормальных клеточных элементов, были
установлены разнообразные типы отклонений их структуры. Присутствие их в
составе периферической крови с определённой статистической частотой
рассматриваются как свидетельство проявления хронического токсикоза
8
организма рыб В-К канала. Характерными патологическими изменениями
структуры эритроцитов крови, обнаруженными при анализе мазков крови
промысловых рыб, были следующие: пойкилоцитоз (появление в крови
эритроцитов различной формы); анизоцитоз (разноразмерность); нарушение
осморезистентности мембраны клетки; псевдоагглютинация; цитолиз
(разрушение эритроцитов); ядра-тени; вакуолизация.
Среди нарушений структуры ядер эритроцитов установлены следующие:
хроматинолиз (уменьшение видимого количества хроматина, ядро окрашено в
светлые тона, контуры его сохраняются); протуберанцы кариоплазмы во
внутриклеточное пространство; гиперхроматоз стенки ядра эритроцитов (ядра
имеют форму кольца, контур четко окрашен, центр ядра светлый, за счет
концентрации хроматина по периметру ядра); кариолизис; кариорексис;
инвагинация ядра; деформация ядра; пристеночные ядра; эксцентричные ядра
(ядро смещено от центра); шистоцитоз; амитоз. Отмеченные нарушения,
относимые ранее к артефактам, в условиях В-К канала в настоящее время
представляют собой реальные этапы гематологических процессов. Так,
появление фестончатых краев эритроцитов, ядерных теней, безъядерных
эритроцитов, по-видимому, есть последовательные звенья одной цепи.
Аналогичное мнение высказано ранее Житеневой Л.Д., 1999.
3.2. Оценка физиологического состояния особей судака обыкновенного
(Stizostedion lucioperca) по состоянию показателей крови и
инвазированности паразитами
Исследование инвазированности судака Волго-Каспийского бассейна
показало, что паразитические сообщества были представлены 16 видами
гельминтов, относящихся к 7 классам. Частота встречаемости особей,
зараженных гельминтами за период исследования, в среднем составляла 98,0 %
весной и 96,0 % осенью, т.е. практически вся рыба была заражена паразитами.
Отмечено незначительное снижение уровня заражения рыб паразитами к осени.
Паразитирование гельминтов в организме судака может отражаться на
изменении параметров периферической крови. Обнаружена корреляционная
зависимость между паразитированием в организме судака гельминтов и
изменением параметров периферической крови рыб. Паразитирование
отдельных гельминтов вызывало снижение количества эритроцитов в объеме
крови (R=-0,57 при р<0,05), увеличение содержания гемоглобина в крови
(R=+0,60, р<0,05), повышение содержания Нф (R=+0,53 при р<0,05) и Пэф
(R=+0,67 при р<0,05), увеличение абсолютного количества лейкоцитов литре
крови (R=+0,51, р<0,05), что является ответной реакцией организма,
направленной на нейтрализацию неблагоприятного эндогенного воздействия.
Показатели периферической крови судака приведены в таблице 3.2.1.
Осенью 2006 г. отмечено недостаточное содержание гемоглобина и общего
количества эритроцитов в литре крови судака. При этом наблюдались
относительно низкие показатели СОЭ. В 2007 году было отмечено повышенное
содержание гемоглобина у большинства исследованных рыб в летний (48%) и
осенний (48%) периоды исследования. Количество эритроцитов было на
9
достаточном уровне у 56% исследованных рыб летом и 52% рыб осенью.
Концентрация гемоглобина в крови особей судака в 2008 году была достоверно
ниже его уровня в 2007 году (при р<0,05). Данные, приведённые в табл. 3.2.1,
свидетельствуют о некотором снижении содержания гемоглобина и количества
эритроцитов в литре крови рыб летом и осенью 2008 года в сравнении с
аналогичными периодами 2007 года.
Таблица 3.2.1
Показатели крови, отражающие физиологическое состояние
особей судака В-К канала
Показатели Условная
крови:
норма
Hb, г/л
70,0-72,0
СОЭ, мм
2006
Осень
M±m
Лето
M±m
Осень
M±m
Лето
M±m
Осень
M±m
Среднее
Лето
Осень
M±m
M±m
61,9±2,2
76,2±2,8
75,0±2,2
63,8±1,9
66,9±1,2
70,0±2,3 67,9±2,2
1,8±0,2
1,6±0,2
1,5±0,1
1,0±0,1
1,5±0,1
1,3 ± 0,1 1,6±0,2
69,0±2,3*
1,4±0,2
39,5±1,6
39,0±1,2
38,1±1,2
38,5±1,3 41,3±1,8
39,9±1,6*
2007
СГЭ, пг
22,4-42,2 46,3±2,6 38,0±1,5
Лето:
Колич.
1,67-1,72
эритроцито
1,30±0,10 1,88±0,08
Осень
в *1012 в л
1,70-1,85
Колич.
лейкоцитов 35,0-95,0
89,5±12,3
*109 в л
ПЭФ, %
3,0
0,4±0,2 0,1±0,09
ЭФ, %
НФ, %
ЛФ, %
Молодые
лейкоциты
%
Мн, %
0,1-2,0
86,4
2008
Общее
среднее
M±m
1,84±0,08 1,54±0,06 1,64±0,05 1,71±0,07 1,59±0,08 1,65±0,07*
90,0±10,9 149,2±16,9 69,2±7,4 119,3±14,6 79,6±9,1
99,5±11,9
0,04 ± 0,03
0,13±0,05
0,0
0,2±0,08 0,07±0,04 0,2±0,05
0,5±0,20 0,09±0,07
0,0
0,36±0,15 0,08±0,06 0,23±0,11 0,19±0,09 0,21±0,09
4,0±1,30 9,8±2,50 11,9±4,4 2,70±1,07 1,74±0,36 6,25±1,79 5,88±2,02 6,06±1,90
93,0±1,30 86,0±3,10 84,7±5,0 96,3±1,1* 97,5±0,4 91,1±2,1 91,7±2,2 91,4±2,2*
-
0,0
3,1±0,7
0,0
2,1
0,1±0,06
0,5±0,48
3,4±0,7
0,02±0,02 0,10±0,04 1,56±0,36 0,03±0,01
0,68±0,20 0,56±0,13
0,6±0,3
4
1,35±0,3
0,83±0,19
0,98±0,32
Повышение количества Нb и Эр может зависеть от воздействия многих
токсических факторов, к этому может приводить также нехватка кислорода в
воде. Насыщение эритроцита гемоглобином (СГЭ, пг) во все периоды
исследования соответствовало норме.
