ТКП/РП Производство лекарственных средств КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА, ДОКЛИНИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ
advertisement
ТЕХНИЧЕСКИЙ КОДЕКС УСТАНОВИВШЕЙСЯ ПРАКТИКИ ТКП/РП Производство лекарственных средств КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА, ДОКЛИНИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ПОЛУЧЕННЫХ НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК Вытворчасць лекавых сродкаў КАНТРОЛЬ ЯКАСЦІ, ДАКЛIНIЧНЫЯ I КЛIНIЧНЫЯ ВЫПРАБАВАННI ЛЕКАВЫХ СРОДКАЎ, АТРЫМАНЫХ НА ПАДСТАВЕ ТЭХНАЛОГІІ РЭКАМБІНАНТНАЙ ДНК Настоящий проект технического кодекса установившейся практики не подлежит применению до его утверждения Департамент фармацевтической промышленности Министерства здравоохранения Республики Беларусь Минск ТКП/РП УДК МКС 11.120.10 Ключевые слова: лекарственные средства, производство, контроль качества, доклинические исследования, клинические исследования, рекомбинантная ДНК, технология КП 01 Предисловие Цели, основные принципы, положения по государственному регулированию и управлению в области технического нормирования и стандартизации установлены Законом Республики Беларусь «О техническом нормировании и стандартизации». 1 РАЗРАБОТАН Научно-производственным республиканским унитарным предприятием «ЛОТИОС». ВНЕСЕН Департаментом Республики Беларусь фармацевтической промышленности Министерства здравоохранения 2 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Департаментом фармацевтической промышленности Министерства здравоохранения Республики Беларусь от «___»_________ 201__ г. №______ 3 Настоящий технический кодекс гармонизирован с международным нормативным документом ЕС CHMP/BMP/3088/99 «Note for Guidance on the quality, preclinical and clinical aspects of gene transfer medicinal products (Примечание к руководству по качеству, доклиническим и клиническим испытаниям лекарственных средств, полученных путем переноса генов). 4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ Настоящий проект технического кодекса установившейся практики не подлежит применению до утверждения Издан на русском языке II ТКП/РП Содержание 1 Область применения ................................................................................................................................. 1 2 Нормативные ссылки ................................................................................................................................ 1 4 Сокращения и обозначения ...................................................................................................................... 4 5 Общие положения ..................................................................................................................................... 4 5.1 Производственная генетика ...................................................................................................................... 4 5.2 Производство .............................................................................................................................................. 5 5.3 Очистка ....................................................................................................................................................... 6 5.4 Характеристика продукта .......................................................................................................................... 6 5.5 Систематический и текущий контроль качества переработанной продукции ..................................... 7 6 Контроль качества лекарственных средств ............................................................................................ 8 6.1 Лекарственные средства на основе плазмидной ДНК ............................................................................ 8 6.2 Невирусные векторы для передачи трансгенов .................................................................................... 11 6.3 Вирусные векторы.................................................................................................................................... 12 6.4 Лекарственные средства на основе клеток ............................................................................................ 13 7 Использование генетически модифицированных организмов (ГМО) .............................................. 16 8 Доклиническая оценка лекарственных средств, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК ............................................................................................................................. 17 8.1 Общие положения .................................................................................................................................... 17 8.2 Специфические аспекты доклинических испытаний ........................................................................... 17 8.3 Потенциальная эффективность ............................................................................................................... 20 8.4 Фармакологическая (токсикологическая) оценка лекарственных средств, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК ......................................................................................................... 20 9 Оценка клинической эффективности и безопасности ......................................................................... 24 9.1 Основные вопросы ................................................................................................................................... 24 9.2 Исследования фармакологии на человеке ............................................................................................. 24 9.3 Исследования эффективности................................................................................................................. 25 9.4 Безопасность ............................................................................................................................................. 25 9.5 Контроль пациентов ................................................................................................................................. 26 III ТКП/РП ТЕХНИЧЕСКИЙ КОДЕКС УСТАНОВИВШЕЙСЯ ПРАКТИКИ Производство лекарственных средств КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА, ДОКЛИНИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ПОЛУЧЕННЫХ НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК Вытворчасць лекавых сродкаў КАНТРОЛЬ ЯКАСЦІ, ДАКЛIНIЧНЫЯ I КЛIНIЧНЫЯ ВЫПРАБАВАННI ЛЕКАВЫХ СРОДКАЎ, АТРЫМАНЫХ НА ПАДСТАВЕ ТЭХНАЛОГІІ РЭКАМБІНАНТНАЙ ДНК Manufacture of medicinal products Quality control, preclinical and clinical investigation of medicinal products based on recombinant DNA technology Дата введения 201х – хх – хх 1 Область применения Настоящий технический кодекс установившейся практики (далее – технический кодекс) распространяется на лекарственные средства, полученные на основе технологии рекомбинантной ДНК. Настоящий стандарт устанавливает общие требования в отношении качества, доклинических и клинических испытаний лекарственных средств, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК. Настоящий технический кодекс предназначен для продукции, поступающей на процедуру регистрационного удостоверения в Республике Беларусь, а также к импортируемым лекарственным средствам. Настоящий технический кодекс не распространяется на химически синтезированные олигонуклеотиды, например антисмысловые олигонуклеотиды или РНК/ДНК химеры. Настоящий технический кодекс может быть использован в производстве ветеринарных препаратов. 2 Нормативные ссылки В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие технические нормативные акты в области технического нормирования и стандартизации (далее – ТНПА): ТКП 030-2013 (02040) Надлежащая производственная практика ТКП 125-2008 (02040) Надлежащая лабораторная практика ТКП 184-2009 (02040) Надлежащая клиническая практика ТКП ХХХХ-ХХХХ (02041) Производство лекарственных средств. Лекарственные средства на основе технологии рекомбинантной ДНК ТКП ХХХХ-ХХХХ (02041) Производство лекарственных средств. Клеточные субстраты ТКП ХХХХ-ХХХХ (02041) Производство лекарственных средств. Лекарственные средства на основе плазмы крови ТКП ХХХХ-ХХХХ (02041) Производство лекарственных средств. Лекарственные средства на основе ксеногенных клеток. ТКП ХХХХ-ХХХХ (02041) Производство лекарственных средств. Контроль качества, доклинические и клинические исследования лекарственных средств на основе технологии рекомбинантной ДНК Примечание – При пользовании настоящим техническим кодексом целесообразно проверить действие ТНПА по каталогу, составленному на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочные ТНПА заменены (изменены), то при пользовании настоящим техническим кодексом следует руководствоваться замененными (измененными) ТНПА. Если ссылочные ТНПА отменены без замены, то положение, в котором дана ссылка на них, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку. 3 Термины и определения В настоящем техническом кодексе применяют следующие термины с соответствующими определениями, установленные в [1], ТКП 030, ТКП ХХХХ Производство лекарственных средств. Лекарственные средства на основе технологии рекомбинантной ДНК, а также следующие термины с соответствующими определениями: 3.1 аденоассоциированные вирусы, ААВ (adeno-associated viruses, AAV): Дефектные сателлитные парвовирусы (род Dependovirus), репродукция которых зависит от присутствия в клетке вируса-помощника (аденовируса или вируса герпеса), хотя при определенных условиях in vitro они способны размножаться в 1 ТКП/РП культуре клеток в отсутствии вируса-помощника. Широко распространенная в природе группа вирусов, способных поражать человека, приматов, копытных и птиц. При инфекции клеток геном аденоассоциированного вируса способен интегрировать в состав хозяйской хромосомы. Места интеграции в составе хромосомы являются специфическими для некоторых типов клеток-хозяев. Это свойство аденоассоциированных вирусов используют при конструировании векторов для генной терапии 3.2 адъюванты (adjuvants): Вспомогательные факторы различного происхождения и различной химической природы, оказывающие неспецифическое стимулирующее действие на иммунный ответ при совместном их применении со специфическими антигенами; вещества, повышающие иммунный потенциал вакцин. В качестве адьювантов. используются убитые микроорганизмы (микобактерии, коринебактерии, нокардии и др.), органические вещества (бактериальные полисахариды и липополисахариды, лецитин, холестерин, ланолин, агар, глицерин, желатина, крахмал, пектины, протамины и др.), неорганические вещества (гидроксид алюминия, фосфат алюминия, хлорид кальция, фосфат кальция, гидроксид железа, аммониево-калиевые квасцы, минеральные масла и др.), синтетические вещества (нуклеотиды, полианионы и др.). Кроме простых адьювантов используют сложные, представляющие собой смеси липидов с минеральными сорбентами, масел с липополисахаридами и эмульгаторами, микроорганизмов с маслами и др. веществами. 3.3 антисмысловой олигонуклеотид (antisense oligonucleotide): Искусственный (реже природный) олигонуклеотид, который комплементарен фрагменту мРНК, благодаря чему способен образовывать с ней гибрид и ингибировать ее нормальную трансляцию на рибосомах. Это ингибирование в отличие от выключения гена в результате его выключения или деградации РНК при РНК-интерференции обратимо и требует продолжительного присутствия антисмыслового олигонуклеотида. Различные химические модификации антисмыслового олигонуклеотида. повышают его стабильность в клетке и усиливают связывание с РНК-мишенью. Преимущество антисмысловой технологии, основанной на антисмысловом олигонуклеотиде, состоит в том, что она позволяет конструировать специфические ингибиторы экспрессии любого представляющего интерес гена, основываясь лишь на знании его нуклеотидной последовательности 3.4 аутоантитело: Антитело, формирующееся в организме под действием аутоантигена против его собственных клеток. 3.5 аутоиммунное заболевание (autoimmune disease): Заболевание, в основе которого лежит реакция образующихся аутоантител (см. Аутоантитело) с собственными тканями организма. 3.6 ауторепликация: Процесс самовоспроизведения макромолекул нуклеиновых кислот, обеспечивающий точное копирование генетической информации и передачу ее от поколения к поколению. 3.7 временной ген (temporal gene): :Ген, регулирующий время и место проявления активности какогото другого гена (генов). 3.8 «голый» ген (naked gene): Ген, входящий в состав выделенной из организма или химически синтезированной ДНК, который вводят в организм в чистом виде при генной терапии без включения его в липосомы, вирусы или другие носители. 3.9 гомологичные белки (homologous proteins): Белки, имеющие сходную структуру, общее эволюционное происхождение и выполняющие одинаковую функцию у разных видов организмов, например гемоглобины. 3.10 дикий тип (wild type): Наиболее часто встречающийся в природной популяции фенотип, признаки которого детерминированы «нормальными» (немутантными) аллелями. 3.11 дикого типа аллель (wild type allele), дикого типа ген (wild type путу): Аллель, кодирующий фенотипическую характеристику, свойственную дикому штамму (виду) организма, наиболее широко представленному в данной природной популяции. 3.12 диссеминация (dissemination): Распространение возбудителя инфекционной болезни из первичного очага по кровеносным и лимфатическим путям в пределах одного органа или всего организма. Синоним: обсеменение. 3.13 ёмкость вектора (vector capacity): Максимальный размер рекомбинантной ДНК (в тыс. пар нуклеотидов), которая может быть клонирована в данном векторе. 3.14 интеин (intein): «Белковый интрон», специфическая аминокислотная последовательность, состоящая из 130—1600 аминокислот, которая самовырезается из белка. 3.15 интрон: Участок ДНК, который является частью гена, но не содержит информации о последовательности аминокислот белка. 3.16 кассета (cassette): В генной инженерии нуклеотидная последовательность ДНК, содержащая блок различных регуляторных элементов и один или более структурных генов, которая как единое целое переносится в геном клетки и обеспечивает экспрессию одного или более генов. 3.17 кодирующая ёмкость ДНК: Ориентировочное количество полипептидов, которое может быть закодировано данным количеством ДНК (максимально – т. е. исключая возможное наличие интронов; минимально – не учитывая возможные перекрывающиеся гены). Считается, что 1 мегадальтон двухцепочечной ДНК кодирует полипептиды общей молекулярной массой 60-70 тыс. дальтон. 2 ТКП/РП 3.18 упаковывающая клеточная линия (packaging cell line): Линия клеток, созданная для продуцирования (упаковки) вирусных частиц, не содержащих инфекционных нуклеиновых кислот. Она содержит все компоненты, необходимые для формирования вирусной частицы. 3.19 персистентность: Количественный показатель, характеризующий скорость элиминации из популяции вредной мутации. Персистентность, обозначаемая как С, равна 1 / i, где i — вероятность элиминации мутантной особи (т. е. среднее уменьшение скорости размножения носителей определенной мутации). 