Экз. ответы по Микробиологии (общая)

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
1. Предмет, задачи, разделы микробиологии, ее связь с другими науками.
Микробиология — наука о живых организмах, невидимых невооруженным глазом
(микроорганизмах): бактерии, архебактерии, микроскопические грибы и водоросли, часто этот
список продляют простейшими и вирусами. В область интересов микробиологии входит их
систематика, морфология, физиология, биохимия, эволюция, роль в экосистемах, а также
возможности практического использования.
Предметом изучения микробиологии являются бактерии, плесневые грибы, дрожжи,
актиномицеты, риккетсии, микоплазмы, вирусы. Но поскольку вирусы абсолютно не могут
существовать без живого организма, изучением их занимается самостоятельная наука, называемая
«вирусологией».
Цель медицинской микробиологии — изучение структуры и свойств патогенных микробов,
взаимоотношения их с организмом человека в определенных условиях природной и социальной
среды, совершенствование методов микробиологической диагностики, разработка новых, более
эффективных лечебных и профилактических препаратов, решение такой важной проблемы, как
ликвидация и предупреждение инфекционных болезней.
Разделы микробиологии: бактериология, микология, вирусология и т. д.
В составе обширной науки микробиологии выделяют разделы:
 *Общая микробиология – изучает закономерности жизнедеятельности всех групп
микроорганизмов, выясняет роль и значение в природном круговороте.
 *Частная микробиология – изучает систематику бактерий, возбудителей отдельных
заболеваний и методы их лабораторной диагностики.
В составе обширной науки микробиологии выделяют разделы:
 *Сельскохозяйственная микробиология изучает роль и формирование структуры почвы и ее
плодородия, роль бактерий в питании растений. Разрабатывает методы и способы использования
бактерий для удобрения почв и консервирования кормов.
 *Ветеринарная микробиология – изучает микробов, вызывающих заболевания у домашних
животных, разрабатывает методы диагностики, профилактики и лечения данных болезней.
 *Техническая (промышленная) микробиология – изучает микроорганизмы, которые можно
использовать в производственных процессах для получения биологически активных веществ,
биомассы и пр. Многие исследования происходят на стыке дисциплин (например, молекулярная
биология, генная инженерия, биотехнология).
 *Санитарная микробиология изучает бактерий, обитающих в объектах окружающей среды,
как автохтонных, так и аллохтонных, способных вызвать загрязнение окружающей среды и играть
определенную роль в эпидемиологии инфекций.
 *Экологическая микробиология изучает роль микроорганизмов в природных экосистемах и
пищевых цепях.
 *Популяционная микробиология выясняет природу межклеточных контактов и взаимосвязь
клеток в популяции.
 *Космическая микробиология характеризует физиологию земных микроорганизмов в
условиях космоса, изучает влияние космоса на симбиотические бактерии человека, занимается
вопросами предупреждения занесения космических микроорганизмов на Землю.
1
 *Медицинская микробиология – изучает микробов, вызывающих заболевания у человека.
Изучает патогенез и клиническую картину заболеваний, факторы патогенности. Разрабатывает
методы профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней человека.
За время существования микробиологии сформировались общая, техническая,
сельскохозяйственная, ветеринарная, медицинская, санитарная ветви.
Общая изучает наиболее общие закономерности, свойственные каждой группе перечисленных
микроорганизмов: структуру, метаболизм, генетику, экологию и т. д.
Техническая занимается разработкой биотехнологии синтеза микроорганизмами биологически
активных веществ: белков, нуклеиновых кислот, антибиотиков, спиртов, ферментов, а также редких
неорганических соединений.
Сельскохозяйственная исследует роль микроорганизмов в круговороте веществ, использует их
для синтеза удобрений, борьбы с вредителями.
Ветеринарная изучает возбудителей заболеваний животных, методы диагностики,
специфической профилактики и этиотропного лечения, направленного на уничтожение возбудителя
инфекции в организме больного животного.
Медицинская микробиология изучает болезнетворные(патогенные) и условно-патогенные для
человека микроорганизмы, а также разрабатывает методы микробиологической диагностики,
специфической профилактики и этиотропного лечения вызываемых ими инфекционных
заболеваний.
Санитарная микробиология изучает санитарно-микробиологическое состояние объектов
окружающей среды, пищевых продуктов и напитков, и разрабатывает санитарномикробиологические нормативы и методы индикации патогенных микроорганизмов в различных
объектах и продуктах
2. Основные этапы развития микробиологии.
Выделяют следующие 5 периоды: эвристический, морфологический, физиологический,
иммунологический, молекулярно-генетический
1. Эвристический: IV-III тыс. до н.э. – эмпирические знания. Гиппократ: предполагал о природе
заразности заболеваний. Факасторо: идея о живом контагии, вызывающем болезни; рекомендовал
изолировать больных и надевать маски
2. Морфологический: Открытие в 1676г. ^ Антонием ван Левенгуком; изготовление линз,
увеличивающих в 200-300 раз. Описал и зарисовал многие микроорганизмы, обнаруженные в
различных настоях, в колодезной воде, на мясе и др. объектах. Назвал микробы
«анималькулюсами».
3. Физиологический: Луи Пастер (1822-1895) французский ученый-химик; основоположник
микробиологии, иммунологии, биотехнологии но и характером жизнедеятельности; они вызывают
разнообразные химические превращения в субстратах, на которых развиваются; он изучал
различные виды брожения (спиртовое, маслянокислое), доказал существование анаэробных
организмов
Значительным вкладом в микробиологию явились исследования немецкого ученого Роберта
Коха (1843-1910). Им были введены в практику плотные питательные среды для выращивания
микробов; это позволило разработать методы выделения (изолирования) микробов в «чистые
культуры», т. е. культуры каждого вида в отдельности, развывшееся в одной клетке. Ввел окраску
анилиновыми красителями. Микрофотографии. Изучал возбудителей сибирской язвы, туберкулеза,
2
холеры и др. заразных болезней; Сформулировал триаду Коха-Генле: найди, докажи, уничтожь. В
1905 – нобелевская премия.
4. Иммунологический: Многочисленные открытия в области микробиологии во второй
половине XIX в. способствовали началу бурного развития иммунологии.
^ И. И. Мечников (1845-1916) разработал фагоцитарную теорию иммунитета - невосприимчивости
организма к заразным болезням. Ему принадлежит идея использования антагонистических
отношений между микробами, что легло в основу современного учения об антибиотиках; с ним
связано развитие микробиологии в России; он организовал первую в России бактериологическую
лабораторию (в Одессе). В 1903 – нобелевская премия. Пауль Эрлих: немецкий химик. Разработал
теорию гуморальной защиты организма антителами. Получил Нобелевскую премию в 1908г.