«Белая» кровь исследуемых особей судака носила ярко выраженный
лимфоидный характер. Гранулярные формы лейкоцитов были представлены
псевдоэозинофилами (Пэф), эозинофилами (Эф) и нейтрофилами (Нф).
Агранулярные формы: моноцитами (Мн), лимфоцитами (Лф). Особенности в
соотношении различных форм лейкоцитов в периферической крови судака
осенью 2006 г. были представлены относительно невысоким содержанием
фагоцитов (моноциты, палочкоядерные, сегментоядерные нейтрофилы), что
может объясняться физиологическими особенностями рыб. Абсолютное
количество лейкоцитов в крови рыб на протяжении 2007 г. было в пределах
нормы. Анализ иммунограммы показал, что весной 2007 г. у рыб наблюдалась
выраженная моноцитопения. Низкий процент моноцитов в лейкограмме может
быть связан с тем, что основная масса моноцитов сконцентрировалась в очагах
воспаления, трансформируясь в макрофаги, что часто наблюдается при
длительном воздействии неблагоприятных факторов среды (Житенева Л. Д. и
другие, 2004). Количество нейтрофилов было повышенным, но они были на
10
стадии молодой клетки имеющей слабую функциональную активность. Осенью
2007 г. наблюдался моноцитоз и нейтрофилия, проявляющиеся на фоне
снижения содержания остальных клеток гранулярного ряда. Это может
свидетельствовать о неблагоприятном состоянии организма рыб и
иммунологической недостаточности. Изменения в соотношении различных
форм лейкоцитов в 2008 г. были представлены значительным повышением
количества лимфоцитов, на фоне снижения эозинофилов и моноцитов, хотя
количество нейтрофилов колебалось в пределах нормы, также как и в 2007 г.
отмечали их слабую фагоцитарную активность. Деструктивные изменения
нейтрофилов (вакуолизация цитоплазмы) охватывали не более 0,1 % клеток на
мазке крови у 3,0 % исследованных особей. Зрелые лимфоциты были
представлены, в основном, клетками узкоплазменной формы. У отдельных рыб
в 2008 г. (20,0 % весной, 48,0 % осенью) отмечали явление кариолиза в
лимфоцитах в яркой форме (рис. 3.2.1).
Рисунок 3.2.1. Кариолиз
лимфоцитов
судака
обыкновенного
В-К
канала (осень 2008г.).
ув. × 1000
Подобные деструктивные изменения ядерных структур могут быть
спровоцированы наличием токсических агентов в организме, а также при
заболеваниях (вирусные, паразитарные). Исследованные особи судака были
неоднородны по характеру гематологических показателей, что может быть
обусловлено индивидуальной резистентностью их организма.
Гематологические показатели находятся в тесной связи с возрастом и
стадиями зрелости гонад рыб, отражая физиологическое состояние их
организма. По мере созревания гонад наблюдается изменение ряда
гематологических показателей, отмечено повышение гемоглобина, СГЭ,
количество лейкоцитов в пересчете на литр крови, это было отмечено ранее и
другими авторами (Житенева Л.Д., 1986; Головина Н.А., 1997). После нереста
(VI-II СЗГ) отмечено снижение гемоглобина, СГЭ и СОЭ. У самок после
нереста возросло количество Нф, что, вероятно, объясняется резорбцией
остаточных ооцитов и пустых фолликулов. Повысилось количество моноцитов,
что возможно связано с участием этих клеток в процессе овуляции, они
выделяют ферменты, обеспечивающие освобождение созревших яйцеклеток
фолликула (Житенева Л.Д., 1987; Иванов А.А., 2003), и, в среднем, у самок
отмечено повышенное количество моноцитов (0,64%) по сравнению с самцами
(0,18%). Установлено, что у самок, находящихся на II СЗГ и, в среднем,
количество гемоглобина было выше. У самцов количество эритроцитов и
лейкоцитов в пересчете на литр крови рыб ниже, чем у самок. Полученные
11
результаты свидетельствуют, что организм рыб обладает большими
компенсаторными возможностями. Физиологическое состояние организма рыб,
его ослабление проявляется в зависимости от зрелости гонад. Значительные
отклонения большинства показателей крови от условной нормы, можно
рассматривать не только как естественные изменения. Значительное количество
патологических изменений показателей крови связано с проявлением
хронического токсикоза рыб.
Таблица 3.2.2
Типы цитопатологических нарушений в эритроцитах судака В-К канала
Основные типы
нарушений
Пойкилоцитоз
Анизоцитоз
Агглютинация
Изменение внешней
плазматической
мембраны
Смещение ядер к
периферии
Пикноз
Деформация ядер
Кариорексис
Инвагинация ядра
Разрушение клетки
Ядра-тени
Хроматинолиз
Ядра-кольца
Протуберанцы
Вакуолизация
цитоплазмы
Кариолиз
Шистоциты
Амитоз
Амитоз – деление
только ядра
Количество
исследованных рыб
Количество особей (%) с нарушениями структуры клеток
от общего количества обследованных рыб
2006
2007
2008
Среднее
Осень
Лето
Осень
Лето
Осень
Лето
Осень
32,0*
78,0*
46,0*
88,0**
72,0*
83
50
8,0*
74,0*
25,0*
92,0**
84,0**
83
39
12,0*
17,0*
8,0
68,0*
8,0*
42
23
76,0**
96,0**
83,0*
72,0*
52,0*
84
70
0,0
100,0
100,0
60,0*
28,0*
80
64
0,0
32,0*
20,0*
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
-
43,0*
56,0*
56,0*
56,0*
70,0*
65,0*
56,0**
0,0
-
0,0
71,0*
21,0*
96,0**
92,0**
42,0*
4,0
0,0
-
68,0*
0,0
76,0*
76,0*
76,0*
100,0
16,0*
56,0*
16,0*
52,0*
0,0
56,0*
48,0*
36,0*
52,0*
8,0*
28,0*
16,0*
55
28
66
66
73
82
36
-
26
34
32
72
64
47
6
-
0,0
22,0*
37,5*
48,0*
4,0
35
21
0,0
4,0
32,0*
17,0*
9,0*
13,0*
4,0
25,0*
8,0
44,0*
0,0
44,0*
12,0*
0,0
12,0*
30
9
28
8
14
17
0,0
13,0*
21,0*
8,0*
12,0*
10
16
25
23
24
25
25
24
25
Примечание: * - р<0,05; ** -р<0,01 (р – достоверность доли, уровень значимости)
В периферической крови особей судака были обнаружены изменения в
структуре
эритроцитов,
отличающиеся
степенью
проявления
патоморфологических нарушений (табл. 3.2.2). К их числу относится:
пойкилоцитоз эритроцитов, который отмечен во все сезоны исследования, в
основном, их полиморфностью (максимально до 15,0 % клеток на мазке).