3.20 пролиферация (proliferation): Разрастание ткани организма путём размножения клеток делением. 3.21 промотор (promotor): Нуклеотидная последовательность, прилежащая к началу кодирующей области гена, которая ответственна за инициацию его транскрипции; с ней специфически связывается фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза. 3.22 резистентность (resistance): Способность организма или клетки оставаться невосприимчивыми к неблагоприятным внешним воздействиям; устойчивость организма к действию физических, химических, биологических объектов (агентов), вызывающих патологическое состояние. 3.23 репортерный ген (reporter gene): Ген, кодирующий легко выявляемый продукт, активность которого в норме отсутствует в клетках. Такие гены используют, например, для того, чтобы убедиться, что данная генетическая конструкция успешно введена в клетку, орган или ткань и сохраняет способность экспрессироваться (например, гены хлорамфеникола, цетилтрансферазы, люциферазы, бетагалактозидазы, «цветных» белков и др.). 3.24 спейсер, спейсерная ДНК (spacer, spacer DNA): 1) Нуклеотидная последовательность эукариотических и некоторых вирусных геномов, разделяющая функционально сходные повторяющиеся гены в генном кластере; 2) нуклеотидные последовательности ДНК в промежутках между адресными сайтами для ДНК-связывающих белков в эукариотических промоторах. 3.25 сплайсинг (splicing): Процесс реорганизации молекул нуклеиновых кислот и белков, протекающий после их первичного синтеза, который заключается в вырезании из длинной молекулы отдельных фрагментов и ковалентного соединения между собой остающихся. 3.26 сплайсинг РНК: Вырезание из молекулы первичного транскрипта участков, транскрибированных с интронов (и спейсеров), и соединение нуклеотидных последовательностей, транскрибированных с экзонов, завершающиеся формированием зрелой молекулы РНК. 3.27 сплайсинг ДНК: Рекомбинационный процесс, включающий образование двунитевых разрывов в ДНК и соединение нуклеотидных последовательностей в новых комбинациях. Сплайсинг ДНК ведет к перегруппировке генов, благодаря таким рекомбинациям создается разнообразие белков, например иммуноглобулинов (антител). 3.28 сплайсинг белка: Вырезание из белка-предшественника интеинов и соединение экстеинов с образованием зрелого белка. Процесс сплайсинга белка нашел применение в биотехнологии для очистки рекомбинантных белков и для получения полусинтетических белковых продуктов. 3.29 субклоны (subclones): Рекомбинантные молекулы ДНК, полученные в результате субклонирования. 3.30 субклонирование (subcloning): Перенос части уже клонированной молекулы ДНК в другой клонирующий вектор. Субклонирование используют для секвенирования длинных фрагментов ДНК, а также для получения различных сложных генно-инженерных конструкций. 3.31 толерантность (tolerance): 1) В иммунологии — отсутствие или ослабление иммунного ответа на данный антиген при сохранении иммунореактивности ко всем прочим антигенам; 2) в токсикологии и фармакологии — снижение чувствительности организма к токсичным и фармацевтическим препаратам (например, к наркотикам), способность организма переносить их воздействие без развития соответствующего терапевтического или токсического эффекта. 3.32 трансген (transgene): Фрагмент ДНК, переносимый при помощи генно-инженерных манипуляций в геном определённого организма с целью модификации его свойств. 3.33 трансдукция (transduction): Перенос фрагментов ДНК (генов) из одной бактериальной клетки в другую, осуществляемый умеренными или вирулентными бактериофагами, который приводит к изменению наследственных свойств клетки-реципиента. При трансдукции в вирионы попадает ДНК клетки-хозяина, затем вирионы заражают другие клетки, и ДНК исходной бактериальной клетки проникает в другую бактериальную клетку. 3.34 тропизм вирусов (tropism of viruses): Совокупность штаммов бактерий, типов клеток или видов одно- и многоклеточных организмов, где может размножаться вирус определенного вида (штамма); Тропизм вирусов ограничивается теми клетками, которые экспрессируют рецепторы, используемые вирусами для проникновения в клетку. 3.35 химерная ДНК (chimeric DNA): ДНК, полученная с помощью генной инженерии путем искусственного соединения in vitro фрагментов ДНК разного происхождения. 3.36 экзон (exon): Участок ДНК гена, с которого считываются последовательности зрелых молекул мРНК. 3.37 экстеин (extein): N- и С-концевые последовательности полипептида, образующиеся после вырезания интеина их белка-предшественника в результате сплайсинга белка. 3 ТКП/РП 3.38 энхансер (enhancer): Регуляторная нуклеотидная последовательность, которая повышает (усиливает) экспрессию генов и может функционировать в разной ориентации и в любых положениях относительно промотора. Характерными свойствами энхансера являются его способность осуществлять регуляторное действие на промотор на больших расстояниях от него (более 60 т.п.о.), независимость его активности от ориентации по отношению к промоторам и от расположения относительно регулируемого гена. Энхансер увеличивает эффективность транскрипции гена в десятки и сотни раз. Важной характеристикой энхансера является его способность активировать любой промотор, расположенный сравнительно недалеко. 4 Сокращения и обозначения В настоящем техническом кодексе применяют следующие сокращения и обозначения: ЛС: лекарственное средство NAT: методика с использованием амплификации нуклеиновой кислоты RT-NAT: методика с использованием обратной транскриптазы и амплификации нуклеиновой кислоты RCA: аденовирусы, способные к репликации RCR: ретровирусы, способные к репликации 5 Общие положения 5.1 Производственная генетика 5.1.1 Для разработки ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, необходимо обоснование, в котором должна быть предоставлена информация относительно пригодности векторных системы и системы доставки вектора, а также данные по контролю и стабильности экспрессии гена. 5.1.2 Каждый элемент экспрессионной конструкции (включая важнейшие области переноса) должен быть документирован и описан. Описание должно включать особенности их природы, идентификации, выделения, так же как инуклеотидные последовательности и функции, включая регуляторную и кодирующую ёмкость. Последовательность должна быть идентифицирована и подтверждена соответствующими методами. 5.1.3 Включение в экспрессионную конструкцию ожидаемых модификаций, например, сайтспецифических мутаций, делеций, перестроек, должны быть детализированы для каждого компонента, который сравнивается с природным эквивалентом. 5.1.4 Следует дать обоснование выбора вышеприведенных элементов, которое должно быть подтверждено рядом научных данных относительно функций этих элементов и их включения в экспрессионную конструкцию. 5.1.5 Для экспрессионной конструкции, которая включает элементы транскрипции, контролирующие экспрессию трансгена, например, временным или сайт-специфичным способом, суммарные данные должны доказать такую специфичность через характеристику продукта и контроль точного включения в нужный сайт. 5.1.6 Должны быть даны перекрестные ссылки на детальных отчеты, включающих соответствующие части доклинических и клинических досье. 5.1.7 Селективные маркеры, например, гены устойчивости к антибиотикам, используемые в процессе скрининга, производства и хранения ЛС, должны быть тщательно оценены относительно потенциального отрицательного воздействия на стандартные методы лечения отдельных заболеваний человека. Где это возможно, должны быть сделаны выводы во избежание их использования. 5.1.8 Основная конструкция, которая может быть использована во включенных различных экспрессионных кассет, должна подвергаться постоянному пересмотру, отражающему современную научную точку зрения на пригодность специфического маркерного гена. 5.1.9 Должны быть предоставлены подробности того, как экспрессионная конструкция включена в вектор, включая информацию о нуклеотидных последовательностях, которые необходимы для репликации экспрессионной конструкции в прокариотических или эукариотических клетках. 5.1.10 Должны быть полностью охарактеризованы клетки, используемые для амплификации генетического материала. Характеристика должна включать историю линии клеток, ее идентификацию, характеристику и потенциальные вирусные контаминанты. Особое внимание необходимо уделить возможности перекрестной контаминации другими клетками или вирусами. 5.1.11 Степень точности репликационной системы должна быть подтверждена для того, чтобы гарантировать отсутствие повреждений и гомогенность амплифицированных нуклеиновых кислот. Должны быть получены доказательства, что правильная нуклеотидная последовательность была сконструирована, и что она сохраняется стабильной во время всех стадий амплификации перед переносом, а также что ген, используемый для лечения, сохраняется неповрежденным при последующем переносе. 4 ТКП/РП Пример -- Ген, содержащий повреждения в основных последовательностях, может обуславливать аномальный белок, который может иметь неприемлемые биологическую и (или) иммунологическую активности. 5.1.12 Процедура переноса предполагает вставку копий генетического материала, включенного в большие количества клеток-мишеней. Вследствие этого, перед использованием необходимо очищать и охарактеризовать генетический материал так детально, как возможно, В этом отношении следует использовать научные принципы, приведенные в [2]. 5.1.13 Для вирусных векторов, необходимо предоставить полную информацию о природе, истории и биологических характеристиках исходного вируса. 5.1.14 Должны быть предоставлены полное описание и характеристика части (частей) вирусного генома, в который вводится экспрессионная конструкция, модификации любой другой части вирусного генома и любые другие последовательности нуклеиновых кислот (например, промоторы), включенные в рекомбинантный вирусный геном. 5.1.15 Плазмида, вирусный вектор и (или) клеточные банки должны быть идентифицированы, охарактеризованы и подлежать периодическому контролю качества. Любой компонент вектора, отличный от нуклеиновой кислоты, который добавляется или модифицируется в целях переноса генов, должен быть детально описан, включая происхождение, идентификацию, физико-химические и функциональные характеристики, а также ожидаемую функцию в конечном продукте. 5.2 Производство 5.2.1 ЛС, полученные на основе технологии рекомбинантной ДНК, должны производиться из хорошо охарактеризованных клеточных линий или клеточных банков в отношении их идентичности, микробиологической чистоты и вирусологического контроля. 5.2.2 Качество всех реагентов, используемых в производстве, должно быть соответственно контролируемо и документировано, включая заключение о соответствии продукции утвержденным нормативным документам и Государственной фармакопее Республики Беларусь [1]. Все сырьё, используемое в производстве и очистке, должно быть описано, включая контроль качества. 5.2.3 Неприемлемо использовать продукцию, о которой известно, что ее агенты усиливают чувствительность у отдельных пациентов, например, бета-лактамные антибиотики, или какие-либо токсические реагенты, например, этидия бромид. 5.2.4 Внутрипроизводственный контроль необходим для всесторонней характеристики конечного продукта, что является основным для контроля качества бактериальных и вирусных вакцин, полученных традиционными методами, и более новых продуктов, полученных на основе рекомбинантной ДНК. 5.2.5 Для того, чтобы представить общие сведения о процессе, в дополнение к детальному описанию, представляют карту обозначения стадий процесса и карту контроля качества основных стадий производственного процесса. 5.2.6 Контроль качества конечного продукта и контроль основных стадий производства должны быть полностью описаны и валидированы. 5.2.7 В некоторых случаях, конструкции могут содержать комплексы нуклеиновых кислот с поликатионами, белками (например, трансферрином) или полимерами (например, полилизином), или связаны с носителями (например, липосомами или пептидами) для усиления специфичности и эффективности ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК. Каждый компонент готовой формы ЛС может быть произведен индивидуально и затем реконструирован непосредственно перед использованием. В любом случае, в дополнение к полному описанию природы производственного процесса, все компоненты конечного продукта, полученного в результате переноса генов, должны быть тщательно охарактеризованы и являться предметом контроля качества и требований нормативной документации (см. раздел 6.2). 5.2.8 В случае вирусных векторов, конструкция исходного вирусного вектора должна осуществляться в соответственно подготовленных линиях клеток-носителей под надлежащим контролем условий, чтобы избежать загрязнения случайными агентами. Поэтому следует предоставлять полную информацию об упаковывающей клеточной линии, включая природу и, где это возможно, локализацию вирусной нуклеиновой кислоты-помощника и кодируемые ею белки (функции). Природа, идентификация, физико-химические и функциональные характеристики линии клеток, так же, как и детали присутствия или отсутствия эндогенных вирусных частиц и последовательностей должны быть описаны. Необходимо установить главный и рабочий банки клеток, детально их охарактеризовать и подвергать периодическому контролю качества. Необходимо предоставить доказательства отсутствия контаминации посторонними агентами (см также раздел 6.3). 5.2.9 Нежеланная вариабельность культуры клеток в процессе производства может приводить к изменениям в продукте, уменьшению выхода продукта производства, и (или) привести к количественным и качественным различиям в присутствующих примесях. Процедуры должны обеспечивать соответствие условий производства, как того требует конечная продукция. 5 ТКП/РП 5.2.10 Расширение масштабов культивирования и (или) очистки проводят от лабораторных условий к полномасштабному коммерческому производству. Это может иметь последствия для качества ЛС, включая воздействие на его биохимические и биологические свойства, и поэтому последствия для контрольных испытаний. Должны быть проведены соответствующие исследования сопоставимости чтобы доказать, что свойства произведенного ЛС существенно не изменятся при изменении масштабов деятельности. Критерии для определения сопоставимости ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, после производственных изменений должны быть полностью обоснованы. 5.2.11 Полученный продукт должен быть четко определен. Каждое контрольное испытание должно быть полностью описано и валидировано. Должно быть предоставлено четкое определение «серия» или «партия» конечного произведенного продукта. Полное описание и характеристики всех материалов, используемых для производства, должны быть предоставлены или они должны быть качества, подходящего для фармацевтических производств. Допустимые пределы для чистоты, стабильности состава и выхода продукта должны быть указаны и обоснованы (см. 5.4 и 5.5). 