5. Молекулярно-генетический: Стенли Прузинер: американский биолог. Открыл прионыэндогенные клеточные образование, связанные с ошибками биосинтеза белка, которые обусловлены
мутацией генов, ошибвами трансляции, процессами протеолиза Н. Ф. Гамалея (1859 - 1949) изучал
вопросы медицинской микробиологии; открыл станцию по прививкам против бешенства; описал
явление бактериофагов
3. Классификация микроорганизмов. Различия между эукариотами, прокариотами и
вирусами.
Микробы, или микроорганизмы (бактерии, грибы, простейшие, вирусы), систематизированы
по их сходству, различиям и взаимоотношениям между собой. Этим занимается специальная наука
— систематика микроорганизмов. Систематика включает три части: классификацию, таксономию и
идентификацию. В основу таксономии микроорганизмов положены их морфологические,
физиологические, биохимические и молекулярно-биологические свойства. Различают следующие
таксономические категории: царство, подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид,
подвид и др. В рамках той или иной таксономической категории выделяют таксоны — группы
организмов, объединенные по определенным однородным свойствам.
Микроорганизмы представлены доклеточными формами (вирусы — царство Vira) и клеточными
формами (бактерии, архебактерии, грибы и простейшие). Различают 3 домена (или «империи»):
«Bacteria», «Archaea» и «Eukarya»:
домен «Bacteria» — прокариоты, представленные настоящими бактериями (эубактериями);
домен «Archaea» — прокариоты, представленные архебактериями;
домен «Eukarya» — эукариоты, клетки которых имеют ядро с ядерной оболочкой и ядрышком, а
цитоплазма состоит из высокоорганизованных органелл — митохондрий, аппарата Гольджи и др.
Домен «Eukarya» включает: царство Fungi (грибы); царство животных Animalia (включает
прстейшие – подцарство Protozoa); царство растений Plante. Домены включают царства, типы,
классы, порядки, семейства, роды, виды.
Вид. Одной из основных таксономических категорий является вид (species). Вид — это
совокупность особей, объединенных по близким свойствам, но отличающихся от других
представителей рода.
Чистая культура. Совокупность однородных микроорганизмов, выделенных на питательной
среде, характеризующихся сходными морфологическими, тинкториальными (отношение к красителям), культуральными, биохимическими и антигенными свойствами, называется чистой
культурой.
3
Штамм. Чистая культура микроорганизмов, выделенных из определенного источника и
отличающихся от других представителей вида, называется штаммом. Штамм — более узкое
понятие, чем вид или подвид.
Клон. Близким к понятию штамма является понятие клона. Клон представляет собой
совокупность потомков, выращенных из единственной микробной клетки.
Для обозначения некоторых совокупностей микроорганизмов, отличающихся по тем или иным
свойствам, употребляется суффикс var (разновидность) вместо ранее применявшегося type.
4. Классификация бактерий. Принципы современной систематики и номенклатуры,
основные таксономические единицы. Понятие о виде, варианте, культуре, популяции,
штамме.
Наибольшую известность получила фенотипическая классификация бактерий, основанная на
строении их клеточной стенки.
Крупнейшими таксономическими группами в ней стали 4
отдела: Gracilicutes (грамотрицательные), Firmicutes (грамположительные), Tenericutes (микоплазм
ы; отдел с единственным классом Mollicutes) и Mendosicutes (археи) MollicutesМикоплазмы — прокариотные одноклеточные, грамотрицательные[1][2] микроорганизмы, не
имеющие клеточной стенки, которые были открыты при изученииплевропневмонии у коров.
Микоплазмы, по всей видимости, являются наиболее простыми самостоятельно
воспроизводящимися живыми организмами, объём их генетической информации в 4 раза меньше,
чем у Escherichia coli.
Многочисленные микроорганизмы (бактерии, грибы, простейшие, вирусы) строго
систематизированы в определенном порядке по их сходству, различиям и взаимоотношениям
между собой. Этим занимается специальная наука, называемая систематикой микроорганизмов.
Раздел систематики, изучающий принципы классификации, называется таксономией (от греч.
taxis . расположение, порядок). Таксон . группа организмов, объединенная по определенным
однородным свойствам в рамках той или иной таксономической категории. Самой крупной
таксономической категорией является царство, более мелкими . подцарство, отдел, класс, порядок,
семейство, род, вид, подвид и др. Образование названий микроорганизмов регламентируется
Международным кодексом номенклатуры (зоологической, ботанической, номенклатуры бактерий,
вирусов). В основу таксономии микроорганизмов положены их морфологические, изиологические,
биохимические, молекулярно-биологические свойства.
Согласно современной систематике, патогенные (болезнетворные) бактерии относятся к
надцарству прокариотов (Procaryotae), царству эукариот (Eucaryotae), грибы — к царству микота
(Mycota), простейшие — к царству Protozoa, вирусы — к царству Vira.
Вид — совокупность микроорганизмов, имеющих общий корень происхождения и максимально
близкие фенотипические признаки и свойства. ( Вид — эволюционно сложившаяся совокупность
особей, имеющих единый тип организации, который в стандартных условиях проявляется
сходными фенотипическими признаками: морфологическими, физиологическими, биохимическими
и др.)
Популяция — совокупность особей одного вида, обитающих в пределах биотопа
(территориально ограниченный участок биосферы с относительно однородными условиями жизни).
Штамм — чистые культуры микробов одного вида, полученные из разных источников или из
одного источника в разное время.
4
Чистая культура — популяция состоящая из особей одного вида. (из одной микробной клетки
на искусственной питательной среде).
5. Методы микроскопии. Микроскопический метод диагностики инфекционных
заболеваний.
Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении
фотолюминесценции.
Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо
источников энергии: световых, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция — люминесценция объекта под влиянием света. Если освещать люминесцирующий объект
синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта.
Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении
дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц
(эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые
заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе .
Фазово-контрастная микроскопия. Фазово-контрастное приспособление дает возможность
увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения,
которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют
темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлое изображение объекта на
темном фоне.
Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное
фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители.
Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за
пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп
применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов,
макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.
Микроскопический метод широко применяют в диагностике инфекционных болезней
бактериальной этиологии, паразитарных и (реже) вирусных заболеваний.
В повседневной практике бактериологической лаборатории микроскопическое исследование, как
правило, используют для ускоренной ориентировочной диагностики. Основные задачи
микроскопии: выявление возбудителя в клиническом материале, ориентировочная идентификация
на основе определения характерных морфологических и тинкториальных признаков
микроорганизмов, а также изучение окрашенных мазков из колоний чистых культур. При
некоторых инфекционных болезнях, для возбудителей которых характерна специфичность
морфологии (протозойные болезни, гельминтозы, грибковые заболевания, спирохетозы),
микроскопическое исследование — основной или один из основных методов диагностики.
Материалом для микроскопического исследования могут служить кровь, костный мозг, СМЖ,
пунктаты лимфатических узлов, фекалии, дуоденальное содержимое и жёлчь, моча, мокрота,
отделяемое мочеполовых путей, биоптаты тканей, мазки со слизистых оболочек (ротовой полости,
нёбных миндалин, носа, влагалища и др.).