Отмечены клетки грушевидной, серповидной, ромбовидной формы.
Патологическая форма эритроцитов с отростками (характерна для угнетения
эритропоэза) встречалась единично, у отдельных особей, независимо от сезона
исследования. Снижение эластичности клеточной мембраны эритроцитов
косвенно указывает на изменение её осмотических свойств. У одной особи
(2008 г.) пойкилоцитоз охватывал до 72,0 % эритроцитов. У этой особи судака
12
отмечено максимальное количество трематод Rossicotrema donicum (90 экз.),
поражающих покровы тела. У всех исследованных рыб нарушения
эритроцитарной мембраны проявлялись гемагглютинирующим эффектом без
явных признаков деструкции. Этот показатель значительно снижался (до 8,0 %)
осенью. Подобные явления, как правило, являются результатом действия
неблагоприятных факторов как вне, так и внутри организма (интоксикация
различной этиологии).
В летний период исследования отмечено увеличение доли рыб с
эритроцитами, имеющими морфологические нарушения. Так, доля (%) рыб с
эритроцитами меньшего диаметра в сравнении с нормоцитами, по отношению к
общему количеству обследованных особей в 2007 и 2008 гг. возрастала в
весенне-летний период относительно осени. Наличие микроцитов в
периферическом русле не превышало 5,2 % от общего пула эритроцитов у
отдельных особей и отражало относительно нормальный процесс гемопоэза
судака. К числу патоморфологических изменений на мазках крови относятся
эритроциты в стадии разрушения.
Рисунок 3.2.2. Разрушение эритроцитов (судак, осень 2008), ув.×1000
Рисунок 3.2.3. Тени эритроцитов (судак, осень 2008), ув. х1000
У отдельных особей в 2007 г., отмечен высокий уровень цитолиза
клеток крови (57% от общего числа исследованных клеток указанных
экземпляров рыб) (рис. 3.2.2). В остальные периоды исследования
встречаемость данного типа отклонений на мазках крови была не высокой, хотя
и данное нарушение отмечали более чем у половины исследованных рыб. В
2007 и 2008 гг. в периферической крови рыб регистрировали разрушившиеся
эритроциты (полный лизис). В летний период 2008 г. у всех исследованных
особей рыб на мазках крови, регистрировали ядра-тени (рис. 3.2.3).
13
Деструктивные
изменения
эритроцитов
были
представлены
деформацией, пикнозом ядра. Явление кариорексиса, хроматинолиза,
гиперхроматоза стенки ядра (ядра-кольца), кариолиза с явлениями близкими
фрагментозу (ареол хроматина вокруг ядра, «протуберанцы» кариоплазмы во
внутриклеточное пространство) чаще отмечали в летний период (рис. 3.2.4.).
90 % особей рыб
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Лето
Аниз
оцит
оз
Пойк
илоц
итоз
Аггл
ютин
ация
Изме
нени
е цит
омем
Смещ
бран
ение
ы
ядер
Пикн
оз
Дефо
рмац
ия яд
ер
Кари
орек
сис
Инва
гинац
ия ...
Разру
шени
е к...
Ядра
-тени
Хром
атин
олиз
Ваку
олиза
ция..
.
Кари
олиз
Шис
тоци
ты
Амит
оз
Амит
оз – д
ел...
Осень
Рисунок 3.2.4.
Доля особей
судака (%) с
нарушениями
в эритроцитах
крови
Типы нарушений в эритроцитах
Подобные патологические изменения ядра встречаются при различных
повреждениях клетки. Изменение коллоидно-осмотического состояния ядра и
цитоплазмы происходит вследствие торможения транспорта веществ через
внешнюю плазматическую мембрану клетки (Шиффман Ф. Дж., 2001). На
мазках крови были отмечены эритроциты в стадии амитоза. Уменьшение
частоты встречаемости и интенсивности проявления цитопатологических
изменений к осени (рис. 3.2.4.) может свидетельствовать: о некоторой
стабилизации токсикологической и гидрохимической обстановки водной среды
в осенний период, о более благополучном физиологическом состоянии рыб в
результате летнего нагульного периода. Этому способствовало и небольшое
снижение количества полостных паразитов рыб осенью.
% особей рыб
100
Анизоцитоз
Кариолиз
Пойкилоцитоз
Хроматинолиз
Кариорексис
Ядра-тени
80
60
40
Рисунок 3.2.5.
Доля особей судака с
цитопатологическим
и отклонениями
(средний %)
в эритроцитах крови
20
0
2006
2007
2008
В период с 2007 по 2008 гг. возросло количество рыб с нарушениями в
структуре ядра эритроцитов (рис. 3.2 5), кариорексис, хроматинолиз, кариолиз.
С 2006 по 2008 гг. возрастает количество (% особей рыб) со структурными
нарушениями в эритроцитах: пойкилоцитоз, разноразмеренность. Такие
нарушения эритроцитарной мембраны возникают при контакте с токсическими
веществами, обладающими повреждающим действием.
Согласно данным токсикологической характеристики воды ВолгоКаспийского канала, в период с 2006 по 2009 гг. было отмечено увеличение
14
содержания в воде некоторых токсических компонентов: марганец, нефть и др.
(Ежегодник. «Качество поверхностных вод», 2007; 2008; 2009).
Большинство
показателей
цитопатологических
изменений
в
количественном отношении не выходили за пределы «условной нормы».
Однако, большое разнообразие форм патологических изменений, связанных с
проявлением хронического токсикоза в виде нарушений структуры ядра
эритроцитов и высокое их общее (суммарное) количество, создаёт общую
неблагоприятную картину физиологического состояния рыб.
Анализ физиологического состояния организма леща европейского
(Abramis brama) Волго-Каспийского канала по гематологическим
показателям и инвазированности паразитами
Исследование инвазированности особей леща Волго-Каспийского
бассейна по сезонам года с 2006 г. по 2008 г., показало, что паразитические
сообщества были представлены 16 видами гельминтов, относящихся к 6
классам, степень инвазии рыб во всех случаях соответствовала
бессимптомному паразитоносительству. Ни в одном из исследованных случаев
инвазия не сопровождалась наличием необратимых видимых патологических
изменений. Интенсивность поражения рыб не достигала летального порога,
однако почти все особи леща (весной 96 %) были заражены паразитами.
Исследованием установлено существование корреляционной зависимости
между паразитированием в организме леща гельминтов и изменением
некоторых параметров периферической крови рыб (также как и для судака).