5.2.12 Для получения вирусного вектора должны быть использованы система посевных материалов и (или) система банков клеток. Эти системы и банки следует полностью описать, с обязательным контролем на каждой стадии. Должны быть приняты меры предосторожности по предотвращению инфекции линий клеток-носителей вирусами дикого типа, которые должны приводить к формированию рекомбинантных вирусов, способных к репликации. 5.2.13 Генетически модифицированные соматические клетки сами могут быть лекарственными средствами, полученными на основе технологии рекомбинантной ДНК, в которые включен и экспрессирован ген, представляющий интерес, например, фибробласты. миобласты, эпителиальные клетки или другие типы клеток (см раздел 6). Этого можно достигнуть путем роста in vitro до достаточных размеров для введения одному или более пациентам, имеющим то же заболевание. 5.2.14 При другом подходе, генетически модифицированные клетки могут быть выращены в коллагеновом каркасе или в другой приемлемой матрице или инкапсулированы для производства «новых органов», которые секретируют специфический белок, используемый для лечения. В таком случае необходимо предоставить полную документацию о происхождении, истории соматических клеток, включая их гистосовместимость и иммунологический фенотип. Необходимо показать гомогенность и генетическую стабильность клеток. 5.2.15 Любое наблюдаемое изменение клеточной морфологии, функций и поведения, например, миграционные характеристики генетически модифицированных соматических клеток по сравнению с исходными немодифицированными клетками, должно быть хорошо задокументировано во всех частях пакета документов. 5.2.16 Главный банк клеток и рабочий банк клеток должны быть установлены, детально охарактеризованы и подлежать периодическому контролю качества. Доказательства чистоты от контаминации случайными агентами, в том числе вирусными векторами дикого типа, должны быть существенными. 5.2.17 Должно быть задокументировано качество всех компонентов, используемых для производства. 5.2.18 Для защиты клеток реципиента используют любые возможные методы. 5.2.19 Иммунная система должна быть рассмотрена как часть конечного продукта. Следовательно, необходимо ее характеризовать, подвергать контролю качества и требований нормативной документации к готовому ЛС. 5.3 Очистка 5.3.1 Потенциальные примеси, содержащиеся в конечном продукте, будут влиять на природу ЛС и выбор производственного процесса. Должен быть выбран соответствующий процесс очистки, который должен обеспечивать эффективное удаление примесей, возникающих в процессе, на необходимом уровне. 5.3.2 Все процессы производства, которые включают культуры клеток, следует контролировать на присутствие посторонних вирусов. 5.3.3 Риск загрязнения конечного продукта посторонними вирусами должен быть минимизирован тщательным исследованием банка клеток, промежуточных и конечных продуктов на присутствие посторонних вирусов. 5.3.4 Кроме того, должны быть отобраны сырьевые материалы биологического происхождения, которые подверглись тщательному тестированию и произведены в процессе, валидированном на удаление случайных и эндогенных вирусов. 5.4 Характеристика продукта 5.4.1 Тщательное исследование произведенного конечного продукта или, где необходимо, конечного продукта и его отдельных компонентов является принципиальным, и их стабильность должна быть установлена в соответствующих пределах молекулярными или биологическими методами. 6 ТКП/РП 5.4.2 Для установления следует включить подходящие испытания, например, того, что находящаяся в составе комплекса нуклеиновая кислота имеет необходимые биохимические и биологические характеристики, требуемые для предполагаемого использования. 5.4.3 Иммунологические и иммунохимические испытания могут предоставлять важную информацию. 5.4.4 В случае вирусных векторов, должны быть включены испытания для демонстрации отсутствия повреждений и гомогенности рекомбинантного вирусного генома. 5.4.5 Должна быть определена чистота произведенного конечного продукта, и должна быть обоснована степень загрязнений, считающаяся приемлемой. К таким загрязнениям относятся, например, бактериальная нуклеиновая кислота при производстве плазмидной ДНК, чужеродные нуклеиновые кислоты в векторных препаратах или другие примеси. 5.4.6 Критерии для принятия или отказа от серийного производства должен быть указаны. Обоснование этих критериев должна быть основано на доклинических или клинических данных безопасности. 5.4.7 В случае применения дефектных по репликации вирусных векторов, следует контролировать, что все меры (шаги) были предприняты, чтобы свести к минимуму возможность того, что они становятся загрязненными способными к репликации вирусами во время производственных процессов. Испытания необходимы, чтобы показать, что репликация вирусов ниже приемлемого уровня. 5.4.8 В случае аденовирусов, способных к репликации, установленный уровень должен доказывать безопасность соответствующих исследований для животных и (или) человека. 5.5 Систематический и текущий контроль качества переработанной продукции 5.5.1 Соответствие 5.5.1.1 Минимум 3 успешные серии готовой лекарственной формы должны показать соответствие требованиям идентификации, чистоты, активности и безопасности. Вслед за этим могут понадобиться более короткие перечни испытаний. 5.5.1.2 Исследования должны включать как молекулярные, биологические и (или) иммунологические методы исследования и оценки продукции, так и методы определения и идентификации примесей. 5.5.1.3 Все различия, которые обнаруживаются между сериями, необходимо описать и исследовать. 5.5.2 Контрольные испытания серий 5.5.2.1 Необходимо представить таблицу спецификаций (включая параметры, методы и спецификации или критерии приемлемости). 5.5.2.2 Необходимо проводить анализы серий продукции для установления соответствия в отношении идентификации, чистоты и активности. Следует отличать аналитические испытания, выполняемые при разработке продукции для ее полного исследования, и испытаниями, осуществляемыми постоянно, для каждой серии лекарственной формы. На основании результатов испытаний продукции, заявитель должен обосновать выбор ряда испытаний с целью их использования для контроля серий. 5.5.2.3 Выбор тестов, используемых для оценки чистоты продукции, должен быть использован для подтверждения идентичности продукции каждой серии. Методы должны включать исследования по определению генетического состава, физико-химических и иммунологических характеристик, совместно с испытаниями по определению предполагаемой биологической активности. 5.5.2.4 Процент требуемой и достигаемой чистоты зависит от нескольких факторов; таких как природа и предполагаемое использование продукции, способ её производства и очистки, а также процента соответствия производственному процессу. Чистота каждой серии должна быть установлена в определенных пределах. Испытания должны быть применимы для определения уровня контаминантов клеточного происхождения, например линии клетокносителей, так же, как и материалов, которые могли быть добавлены в производственный процесс. Необходимо определить приемлемый верхний предел содержания для каждого обнаруживаемого контаминанта. 5.5.2.5 Для определения активности векторов, где возможно, следует применять биологические испытания, которые дают оценку эффективности переноса, уровня и стабильности экспрессии генетического материала, или его эффектов. 5.5.2.6 Должен быть установлен и использован в сравнительных исследованиях образец сравнения в виде серии вектора с необходимой активностью. 5.5.2.7 Эффективность, с которой векторы переносят генетический материал, в клетки-мишени (исследуемые клетки) с информацией о полученном уровне экспрессии гена, может служить основой оценки активности. 5.5.2.8 Если испытания проводят in vitro, популяцию клеток-мишеней необходимо детально описать. 7 ТКП/РП Изменчивость биологических систем в целом нуждается в контроле, особенно там, где клетки-мишени могут быть получены из разных источников (доноров) и где следует долговременная экспрессия или проявление перенесенного генетического материала. 5.5.2.9 В случае необходимости и для векторов, предназначенных для непосредственного применения in vivo, должны быть рассмотрены биологические испытания активности в тканях животных, поддерживаемых ex vivo или в целых животных организмах. Для этой цели могут быть пригодны трансгенные животные или животные с пересаженными тканями или системами человека, например, подходящая модель ксенотрансплантата,. 5.5.2.10 По возможности, должны быть установлены подходящие способы для выражения активности векторов, и результаты представлены в соответствующих единицах измерения. 5.5.2.11 Должна быть определена точная биологическая активность вектора. 5.5.2.12 В продуктах, содержащих вирусы, неспособные к репликации, важное значение имеет тест на обнаружение вирусов, неспособных к репликации, в надосадочной жидкости клеток и в осадке на соответствующих стадиях производства. Испытания должны проводиться при каждом запуске производства и в каждой серии продукции. 5.5.2.13 В случае использования в качестве векторов дефектных по репликации аденовирусов, должен быть установлен строгий верхний предел для способных к репликации аденовирусов (RCA), присущий производственному процессу. Характеристики RCA должны быть четко определены, и производственный процесс должен быть последовательным и хорошо контролируемым. Кроме того, должен быть доказан уровень RCA для безопасности исследований на животных и (или) человеке. 5.5.2.14 В случае использования ретровирусов в качестве векторов, при обнаружении способных к репликации ретровирусов, вся партия продукта должна быть забракована (см. 6.3). 5.5.2.15 Соотношение инфекционных частиц вирусных векторов должно быть определено и нижний критерий приемлемости должен быть установлен для контроля возможной токсичности, обусловленной вирусными белками и активностью продукта. 5.5.2.16 Стабильность готового продукта при использовании и во время хранения должны быть надлежащим образом исследованы, в том числе его совместимость с любыми используемыми растворителями. 6 Контроль качества лекарственных средств 6.1 Лекарственные средства на основе плазмидной ДНК 6.1.1 В этом случае ЛС, полученное на основе технологии рекомбинантной ДНК, состоят из бактериальной плазмидной ДНК, в которую вставлена экспрессионная конструкция. Когда конечный продукт, полученный на основе технологии рекомбинантной ДНК, состоит из более чем одной индивидуальной плазмиды, соответствующая информация, изложенная ниже, должна быть получена для каждого отдельного компонента, если только не будет научно обосновано, что смесь следует охарактеризовать как единое целое. 6.1.2 Должно быть предоставлено подробное описание получения плазмидной ДНК. Оно должно включать информацию о гене, кодирующем белок, конструкции всей плазмиды, происхождении и истории бактериальной клетки-хозяина. 6.1.3 Происхождение нужного гена должно быть подробно описано, а именно: идентичность микроорганизма или клетки, из которых был получен ген, происхождение источника, его виды, история пассажей, подтип и последующая стратегия выделения. 6.1.4 В некоторых случаях, введенный ген может содержать небольшие участки, полученные из нескольких генов, присутствующих в исходном организме, имеет измененную нуклеотидную последовательность для оптимизации использования или содержат совершенно новые кодирующие последовательности. В любом случае, основание для применения гена (генов) должны быть обсуждено, и должна быть предоставлена подробная информация о последовательности гена дикого типа и биологических свойствах, например, функциональности или антигенности, кодируемого белка в его естественном состоянии. 6.1.5 Этапы конструирования всей плазмиды должны быть описаны, в том числе источник плазмиды и субклоны, генерируемые во время процедуры клонирования. 6.1.6 Функциональные компоненты, такие как регуляторные последовательности (начало репликации, вирусные (эукариотические) промоторы, доноры и акцепторы при сплайсинге, обрыв последовательности) и выбор маркеров должны быть четко указаны, и должны быть предоставлены сведения об источнике и функции этих элементов. 6.1.7 Использование всех отдельных элементов или участков ДНК должны быть обосновано. Особое внимание должно быть уделено природе селективного маркера. Следует избегать использования 8 ТКП/РП определенных селективных маркеров, таких как устойчивость к антибиотикам, которые могут негативно повлиять на другие клинические методы лечения в целевой группе пациентов. 6.1.8 Должны быть представлены данные о последовательности нуклеотидов всей плазмиды (это, как правило, должно быть получено для плазмиды в ГБК) и информативная карта рестрикции плазмиды. Альтернативные непредвиденные матрицы считывания должны быть рассмотрены и проверка гомологии последовательности плазмиды с международной базой данных могут дать полезную информацию в отношении последовательностей с непредусмотренным биологическим значением должны быть представлены. 6.1.9 Обсуждение возможности хромосомной интеграции должно быть предоставлено в качестве заключения в пакете документов по качеству, доклинической и клинической экспертизе, с учетом способа применения и способа введения. При этом следует принимать во внимание значимость любой последовательности, гомологичные геному человека. 6.1.10 Обоснование выбора бактериальной клетки-хозяина, использующейся для производства плазмиды, должно быть предоставлено вместе с описанием ее источника, фенотипа и генотипа. Должно быть доказано, что клетка-хозяин является однородной и свободной от загрязнения случайными агентами. 6.1.11 Идентичность ДНК плазмиды после трансфекции в бактериальную клетку, которая будет использоваться для производства, и фенотип трансфицированных клеткок должны быть подтверждены. 6.1.12 Для обеспечения правильной последовательности нуклеотидов плазмиды, содержащей вставленный ген, необходимы данные о сохранении стабильности плазмиды в бактериальной клетке во время ферментации. 6.1.13 Экспрессия любых прокариотических генов, таких как селективный маркер, в эукариотической линии клеток должна быть исследована и обоснована по отношению к клиническому применению лекарственного средства. 6.1.14 Клеточные банки 6.1.14.1 Производство плазмидной ДНК должно быть основано на хорошо определяемых клетках из ГБК и РБК. 6.1.14.2 Должны быть описаны процедуры клонирования и культивирования, используемые для создания ГБК. Во время создания ГБК и РБК следует учитывать, что необходимо избежать загрязнения другими клеточными линиями. 6.1.14.3 Происхождение, форму, хранение, использование и ожидаемой продолжительности предполагаемого использования следует описать в полном объеме для всех банков клеток. ГБК должен быть полностью описан так же, как и конкретные фенотипические признаки, которые образуют основу для идентификации. Последовательность всей плазмиды должны быть установлены на стадии ГБК. 6.1.14.4 РБК должны быть надлежащим образом охарактеризованы и отвечать установленным критериям приемлемости. 