Для обнаружения кровяных паразитов, например простейших (малярийные плазмодии,
трипаносомы, лейшмании, бабезии) и гельминтов (микрофилярии), исследуют препараты крови
«тонкий мазок» и/или «толстая капля».
5
6. Методы окраски микробов и их отдельных структур.
Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые
заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю —
Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют
дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям
расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые
используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических
включений.
При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители
анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель
обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства.
Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый
фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин.
Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более
интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде
порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и
служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на
поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин,
метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи
воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и
микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле
зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.
Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации
микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно
нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету,
протравы, спирты, кислоту и др.
7. Морфология и химический состав бактерий. Протопласты. L – формы бактерий.
Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны,
цитоплазмы с включениями и ядра, называемого нуклеоидом. Имеются дополнительные структуры:
капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях
способны образовывать споры.
Клеточная стенка. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое
количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки
этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90
% массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий
ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка).
В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная
посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий
наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней
мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран
является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны
представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид.
Функции клеточной стенки:
1. Обусловливает форму клетки.
2. Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее
давление.
6
3. Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды
питательные вещества.
4. Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.
Метод выявления клеточной стенки - электронная микроскопия, плазмолиз.
Протопласты – клетки микроорганизмов, полностью утратившие клеточную стенку. Могут
образовываться в результате мутаций, автолитических процессов, действия некоторых
антибиотиков (лизоцима, пенициллина). Микоплазмы и L–формы бактерий представляют собой
протопласты. Их получают и искусственно для исследовательских целей.
L-формы бактерий, их медицинское значение
L-формы - это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки (протопласт +/остаток клеточной стенки), поэтому имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких
сферических клеток. Способны к размножению.
Цитоплазматическая мембрана располагается под клеточной стенкой (между ними периплазматическое пространство). По строению является сложным липидобелковым комплексом,
таким же, как у клеток эукариот (универсальная мембрана).
Функции цитоплазматической мембраны:
1. Является основным осмотическим и онкотическим барьером.
2. Участвует в энергетическом метаболизме и в активном транспорте питательных веществ в
клетку, так как является местом локализации пермеаз и ферментов окислительного
фосфорилирования.
3. Участвует в процессах дыхания и деления.
4. Участвует в синтезе компонентов клеточной клетки (пептидогликана).
5. Участвует в выделении из клетки токсинов и ферментов.
Цитоплазматическая мембрана выявляется только при электронной микроскопии.
8. Ультраструктура бактерий.
Ультраструктура бактериальной клетки отражает уникальность ее организации. С помощью
электронно-микроскопического исследования ультратонких срезов бактерий, цитохимических и
других методов исследования можно установить структуру определенных органелл, определить их
химический состав и функциональную роль, которую они играют в процессе жизнедеятельности
клетки. Бактериальная клетка окружена внешней оболочкой, которая состоит из капсулы,
капсулоподобной оболочки и клеточной стенки. От их состава зависит способность клетки
воспринимать анилиновые красители (тинкториальные свойства). Капсулы в зависимости от
степени выраженности подразделяют на микро- и макрокапсулы. Первые обнаруживаются только
при электронно-микроскопическом исследовании в виде микрофибрилл из мукополисаха-ридов,
которые тесно прилегают к клеточной стенке. Макрокапсулы представляют собой выраженный
слизистый слой, снаружи покрывающий клеточную стенку. Он состоит из полисахаридов и редко
из полипептидов (например, у сибиреязвенных бактерий). Как правило, макрокапсулу образуют
немногие виды патогенных бактерий (пневмококки и др.) при неблагоприятных условиях среды,
например в организме животных или человека. Однако у некоторых видов (клеб-сиеллы
пневмонии) макрокапсула обнаруживается постоянно.
Капсулоподобная оболочка - липидо-полисахаридное образование, сравнительно непрочно
связанное с поверхностью клетки, вследствие чего в отличие от капсулы может выделяться в
окружающую среду.
Клеточная стенка (КС) представляет собой биогетерополимер сложного химического состава,
который покрывает всю поверхность прокариотической клетки.
7
У грамположительных бактерий пептидогликан связан с тейхоевыми и липотейхоевыми
кислотами за счет чего он имеет многослойную структуру.
У грамотрицательных бактерий пептидогликан однослоен и покрыт наружной мембраной с
мозаичным строением.
Жгутики. На поверхности ряда бактериальных клеток располагаются жгутики. В их состав
входит белок флагелин, который по своей структуре относится к сократимым белкам типа миозина.
Жгутики прикрепляются к базальному телу, состоящему из системы нескольких дисков,
вмонтированных в цитоплазматическую мембрану и КС. Количество и расположение жгутиков у
разных бактерий неодинаково. Монотрихи имеют на одном из полюсов клетки только один жгутик,
лофотрихи - пучок жгутиков, у амфитрихов жгутики расположены на обоих полюсах клетки, а у
перитрихов - по всей ее поверхности.
Пили (pili, синоним ворсинки, фимбрии) - тонкие полые нити белковой природы длиной 0,3-10
мкм, толщиной 10 нм, покрывающие поверхность бактериальных клеток. В отличие от жгутиков не
выполняют локомоторную функцию. По своему функциональному назначению подразделяются на
несколько типов.
Пили 1 общего типа обусловливают прикрепление или адгезию бактерий к определенным
клеткам организма хозяина. Их количество велико - от нескольких сотен до нескольких тысяч на
одну бактериальную клетку. Адгезия является первоначальной стадией любого инфекционного
процесса.
Пили 2 типа (синоним: конъюгативные, или половые пили) участвуют в конъюгации бактерий,
обеспечивающей перенос части генетического материала от донорной клетки к реципиентной. Они
имеются только у бактерий-доноров в ограниченном количестве (1-4 на клетку).
Цитоплазматическая мембрана (ЦМ) является жизненно необходимым структурным
компонентом бактериальной клетки. Она ограничивает протопласт, располагаясь непосредственно
под клеточной стенкой. ЦМ в химическом отношении представляет собой липопротеин, состоящий
из 15-30% липидов и 50-70% протеинов.
Мезосомы являются производными ЦМ. Они имеют неодинаковое строение у разных бактерий,
располагаясь в разных частях клетки либо в виде концентрических мембран, либо пузырьков,
трубочек, либо в форме петли, характерной в основном для грамотрица-тельных бактерий.
Мезосомы связаны с нуклеоидом. Они участвуют в делении клетки и спорообразовании.
Цитоплазма у прокариот, так же как и у эукариот, представляет собой сложную коллоидную
систему, состоящую из воды (около 75%), минеральных соединений, белков, РНК и ДНК, которые
входят в состав органелл нуклеоида, рибосом, мезосом, включений.