Следовательно, паразитирование гельминтов в организме леща отражается
непосредственно на изменении параметров периферической крови рыб.
Анализ состояния периферической крови исследованных особей леща
осенью 2006 года обнаружил пониженное (недостаточное) содержание
гемоглобина и количества эритроцитов в одном литре периферической крови
особей леща (табл. 3.3.1.). У этих же рыб был отмечен относительно низкий
уровень СОЭ. В 2007 году, как и в 2006, было отмечено пониженное
содержание гемоглобина. Насыщение эритроцита гемоглобином (СГЭ) было
достаточно низким. При этом наблюдался низкий уровень СОЭ у этих же рыб.
Количество эритроцитов в литре крови находилось в пределах нормы. В 2008
году отмечено недостаточное содержание гемоглобина и уровень СОЭ.
Количество эритроцитов в литре крови весной было незначительно выше
условной нормы, а осенью - ниже. Преобладающими клетками в составе белой
крови рыб являются лимфоциты, которые составляли у отдельных особей до
100 % всех лейкоцитов, но средний уровень их был в пределах нормы
(Справочник…, 1986, Методические указания…, 1974, 1999; Экологогематологические характеристики, 1997). Общее количество лейкоцитов в
литре крови леща в течение исследования было в пределах нормы. Однако, в
лейкограмме выявлены существенные различия в составе популяций клеток. В
период с 2006 по 2008 гг. отмечено понижение содержания псевдобазофилов в
крови рыб, количество псевдоэозинофилов увеличилось с 2006 по 2008 гг., но
всегда находилось в пределах нормы. На фоне снижения нейтрофилов из года в
3.3.
15
год и относительно условной нормы, происходило увеличение доли клеток
лимфоидного ряда как относительно нормы, так и с 2006 по 2008 год.
Таблица 3.3.1.
Показатели крови, отражающие физиологическое состояние особей леща
2006
2007
2008
Среднее
по сезонам
Показатели
Условная
крови:
Осень
Весна
Осень
Весна
Осень
Весна
Осень
норма
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
92,0Hb, г/л
75,9±3,8 79,7±2,2 88,1±4,3 82,8±3,0 82,8±4,6 81,2±2,6
82,3±4,2
101,0
СОЭ, мм
4,7
2,5±0,3 2,7±0,4 2,1±0,2 3,6±0,3 0,5±0,07 3,2±0,4
1,7±0,2
Колич.
эритроцитов 1,36 1,11±0,11 1,35±0,04 1,38±0,08 1,51±0,1 1,1±0,09 1,43±0,07 1,20±0,09
*1012 в л
СГЭ, пг
70,2
70,4±9,0 52,9±1,4 58,8±3,8 54,9±3,4 73,7±5,1 53,9±2,4
67,7±5,9
Колич.
45,0лейкоцитов
65,5±7,7 80,3±9,9 72,7±7,4 77,4±11,0
69,1±7,5 78,8±6,9
120,0
*109 в л
ПЭФ, %
4,9
1,73±0,40 1,71±0,32 2,0±0,57 0,05±0,03 2,52±1,86 0,88±0,17 2,08±0,9
ПБФ, %
10,38±1,2 2,62±0,69 0,9±0,27 0,6±0,14 0,12±0,06 1,61±0,41 3,8±0,51
5,55,25±0,84 3,6±0,5
НФ, %
4,96±0,69 7,5±1,25 3,0±0,4 3,0±0,44 2,8±0,56
14,4
ЛФ, %
81,0-89,0 82,3±1,67 86,59±1,6 93,7±0,64 95,6±0,5* 93,7±1,9391,1±1,07*
89,9±1,4
Молодые
0,0
0,66±0,25 0,3±0,11 0,18±0,14 0,28±0,12 0,42±0,19 0,19±0,08
лейкоциты,%
Мн, %
2,3-8,4
0,0
0,91±0,23 0,2±0,08 0,6±0,27 0,5±0,12 0,75±0,25 0,23±0,07
Общее
среднее
M±m
81,8±3,4*
2,4±0,3
1,31±0,08
60,8±4,2
74,0±7,3
1,48±0,56
2,70±0,46
4,41±0,70
90,5±1,2**
0,3±0,1
0,5±0,2
Содержание моноцитов (%) всегда находилось ниже условной нормы.
Отмеченный лимфоцитоз – увеличение содержания лимфоцитов относительно
всего пула клеток, на фоне монопении, а также снижение количества
нейтрофилов и их малой функциональной активности, свидетельствует о
неблагополучном состоянии организма, иммунологической недостаточности,
что может быть спровоцировано хроническим воздействием токсических
веществ или наличием инфекционных заболеваний неизвестной этиологии.
Описанное физиологическое состояние особей леща нельзя оценивать как
угнетенное. По-видимому, наблюдаемая картина крови с её отклонениями есть
результат адаптации организма рыб к существованию в условиях хронического
токсикоза и интенсивной антропогенной нагрузки.
Анализ патоморфологических изменений в структуре эритроцитов леща
Патоморфологические изменения клеток красной крови леща
соответствуют аналогичным нарушениям, обнаруженным в крови особей
судака (табл. 3.3.2). Пойкилоцитоз эритроцитов был выражен, как и у судака,
полиморфностью клеток. Эритроциты с отростками (характерные для
угнетения эритропоэза), встречались единично, у отдельных особей. Осенью
2007 г. у 96% особей в крови рыб регистрировали эритроциты различной
формы, но данное изменение формы вполне обратимо и может быть
возвращено в нормальное состояние при изменившихся условиях.
На мазках крови исследованных особей рыб отмечены случаи амитоза
эритроцитов, находящихся на различных стадиях деления. Отдельно выделяли
эритроциты с ядрами в стадии деления. Снижение частоты встречаемости
данного признака отмечено от весны к осени, что может быть обусловлено
16
физиологическим состоянием организма рыб. Доказано, что при токсическом
воздействии происходит первая ответная реакция организма в виде увеличения
концентрации гемоглобина в крови рыб. Повышение частоты встречаемости
делящихся клеток путем амитоза приводит к увеличению их количества и, как
следствие, к увеличению общего количества гемоглобина. Такая реакция
эритроцитов может иметь компенсаторный характер и служить элементом
адаптации организма рыб при токсикозах. Амитотическое деление эритроцитов
может быть результатом воздействия повреждающих токсических веществ на
ядерные структуры клетки. Разноразмеренность клеток красной крови отмечали
у исследованных особей во все периоды исследования. Однако частота
встречаемости данного показателя у отдельных рыб не превышала 4,3 % от
общего пула эритроцитов, и отражало нормальный процесс гемопоэза. В крови
рыб отмечали эритроциты, находящиеся на стадии разрушения.