6.1.14.5 Должна быть определена жизнеспособность системы хозяин-вектор в ГБК и РБК при хранении и восстановлении условий. 6.1.14.5 Должно быть продемонстрировано, что ГБК и РБК свободны от посторонних микробных агентов. 6.1.15 Производство 6.1.15.1 Процедуры и материалы, используемые в производственном процессе ферментации, должны быть подробно описаны. 6.1.15.2 Должны быть представлены данные о согласованности условий ферментации, роста культуры и выхода плазмиды. Соответствующий контроль в процессе должен быть определен и критерии отклонений в процессе ферментации должны быть установлены. 6.1.15.3 Максимальный уровень роста клеток, разрешенный в процессе производства, должен быть определен и основан на информации об устойчивости системы клетки-хозяина и плазмиды до и после стадии ферментации, используемой в производстве. 6.1.15.4 В конце ферментации должны быть исследованы бактериальные характеристики клеток (плазмиды): число копий плазмид, степень сохранения плазмиды в бактериальной клетке, анализ фрагментов рестрикции, производительность процесса получения клеток и плазмиды. 6.1.15.4 Критерии для выбраковки должны быть установлены таким образом, чтобы выход, характер и качество продукта не менялся по отношению к заданным параметрам. 9 ТКП/РП 6.1.16 Очистка 6.1.16.1 Методы, используемые для очистки плазмидной ДНК и ее контроля в процессе производства, в том числе касающиеся пределов значений спецификаций, должны быть подробно описаны, обоснованы и подтверждены. 6.1.16.2 Способность процесса очистки к удалению нежелательной нуклеиновой кислоты (РНК хозяина, хромосомная ДНК, линейной или денатурированной плазмиды), полученных белков клеток-хозяина, углеводов, эндотоксинов и других примесей, полученных из производства или процесса очистки (в том числе компонентов, полученных из среды) должны быть тщательно исследованы, равно как и воспроизводимость процесса. 6.1.16.3 Могут потребоваться данные о валидированных стадиях по процедурам очистки с использованием концентрации загрязняющих веществ выше, чем ожидалось во время нормального производства, чтобы продемонстрировать способность к клиренсу на каждом этапе очистки и в целом для всего процесса. Должен быть установлен фактор редукции для таких контаминантов на каждом этапе очистки, и в целом для производства. Особое внимание следует уделить удалению эндотоксинов. 6.1.17 Характеристика серии очищенной плазмиды Идентичность, чистота, активность и стабильность серии очищенной плазмиды должны быть установлены. Сначала должна быть выполнена детальная характеристика, по крайней мере, одной производственной серии. После этого, она может применяться на регулярной основе для контроля следующих серий. 6.1.18 Идентичность 6.1.18.1 Начальная характеристика должна включать в себя различные химические, физические и биологические методы. 6.1.18.2 Если конечный продукт содержит более одной отдельной частицы должна быть определена вся последовательность нуклеотидов плазмиды (или плазмид), хотя бы один раз на этом этапе и должна быть рассмотрена потенциальная гетерогенность последовательности нуклеотидов. 6.1.18.3 Молекулярная форма плазмиды, то есть доля супервитков и т.д. в очищенной массе должна быть оценена, и все молекулярные формы должны быть определены. 6.1.18.4 Следует обратить внимание на любые изменения в ДНК, которые могли произойти во время производства, например, бактериальное специфическое метилирование, которые могут повлиять на экспрессию антигенов, закодированных в клетках млекопитающих. 6.1.19 Чистота 6.1.19.1 Необходимо идентифицировать загрязняющие вещества и установить пределы их присутствия. Такие вещества могут включать несоответствующие формы плазмидной ДНК и контаминанты клеток- хозяев, такие как белок клеток-хозянв, хромосомальная ДНК, РНК и эндотоксины. 6.1.19.2 Необходимо выполнить подходящие испытания, чтобы удостовериться, что материалы, используемые в производстве и очистке, удалены на допустимом уровне. Процент контаминации, считающийся допустимым для каждого контаминанта, должен быть обоснован, и критерии отбраковки серии продукции должны быть специально оговорены. 6.1.19.3 Должны быть установлены спецификации для допустимых соотношений молекулярных форм плазмиды, которые обеспечивают эффективность. 6.1.20 Активность 6.1.20.1 План определения активности должен принимать во внимание природу заболевания, предполагаемое использование плазмиды, экспрессируемый белок и искомый биологический (иммунологический) отклик. 6.1.20.2 Вероятно, эти испытания необходимо выполнять in vivo, хотя возможно обосновать и валидировать подходящие количественными испытания in vitro. 6.1.20.3 Любые испытания, собственные препараты сравнения должны быть установлены с применением хорошо охарактеризованных серий плазмид, которые предпочтительно были клинически исследованы. 6.1.21 Стабильность 6.1.21.1 Должна быть определена стабильность конечной формы ЛС, как и данные, используемые для установления срока хранения в складских условиях перед применением. 10 ТКП/РП 6.1.21.2 Реальное время испытаний стабильности необходимо устанавливать для этой цели, но ускорение испытаний стабильности при повышении температуры могут обеспечить дополнительное подтвержденное доказательство стабильности продукции. 6.1.22 Постоянство выпуска 6.1.22.1 Минимальное количество из трех успешных серий очищенной плазмиды должно быть охарактеризовано так полно, как возможно, для определения постоянства выпуска. Где приемлемо, характеристика должна включать испытания конечной плазмидной формы ЛС. 6.1.22.2 Данные, полученные в этих испытаниях, необходимо использовать как основу для массовой очистки или спецификации на конечную плазмидную ДНК. 6.2 Невирусные векторы для передачи трансгенов 6.2.1 Невирусные векторы для передачи трансгенов (например, липосомы, опосредованные рецепторами лиганды) конструируют с использованием физико-химических или коллоидных свойств, например, размера и поверхностного заряда, позволяющих доставить конструкцию сайт-специфично или в определенную мишень. 6.2.2 Нижеизложенные принципы доставки конструкции, в основном, не существенно отличаются от таковых для традиционных лекарственных форм. 6.2.3 Экспериментально продемонстрированы определенные стратегии для увеличения специфичности или эффективности переноса генетического материала в форме комплекса с катионными, липосомами, с белками (например, с трансферрином), или полимерами (например, полилизином или дендримерами). 6.2.4 Характеристика комплекса и постоянство его показателей, приемлемых для физико-химических и биологических методов испытаний, является фундаментально важной в понимании того, как эти свойства могут влиять на эффективность переноса и биораспределение комплекса (см. также 8.2.1). 6.2.5 Должна быть описана целесообразность комплекса, с обращением внимания на физикохимические характеристики, которые придают стабильность ЛС в данных условиях или в определенном биологическом окружении. Пример – Липидная композиция может обеспечивать стабильность или нестабильность лекарственной формы в пределах определенных значений рН или в подходящем биологическом матриксе. 6.2.6 Для систем переноса, использующих катионные липиды, липосомы или катионные полимеры, необходимо соответственно характеризовать свойства поверхности, включая поверхностный заряд. 6.2.7 Качество компонентов, используемых в образовании комплекса, должно быть четко определено, принимая во внимание их чистоту. 6.2.8 Необходимо принимать во внимание взаимодействие между векторами и отрицательно заряженной ДНК. 6.2.9 Состав лекарственной формы, используемый для переноса конструкции, должен быть подтвержден экспериментальными данными в отношении, например эффективности переноса конструкции и ее биораспределения in vivo. 6.2.10 Поскольку на эффективность переноса и биодоступность in vivo может влиять размер частицы, то он также детально, как и величина распределения частиц, должен быть охарактеризован при использовании подходящих методов исследований (см. 8.2.2). 6.2.11 Должна быть учтена стабильность частиц. Необходимо рассмотреть и проанализировать влияние рН и буферных реагентов, используемых для стабилизации комплекса и его поверхностных свойств,. Необходимо сравнить продукты потенциального распада собственно вектора переноса, путем, например, окисления или деполимеризации. Данные должны формировать основу стратегии получения лекарственной формы также, как и предполагаемых условий хранения. 6.2.12 Опосредованные лигандом конструкции для переноса генов, в основном, содержат связанный с рецептором лиганд, присоединенный к ДНК-связывающему домену, например, поли-L-лизину или белку. Затем генная конструкция может быть передана в клетки, экспрессирующие соответствующий рецептор. Должно быть представлено доказательство предложенной стратегии доставки данной конструкции через соединение. Необходимо подтвердить экспериментальными данными.селективность (присоединение к мишени) и специфичность вектора переноса (см. 8.2.2). Данные должны сформировать основу для разработки соответствующих методов контроля. Синтез и химическая характеристика лиганда должны быть тщательно задокументированы. Необходимо учитывать побочные продукты, полученные при синтезе и производстве лигандов и комплексов, принимая во внимание их воздействие на безопасность и применение комплекса для назначения пациентам. 11 ТКП/РП 6.2.13 Для ЛС, которые требуют изобретения конструкции доставки, текущие параметры, их калибровка или валидация должна учитывать их предполагаемое клиническое испытание. 6.3 Вирусные векторы 6.3.1 Должна быть представлена полная документация о происхождении, истории, биологических характеристик вируса (например, жизненный цикл). 6.3.2 Необходимо предоставить полное описание и характеристику части (частей) вирусного генома, в которую была вставлена или лигирована экспрессионная конструкция, модификации оставшихся вирусных последовательностей и любые другие последовательности (например, промоторы), включенные в рекомбинантный вирусный геном. 6.3.3 Должно быть предоставлено научное обоснование в отношении выбора вирусного вектора по сравнению с предложенными клиническими индикаторами, которое должно включать: тканевый тропизм; эффективность переноса в популяцию клеток-мишеней или тип клеток, например, в клетки, которые делятся и окончательно дифференцируются, или в клетки, экспрессирующие подходящий вирусный рецептор для распространения; присутствие и поддержание вирусной генной последовательности (последовательностей), важной для антивирусной химиотерапии вируса дикого типа (см. 8.2.3); тканевую специфичность репликации. 6.3.4 Главное и рабочее потомство вирусов необходимо установить, подробно охарактеризовать и хранить в подходящих стандартизированных условиях. Условия хранения необходимо постоянно корректировать. 6.3.5 В большинстве случае вирусных векторы переноса генов является дефектными по репликации. Дефектные по репликации вирусы размножаются в упаковывающих линиях клеток, в основном модифицированных к экспрессии вирусных белков, необходимых для производства и упаковки вирусных геномов, содержащих экспрессионную конструкцию. Основное исследование безопасности связано с использованием дефектных по репликации вирусных векторов, приобретающих способности к репликации через рекомбинацию или комплементацию с контаминирующими вирусными нуклеотидными последовательностями. Стратегия воспроизведения вирусного вектора с дефектной репликацией, должна быть точно документирована. 6.3.6 В случае ретровирусных векторов, существует один путь для минимизации рекомбинации – это экспрессия кодирующих вирусные структурные и энзимные белки из независимых конструкций, которые были вставлены в отдельные хромосомные интеграционные сайты упаковывающей клеточной линии. Поэтому исследования, которые проводятся для предотвращения контаминации в процессе производства и конструировании вектора, касаются минимизации рекомбинации. Должна быть рассмотрена вероятность рекомбинации с эндогенными ретровирусными последовательностями, которые могут присутствовать в клеточном субстрате для упаковки. Подходящий контроль необходимо применить при проверки этой возможности. 6.3.7 Где возможно, продукты, промежуточные продукты, а также упаковывающие клеточные линии необходимо защищать от вирусов, способных к репликации. 6.3.8 Должна быть дана полная характеристика создания упаковывающей клеточной линии, включая природу, и, где возможно, локализацию последовательностей-помощников вирусной нуклеиновой кислоты и кодируемых белков (функций). Должны быть описаны происхождение, идентификация и биологические характеристики упаковывающей клеточной линии с деталями присутствия или отсутствия эндогенных вирусных частиц и последовательностей. 6.3.9 Главный и рабочий банки клеток должны быть установлены, тщательно охарактеризованы и подлежать периодическому контролю качества. 6.3.10 Отсутствие загрязнения случайными агентами существенно для уверенности в микробиологической чистоте ЛС. 6.3.11 Также должна быть рассмотрена возможность случайной рекомбинации, имеющей место in vivo, когда последовательность нуклеиновых кислот в векторе имеет гомологию с любыми известными ретровирусной последовательностью (последовательностями), присутствующей в клеточном геноме. 6.3.12 Необходимо рассмотреть делеции вирусных последовательностей для ткоторых известна их связь с патогенностью, Такая второстепенная информация, в формате обобщения, может помочь в разработке подходящих доклинических токсикологических исследований. 6.3.13 Вирусы, способные к репликации, также могут применяться как векторы генного переноса. В случае применения RCV-вектора, должны быть предоставлены точные доказательства конструкции и индивидуальных генетических элементов в отношении безопасности их использования в предполагаемых 12 ТКП/РП клинических испытаниях. Необходимо уделить внимание следующим факторам, касающимся приемлемости RCV для генного переноса: способность к репликации является абсолютно необходимой для эффективности ЛС; вектор не содержит никакого элемента, известного способностью вызывать онкогенность или инсерционный мутагенез; если хозяин вирусного происхождения является известным патогенном, инфекционность вирулентность и патогенность RCV должны быть существенно модифицированы перед работой с геном; тканевая специфичности репликации. Для вирусных векторов, которые выбраны на основе их тропизма к органу или ткани, должно быть предоставлено доказательство селективной экспрессии вставленного гена или соответствующего репортерного гена в требуемый сайт. Это предоставляет основу для разработки и развития соответствующих методов контроля (см. также 8.2.3). 