Нуклеоид является эквивалентом ядра эукариот, хотя отличается от него по своей структуре и
химическому составу. Он лишен ядерной мембраны, не содержит хромосом, не делится митозом. В
составе нуклеоида отсутствуют основные белки- гистоны. Исключение составляют только
некоторые бактерии. В нем содержится двунитевая кольцевая молекула ДНК, а также небольшое
количество РНК и белков.
Рибосомы у бактерий представляют собой рибонуклеопро-теиновые частицы размером 20 нм,
состоящие из двух субъединиц 30S и 50S. Перед началом синтеза белка происходит объединение
этих субъединиц в одну - 70S.
Включения являются продуктами метаболизма про- и эукариотических микроорганизмов,
которые располагаются в их цитоплазме и используются в качестве запасных питательных веществ.
К ним относятся включения гликогена, крахмала, серы, полифосфата (волютина) и др.
8
9. Спорообразование у бактерий. Патогенные спорообразующие микробы.
Споры (эндоспоры) бактерий — особый тип покоящихся репродуктивных клеток,
характеризующихся резко сниженным уровнем метаболизма и высокой резистентностью.
Бактериальная спора формируется внутри материнской клетки и называется эндоспорой.
Способностью к образованию спор обладают преимущественно палочковидные
грамположительные бактерии родов Bacillus и Clostridium, из шаровидных бактерий — лишь
единичные виды, например, Sporosarcina ureae. Как правило, внутри бактериальной клетки
образуется только одна спора.
Основная функция спор—сохранение бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды.
Переход бактерий к спорообразованию наблюдается при истощении питательного субстрата,
недостатке углерода, азота, фосфора, накоплении в среде катионов калия и марганца, изменении
рН, повышении содержания кислорода и т. д.
Процесс образования спор проходит ряд последовательных стадий:
1. подготовительная. Изменяется метаболизм, завершаетется репликация ДНК и происходит
ее конденсация. Клетка содержит два или более нуклеоида, один из них локализуется в
спорогенной зоне, остальные — в цитоплазме спорангия. Одно­временно синтезируется
дипиколиновая кислота;
2. стадия предспоры. Со стороны цитоплазматической мембраны вегетативной клетки
происходит врастание двойной мембраны, или септы, отделяющей нуклеоид с участком
уплотненной цитоплазмы (спорогенная зона). В результате чего образуется проспора,
окруженная двумя мембранами;
3. образование оболочек. Вначале между мембранами про-споры образуется зачаточный
пептидогликановый слой, затем над ним откладывается толстый пептидогликановый слой
кортекса и вокруг его наружной мембраны формируется споровая оболочка;
4. созревание споры. Заканчивается образование всех структур споры, она становится
термоустойчивой, приобретает характерную форму и занимает определенное положение в
клетке.
При попадании в благоприятные условия споры прорастают в вегетативные клетки
10. Капсулы у бактерий. Методы их обнаружения.
Капсула - слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов
(пневмококк) или полипептидов (бацилла сибирской язвы). Микрокапсулу (толщиной менее 0,2
мкм) способны формировать большинство бактерий, четко выраженную макрокапсулу (толщиной
более 0,2 мкм) формируют пневмококк, клебсиеллы, возбудитель сибирской язвы и некоторые
другие. У патогенных бактерий капсула образуется в макроорганизме, на искусственных
питательных средах она обычно утрачивается (за исключением клебсиелл).
В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от бактериофага,
фагоцитоза и гуморальных факторов иммунитета, определяет антигенную специфичность
микроорганизмов.
Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления чаще всего
применяют методы негативного контрастирования.
Метод выявления капсулы по Бурри-Гинса
1. На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с помощью
петли с каплей культуры капсульных бактерий.
9
2. Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на
воздухе и фиксируют в пламени горелки.
3. Окрашивают 5 мин карболовым фуксином, разведенным водой 1:3.
4. Осторожно промывают водой, высушивают.
Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном
фоне препарата.
11. Жгутики и включения у бактерий. Методы их обнаружения.
Жгутики служат бактериальной клетке органами движения. Лишь у спирохет эту функцию
выполняет осевая нить (аксиальная фибрилла). И жгутики бактерий, и осевые нити спирохет
состоят из сократительного белка флагеллина.
А. Жгутики обладают вращательным типом движения.
Б. Существует классификация бактерий по числу и расположению их жгутиков.
1. Бактерии, имеющие один жгутик называются монотрихами. Как правило, такой жгутик
расположен на полюсе клетки. Монотрихи – самые «быстроходные» среди бактерий.
2. Бактерии, имеющие более одного жгутика, называются политрихами.
а. Если у бактерий имеется – как правило, на полюсе клетки – пучок жгутиков, то такие бактерии
на-зываются лофотрихами.
б. Если пучки жгутиков (или два жгутика) располагаются на противоположенных полюсах
клетки, то такие бактерии называются амфитрихами.
в. Если жгутики располагаются по всему периметру клетки, то такие бактерии называются
перитри-хами.
3. Бактерии, лишённые жгутиков, называются атрихами.
В. Методы выявления жгутиков условно можно разделить на две группы: косвенные и прямые.
1. Косвенно жгутики можно выявить по факту подвижности бактериальных клеток. Для
выявления подвижности бактерий готовят, например, препарат «раздавленная» (или
«придавленная») капля. Для этого каплю бактериальной культуры – лучше, если эта культура будет
при этом выращена на жидкой питательной среде – помещают на предметное стекло и накрывают
покровным стеклом. Микроскопируют или с помощью иммерсионной системы или использую
объектив 40. Для того, чтобы чётче раз-глядеть неокрашенные живые бактерии, можно несколько
затемнить поле зрения, приспустив конденсор.
2. При прямом обнаружении жгутиков их непосредственно наблюдают в микроскоп.
Для этого применяются специальные методы окраски. Например, метод Морозова основан на
обволакивании жгутика тонким слоем солей серебра или ртути. При этом жгутик, не меняя своей
формы, становиться чуть толще. Этого достаточно, чтобы структура, «перешагнув» нижнюю
границу разрешающей способности иммерсионного микроскопа, стала видимой.
Включения. В цитоплазме имеются различные включения в виде гранул гликогена,
полисахаридов, бета-оксимасляной кислоты и полифосфатов (волютин). Они накапливаются при
избытке питательных веществ в окружающей среде и выполняют роль запасных веществ для питания и энергетических потребностей.
Волютин обладает сродством к основным красителям и легко выявляется с помощью
специальных методов окраски (например, по Нейссеру) в виде метахроматических гранул.
10
Толуидиновым синим или метиленовым голубым волютин окрашивается в красно-фиолетовый
цвет, а цитоплазма бактерии — в синий. Характерное расположение гранул волютина выявляется у
дифтерийной палочки в виде интенсивно прокрашивающихся полюсов клетки. Метахроматическое
окрашивание волютина связано с высоким содержанием полимеризо-ванного неорганического
полифосфата. При электронной микроскопии они имеют вид электронно-плотных гранул размером
0,1—1,0 мкм.