Таблица 3.3.2.
Типы цитопатологических нарушений в эритроцитах особей леща
Основные типы
нарушений
Пойкилоцитоз
Анизоцитоз
Агглютинация
Изменение внешней
плазматической
мембраны
Смещение ядер к
периферии
Пикноз
Деформация ядер
Кариорексис
Инвагинация ядра
Разрушение клетки
Ядра-тени
Хроматинолиз
Ядра-кольца
Протуберанцы
Вакуолизация
цитоплазмы
Кариолиз
Шистоциты
Амитоз
Амитоз – деление
только ядра
Количество
исследованных рыб
Количество особей (%) с нарушениями структуры клеток
от общего количества обследованных рыб
2006
2007
2008
Среднее
Осень
Лето
Осень
Лето
Осень
Лето
Осень
68,0*
65,0*
96,0**
100,0
88,0*
83
84
4,0
5,0
52,0*
95,5**
52,0*
50
36
40,0*
15,0*
4,4
41,0*
4,0
28
16
12,0*
30,0*
52,0*
73,0*
88,0*
52
51
0,0
100,0
61,0*
95,5**
80,0*
98
75
60,0*
36,0*
12,0*
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
-
5,0
90,0**
10,0*
50,0*
15,0*
0
20,0*
0,0
-
48,0*
48,0*
39,0*
39,0*
96,0**
44,0*
30,0*
0,0
-
95,5**
86,0*
91,0**
77,0*
95,5**
100
91,0**
45,0*
36,0*
44,0*
76,0*
28,0*
40,0*
72,0*
88,0*
40,0*
80,0*
24,0*
50
88
50
63
55
50
55
-
51
53
26
40
84
66
35
-
0,0
35,0*
17,0*
14,0*
0,0
24
9
0,0
0,0
40,0*
5,0
10,0*
60,0*
26,0*
4,0
30,0*
68,0*
27,0*
55,0*
32,0*
8,0*
28,0*
37
19
58
29
6
33
0,0
70,0**
40,0*
77,0*
40,0*
74
40
25
20
23
22
25
21
24
У всех исследованных рыб в 2008 г. встречались эритроциты в
предгемолитическом состоянии (95% весной и 72% осенью). Полностью
разрушенные эритроциты, ядра-тени, отмечались у всех исследованных рыб
весной и у 88% особей осенью 2008 г. Частота их встречаемости (% от общего
количества исследованных эритроцитов), в среднем, составляла 1,1 % весной и
0,9 % осенью, и не превышала летального порога.
17
При исследовании крови леща (как и судака) регистрировали увеличение
количества (%) особей с цитопатологическими нарушениями в весенний период
(по сравнению с осенью). Снижение частоты встречаемости и интенсивности
проявления цитопатологии к осени может свидетельствовать: о некоторой
стабилизации токсикологических процессов водной среды в осенний период, о
более благополучном физиологическом состоянии рыб после летнего
нагульного периода. Это указывает на влияние сезонного фактора, на
физиологическое состояние рыб. С 2006 по 2008 гг. возросло количество
особей леща с патологическими нарушениями эритроцитов крови –
пойкилоцитоз, анизоцитоз. Возросло с 2006 по 2008 г. количество структурных
нарушений в ядре эритроцитов крови – хроматинолиз, кариолиз, кариорексис
(рис. 3.3.1.).
Анизоцитоз
Кариорексис
Хроматинолиз
120
Пойкилоцитоз
Ядра-тени
Кариолиз
% особей рыб
100
80
60
40
Рисунок 3.3.1.
Уровень (средний %)
цитопатологических
отклонений в эритроцитах
крови леща
20
0
2006
2007
2008
Возросла доля (процентное содержание рыб в выборке) с нарушениями в
структуре ядра эритроцитов периферической крови леща (так же как и судака).
Доля (%) особей леща с присутствием явления кариорексиса в эритроцитах в
2006, 2007, 2008 гг. составила 12%, 24% и 59% соответственно, количество
особей судака с нарушением в структуре ядра (кариорексис) в 2006 г. составило
20%, в 2007г. – 38%, в 2008 г. – 66%. Для периферической крови судака и леща
с 2006 по 2008 гг. отмечено достоверное возрастание количества (%) особей с
другими структурными нарушениями ядра эритроцитов (кариолиз,
хроматинолиз)
Глава 4. Микроядра как элемент структурной патологии эритроцитов
периферической крови рыб
Исследование характера и частоты возникновения микроядер в
эритроцитах периферической крови рыб Волго-Каспийского канала показало,
что в эритроцитах рыб присутствуют относительно крупные, так и мелкие
микроядра (рис 4.1.1). При этом в одной клетке отмечались по 1 - 2 и более
микроядер. Однако наиболее часто присутствовали клетки с одним
микроядром, помимо основного ядра. Учет клеток с микроядрами,
различающимися по форме и их количеству, не проводился.
Вероятность встречаемости эритроцитов с МЯ в периферической крови
при спонтанном мутагенезе, составляет 0,5-1,0%. (Ильинских, 1992; 2009).
Проведенный анализ показал превышение частоты встречаемости эритроцитов
с МЯ в периферической крови судака и леща по сравнению с уровнем,
наблюдаемым при спонтанном мутагенезе (рис. 4.1.2.).
18
а
б
в
Рисунок 4.1.1 Микроядра в эритроцитах периферической крови судака
(а - относительно крупное, б - мелкое, в - 2 микроядра в одном эритроците)
В летний период исследований 2007 и 2008 гг. содержание клеток с
микроядрами в эритроцитах судака было достоверно выше, чем в осенний
период (при p<0,001). В эритроцитах леща отмечена та же тенденция – более
высокая доля клеток с микроядрами в весенний период (рис. 4.1.2.).
Доля (%) клеток с
микроядрами
3,5
3
Лещ
Судак
Фоновый уровень клеток с МЯ
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Весна
Осень
Весна
2007
2007
2008
Сезон и год исследования
Рисунок 4.1.2.