6.3.14 Безопасность следует рассматривать в связи с использованием ретровирусных векторов, включая активацию клеточных онкогенов или инактивацию опухолевых супрессорных генов, благодаря провирусной интеграции. Возможность этих явлений будет увеличиваться в присутствии ретровирусов, способных к репликации (RCR). Для минимизации риска продуцирования RCR, должны быть использованы упаковывающие клеточные линии с минимальным риском рекомбинации, в которых структурные или функциональные гены экспрессированы независимо от различных конструкций. Эта стратегия призвана увеличить количество случаев рекомбинационных событий, необходимых для генерации RCR. В любом случае, необходимо предоставить детальные сведения в обосновании произведства ЛС, включая минимизацию получения RCR. 6.3.15 Для определения RCR, должна быть исследована надосадочная жидкость клеточной культуры после производства вектора после пассажа (пассажей) клеточной линии, позволяющей репликацию RCR. После этого следует соответствующим анализом обнаружить и количественно определить RCR. Выбранный анализ должен быть валидирован и должна быть определена его чувствительность. Каждый анализ должен включать соответствующий контроль для стандартизации этого анализа. В связи с этим, должным образом валидированный анализ, основанный на применении технологии амплификации нуклеиновой кислоты, должен быть рассмотрен на предмет включения его в качестве контрольного испытания. 6.3.16 Для ЛС, использующих другие вирусные векторы, во время разработки следует обратить внимание на: патогенность родительского вируса и векторных компонентов для человека и других видов; минимизацию несущественного окружения вирусных компонентов или создание вирусных упаковывающих белков для воспроизведения вирусных векторов с ограниченной репликацией; создание вирусного вектора с минимальной гомологией любому человеческому вирусу или эндогенным вирусам (например, эндогенным ретровирусам) для уменьшения риска получения нового инфекционного агента. Подобная стратегия принята для анализов определения RCR, как показано выше Присутствие RCV необходимо тестировать для приемлемых клеточных линий, приемлемых для амплификации RCV. Присутствие RCV может быть обнаружено при использовании подходящей обнаруживающей клеточной линии. Альтернативный метод обнаружения может быть представлен системой, предложенной как полностью валидированная в процессе разработки ЛС. 6.3.17 Пациенты ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, также подлежат соответственному наблюдению для того, чтоб отследить безопасность вирусных векторов в этих клинических испытаниях. Эти пациенты подвергаются как испытаниям на серологию, так и на тщательно валидированное испытание по амплификации нуклеиновой кислоты (см. раздел 9). 6.4 Лекарственные средства на основе клеток 6.4.1 Источник клеток 6.4.1.1 Клетки, рассматриваемые в этом документе, получают из банков клеток. В ЛС, полученном на основе технологии рекомбинантной ДНК могут быть использованы аллогенные или ксеногенные клетки, а также клетки в суспензии или в капсулах, или прикрепленные к матрице, 6.4.1.2 Необходимо привести соответствующие ссылки на документы или руководства, относящиеся к контролю клеточной терапии или клеточных субстратов. 6.4.1.3 Особым образом должен быть рассмотрен перенос генов ex vivo клетками, полученными у того же самого пациента (аутологические), или от другого гистологически совместимого пациента (аллогенные),. 6.4.1.4 Генетическая модификация может осуществляться путем использования тех же типов продуктов генного переноса (плазмид, вирусных и невирусных векторов), как и использование in vivo процедуры генного переноса. 13 ТКП/РП В этих сценариях, с целью минимизировать нежелательные трансформации, конечные популяции клеток часто ограничены клиническими дозами. Необходим соответствующий контроль во время манипуляций с клетками. Когда ex vivo генетически модифицированные клетки используются несоответствующим образом, что можно назвать как часть медицинской процедуры, необходимо следовать принципам, приведенным в настоящем техническом кодексе. 6.4.1.5 Доноры аллогенетических клеток отбираются по тем же критериям, которые установлены для доноров крови и органов в соответствии с требованиями ТКП ХХХХ Производство лекарственных средств. Лекарственные средства на основе плазмы крови (проект) и [3]. Эти критерии включают: наблюдение основных вирусных и бактериальных патогенов (например, HIV, HBV, HCV, CMV, микобактерии); типирование по группам антигенов крови, главной и (или) второстепенной, где возможно, и по гистологической совместимости антигенов. Соответственно рассматривают обратные процедуры и, где применимо, должны иметь место карантинные системы. 6.4.1.6 Отбор и типирование, например, HLA, должны быть выполнены с использованием валшидированных утвержденных самых современных методов на самом высоком уровне чувствительности и специфичности. Примечение -- HLA (англ. Human Leucocyte Antigens): Человеческие лейкоцитарные антигены. Система генов тканевой совместимости человека. 6.4.1.7 Процедуры и стандарты, используемые для этих целей, должны быть детализированы и обоснованы. 6.4.1.8 Пациенты с ксенотрансплантантатами должны быть исключены в качестве подходящих доноров, с тем, чтобы избежать возможных горизонтальных передач зоонозов. 6.4.1.9 Доноры, которые дали положительный результат на любой основной возбудитель (патоген), должны быть исключены; эти доноры являются приемлемым только в самых исключительных обстоятельствах, таких как трудности в получении соответствия на гистосовместимость для лечения угрожающих жизни заболеваний. 6.4.1.10 Кроме того, специфическое обнаружение и типирование должны осуществляться, если это применимо, на антигены для некоторых болезней (например, опухолевые антигены). 6.4.1.11 Объединение клеток от разных доноров требуют тщательного рассмотрения. Особое внимание должно быть обращено на потенциальные негативные взаимодействия между этими клетками в результате несовместимости донора. Это может повлиять на качество клеточной популяции. 6.4.1.12 Критерии для принятия (отклонения) донора должны быть описаны и полностью обоснованы. Должно быть установлено отношения между количеством доноров и серии продукта на основе аллогенных клеток. 6.4.1.13 Из-за больших рисков, связанных с использованием первичных ксеногенных клеток, они не должны быть использованы, пока не будут: - достигнуто международное соглашение по ксенотрансплантации; - принята эффективная международная система наблюдения; - изданы специальные международные руководства. 6.4.1.14 Ксеногенные клетки могут быть использованы для получения лекарственных средств на основе технологии рекомбинантной ДНК только в том случае, когда они получены из хорошо изученных и установленных клеточных линий, а также принимая во внимание любые конкретные указания, выданные в связи с клиническим использованием ксеногенных клеток. 6.4.1.15 Должна проводиться соответствующая оценка риска (пользы), чтобы оправдать использование ксеногенной клеточной линии с целью переноса генов. В такой оценке внимание должно быть уделено потенциальному риску горизонтальной передачи в более широкой популяции известных или неизвестных ранее инфекционных агентов. 6.4.1.16 Кроме того, должна быть установлена система клеточных банков. 6.4.1.17 Контрольные испытания должны проводиться с использованием утвержденных государством самых современных методов на самом высоком уровне чувствительности и специфичности. 6.4.1.18 Клеточные линии, из которых получен ГБК, должны быть свободными от вирусов животных, например, эндогенных ретровирусов или других посторонних агентов, таких как бактерии, грибы и микоплазмы (см. также ТКП ХХХХ Производство лекарственных средств. Лекарственные средства на основе ксеногенных клеток). 6.4.2 Биологическая характеристика клеточной популяции 6.4.2.1 Методы выделения (отбора) клеток должны быть описаны. 14 ТКП/РП Идентичность ткани, из которой клетки получают, должна быть подтверждена соответствующими гистологическими и / или фенотипическими анализами. Для клеток, хранящихся in vitro, как и для клеточных линий, из которых получают клетки, должны быть четко документированы. 6.4.2.2 Идентичность, однородность (чистота), специфическая активность и стабильность клеток, полученных для переноса генов, должны быть надлежащим образом описаны в отношении их биохимических, морфологических, иммунологических и физиологических характеристик. 6.4.2.3 Эти клетки также должны быть проверены на наличие случайных, а также эндогенных вирусов, чтобы исключить инфицированные клетки для использования в производстве. 6.4.2.4 Критерии для принятия (отклонения) клеточных препаратов на различных этапах должны быть описаны и обоснованы. 6.4.2.5 Для ксеногенных клеток, где это применимо, должен быть разработан и утвержден чувствительный и специфичный метод для того, чтобы различать ксеногенные клетки и клетки реципиента. 6.4.2.6 Должны быть определены понятие «серия клеток» и ее объем. 6.4.3 Работа с клетками in vitro 6.4.3.1 С клетками работают в соответствии со стратегией переноса генов, как описано выше. 6.4.3.2 Используемые векторы необходимо произвести, охарактеризовать, проконтролировать качество многих выпусков, качество по отношению к аспектам безопасности преобразованных клеток, как описано ниже. 6.4.3.3 На всех этапах работы in vitro клетки должны подвергаться надлежащему контролю условий, чтобы избежать микробиологического загрязнения. Внимание должно быть уделено предотвращению перекрестного загрязнения с другими клеточными линиями или образцами. Никакие другие клеточные линии не должны обрабатываться одновременно в той же самой лаборатории или тем же персоналом, до тех пор, пока не доказано другое. 6.4.3.4 Специфическое валидированное испытание идентификации различий должно осуществляться на отдельных стадиях процесса. Такие результаты испытания должны быть представлены в досье заявки. 6.4.3.5 Весь процесс работы с клетками должен быть валидирован для обеспечения исключения попадания случайных агентов (вирусы, бактерии, грибки, микоплазмы) в количествах, ниже пределов обнаружения. 6.4.3.6 Все реагенты и материалы животного происхождения, используемые для производства, должны соответствовать текущим руководствам, чтобы свести к минимуму риск трансмиссивных губчатых энцефалопатий. 6.4.3.7 Используемые реагенты должны быть надлежащим образом задокументированы по их источнику, происхождению и применению контроля качества (в частности, на наличие вирусов, бактерий, эндотоксинов). 6.4.3.8 Следует рассмотреть, где это возможно, альтернативы сыворотки животного или человека. 6.4.3.9 В процессе производства, должен быть выполнен соответствующий контроль качества на ключевых промежуточных этапах для контроля клеточных препаратов. Он включает в себя испытания на идентичность, чистоту, жизнеспособность, биологическую активность, стерильность, отсутствие микоплазм и вирусов, вектора генного переноса (например, RCV, остаточного вектора или нуклеиновые кислоты, процент преобразованных клеток и т.д.). 6.4.3.10 Спецификации и пределы должны быть установлены для этих параметров и обоснованы. 6.4.4 Клеточные банки 6.4.4.1 Для аллогенных и сеногенных клеток должна быть создана система банков клеток, состоящий из главного банка клеток (ГБК), рабочего банка клеток (РБК) и производственногог банка клеток (ПБК) или клеток в конце их предельного роста in vitro. 6.4.4.2 Максимальный предел времени выращивания клеточной культуры должен быть однозначно заявлен, основан на данных, полученных из ПБК. 6.4.4.3 Для ксеногенных и аллогенных клеток, ГБК и РПБК должны быть полностью охарактеризованы на идентичность, жизнеспособность, однородность, концентрацию клеток, чистоту, стерильности, функциональную активность, фенотип, отсутствие микоплазм и случайных или эндогенных вирусов. 6.4.4.4 Клетки, в которые были перенесен генетический материал, должны быть охарактеризованы, где это применимо, на генетическую целостность, экспрессию, стабильность, остаточный вектор или нуклеиновые кислоты, и RCV (см. также ТКП ХХХХ-ХХХХ Производство лекарственных средств. Клеточные субстраты). 6.4.5 Пролиферативная способность 6.4.5.1 Клетки можно обрабатывать факторами роста или цитокинами для того, чтобы добиться дифференциации клеток и (или) распространения. 15 ТКП/РП 6.4.5.2 Расширенная популяция клеток должна быть проверена на наличие предполагаемого фенотипа. Непреднамеренное преобразование следует рассматривать как часть для критериев контроля. 6.4.5.3 Для любого ЛС полученного на основе технологии рекомбинантной ДНК, для которого пролиферация in vivo не является предпосылкой для эффективности, должны быть разработана стратегия остановки клеточного роста путем применения соответствующей валидированной обработки, например, облучением. 6.4.5.4 Должны быть приведены доказательства того, что клетки лишены какого-либо пролиферативного потенциала и любая остаточная пролиферативная способность должна быть измерена, проконтролирована и обоснована. 6.4.5.5 Там, где способность in vivo к пролиферации клеток является предпосылкой для клинической эффективности лекарственного средства, должно быть предусмотрено доказательство, что клетки после хранения способны к восстановлению популяции или пролиферации. Это, должно определяться соответствующим валидированным методом испытания. 6.4.6 Стабильность и продолжительность жизни культуры 6.4.6.1 Необходимо продемонстрировать, что условия культивирования и работы достаточны для проявления и (или) сохранения целевого фенотипа в течение времени. сопоставимого с функцией генетически модифицированных клеток in vivo. 6.4.6.2 Должно быть показано, что фенотипические и генотипические характеристики, а также жизнеспособность клеточной популяции стабильно сохраняются в процессе, например, от ГКБ в РКБ и ПБК. 6.4.6.3 Максимальное время культивирования должно быть соответственно определено и обосновано. 6.4.7 Аспекты качества генно-модифицированных клеток 6.4.7.1 После генетической модификации и подходящих стадий обработки, должна быть выполнена соответствующая биологическая, а также генетическая характеристика окончательной партии клеток. Следующие контрольные показатели должны быть получены для характеристики полученные клеток: идентичность; жизнеспособность; концентрация; однородность (процент от субпопуляций, процент преобразованных клеток); чистота (наличие остаточных реагентов, полученных в ходе процесса, таких как факторы роста или моноклональные антитела); биологическая активность; стерильность. 6.4.7.2 Для клеток, в которые был перенесен целевой ген (гены), должны определяться соответствующими методами, насколько это возможно: - целостность; - экспрессия (конститутивная или регулируемая); - число копий, идентичность продукта, функциональная активность и состояние интеграции вектора. 6.4.7.3 В случае необходимости, должно находиться под контролем присутствие RCV, остаточного вектора или плазмидных нуклеиновых кислот, и связанных с ними полимеров. 6.4.7.4 Необходимо проводить испытания по определению биологической активности, включая приобретенную после переноса гена биологическую функцию, Такая биологическая активность должна сохраняться во время хранения. 