12. Питание бактерий. Источники основных элементов. Классификация бактерий по типам
питания. Основные различия между ауто – и гетеротрофами, сапрофитами и паразитами.
Факторы роста. Механизмы транспорта питательных веществ в бактериальную клетку.
Типы питания. Микроорганизмы нуждаются в углеводе, азоте, сере, фосфоре, калии и других
элементах. В зависимости от источников углерода для питания бактерии делятся на аутотрофы,
использующие для построения своих клеток диоксид углерода С02 и другие неорганические
соединения, и гетеротрофы, питающиеся за счет готовых органических соединений. Аутотрофными
бактериями являются нитрифицирующие бактерии, находящиеся в почве; серобактерии,
обитающие в воде с сероводородом; железобактерии, живущие в воде с закисным железом, и др.
Гетеротрофы, утилизирующие органические остатки отмерших организмов в окружающей
среде, называются сапрофитами. Гетеротрофы, вызывающие заболевания у человека или животных,
относят к патогенным и условно-патогенным. Среди патогенных микроорганизмов встречаются
облигатные и факультативные паразиты (от греч. parasitos — нахлебник). Облигатные паразиты
способны существовать только внутри клетки, например риккетсии, вирусы и некоторые
простейшие.
В зависимости от окисляемого субстрата, называемого донором электронов или водорода,
микроорганизмы делят на две группы. Микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода неорганические соединения, называют литотрофны-ми (от греч. lithos — камень), а
микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода органические соединения, —
органотрофами.
Механизмы питания. Поступление различных веществ в бактериальную клетку зависит от
величины и растворимости их молекул в липидах или воде, рН среды, концентрации веществ,
различных факторов проницаемости мембран и др. Клеточная стенка пропускает небольшие
молекулы и ионы, задерживая макромолекулы массой более 600 Д. Основным регулятором поступления веществ в клетку является цитоплазматическая мембрана. Условно можно выделить четыре
механизма проникновения питательных веществ в бактериальную клетку: это простая диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт, транслокация групп.
Наиболее простой механизм поступления веществ в клетку — простая диффузия, при которой
перемещение веществ происходит вследствие разницы их концентрации по обе стороны
цитоплазматической мембраны. Вещества проходят через липид-ную часть цитоплазматической
мембраны (органические молекулы, лекарственные препараты) и реже по заполненным водой
каналам в цитоплазматической мембране. Пассивная диффузия осуществляется без затраты
энергии.
Облегченная диффузия происходит также в результате разницы концентрации веществ по обе
стороны цитоплазматической мембраны. Однако этот процесс осуществляется с помощью молекулпереносчиков, локализующихся в цитоплазматической мембране и обладающих специфичностью.
Каждый переносчик транспортирует через мембрану соответствующее вещество или передает
другому компоненту цитоплазматической мембраны — собственно переносчику. Белкамипереносчиками могут быть пермеазы, место синтеза которых — цитоплазматическая мембрана.
11
Облегченная диффузия протекает без затраты энергии, вещества перемещаются от более высокой
концентрации к более низкой.
Активный транспорт происходит с помощью пермеаз и направлен на перенос веществ от
меньшей концентрации в сторону большей, т.е. как бы против течения, поэтому данный про цесс
сопровождается затратой метаболической энергии (АТФ), образующейся в результате
окислительно-восстановительных реакций в клетке.
Перенос (транслокация) групп сходен с активным транспортом, отличаясь тем, что
переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, например фосфорилируется.
Выход веществ из клетки осуществляется за счет диффузии и при участии транспортных систем.
13. Классификация бактерий по источнику получения энергии. Основные различия между
фото – и хемотрофами, аэробами и анаэробами. Биохимические механизмы аэробного и
анаэробного дыхания. Методы культивирования анаэробных бактерий.
Учитывая источник энергии, среди бактерий различают фототрофы, т.е. фотосинтезирующие
(например, сине-зеленые водоросли, использующие энергию света), и хемотрофы, нуждающиеся в
химических источниках энергии.
Дыхание, или биологическое окисление, основано на окислительно-восстановительных
реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии.
Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят
процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами)
водорода или электронов; восстановление — присоединение водорода или электронов к акцептору.
Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание
называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным —
нитратным, сульфатным, фумаратным).
Анаэробиоз (от греч. аег — воздух + bios — жизнь) — жизнедеятельность, протекающая при
отсутствии свободного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода являются органические
соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное
расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С
учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое,
уксуснокислое и другие виды брожения.
По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы:
облигатные, т.е. обязательные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы.
Методы культивирования анаэробов.
Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный
потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и
окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и биологических методов.
Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что
достигается:
1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;
2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред;
12
3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные
микроорганизмы;
4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом.
В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или
растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают
растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода
в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают
сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке
около 1 см.
В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий.
Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта —
Тароцци, которая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из
исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.
Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по способу Виньяль — Вейона,
который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут
стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр
в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец
трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С
питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в
стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и
трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих
анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила
асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в
пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.
Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов
— анаэроста-тов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат
представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с
резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения
засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.
Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом) можно
производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.
Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом
сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия
Na2S204.
Биологические методы. Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими
аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным
скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке.
На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например часто используют S. aureus или
Serratia marcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или
заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в
чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими
использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздушного
пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.
Комбинированные методы. Основаны на сочетании физических, химических и биологических
методов создания анаэробиоза.
13
14. Рост и размножение бактерий. Кинетика размножения бактериальной популяции.
Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — формированием структурнофункциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также
размножением — самовоспроизведением, приводящим к увеличению количества бактериальных
клеток в популяции.
Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования.
Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися
бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии
делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а
грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из
которых образуются две одинаковые клетки.
Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному
типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида.
Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элонгация, или рост цепи, и терминация.
Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не
изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что
приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий.
Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а
культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем
непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной
жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура — непрерывной.
При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный
или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий,
выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:
1. лаг-фаза;
2. фаза логарифмического роста;
3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации
бактерий;
4. фаза гибели бактерий.
Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кривой размножения бактерий,
отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени их культивирования.
Лаг-фаза — период между посевом бактерий и началом размножения. Продолжительность лагфазы в среднем 4—5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению;
нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов.
Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом интенсивного деления
бактерий. Продолжительность ее около 5— 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут
делиться каждые 20—40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется
высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам
синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.
Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток
остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее
14
продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их
особенностей и культивирования.
Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бактерий в
условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма
бактерий. Продолжительность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интенсивность роста и
размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной
среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.
Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных
питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными
краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.
Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают её. Другая
группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. И, наконец,
существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.
Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пигменты, как каротины, ксантофиллы
и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного
цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой,
супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных
перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают антимикробным,
антибиотикоподобным действием.
15. Морфология и ультраструктура риккетсий. Морфология и ультраструктура хламидий.