Сезонная изменчивость
частоты встречаемости
эритроцитов с
микроядрами в крови
судака и леща В-К
канала
Осень
2008
Сезонные различия доли клеток с микроядрами связаны с различием
генотоксического воздействия загрязнения воды В-К канала в весенние и
осенние месяцы года. Кроме того, сезонная динамика присутствия эритроцитов
с микроядрами в периферической крови может быть обусловлена изменениями
клеточного метаболизма рыб. Установлены достоверные различия в крови рыб
по содержанию клеток с микроядрами, связанные с развитием их половых
продуктов. Количество эритроцитов с микроядрами у рыб с гонадами II стадии
зрелости достоверно выше по отношению к таковым, имеющим III
(преднерестовую) и VI-II (после нереста) стадии зрелости гонад. Осенью рыба,
отметавшая
икру,
характеризовалась
меньшим
количеством
всех
цитологических нарушений в периферической крови. Обнаружены
достоверные половые различия частоты встречаемости микроядер в
эритроцитах периферической крови рыб. За период исследования количество
клеток с микроядрами у самок судака и леща было достоверно выше по
сравнению с самцами (р<0,001). При статистическом анализе полученных
результатов была обнаружена обратная корреляционная зависимость частоты
19
встречаемости клеток с микроядрами и вероятности встречаемости клеток с
другими признаками цитопатологических нарушений (R ± mr = -0, 58±0,11 при
р<0, 05).
Зависимость доли эритроцитов с МЯ и эритроцитов с другими
нарушениями структуры ядра может быть выражена графически в виде кривой
(рис. 4.1.3), соответствующей распределению Пуассона. Микроядра в ряде
случаев могут образовываться в процессе освобождения клетки от «лишнего»
хроматина, когда клетка после мутационного воздействия «пытается»
восстановить ядерный аппарат (Ильинских Н.Н., 1992; Чеботарева Ю.В., 1996).
В изменившихся условиях клетка переходит на новый уровень своего
функционирования, и «старается» сохранить своё стабильно-динамическое
состояние без особых повреждений
Другие нарушения ядра
35
y = -28,978Ln(x) + 32,431
Рисунок 4.1.3.
Зависимость присутствия
эритроцитов с
микроядрами от
вероятности других
нарушений структуры
ядра в эритроцитах судака
(2007-2008гг.)
R2 = 0,6297
30
25
20
15
10
5
0
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Эритроциты с МЯ
2
2,2
2,4
Образование микроядер в данном случае можно рассматривать как
результат (и вариант) адаптивных процессов. Такие нарушения в структуре
клетки как конденсация ядра (кариопикноз) с последующим его растворением
(кариолизис) или распадом на конденсированные глыбки (кариорексис) можно
рассматривать как начальные стадии повреждения клетки. Чем больше клеток с
предшествующими повреждениями, тем меньше клеток с микроядрами.
Таким образом, формирование клеток с микроядрами может
рассматриваться в качестве индикатора, указывающего на развитие
патологических изменений вследствие действия повреждающих факторов.
Образование микроядер в клетках может представлять собой проявление
реализации компенсаторно-приспособительных процессов клетки.
Анализ взаимосвязи частоты возникновения микроядер с состоянием
показателей периферической крови рыб, с гидрохимической и
токсикологической характеристиками воды В-К канала
При статистической оценке гематологических и цитогенетических
данных обнаружена корреляционная взаимосвязь между количеством
эритроцитов и количеством лейкоцитов в литре крови по отношению к уровню
микроядер в эритроцитах крови рыб. Установлена положительная взаимосвязь
между частотой образования эритроцитов с МЯ и долей лейкоцитарных клеток.
У особей судака в летний период при высоком содержании эритроцитов с МЯ
обнаружено повышенное количество Мн в лейкоформуле крови (R = +0,42,
р<0,01). Обнаружена положительная корреляционная зависимость между
20
содержанием эритроцитов с МЯ в крови леща и количеством Пэф и Пбф в
лейкоформуле крови (R = +0,58 и R = +0,51 соответственно, при р<0,01). У
самок леща обнаружена положительная взаимосвязь высокой степени между
количеством клеток с МЯ и Нф (R= + 0,77; при р < 0,01). Обнаружена прямая
положительная корреляционная зависимость высокой степени между
количеством клеток с микроядрами и содержанием особо опасных металлов в
воде В-К канала. Величина коэффициента корреляции между количеством
клеток с микроядрами и содержанием ртути у судака R=+0,88, леща - R=+0,73;
молибдена R=+0,65 и R=+0,71 соответственно. В составе соединений
минеральных форм азота в воде В-К канала в период 2006-2008 гг. преобладала
нитратная форма. Проведённый анализ показал прямую корреляционную
зависимость между уровнем эритроцитов с микроядрами у рыб и нитратной
формой азота в воде. Обнаружена прямая корреляционная зависимость между
количеством эритроцитов с микроядрами в крови судака и леща и
концентрацией нефти в воде Главного банка в точке отбора проб – Волго–
Каспийском канале, главном судоходном русле с большой антропогенной
нагрузкой (R=+0,45; R=+0,60 соответственно; при р < 0,01).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследование цитофизиологических особенностей крови судака и леща
В-К канала выявило наиболее существенные отклонения в структуре клеток
крови, позволяющие диагностировать изменения, связанные с проявлением
хронического токсикоза рыб. Установлено достоверное влияние сезонного
фактора на физиологическое состояние рыб, состояние гематологических
показателей, их изменение. В крови судака отмечено снижение содержания
гемоглобина в осенний период. В периферической крови леща отмечено
недостаточное содержание гемоглобина относительно «условной нормы»,
значение этого показателя повышалось от весны к осени. Количество
эритроцитов в пересчете на литр крови у обоих видов рыб снижалось осенью.
СГЭ в осенний период исследования у особей рыб повышался на 2,8 пг у
судака, и на 13,8 пг - у леща. От весны к осени в крови леща увеличивалось
абсолютное количество лейкоцитов (×109 в л.) в 1,2 раза. Установлено, что
изменение ряда гематологических показателей проявляется в зависимости от
зрелости гонад. По мере созревания гонад наблюдается повышение
гемоглобина, СГЭ, количество лейкоцитов в пересчете на литр крови. После
нереста (VI-II СЗГ) отмечено снижение гемоглобина, СГЭ и СОЭ. У самок
после нереста возросло количество Нф в 1,4 раза, Мн в 1,5 раза. В среднем у
самок отмечено повышенное количество моноцитов (0,64%) по сравнению с
самцами (0,18%). У самок, находящихся на II СЗГ и в среднем количество
гемоглобина выше. У самцов рыб ниже, чем у самок количество эритроцитов и
лейкоцитов в пересчете на литр крови. Анализ лейкоформулы крови
промысловых рыб выявил отклонения в соотношении лейкоцитарных клеток. В
большинстве случаев отмечен лимфоцитоз на фоне низкого уровня
фагоцитарных клеток (моноцитов и палочкоядерных нейтрофилов), чаще
регистрировались нейтрофилы на стадии молодой клетки, обладающей
незначительной функциональной активностью. Подобная трансформация
21
системы белой крови может являться реакцией организма на постоянную
стрессовую ситуацию. Проведённые исследования свидетельствуют о
проявлении хронического токсикоза промысловых видов рыб в показателях
цитофизиологических особенностей крови и патологических изменениях
форменных элементов в их динамике в условиях высокой антропогенной
нагрузки В-К канала. В крови рыб В-К канала со статистически значимой
вероятностью обнаружены структурные изменения клеток красного ряда,
отличающихся степенью проявления патоморфологических изменений. У
исследованных особей рыб зарегистрированы разнообразные деструктивные
нарушения в строении эритроцитов. К их числу относятся: пойкилоцитоз,
нарушение
осмотической
резистентности
мембраны
эритроцитов,
псевдоагглютинация. Характер отмеченных изменений связан с нарушениями
эритроцитарной мембраны при контакте с физическими, механическими
факторами и химическими компонентами загрязнения воды, обладающими
повреждающим
действием.