7 Использование генетически модифицированных организмов (ГМО) 7.1 В дополнение к вопросам, касающимся безопасности, качества и эффективности лекарственных средств, содержащих или состоящих из генетически модифицированных организмов (ГМО), могут потребоваться сведения о биобезопасности, касающиеся преимущественно внутренних свойств безопасности и безопасного обращения с живыми организмами по отношению к окружающей среде и более широкой человеческой популяции. 7.2 К основным видам деятельности, которые урегулированы [4], относятся: осуществление генно-инженерной деятельности в замкнутых системах, т.е. создание новых генетических организмов в лабораториях; высвобождение генно-инженерных организмов в окружающую среду, т.е. проведение полевых испытаний на опытных полях, последующее их выращивание; использование полученных сортов генно-инженерных растений, пород животных в хозяйственных целях; перемещение генно-инженерных организмов через границу, т.е. их ввоз, вывоз, транзит. Указанное законодательство не распространяет свое действие на следующие отношения: 16 ТКП/РП применение генетической инженерии к человеку, его органам и тканям; обращение с лекарственными средствами; обращение продовольственного сырья и пищевых продуктов, корма для животных, полученных из генно-инженерных организмов или их компонентов. 8 Доклиническая оценка лекарственных средств, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК 8.1 Общие положения 8.1.1 При проведении доклинических исследований ЛС, полученных на основе рекомбинантной ДНК, необходимо руководствоваться требованиями ТКП 125. 8.1.2 Некоторые вопросы безопасности требуют четкого понимания характеристик продукции с целью разработки программы доклинических испытаний, необходимых для оценки конкретных вопросов, относящихся к фармакологии и токсикологии лекарственного средства. 8.1.3 ЛС, полученные на основе технологии рекомбинантной ДНК, должны соответствовать требованиям ТКП ХХХХ Производство лекарственных средств. Контроль качества, доклинические и клинические исследования лекарственных средств на основе технологии рекомбинантной ДНК. 8.1.4 ЛС должно быть достаточно охарактеризовано, чтобы обеспечить гарантии того, что доклинические исследования были проведены с материалом, который является репрезентативным для того, чтобы вводить людям в клинических исследованиях. 8.1.5 Должны быть рассмотрены потенциальное воздействие любых изменений в процессе производства и испытаний материалов и экстраполяция результатов, полученных на животных, для человека. 8.1.6 При изменениях в генетической последовательности, которые приводят к изменениям в ЛС, использовании альтернативных промоторных (энхансерных) последовательностей ДНК, или других изменениях в продукции могут потребоваться дополнительные доклинические оценки безопасности. Должно быть предоставлено научное обоснование подхода. 8.1.7 Аналогично другим биотехнологическим ЛС, для оценки безопасности использования животных в доклинических моделях следует рассмотреть два вопроса: - выбор вида животного в физиологическом (патологическом) состоянии; - способ введения, в том числе дозы, пути введения и схемы лечения (частота и длительность). 8.1.8 Соответствующие виды животных и модели должны использоваться там, где это возможно, т.е. виды (модели), чей биологический ответ на систему введения и выражения ЛС, полученного на основе рекомбинантной ДНК, вероятно, сходный с реакцией человека. 8.2 Специфические аспекты доклинических испытаний 8.2.1 Непредусмотренные и неожиданные последствия переноса генов 8.2.1.1 Непредусмотренные и непредвиденные последствия переноса генов включают инсерционный мутагенез, индуцированные клеточные изменения и мобилизацию векторной ДНК, которые рассматривались также в связи с аспектами качества ЛС, полученных на основе рекомбинантной ДНК. 8.2.1.2 Потенциал для интеграции новых генов в геном хозяина должен быть исследован и обсужден и там, где она должна происходить и присуща способу экспрессии, например, при использовании ретровирусных векторов, и в случаях, когда интеграция не должна происходить, например, для аденовирусных векторов, голых или находящихся в комплексе нуклеиновых кислот. 8.2.1.3 Для некоторых ЛС, полученных на основе рекомбинантной ДНК, где было поставлено много экспериментов (клинических и доклинических), в использовании определенного вектора доставки с конкретным путем введения может оказаться возможным использовать информацию, полученную из литературы, вместо дальнейшей экспериментальной работы. Этот подход должен быть обоснован. 8.2.1.3 Теоретический риск, связанный со способностью векторной интеграции в геном человека или получения неожиданных кодирующих последовательностей должен быть оценен путем сравнения векторных последовательностей с имеющейся информацией о геноме человека. Неясно, в какой степени векторные последовательности гомологичные человеческим последовательностям будут стимулировать интеграцию. 8.2.1.4 В зависимости от способности к интеграции ДНК в геном хозяина и предлагаемых клинических показаний, могут потребоваться исследования вероятности формирования опухоли или нарушения нормальной экспрессии генов. 8.2.1.5 Должны быть оценены сайт, распределения и степень желательной и нежелательной экспрессии генов вектора. 8.2.1.6 Подходящие методы анализа могут включать в себя анализ с использованием методики амплификации нуклеиновой кислоты (NAT), например, in situ NAT или RT-NAT (для исследования в том 17 ТКП/РП случае, если ген экспрессируется и транскрибируется), иммунологические методы анализа и другие подходящие методы для определения продукта экспрессии гена. 8.2.1.7 Если продукт переноса генов присутствует и экспрессируется в поврежденные ткани, то должны быть изучены длительность экспрессии и жизнестойкость генов. 8.2.1.8 Должны быть исследованы возможность распространения, интеграции и (или) экспрессии в клетках зародышевой линии, пока не подтверждено другое. Пример - Клинические показания и (или) выборка пациентов показывают, что такие исследования не являются полномочными. Нежелательные эффекты могут возникнуть в результате: экспрессии гена в нецелевые сайты; экспрессии гена в несоответствующих количествах, например, экспрессии рецепторов (ионных каналов) в сайты, где они обычно не экспрессируются; увеличенная экспрессия фермента; очень пролонгированной экспрессии фактора роста или рецепторов факторов роста, индукция, экспрессия или подавление других генов. 8.2.2 Голая и находящаяся в комплексе нуклеиновая кислота 8.2.2.1 Важным вопросом для рассмотрения является возможность распространения и локализации продукта переноса генов в половых железах и повреждения зародышевой линии. Уверенность в отсутствии повреждения зародышевой линии может быть получена из исследования наличия и сохранения сигнала NAT для вектора и (или) экспрессии продукта гена в половых железах, у пациентов как мужского, так и женского рода. 8.2.2.2 Наличие NAT и (или NAT RT) сигнала в половых тканях должно быть оценено. Положительные результаты с точки зрения их наличия и (или) сохранения требует дальнейшего исследования, чтобы исключить наличие продукта переноса генов в активных клетках зародышевой линии и интеграции в геном клетки зародышевой линии. 8.2.2.3 Может быть проведена экспертиза спермы и яйцеклеток с использованием NAT методик. Такое доказательство необходимо перед началом любого исследования продукта на человеке. 8.2.2.4 Влияние на способность к оплодотворению и общая репродуктивная функция должны быть рассмотрены на этапе получения регистрационного удостоверения, или должно быть обосновано отсутствие таких исследований. 8.2.2.5 Особое внимание должно быть уделено соответствующим исследованиям для решения конкретных проблем безопасности, связанным с конкретным продуктом переноса генов и с учетом предлагаемого клинического применения и клинической выборкой пациентов. Пример – Конкретные проблемы безопасности могут относиться к комплексообразующим материалам, используемым в вирусных векторах, функциональной активности экспрессируемого гена или патогенности вирусного вектора, способного к репликации. 8.2.3 Вирусные векторы 8.2.3.1 Вирусные векторы также могут использоваться для ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, и соответствующий уровень оценки доклинической безопасности должен быть предусмотрен для подтверждения оценки риск /польза. 8.2.3.2 Должно быть предоставлено соответствующее обоснование для использования вирусных векторов, способных или неспособных к репликации, (см. 6.3). 8.2.3.3 Должно быть представлено обоснование разработки вирусных векторов с учетом следующего: требуемый способ действия и тканевая экспрессия трансгена; расположение трансгенов в векторе, наличие и (или) сохранение последовательностей гена, важных для антивирусной химиотерапии вирусом дикого типа; генетические изменения для придания желаемого уровня способности или неспособности к репликации; риск появления трансгенов, экспрессированных вирусами, способными к репликации, вследствие рекомбинации или реактивации; генетические изменения для ослабления патогенного эффекта. 8.2.3.4 Следует рассматривать способность к загрязнению, производству патогенных вирусных последовательностей или вирусов, способных к репликации. Этот вопрос обсуждается более подробно в рамках аспектов качества. 8.2.3.5 Количество вирусных частиц вектора на дозу и количество введений, требуемых для достижения необходимой экспрессии генов и безопасности таких введений для переноса генов in vivo, 18 ТКП/РП следует рассматривать с учетом возможной иммунологической (цитотоксической) проблемы, связанной с высокой вирусной нагрузкой. Это рассмотрение будет включать в себя изучение воспалительных и иммунологических реакций и их долгосрочные последствия. 8.2.3.6 Вирусные векторы или экспрессионные конструкции, которые отбираются на основе их органотропизма (тканевого тропизма), должны обоснованно приводить к селективной экспрессии генного продукта в нужный сайт. 8.2.3.7 Модели животных, выбранные для оценки безопасности ЛС, полученного на основе технологии рекомбинантной ДНК, где возможно, должны быть чувствительны к инфекции и патологическим последствиям инфекции, индуцированных вирусом дикого типа, используемого как вектор. 8.2.3.8 Должно быть предоставлено обоснование выбора той или иной модели животного. 8.2.3.9 Вопросы безопасности, специфичные для конкретного вирусного вектора, должны быть рассмотрены на соответствующих чувствительных моделях животных. Пример – Использование векторов вируса простого герпеса потребует оценки нейровирулентности и способности к латентности (реактивации). Эти аспекты будут иметь решающее значение, если продукт переноса генов должен быть введен в нервную систему. 8.2.4 Генетически модифицированные соматические клетки 8.2.4.1 Все исследования, описанные ниже, должны проводиться с клетками, полученными после переноса генов, охарактеризованными как можно тщательнее, с использованием утвержденных самых современных чувствительных и специфичных методов, и должны быть хорошо документированы в досье заявителя. 8.2.4.2 Если конечный продукт на основе клеток содержит в своем составе поддерживающий рост материал, имплантируемое или инкапсулированное устройство, исследования должны проводиться с окончательной формой клеточного лекарственного средства, полученного на основе технологии рекомбинантной ДНК. В некоторых случаях может быть необходимым провести отдельные исследования. 8.2.4.3 Должна быть исследована способность поддерживающего (капсулирующего) материала к выделению (связыванию) клеток. Также должны проводиться исследования прочности и совместимости с тканями таких поддерживающих (капсулирующих) материалов (см. 5.2.4). 8.2.4.4 Исследования In vitro и (или) in vivo должны быть использованы для изучения любого воздействия на клеточную морфологию, функции и поведение, таких как пролиферация, обездвиживание или индукция специально-трансформированного фенотипа, т.е. в «голых» мышах. 8.2.4.5 Повторно введенные клетки должны быть свободны от внеклеточных продуктов переноса генов (нуклеиновых кислот), которые могут быть распространены и приводить к воздействию нуклеиновой кислоты на отдаленные ткани (органы). 8.2.4.6 Должны быть рассмотрены выход и перемещение вектора переноса in vivo, а также возможность его интеграционно-репликационного взаимодействия с другими вирусами и (или) распространения в половые железы или в другие ткани.. 8.2.4.7 Использование аллогенных или ксеногенных клеток может привести к нежелательным иммунным ответам на вводимые клетки, и исследования in vivo на животных могут дать полезную информацию о токсикологических последствиях такого иммунного ответа. 8.2.4.8 Исследования in vivo на животных могут также предоставлять информацию относительно того, как трансдуцированные ex vivo клетки ведут себя in vivo по сравнению с их не трансдуцированными аналогами. Трансдукция может привести к изменению распределения, миграции, локализации и уничтожения этих модифицированных клеток in vivo. Это может быть важно для исследования сохранения преобразованных клеток и продукта их экспрессированного гена с помощью ПЦР и иммуногистохимических методов. Иммуногистохимическое окрашивание в отделах ткани-мишени может продемонстрировать, что экспрессия генного продукта, происходящая в соответствующих популяциях клеток, не связана с патологическими изменениями в органе, где происходит экспрессия. 8.2.4.9 После передачи вектора могут произойти непреднамеренные и непредвиденные изменения по сравнению с немодифицированной популяцией клеток. В исследованиях In vitro и (или), когда это применимо, in vivo следует рассмотреть любые воздействия на клеточную морфологию, фенотип, функции и поведение, такие как пролиферация, обездвиживание или индукция трансформированного фенотипа. Кроме того, должна быть исследована вероятность того, что латентные вирусы (например, опоясывающий герпес, вирус Энштейна-Барра и цитомегаловирус) были реактивированы, приводя к образованию инфекционных вирусов. Если не предусмотрено свойство генетической модификации (например, трансдукция антигенов для увеличения иммуногенности опухолевых клеток), должно быть предоставлено доказательство, что трансдуцированные клетки не вызывают нежелательных иммунных ответов. 8.2.4.10 Введение аллогенных или ксеногенных клеток может привести к нежелательным иммунным ответам. Исследования In vivo на животных могут дать полезную информацию о токсикологических последствиях и методах предотвращения (уменьшения) такого ответа. Исследования на животных могут 19 ТКП/РП также предоставлять информацию относительно того, как трансдуцированные клетки ex vivo ведут себя in vivo по сравнению с их не трансдуцированными аналогами. Соответствующие исследования должны быть рассмотрены для демонстрации того, как трансдукция приводит к изменению распределения, миграции и локализации этих модифицированных клеток in vivo. 8.2.4.11 Следует также определить, как долго трансдуцированные клетки сохраняются и действуют in vivo, аналогично исследования должны быть проведены, чтобы продемонстрировать соответствующую экспрессию, жизнестойкость, локализацию и активность соответствующего продукта гена (продуктов генов) без патологических изменений в тех местах, где происходит экспрессия. 