Патогенные виды.
Риккетсии и хламидии относятся к классу Rickettsia облигат-ных внутриклеточных паразитов,
который делится на два порядка: Rickettsiales и Chlamidiales.
Риккетсии представляют собой мелкие грамотрицательные микроорганизмы,
характеризующиеся выраженным полиморфизмом—образуют кокковидные, палочковидные и
нитевидные формы (рис. 22). Размеры риккетсии варьируют от 0,5 до 3-4 мкм, длина нитевидных
форм достигает 10—40 мкм. Спор и капсул не образуют, окрашиваются по Здродовскому в красный
цвет.
Многие виды риккетсий вызывают заболевания человека, называемые риккетсиозами. Это
Rickettsia prowazekii (риккетсий Провацека) - возбудитель эпидемического сыпного тифа и Coxiella
burneti (коксиелла Бернета) -возбудитель Ку-лихорадки.
Хламидии имеют шаровидную, овоидную или палочковидную форму. Их размеры колеблются в
пределах 0,2—1,5 мкм. Морфология и размеры хламидии зависят от стадии их внутриклеточного
цикла развития, для которого характерно превращение небольшого шаровидного элементарного
образования в крупное инициальное тельце с бинарным делением. Перед делением частицы
хламидии обволакиваются образованием, напоминающим бактериальную капсулу. Хламидии
окрашиваются"* по Романовскому—Гимзе, грамотрицательны, хорошо видны в прижизненных
препаратах при фазово-контрастной микроскопии.
Согласно современным таксономическим представлениям возбудитель хламидиоза относится к
семейству Chlamydiacea, которое состоит из двух родов: Chlamydia и Chlamydophila. Род Chlamydia
включает патогенный для человека вид С. trachomatis. Род Chlamydophila включает патогенные для
человека виды: С pneumoniae и С. psittaci.
16. Морфология и ультраструктура спирохет. Классификация, патогенные виды. Методы
выделения.
15
Спирохеты — извитые подвижные бактерии, относящиеся к порядку Spirochaetales, семейству
Spirochaetaceae. Патогенные спирохеты принадлежат к трем родам: Borrelia, Treponema, Leptospira.
Клетка спирохеты имеет цилиндрическую извитую форму, содержит цитоплазму,
отграниченную цитоплазматической мембраной,, снаружи которой расположена клеточная стенка
со слабовыраженным пептидогликановым слоем. Патогенные спирохеты имеют длину 3—20 мкм и
толщину 0,1-0,5 мкм. Представители отдельных родов различаются по длине и толщине, числу и
характеру завитков (табл. 2; рис. 21). Спирохеты грамотрицательны. Боррелии в отличие от трепонем и лептоспир хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Морфологию трепонем и
лептоспир изучают путем микроскопии живых микроорганизмов в препаратах «раздавленная» или
«висячая» капля в темнопольном или фазово-контрастном микроскопе, а также в мазках,
окрашенных по Романовскому—Гимзе или специальными методами, например серебрением.
По Гимза, спирохеты возвратного тифа окрашиваются в фиолетово-синий цвет, а бледная
спирохета—в красновато-розовый, что зависит повидимому от различий в биохим. составе
спирохет.
17. Морфология и ультраструктура микоплазм. Патогенные для человека виды.
Микоплазмы — мелкие бактерии, окруженные только цитоплазматической мембраной. Они
относятся к классу Mollicutes, содержат стеролы. Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы
осмотически чувствительны.
Имеют разнообразную форму: кокковидную, нитевидную, колбовидную. Эти формы видны при
фазово-кон-трастной микроскопии чистых культур микоплазм. На плотной питательной среде
микоплазмы образуют колонии, напоминающие яичницу-глазунью: центральная непрозрачная
часть, погруженная в среду, и просвечивающая периферия в виде круга.
Микоплазмы вызывают у человека атипичную пневмонию (Mycoplasma pneumoniae) и
поражения мочеполового тракта (М. homi-nis и др.). Микоплазмы вызывают заболевания не только
у животных, но и у растений. Достаточно широко распространены и непатогенные представители.
L-формы бактерий, их медицинское значение
L-формы - это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки (протопласт +/остаток клеточной стенки), поэтому имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких
сферических клеток. Способны к размножению.
Отличие микоплазм от L-форм бактерий. Микоплазмы не трансформируются в исходные
формы.
18. Систематика и номенклатура вирусов. Принципы современной классификации
вирусов.
Вирусы отнесены к царству Vira. В основу их классификации положен тип нуклеиново кислоты,
образующей геном. Соответственно выделяют рибовирусы (РНК-вирусы) и дезоксирибовирусы
(ДНК-вирусы). Для вирусов предложены следующие таксономические категории (по восходящей):
Вид (Species) —> Род (Genus) —> Подсемейство (Subfamilia) —> Семейство (Familia). Но категории
подсемейств и родов разработаны не для всех вирусов. Видовые названия вирусов обычно
связывают с вызываемыми ими заболеваниями (например, вирус бешенства) либо по названию
места, где они были впервые выделены (например, вирусы Коксаки, вирус Эбола). Если семейство
включает большое количество видов, то видовые названия дают в соответствии с антигенной
структурой и разделяют их на типы (например, аденовирус 32 типа или вирус герпеса 1 типа). Реже
используют фамилии учёных, впервые их выделивших (например, вирус Эпстайна-Барр или вирус
16
саркомы Рауса). Иногда используют устаревшие названия групп вирусов, отражающих их
уникальные эпидемиологические характеристики (например, арбовирусы).
В основу классификации вирусов положены следующие категории:
• тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей (одна или две),
особенности воспроизводства вирусного генома;
• размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии;
• наличие суперкапсида;
• чувствительность к эфиру и дезоксихолату;
• место размножения в клетке;
• антигенные свойства и пр.
Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому
различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т.е. имеют один
набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми,
однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными. Среди РНК- содержащих вирусов
различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов
выполняет наследственную функцию и функцию информационной РНК (иРНК). Имеются также
РНК-содержащие вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию.
Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей
системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными
внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Они —
автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным)
способом размножения (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты
вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная
частица называется вирионом.
Морфологию вирусов изучают с помощью электронной микроскопии, так как их размеры малы
(18-400 нм) и сравнимы с толщиной оболочки бактерий.
Форма вирионов может быть различной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной
(вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), нитевидной (филовирусы), в виде
сперматозоида (многие бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.
Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки,
называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц —
капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.
Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены ли-попротеиновой оболочкой
(суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирусинфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы, или шипики
(пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок.
Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спиральный, икосаэдрический
(кубический) или сложный тип симметрии. Икосаэдрический тип симметрии обусловлен
образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту
(например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спиральный тип симметрии обусловлен
винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).
17
19. Эволюция и происхождение вирусов. Основные отличия вирусов от бактерий.