Цитопатологический
анализ
клеток
периферической крови рыб позволил выявить разнообразные деструктивные
нарушения ядер клеток - кариопикноз, кариолизис, кариорексис, деформация
ядер, инвагинация ядер и состояние клетки в стадии амитоза. Осенью отмечено
снижение частоты встречаемости и интенсивности проявления деструктивных
изменений в строении эритроцитов по сравнению с летним периодом.
Снижение
частоты
встречаемости
и
интенсивности
проявления
цитопатологических изменений к осени может свидетельствовать: о некоторой
стабилизации токсикологического состояния загрязнения воды в осенний
период, о более благополучном физиологическом состоянии рыб в результате
летнего нагульного периода. Разнообразие форм патологических изменений
структуры эритроцитов, отмеченных в крови рыб и их высокое суммарное
количество, указывает на наличие постоянного стрессорного воздействия
комплекса экзогенных и эндогенных факторов на организм рыб, имеющего
хронический характер.
Развитие деструктивных изменений сопровождается образованием
микроядер в эритроцитах периферической крови судака и леща. Проведенный
анализ обнаружил повышенный уровень частоты встречаемости эритроцитов с
микроядрами в периферической крови судака и леща по сравнению с уровнем,
наблюдаемым при спонтанном мутагенезе. Формирование клеток с
микроядрами может рассматриваться в качестве индикатора, указывающего на
развитие патологических изменений в структуре эритроцитов под действием
генотоксических факторов загрязнения среды. Осенью доля эритроцитов с
микроядрами снизилась в 1,8 раз (судак) и в 1,9 раз (лещ), что связано с общим
снижением концентрации загрязняющих веществ в воде Волго-Каспийского
канала. Установлена достоверная взаимосвязь уровня микроядерности
эритроцитов с другими патологическими процессами, ведущими к нарушениям
структуры ядра клетки (хроматинолиз, кариолиз, кариорексис). Оценка уровня
клеток с микроядрами может служить индикатором состояния организма, его
адаптационных
возможностей,
а
также
уровня
возникновения
цитопатологических изменений в клетке вследствие действия повреждающих
22
факторов. Установлена достоверная прямая положительная корреляция частоты
встречаемости эритроцитов с МЯ и содержанием ртути, молибдена, свинца,
хрома в воде В-К канала. Патологические изменения клеток крови имеют
характер ответной реакции на общее токсическое воздействие соединений
тяжёлых металлов на организм рыб. Обнаружена прямая корреляционная
зависимость между количеством эритроцитов с микроядрами в крови судака и
леща и концентрацией нефти в воде в точке отбора проб В-К канала. Уровень
клеток с микроядрами имеет устойчивые взаимосвязи с другими показателями,
крови, характеризующими физиологическое состояние рыб, а также с
показателями, характеризующими среду их обитания. Таким образом, оценка
частоты встречаемости клеток с МЯ может служить индикатором
физиологического состояния организма рыб, его адаптационных возможностей,
а также уровня нарушений в ядрах клеток вследствие действия повреждающих
факторов внешней и внутренней среды.
Анализ «уровня микроядерности эритроцитов» может применяться для
экспресс-оценки физиологического состояния организма рыб, а также
выявления зон обитания организмов, подвергавшихся воздействию
загрязняющих веществ. Данные цитофизиологических показателей крови,
патологических изменений форменных элементов крови могут служить одним
из объективных критериев оценки физиологического состояния организма рыб
в динамике лет и сезонов и могут быть использованы для ранней диагностики
развития патологического процесса организма рыб в условиях повышенной
антропогенной нагрузки. Изучение морфологических изменений элементов
крови, оценка цитофизиологических особенностей и изменений клеток крови
является необходимым элементом наблюдения за состоянием популяций рыб,
как в рыбоводной практике, так и при прогнозировании динамики популяций в
естественных условиях.
ВЫВОДЫ
В результате анализа цитофизиологических особенностей крови
промысловых рыб Волго-Каспийского канала, исследования динамики
патологических изменений форменных элементов крови, установлено:
1. Существует относительно высокий общий уровень патологии клеток,
разнообразие форм патологических изменений периферической крови рыб
Волго-Каспийского канала, указывающие на наличие постоянного стрессорного
воздействия комплекса экзогенных и эндогенных факторов на организм.
Установлено достоверное влияние сезонного фактора, стадий зрелости гонад и
семенников, а также пола особей на физиологическое состояние рыб и
изменение показателей крови.
2. Осенью доля клеток с нарушениями их морфологической структуры
снижается, что обусловлено общим снижением концентрации загрязняющих
веществ в воде В-К канала и сезонными изменения клеточного метаболизма
рыб.
Количество
особей
рыб
с
патологическими
изменениями
морфологической структуры клеток крови также коррелирует с содержанием
тяжелых металлов в воде канала. Доля особей леща с присутствием явления
кариорексиса в эритроцитах в 2006, 2007, 2008 гг. составила 12%, 24,5% и
23
59,5% соответственно, количество особей судака с нарушением в структуре
ядра (кариорексис) в 2006 г. составило 20%, в 2007г. – 38,5%, в 2008 г. – 66%.
3. Выявлено повышение количества лимфоцитов относительно общего
количества лейкоцитарных клеток и «условной» нормы во все сезоны
исследования. Содержание нейтрофилов, чаще регистрируемых на стадии
миелоцита, снижается от весны к осени у судака на 0,37 % и леща на 1,65 %.