8.2.4.12 Возможность того, что трансдуцированные клетки, намеренно разработанные для этой цели или нет, выделяют вектор или плазмиду при переносе in vivo, должна быть тщательно иссследована, в том числе способность взаимодействия с другими инфекционными агентами или лекарствами, применяемыми при данном заболевании. Масштабы этих исследований будет зависеть от вектора или плазмиды, его способности к репликации и его интеграционного статуса в клетках. 8.2.4.13 Должны быть исследовано распространение векторов в различные ткани и органы, в частности, половые железы, и в окружающую среду. Должны быть определены идентичность, инфекционность, способность к существованию и активность распространяемого агента. 8.3 Потенциальная эффективность 8.3.1 Должны быть проведены исследования In vitro и (или) in vivo с использованием соответствующих моделей и соответствующих видов животных чтобы показать, что ген экспрессируется в соответствующем месте, в соответствующие сайты, на соответствующем уровне, и что реализуется его функциональная активность. Пример – Если ген кодирует рецептор, должны быть предоставлены доказательства того, что экспрессируемый рецептор соответствующим образом связан с системой клеточных сигналов,. 8.3.2 Важно разработать адекватные методы мониторинга для установления, происходит ли соответствующая экспрессия. Репортерные гены могут быть полезными для оценки трансгенной доставки в клетки-мишени и ее последующего выражения. 8.3.3 Стратегии придания конкретного тканевого тропизма ЛС, полученного на основе технологии рекомбинантной ДНК, для целевого участка-мишени, должны быть оценены на соответствующих моделях животных. 8.3.4 Ингибирующие механизмы могут существовать в клетках-мишенях, которые препятствуют экспрессии встроенного гена. Любые стратегии, направленные на преодоление этих ингибирующих механизмов, должны быть описаны, как обоснование использования любых ассоциированных последовательностей промотора и дополнительных транскрипционных регуляторных элементов. 8.3.5 Должна быть исследована продолжительность экспрессии гена, и предусмотрено обоснование данного предлагаемого режима дозирования в клинических исследованиях при повторном введении. 8.3.6 Для ДНК-вакцин, должна быть исследована вызванная иммунная реакция, в том числе клеточный и гуморальный ответ и эффективность защиты. 8.3.7 Виды, используемые для обычных тестов на токсичность (например, крысы и собаки), не могут подходить в качестве животных моделей для выявления желаемых фармакологических ответов на некоторые продукты переноса генов. Но они могут использоваться для исследования диапазона параметров безопасности для однократной или повторяющихся доз введения животным для исследования потенциальной эффективности (т.е. тех параметров, которые обычно контролируются в доклинических исследованиях токсичности – например, масса тела, клиническая патология, гематология, офтальмоскопия, ЭКГ (кровяное давление), вскрытие и гистопатология). 8.4 Фармакологическая (токсикологическая) оценка полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК лекарственных средств, 8.4.1 Основные принципы 8.4.1.1 Исследования токсичности на животных должно предоставлять некоторую информацию относительно потенциально не рассматриваемых или неожидаемых эффектов, но исследования должны быть построены на подходе «от случая к случаю». 8.4.1.2 Подходящие виды животных должны быть использованы, где возможно, например, где биологический отклик на ЛС, полученные на основе технологии рекомбинантной ДНК, должен быть подобен на отклик человека. 8.4.1.3 В некоторых случаях, в частности, если используются вирусные векторы, способные к репликации, может случиться, что модели животных, выбранные по критериям безопасности ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, должны быть чувствительны к инфицированию и, 20 ТКП/РП где возможно, к подобным патологическим последствиям инфекции, индуцированным вирусом дикого типа, вставленного в вектор. 8.4.1.4 Подходящие модели животных могут включать использование трансгенных животных моделей или иммунодефицитных животных, содержащих трансплантат человеческой ткани. 8.4.1.5 Выбор дозы, периодичности и кратности дозирования должен быть основан на клинически проверенной схеме приема и степени и продолжительности экспрессии гена в экспериментальных животных моделях и у человека. 8.4.1.6 Необходимо рассмотреть группы промежуточного умерщвления подопытных животных, если необходимо контролировать морфологические изменения во время максимальной воспалительной реакции (например, на аденовирусный вектор) или когда экспрессия гена максимальна. 8.4.1.7 Проект исследований токсичности должен быть обоснован. Использование одних подходящих видов животных для исследований токсичности однократной и повторяющейся дозы может быть достаточно, если специфическая безопасность не требует других видов животных. Подход следует научно обосновать. 8.4.1.8 Как предложено в подразделе 8.3, контроль критических параметров безопасности во время исследований по изучаемой потенциально возможной эффективности может предоставить достаточную информацию в некоторых случаях, например, в случае, где применяются специфические устройства для доставки ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, например, внутрикоронарные устройства доставки. 8.4.2 Исследование токсичности однократного введения 8.4.2.1 Исследования токсичности однократного введения, включающие некоторые безопасные фармакологические показатели (например, сердечно-сосудистые (респираторные), могут быть более пригодными, чем отдельные исследования токсичности единичной дозы и фармакологической безопасности. Такие показатели безопасности могут также включаться в исследования для нахождения изучаемой потенциально возможной эффективности. 8.4.2.2 В дополнение, к испытанию в клинической серии введения, исследования токсичности единичной дозы должны быть связаны с использованием лечебной схемы приема ЛС, полученной в максимальном системном воздействии. Такие исследования могут не быть необходимыми, если соответствующиее данные могут показать отсутствие проникновение в системную циркуляцию и локальные удержание. 8.4.3 Исследования токсичности повторяемой дозы 8.4.3.1 Многие из потенциально токсических эффектов ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, изложенные впервые в этом техническом кодексе, необходимо учитывать при планировании исследований токсичности повторяемой дозы. 8.4.3.2 Исследования токсичности повторяемой дозы требуются, гесли предполагаются для использования многократных доз у пациентов-людей. 8.4.3.3 Путь поступления в организм, способ, частота и длительность введения в исследованиях на животных должны воспроизводить клиническую схему приема, где возможно. Где течение заболевания пациентов долгосрочное, исследования токсичности должны в основном быть 6-ти месячной продолжительности. 8.4.3.4 Исследования продолжительности фазы восстановления следует основывать на продолжительности пребывания в организме лекарственного средства, полученного путем генного переноса, и его экспрессии. 8.4.3.5 Подходящие фармакокинетические (тканевые) параметры локализации могут исследоваться в подобных экспериментах для соотнесения полученных результатов с присутствием векторного материала, включая нуклеиновую кислоту и /или экспрессируемый генетический продукт. 8.4.3.6 Выбор дозы и схемы приема ЛС должно сделать возможным определение начальной безопасной дозы и расширения схемы приема ЛС для начала клинических испытаний и предоставлять информацию о параметрах, которых требует клинический контроль, и информацию о механизме любых результатов исследования токсичности, наблюдаемых в клинических испытаниях. 8.4.4 Иммуногенность и иммунотоксичность 8.4.4.1 Для ДНК-вакцин, иммуногенная реакция против экспрессионной конструкции – это ожидаемый отклик. Это должно быть тщательно исследовано. 8.4.4.2 Для других ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, должны быть исследованы способность стимулировать опосредованный клетками или гуморальный иммунитет к нуклеиновой кислоте, произведенного вектором материала (например, вирусного белка), экспрессируемый белок или трансплантированные генетически модифицированные клетки. 21 ТКП/РП 8.4.4.3 Выработка иммунологического отклика против вектора или конструкции, в основном, может их эффективность с измененными токсикологическими последствиями. 8.4.4.4 Контроль иммуногенности во время токсикологических испытаний будет способствовать интерпретации результатов этих испытаний. 8.4.4.5 В отдельных случаях, усиление аутоиммунности или дополнительный иммунный отклик могут оказывать побочный токсический эффект. 8.4.4.6 Носители аденовируса могут служить как адьюванты в формировании иммунного ответа, против экспрессированного генетического продукта. В этом продукте существует чужеродная гомология собственному белку, аутоиммунный отклик может происходить против гомологичного собственного белка хозяина (нарушение устоцйчивости). Если это происходит, необходимо провести исследования. 8.4.4.7 Могут быть неожиданные и не рассматриваемые последствия долгосрочной экспрессии чужеродного антигена. Вопросы безопасности необходимо анализировать в соответствующих исследованиях на животных. Они должны включать потенциальную аутоиммунность, обусловленную избыточной стимуляцией иммунного ответа, ведущему к перекрестной реактивности. 8.4.4.8 В дополнение, экспрессия поверхностных антигенов в клетках, экспрессирующих модифицированную клеточную конструкцию, должна быть видоизменена, что также может иметь проявление в потенциальной аутоимунности. 8.4.4.9 Когда продукт экспрессированного гена имеет иммуномодуляторную активность, необходимо анализировать ее последствия. 8.4.5 Репродуктивная характеристика и развивающаяся токсичность 8.4.5.1 Важным вопросом для решения является возможность распространения и локализации продукта переноса генов в половых железах и изменения зародышевой линии. Доказательства отсутствия изменения зародышевой линии могут быть получены из исследования наличия и сохранения сигнала NAT для вектора и (или) экспрессированного генетического продукта в половых железах, как в мужской, так и женской. 8.4.5.2 NAT-сигнал и (или) NAT RT-сигнал в половых тканях должны быть оценены. Положительные результаты в плане их присутствия и (или) сохранения требуют дальнейшего исследования, чтобы исключить наличие продукта переноса генов в самих клетках зародышевой линии и интеграции в геном клетки зародышевой линии. Может быть проведена экспертиза спермы и яйцеклеток с использованием NAT методик. Исключение этого необходимости перед началом любого исследования с продуктом на человека. 8.4.5.3 Влияние на фертильность и общую репродуктивную функцию, должны быть рассмотрены на этапе регистрационного удостоверения, если не доказано, что отсутствие таких исследований является оправданным. 8.4.5.4 Особое внимание должно быть уделено соответствующим исследованиям для решения конкретных проблем безопасности, связанных с конкретным продуктом переноса генов и с учетом предлагаемого клинического применения и выбором групп пациентов. Пример – Конкретные проблемы безопасности могут относиться к комплексообразующим материалам, используемым в вирусных векторах, функциональной активности экспрессионного генетического продукта или патогенности вирусного вектора, способного к репликации. 8.4.5.5 Рекомендации по соответствующей контрацепции должны учитывать сохранение продуктов переноса генов в половых железах. Аналогичным образом, может потребоваться анализ эмбриональнофетальной и перинатальной токсичности, если женщины детородного возраста должны подвергаться воздействию ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, в зависимости от клинического применения и клинической категории населения. Такие исследования на животных могут не проводиться в начале тщательно контролируемых клинических исследований у пациентов с серьезными угрожающими жизни заболнваниями, при условии соответствующих мер предосторожности для минимизации рисков. 8.4.5.6 Вопросы, связанные с потенциальной репродуктивной токсичностью ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, являются очень сложными, и в руководства в этой области могут быть внесены изменения в процессе дальнейшего накопления опыта. 8.4.6 Исследования генотоксичности (онкогенности) 8.4.6.1 Общепринятая серия испытаний на генотоксичность и обычные исследования онкогенности, как правило, не применяется к ЛС, полученным на основе технологии рекомбинантной ДНК. Тем не менее, исследования генотоксичности могут быть необходимы для разрешения обеспокоенности по поводу специфических примесей или компонентов, например, системы доставки комплексообразующего материала. 8.4.6.2 Вопросом повышенной важности для ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК, является возможность инсерционного мутагенеза, как уже обсуждалось 8.2.1. Важно, что если введенная нуклеиновая кислота обнаружена (по методике NAT), и экспрессируется (например, по RT-NAT методике) в тканях (органах), кроме целевого места действия, и такая экспрессия повторяется, то следует 22 ТКП/РП воспользоваться методом, который способен подтвердить, есть ли интеграция такой нуклеиновой кислоты в геномную ДНК. 8.4.6.3 Основа любого использованного анализа интеграции должна быть описана, и пределы чувствительности обсуждены в связи со спонтанной частотой мутаций, если это возможно. 8.4.6.4 В дополнение к исследованию возможности интеграции нуклеиновой кислоты в геном клеткихозяина, информация о потенциальном инсерционном мутагенезе также может быть получена из лабораторных исследований с использованием различных клеточных линий, чтобы исследовать изменения в морфологии клеток, функции и поведении. 8.4.6.5 Цитогенетическая оценка костного мозга и (или) периферической крови, как часть исследования токсичности (распределения), также может предоставлять полезную информацию, если в этих тканях находятся стойкие NAT (RT-NAT) сигналы. Так как исследование генотоксичности неразрывно связано с исследованием фармакокинетики, этот раздел следует также рассматривать со ссылкой на 8.4.8. 8.4.6.6 Онкогенная способность экспрессированного продукта гена также может рассматриваться, например, очень пролонгированная экспрессия фактора роста, рецепторов фактора роста, или иммуномодулирующих агентов. 8.4.7 Вторичная фармакодинамика Вторичные фармакологические исследования могут быть необходимы, когда фармакологические критические точки не включены в другие токсикологические испытания. приемлемые 8.4.8 Фармакокинетика 8.4.8.1 Исследования спектра абсорбции (распределения, метаболизма) и экскреции, проведенные с обычными лекарственными средствами, могут не быть актуальными для ЛС, полученным на основе технологии рекомбинантной ДНК. Более соответствующими критическими точками, которые требуют исследования, являются обсуждаемые выше в 8.2.1, и может оказаться полезным включить такие критические точки в исследования токсичности. 