Происхождение вирусов — вопрос, который на протяжении многих лет составлял предмет
дискуссий. Было выдвинуто три гипотезы происхождения вирусов:
1. Вирусы — потомки бактерий и других одноклеточных организмов, претерпевших
дегенеративную (регрессивную) эволюцию.
2. Вирусы — потомки древних доклеточных форм жизни, перешедших к паразитическому
способу существования.
3. Вирусы — дериваты (производные) клеточных генетических структур, ставших относительно
автономными, но сохранивших зависимость от клеток.
Идея регрессивной эволюции вирусов впервые была высказана французским ученым Николлем,
развита американцем Грином и модернизирована Барнетом в 1943 г. Основанием для выдвижения
этой гипотезы явилось существование крупных сложноустроенных ДНК-содержащих вирусов,
имеющих сотни генов и обладающих относительной автономностью систем
репликации/транскрипции. Примером могут служить поксвирусы (вирусы оспы). Согласно идее
регрессивной эволюции, вирусы оспы находятся последними в ряду облигатных внутриклеточных
паразитов — потомков бактерий:
Бактерии -> микоплазмы и риккетсии -> хламидии -> вирусы оспы
В свете современных данных о вирусах, эта гипотеза не находит сторонников, так как мир
вирусов слишком велик, чтобы признать возможность столь глубокой дегенеративной эволюции.
Наиболее веским аргументом против теории регрессивного происхождения вирусов является
неклеточная организация вирусов.
Вторая гипотеза — происхождение вирусов из доклеточных форм жизни — базируется на
многообразии видов генетического материала у вирусов, которое «исчерпывает» все возможные
формы — однонитевые и двухнитевые ДНК и РНК, их линейные, кольцевые, сегментированные
формы. Природа как бы испробовала на вирусах возможные варианты нуклеиновых кислот. В
настоящее время известны генетические паразиты, не кодирующие белков и обладающие
рибозимазной активностью (вироиды), которые, по всей вероятности, являются прародителями
отдельной эволюционной линии РНК-геномных вирусов. Вирусные геномы обладают кодом,
который реализуется с использованием клеточных механизмов репликации/транскрипции, что
делает маловероятной возможность возникновения вирусов до появления клеточных форм жизни.
Третья гипотеза была сформулирована около 30 лет назад и получила название гипотезы
«взбесившихся генов». Она предполагает, что вирусы являются видоизмененным генетическим
материалом клеток.
Биологическая эволюция — это процесс накопления изменений в организме и увеличение их
разнообразия во времени.
Вирусы — это не организмы, это неклеточные формы жизни, основой которой является
функционально активный геном. На генетическом уровне эволюция представляет собой накопление
изменений в генетической структуре популяций и включает два этапа: первоначально происходит
возникновение изменений в результате известных молекулярных механизмов изменчивости, затем
их накопление и закрепление в популяции под действием естественного отбора.
Вирусы, являясь генетическими паразитами и представляя собой несовершенную форму жизни,
подчиняются законам эволюции органического мира и обладают необходимыми атрибутами жизни
— наследственностью и изменчивостью, а также подвержены естественному отбору. Изменчивость
вирусов затрагивает различные биологические свойства — морфологию, антигенную структуру,
18
иммуногенность, тканевой тропизм, патогенность, круг восприимчивых хозяев, биохимические
свойства, устойчивость к физическим и химическим воздействиям. Основу наследственной
изменчивости вирусов составляют изменения их генетического материала.
20. Морфология, ультраструктура и химический состав вирусов. Функции основных
химических компонентов вируса.
Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей
системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными
внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Они —
автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным)
способом размножения (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты
вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная
частица называется вирионом.
Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью электронного микроскопа, так как их
размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий.
Форма вирионов может быть различной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной
(вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие
бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.
Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки,
называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц —
капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.
Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены ли-попротеиновой оболочкой
(суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирусинфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы, или шипики
(пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок.
Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окружающей среды, обусловливают
избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные
свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называются сердцевиной.
Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спиральный, икосаэдрический
(кубический) или сложный тип симметрии. Икосаэдрический тип симметрии обусловлен
образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту
(например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спиральный тип симметрии обусловлен
винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).
Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре
клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы
образует цитоплазмати-ческие включения — тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы —
внутриядерные включения.
Размеры вирусов определяют с помощью электронной микроскопии, методом
ультрафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования.
Одним из самых мелких вирусов является вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным —
натуральной оспы (около 350 нм).
Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают
ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т.е. имеют один набор
генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми,
однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными. Среди РНК-содержащих вирусов
19
различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов
выполняет наследственную функцию и функцию информационной РНК (иРНК). Имеются также
РНК-содержащие вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию.
Геном вирусов способен включаться в состав генетического аппарата клетки в виде провируса,
проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов (вирусы
герпеса и др.) могут находиться в цитоплазме инфицированных клеток, напоминая плазмиды.
21. Репродукция вирусов. Основные фазы репродукции вирусов. Методы индикации
вирусов в исследуемом материале.
Вирусы не способны размножаться на питательных средах - это строгие внутриклеточные
паразиты. Более того, в отличие от риккетсий и хламидий, вирусы в клетке хозяина не растут и не
размножаются путем деления. Составные части вируса - нуклеиновые кислоты и белковые
молекулы синтезируются в клетке хозяина раздельно, в разных частях клетки - в ядре и в
цитоплазме. При этом клеточные белоксинтезирующие системы подчиняются вирусному геному,
его НК.
Репродукция вируса в клетке происходит в несколько фаз:
1. Первая фаза - адсорбция вируса на поверхности клетки, чувствительной к данному
вирусу.
2. Вторая фаза - проникновение вируса в клетку хозяина путем виропексиса.
3. Третья фаза - «раздевание» вирионов, освобождение нуклеиновой кислоты вируса от
суперкапсида и капсида. У ряда вирусов проникновение нуклеиновой кислоты в клетку
происходит путем слияния оболочки вириона и клетки-хозяина. В этом случае вторая и
третья фазы объединяются в одну.
В зависимости от типа нуклеиновой кислоты этот процесс совершается следующим образом.
ДНК-содержащие (ДНК —> иРНК —>белок):
1. Репродукция происходит в ядре: аденовирусы, герпес, паповавирусы. Используют ДНКзависимую РНК - полимеразу клетки.
2. Репродукция происходит в цитоплазме: вирусы имеют свою ДНК-зависимую РНК
полимеразу.
РНК-содержащие вирусы:
1. Рибовирусы с позитивным геномом (плюс-нитиевые): пикорна-, тога-, коронавирусы.
Транскрипции нет.
РНК —>белок
2. Рибовирусы с негативным геномом (минус- нитевые): грипп, корь, паротит, орто-,
парамиксовирусы.
(-)РНК —> иРНК —> белок (иРНК комплементарная (-)РНК). Этот процесс идет при участии
специального вирусного фермента - вирионная РНК-зависимая PHK-полимераза ( в клетке
такого фермента быть не может).