4. Частота встречаемости эритроцитов с микроядрами в крови рыб зависит от
сезона года, гидрохимического и токсикологического состояния воды В-К
канала. Осенью доля эритроцитов с микроядрами снижается (в 1,8 раз в крови
судака и в 1,9 раз - леща), что связано со снижением концентрации
загрязняющих веществ в воде В-К канала. Обнаружена прямая положительная
корреляция между количеством клеток с микроядрами и содержанием ртути
(судак R=+0,88, лещ R=+0,73), а также молибдена (судак R=+0,65, лещ
R=+0,71).
5. Установлена прямая положительная корреляция между количеством
эритроцитов с МЯ и долей лейкоцитарных клеток в периферической крови. У
особей судака в летний период исследования при высоком уровне эритроцитов
с МЯ отмечено повышенное количество моноцитов в лейкоформуле крови
(R=+0,42, р<0,01). Обнаружена прямая положительная корреляция между
содержанием эритроцитов с МЯ и количеством псевдоэозинофилов (R=+0,58) и
псевдобазофилов (R=+0,51) в лейкоформуле крови леща при р < 0,01.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Количество клеток с микроядрами имеет устойчивую взаимосвязь с
другими показателями крови, отражающими физиологическое состояние
организма рыб, и отражает состояние среды их обитания, поэтому:
1. Показатель «уровень микроядер в эритроцитах периферической крови
промысловых рыб» может быть использован в качестве объективного критерия
для дифференциальной диагностики результатов нормального процесса
гемопоэза или патологического его течения.
2. Доля эритроцитов с микроядрами в периферической крови рыб
рекомендуется для применения в качестве индикатора экспресс-оценки
состояния популяций рыб, а также для оценки состояния среды их обитания.
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ
1. Кузина Т.В. Анализ гематологических показателей судака Волго-Каспийского канала
/Т.В. Кузина // Естественные науки. – Астрахань, 2009.- №4 (29)- С. 96-100.
2. Кузина Т.В.. Образование микроядер в эритроцитах промысловых рыб ВолгоКаспийского канала / Т.В. Кузина // Естественные науки. – Астрахань, 2010.- №4 (33). – С.
124 -129.
3. Кузина Т.В. Изменения структуры ядра эритроцитов периферической крови
промысловых рыб Волго-Каспийского канала. / Т.В. Кузина // Вестник Московского
государственного областного университета. Серия «Естественные науки». – М. : Изд-во
МГОУ, 2011 - № 2. – С. 50-57.
24
Статьи в научных сборниках, журналах и материалах конференций
4. Самсукова Т. В. (Кузина Т.В.) Микроядерное тестирование состояния воздушной среды /
Т.В. Самсукова, Е.В. Щепетова, В.В. Савин, Е.С. Лебедева // Материалы межвузовской
конференции молодых ученых РГПУ. Герценовские чтения. - СПб. Изд-во «ТЕССА», 2005. Выпуск 5.- С.36-38.
5. Самсукова Т.В. (Кузина Т.В.) Оценка генотоксического влияния загрязнения
атмосферного воздуха методом микроядерного тестирования / Т.В. Самсукова, Е.В.
Щепетова, Н.В. Марченко, Е.С. Уланова // Материалы межвузовской конференции молодых
ученых РГПУ. - Герценовские чтения.- СПб: Изд-во «ТЕССА», 2006. - Выпуск 6. – С. 43-44.
6. Самсукова Т. В. (Кузина Т.В.) Оценка состояния атмосферного воздуха территорий
Кировского района г. Астрахани методом микроядерного тестирования / М.Ф. Козак, Е.В.
Щепетова, Т.В. Самсукова /Материалы IX Международной конференции: «Экологобиологические проблемы бассейна Каспийского моря». – Астрахань: Издательский дом
«Астраханский университет», 2006. - С. 251-255.
7. Самсукова Т. В. (Кузина Т.В.) Частота встречаемости эритроцитов с микроядрами в
периферической крови судака Stizostedion luciperca Волго-Каспийского канала / Т.В.
Самсукова // Материалы докл. XIII Международной молодежной школы-конференции. –
Рыбинск, 2007. – С. 168-174
8. Самсукова Т. В. (Кузина Т.В.) Взаимосвязь частоты встречаемости эритроцитов с
микроядрами в периферической крови судака при отклонениях по гематологическим
показателям / Т.В. Самсукова // Материалы X Международной научно-практической
конференции, посвященной 450-летию Астрахани.- Астрахань, 2008.- С.107-109.
9. Самсукова Т.В. (Кузина Т.В.) Гематологические показатели судака (Stizostedion luciperca)
Волго-Каспийского канала / Т.В. Самсукова // Материалы Международной научнопрактической конференции «Комплексный подход к проблеме сохранения и восстановления
биоресурсов Каспийского бассейна». – Астрахань, 2008. – С. 280-284.
10. Кузина Т.В. Анализ патологических форм эритроцитов крови судака (Stizostedion
luciperca) Волго-Каспийского канала / Т.В. Кузина // Материалы 1-ой международной
телеконференции «Фундаментальные медико-биологические науки и практическое
здравоохранение». – Томск, 2010. – С. 105-107
11. Kuzina T.V. Analysis of hematological parameters of zander (Stitostedium lucioperca) of the
Volga Caspian channel / T.V. Kuzina // Biological research. – Astrakhan, № 1, 2009. – P. 6-10.
12. Кузина Т.В. Использование цитогенетических и цитогематологических показателей рыб в
системе комплексного биологического мониторинга / Т.В. Кузина // Международная научнопрактическая конф. «Фундаментальные и прикладные исследования университетов,
интеграция в региональный инновационный комплекс»: Докл. молодых ученых в рамках
программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», «У.М.Н.И.К.»
/Астрахан. гос. техн. ун-т. – Астрахань: Изд-во АГТУ, 2010. – Т.2. – С.122-124.
13. Кузина, Т. В. Цитогенетические нарушения в эритроцитах промысловых видов рыб
Волго-Каспийского канала / Т.В. Кузина // Экокультура и фитобиотехнологии улучшения
качества жизни на Каспии: /Материалы Международной конференции с элементами научной
школы для молодежи. – Астрахань, Издательский дом «Астраханский университет», 2010. –
С.300-303.
14. Кузина, Т.В. Гематологические показатели судака Stizostedion luciperca ВолгоКаспийского канала / Т.В. Кузина // Материали за 6-а международна научна практична
конференция, «Научният потенциал на света». - София : «Бял ГРАД-БГ» ООД. – 2010,
Том.6. - С.52-57.
15. Кузина, Т. В. Цитогенетическое исследование клеток крови и оценка иммунного статуса
судака р. Волги / Т.В. Кузина // Экология и жизнь: Сборник статей XIX Международной
научно-практической конференции. – Пенза. Приволжский Дом знаний. - 2010. – С.22-24.
25