8.4.8.2 Должны быть исследованы распределение, воздействие, клиренс и транскрипция введенных нуклеиновых кислот. 8.4.8.3 Исследования биораспределения должны, в первую очередь, использовать NAT анализы для исследования распределения в ткани и сохранения продукта переноса генов. Если вводимые нуклеиновые кислоты обнаружены в неожидаемых тканях (органах) с помощью NAT анализа, может оказаться полезным определение мРНК в продукте гена методом RT-NAT, а также продолжительности и уровня экспрессии продукта гена с использованием иммунологического RT-NAT анализа и (или) анализы для выявления функциональных белков. 8.4.8.4 Кроме того, может быть необходимым определить, действительно ли нуклеиновые кислоты включены в геном клетки-хозяина. Это было бы особенно важно, если нуклеиновые кислоты были обнаружены в половых клетках. 8.4.8.5 Подробная информация об использованных испытаниях должна быть обсуждена, в том числе использования отрицательного (положительного) контроля и чувствительности методов. 8.4.8.6 Вместо определения предела цикла NAT или уровня обнаружения (например, 1 копия на п клеток или мкг геномной ДНК), заявители должны обосновать, что анализы, используемые для исследований биораспределения и пределов чувствительности, основаны на правильной валидированной процедуре. 8.4.8.7 Применение in situ NAT методик может определить локализацию ДНК вектора (трансгена) в клетках (тканях). 8.4.8.8 Фармакокинетическое поведение экспрессионного продукта гена также должно быть исследовано в отношении продолжительности, места экспрессии и /или соблюдения требований нормативной документации к готовому ЛС. 8.4.8.9 Также может быть целесообразно исследовать распределение и клиренс материала, используемого для доставки нуклеиновых кислот, например, катионных липидов комплексообразующего материала. 8.4.9 Локальный толерантность Исследование локальной толерантности может потребоваться на соответствующих видах животных. Однако, если предлагаемая лекарственная форма для клинического применения и пути введения были рассмотрены в других исследованиях на животных, то отдельные исследования локальной толерантности не являются необходимыми. 23 ТКП/РП 9 Оценка клинической эффективности и безопасности 9.1 Основные вопросы 9.1.1 При проведении клинических исследований ЛС, полученных на основе рекомбинантной ДНК, необходимо руководствоваться требованиями ТКП 184. 9.1.2 Раздел по оценке клинической эффективности и безопасности технического кодекса содержит конкретные рекомендации для клинических исследований с лекарственными средствами, полученнымина основе технологии рекомбинантной ДНК. Заявители также должны руководствоваться существующими руководящими документами по проведению клинических испытаний, использованию биостатистические методологии в клинических исследованиях и рекомендации в отношении конкретных терапевтических направлений. 9.1.3 Во время этапов клинических испытаний природа, степень эффективности и оценка безопасности зависят от: характеристик продукта генного переноса; его клинического использования; категории пациентов, принимаюших лечение, например, дети, женщины и беременные женщины; предполагаемого пути поступления в организм; длительности лечения. 9.1.4 Следует учитывать, что в большинстве случаев не может быть подходящей модели животных, для определения начальной дозы. Глубокое понимание особенностей и механизмов действия важно для разработки хорошо продуманных программ клинических исследований. Пример – В случае вирусных векторов должны быть рассмотрены патологические последствия введения таких векторов пациентам на основе доступной информации для родительского штамма и тропизма тканей. 9.1.5 Планирование клинических испытаний должно основываться, насколько это возможно, на данных, полученных доклинических фармакологических и токсикологических исследований и быть обосновано учреждением-заявителем. Программа клинических испытаний должна включать пути введения, подбора дозы и схемы, а также контроль состояния пациента при потенциальных осложнениях, связанных с использованием специфических методов переноса генов. 9.1.6 При определении клинической безопасности вектора следует принимать во внимание результаты доклинических исследований и опубликованных клинических и доклинических данных для аналогичного вектора, несущего различные терапевтические гены-маркеры или для аналогичных доз и пути введения. Такая информация может быть полезна при планировании контроля пациентов в ходе клинических исследований. 9.1.7 Оценка также должна включать другие компоненты, например, медицинские устройства, которые могут играть ключевую роль в доставке продукта передачи гена, в том числе генетически модифицированных клеток, так как это может воздействовать на оценку конечной клинической безопасности и эффективности. 9.1.8 Сочетание продукта, полученного из определенного вектора переноса генов, и генов, представляющих интерес, является предметом анализа в каждом конкретном случае. 9.2 Исследования фармакологии на человеке 9.2.1 Главными целями фармакологического исследования на человеке должны быть: - определение подходящей дозы и используемого плана испытаний эффективности на основе безопасности и, где возможно, исследование с использованием суррогатных точек клинической эффективности; - валидация предписанного пути введения в организм; - исследования, где возможно и применимо, биораспределения вектора, несущего требуемый ген, последовательность для экспрессии, что включает: 1) предрасположенность в органах и (или) клетках-мишенях, как и в других сайтах или типов клеток; 2) обоснование степени загрязнения, подходящей для будущих исследований; При ожидаемом биораспределении вектора у пациента, общепризнано, что данные распределения вектора в органах (тканях) пациента могут быть ограничены. Проведение таких исследований может быть ограничено группой пациентов для испытания, путем введения, продуктом и симптомами. Тем не менее, необходимость и объем исследований должны быть рассмотрены на основе специфичности продукта. - подтверждение, что векторы демонстрируют специфический органо-тканевый тропизм или селективную экспрессию трансгена в требуемый сайт, где возможно; 24 ТКП/РП - оценка уровня экспрессии гена, как результат присутствия трансгена и взаимосвязь между уровнем экспрессии гена и необходимыми функциональными или фармакодинамическими параметрами в тканяхмишенях или популяциях клеток для анализа продолжительности наблюдаемых изменений этих параметров. Такие исследования следует углубить для тканей (клеток), не являющихся мишенями. Для ДНК-вакцин тип выявленного иммунного ответа должен быть исследован как часть данных по эффективности (см. 8.2.1 и 8.2.4) - определение краткосрочных побочных эффектов, которые могут быть связаны с использованием ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК (см. 8.2.1). 9.2.2 Начальные клинические исследования должны включать единичное введение ЛС. 9.2.3 Затем проводятся исследования повторяющегося введения, руководствуясь соответствующими фармакодинамическими откликами. 9.2.4 Если возможно, начальная стадия клинических испытаний должна производиться на целевой группе пациентов, включая предполагаемый путь введения. На каждом уровне дозирования должно быть исследовано достаточное количество пациентов. 9.3 Исследования эффективности Исследования, которые проводятся на людях один раз, накапливают достаточно информации о продукте переноса генов в отношении следующего: биораспределения или фармакокинетики; фармакодинамики. Оптимальные дозы и план должны быть определены на основе первоначальной оценки безопасности и доказательств наличия и экспрессии терапевтического гена in vivo. Должен быть разработан количественный анализ активности, который отражает биологическую активность in vivo . В общем, пациенты должны быть рандомизированы, где это уместно, в исследованиях. Соответственно подтвержденные клинические или суррогатные клинические конечные точки, если это оправдано, должны быть использованы в оценке эффективности. Препарат сравнения, используемый в исследованиях, должен обоснованно отражать клинические методы, обычно используемые для лечения в клинических условиях в стадии исследования. Тем не менее, в редких условиях хорошо определенного клинического исхода, могут быть приемлемыми исследования без препарата сравнения. Использование плацебо в данном клиническом исследовании должно быть этически и клинически оправдано. 9.4 Безопасность 9.4.1 В зависимости от типа ЛС, полученного на основе технологии рекомбинантной ДНК, используемого в клинических испытаниях, должны быть исследованы основной и специфические для ЛС побочные эффекты, полученные на основании данных доклинических исследований или информации из литературы. 9.4.2 Результаты доклинических исследований могут быть полезными в установлении клинического профиля безопасности целевого продукта и определения масштабов и продолжительности клинического наблюдения после введения пациентам. 9.4.3 Особое внимание должно быть уделено как краткосрочным, так и долгосрочным побочным эффектам, которые могут быть связаны с введением ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК. 9.4.4 Хотя некоторые эффекты могут быть легко идентифицированы, когда ЛС впервые вводят людям, вполне вероятно, что весь профиль безопасности не может быть легко различим, и может потребоваться долгосрочные наблюдения за этими пациентами. В связи с этим, следующие аспекты должны быть рассмотрены: - контроль вирусной безопасности (см. также 5.5.2 и 6.3): 1) присутствие или отсутствие вирусов, способных к репликации, таких как RCA или RCR, когда в качестве векторов используется вирусы, не способные к репликации, или условно реплицирующиеся вирусы; - появление повторно собранных вирусов дикого типа как результат рекомбинации in vivo, в частности, когда обнаруживаемые вирусы, произведенные из числа патогенов человека, используются как векторы. - высвобождение эндогенным вирусам в случае клеток на основе ЛС, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК (раздел 6.4.9). 2) бессимптомное высвобождение вирусов должно контролироваться у достаточного количества пациентов, и это должно формировать основу, на которой продолжение такого контроля считается необходимым. - функциональные клеточные изменения как результат непреднамеренной (эктопической) трансфекции и другие патологические последствия. - последующий клинический эффект (эффекты) как результат пролонгированной экспрессии чужеродного белка продолжительное время (см. раздел 8.4.4). 25 ТКП/РП - контроль иммунной системы с целью выявить способность стимулировать опосредованный клетками или гуморальный иммунитет и минимизировать иммунологические реакции и вызванные ими побочные эффекты, нацеленные на: 1) систему контроля и доставки (целые клетки или другое); 2) собственно вирусные векторы; 3) материал экспрессии вектора; 4) белок, полученный в результате экспрессии трансгена; 5) себя (аутоиммунность). Любой иммунологический ответ, осуществленный против вектора или конструкции, подобен отрицательному воздействию на эффективность процедуры переноса генов, и (или) может повлиять на клиническую безопасность. Доклиническая иммунотоксикология может помочь в интерпретации некоторых результатов исследований клинической безопасности (раздел 8.4.4). В некоторых образцах, способных содействовать иммунной реакции, однако, будучи благоприятными для данного клинического симптома, должны быть предоставлены доказательства и оценены непредусмотренные последствия; - способность интеграции в геном, предполагаемой или нет, и ее клинические последствия, такие как инсерционный мутагенез, должны быть полностью описаны и исследованы. Общеизвестно, однако, что это непросто определить на стадии клинических испытаний. Где обосновано и возможно, должно быть осуществлено последующее долгосрочное врачебное наблюдение за реципиентами; - необходимо рассмотреть любое случайное влияние ЛС, полученного на основе технологии рекомбинантной ДНК, на здоровье персонала, например, во время назначения и удаления пациентам. Необходимо устанавливать продолжительность испытания и степень контроля за здоровьем работающего персонала. 9.5 Контроль пациентов 9.5.1 Необходимо осуществить следующие виды контроля: краткосрочный контроль широкомасштабными исследованиями, охватывающий фармакодинамику человека и эффективность. Исследования безопасности должны включать анализы, относящиеся к ранней токсичности, общей и органоспецифической, вирусной безопасности, иммунотоксичности и удаления вектора переноса генов; долгосрочный контроль, содержащий: 1) оценку экспрессии гена и стабильность процедуры генного переноса; 2) безопасность с обращением особого внимания на потенциальные долгосрочные клинические последствия интеграции гена и возможную неспецифическую трансдукция других типов клеток, присущих использованному вектору; пролонгированную экспрессию чужеродного белка и использованию вирусных векторов. 9.5.2 Заявителем должны быть обоснованы объем данных и продолжительность контроля. 26 ТКП/РП Библиография [1] Государственная фармакопея Республики Беларусь, 2 издание, том 1 Общие методы контроля качества лекарственных средств. Молодечно, 2012 [2] ICH Q5B (Международная конференция по гармонизации – Качество, Q5B) [3] Закон Республики Беларусь от 4 марта 1997 года «О трансплантации органов и тканей человека» c с изменениями и дополнениями от 21 июня 2012 года. [4] Закон «О безопасности генно-инженерной деятельности». 9 января 2006 г. № 96-3 Quality of Biotechnological Products: Analysis of the Expression Construct in Cells Used for Production of r-DNA Derived Protein Products (Качество биотехнологических продуктов: Анализ экспрессионной конструкции в клетках, используемых для производства белковых продуктов на основе р-ДНК) Неофициальный перевод УП «ЛОТИОС» Перевод с английского языка (en) 27 ТКП/РП Директор Государственного предприятия «НПЦ ЛОТИОС», д.м.н., профессор Научный руководитель разработки, заведующий отделом промышленной биотехнологии Государственного предприятия «НПЦ ЛОТИОС», к.б.н. Научный руководитель разработки, зам. директора по научной работе Государственного предприятия «НПЦ ЛОТИОС», к.б.н. Заместитель заведующего отделом промышленной биотехнологии Государственного предприятия «НПЦ ЛОТИОС» Старший научный сотрудник отдела промышленной биотехнологии Государственного предприятия «НПЦ ЛОТИОС» Старший научный сотрудник отдела промышленной биотехнологии Государственного предприятия «НПЦ ЛОТИОС» Научный сотрудник отдела промышленной биотехнологии Государственного предприятия «НПЦ ЛОТИОС» Научный сотрудник отдела промышленной биотехнологии Государственного предприятия «НПЦ ЛОТИОС» Младший научный сотрудник отдела промышленной биотехнологии Государственного предприятия «НПЦ ЛОТИОС» 28 Гапанович В.Н. Белявский К.М. Андреев С.В. Карпович Н.В. Семашко И.В. Квятковская Н.В. Костюк И.Н. Худобченок Л.Г. Бакуменко А.А.