3. Ретровирусы
(-)РНК -> ДНК —> иРНК —>белок (и РНК гомологична РНК). В этом случае процесс
образования ДНК на базе (-)РНК возможен при участии фермента - РНК-зависимой ДНКполимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы)
20
4. Четвертая фаза - синтез компонентов вириона. Нуклеиновая кислота вируса образуется
путем репликации. На рибосомы клетки транслируется информация вирусной иРНК, и в
них синтезируется вирус-специфический белок.
5. Пятая фаза - сборка вириона. Путем самосборки образуются нуклеокапсиды.
6. Шестая фаза - выход вирионов из клетки. Простые вирусы, например, вирус
полиомиелита, при выходе из клетки разрушают ее. Сложноорганизованные вирусы,
например, вирус гриппа, выходят из клетки путем почкования. Внешняя оболочка вируса
(суперкапсид) формируется в процессе выхода вируса из клетки. Клетка при таком
процессе на какое-то время остается живой.
Описанные типы взаимодействия вируса с клеткой называются продуктивными, так как
приводят к продукции зрелых вирионов.
Иной путь - интегративный - заключается в том, что после проникновения вируса в клетку и
"раздевания" вирусная нуклеиновая кислота интегрирует в клеточный геном, то есть встраивается в
определенном месте в хромосому клетки и затем в виде так называемого прови-руса реплицируется
вместе с ней. Для ДНК- и РНК-содержащих вирусов этот процесс совершается по-разному. В
первом случае вирусная ДНК интегрирует в клеточный геном. В случае РНК-содержащих вирусов
вначале происходит обратная транскрипция: на матрице вирусной РНК при участии фермента
"обратной транскриптазы" образуется ДНК, которая встраивается в клеточный геном. Провирус
несет дополнительную генетическую информацию, поэтому клетка приобретает новые свойства.
Вирусы, способные осуществить такой тип взаимодействия с клеткой, на­зываются
интегративными. К интегративным вирусам относятся некоторые онкогенные вирусы, вирус
гепатита В, вирус герпеса, вирус иммунодефицита человека, умеренные бактериофаги.
Кроме обычных вирусов, существуют прионы - белковые инфекционные частицы, не
содержащие нуклеиновую кислоту. Они имеют вид фибрилл, размером до 200 нм. Вызывают у
человека и у животных медленные инфекции с поражением мозга: болезнь Крейтцфельда-Якоба,
куру, скрепи и другие.
Методы индикации вирусов в исследуемом материале.
О репродукции вирусов в культурах клеток судят по их цитопатическому действию (ЦПД),
которое носит разный характер в зависимости от вида вируса, по бляшкообра- манию на клеточном
монослое, покрытом тонким агаровым слоем, гемадсорбции эритроцитов и другим тестам.
Таким образом, индикация вирусов производится микроскопически по наличию ЦПД,
бляшкообразованию на клеточном монослое, гемадсорбции эритроцитов, добавленных к клеточной
культуре вируса, а также в реакции гемагглютинации с исследуемым вируссодержащим
материалом. Реакцию гемагглютинации вызывают вирусы, содержащие в составе своего капсида
или суперкапсида гемагглютинин.
22. Вирусологический метод диагностики. Методы культивирования вирусов.
Вирусологический метод включает культивирование вирусов, их индикацию и идентификацию.
Материалами для вирусологического исследования могут быть кровь, различные секреты и
экскреты, биоптаты органов и тканей человека. Исследование крови часто проводят в целях
диагностики арбовирусных заболеваний. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства,
эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения
возбудителя гриппа, кори, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В
смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные
энтеровирусы, адено-, рео- и ротавирусы.
21
Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных
животных.
Источник получения клеток — ткани, извлечённые у человека при операции, органы эмбрионов,
животных и птиц. Используют нормальные или злокачественно перерождённые ткани:
эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Вирусы человека лучше размножаются в
культурах клеток человека или почечных клеток обезьян.
Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности.
Например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, что определяет необходимость
подбора соответствующей культуры. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно
одномоментное заражение 3-4 культур клеток, так как одна из них может оказаться чувствительной.
Вирусы культивируют на биологических моделях: в организме лабораторных животных, в
развивающихся куриных эмбрионах и культурах клеток (тканей).
Лабораторных животных (взрослых и новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян
и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами. Индикацию,
т.е. обнаружение факта размножения вирусов, устанавливают на основании развития типичных
признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или
положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов
вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за
счет имеющегося на поверхности вириона особого белка гемагглютинина. Реакцию проводят вне
организма — в пробирках (in vitro), по сути она не является иммунологической реакцией.
Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях в настоящее
время весьма ограничено.
Развивающиеся 5—12-дневные куриные эмбрионы заражают путем введения исследуемого
материала в различные полости и ткани зародыша (рис.3.3). Индикацию вирусов осуществляют на
основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также
в РГА. Методику культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц широко используют
при промышленном выращивании вирусов.
23. Культуры клеток. Классификация клеточных культур. Питательные среды для
культур клеток. Методы индикации вирусов в культуре клеток.
Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные
клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в
контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к
выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще
всего животных.
Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на
первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных
этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной
однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием
клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением
телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им
постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
22
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных
линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных
условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из
карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона
человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют
собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор
хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека
не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию
(ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими
изменениями клеток.
Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для
ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.
Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре, а для
клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в
инкубаторе клеточных культур[6][7]. Как правило, регулируется концентрация в воздухе
углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных
культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и
др[8]. Факторы роста, используемые в питательных средах, чаще всего добавляют вместе с
сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры
клеток прионами или вирусами.
24. Морфология, ультраструктура и химический состав фагов. Этапы репродукции фагов.
Различия между вирулентными и умеренными фагами.
Размеры бактериофагов колеблются от 20 нм до 200 нм. Как все вирусы, содержат ДНК, или
РНК, и белковый капсид. Чаще всего встречаются и лучше изучены бактериофаги, имеющие форму
сперматозоида или головастика. Состоят они из головки, хвостового отростка, батальной пластинки
с короткими шинами и хвостовыми нитями. Внутри головки располагается спирально скрученная
пить ДНК, покрытая белковым капсидом. Хвостовой отросток - что полый цилиндрический
стержень, окруженный сократительным чехлом. Базальная пластинка и нити осуществляют
процесс адсорбции бактериофага на бактериальной клетке. Существуют бактериофаги, имеющие
другое строение: с короткими отростком, с отростком без сократительного чехла, без отростка,
нитевидной формы.
Основными компонентами фагов являются белки и нуклеиновые кислоты. Важно отметить, что
фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты —
дезоксирибонуклеиновую (ДНК) или рибонуклеиновую (РНК). Этим свойством вирусы отличаются
от микроорганизмов, содержащих в клетках оба типа нуклеиновых кислот.
Нуклеиновая кислота находится в головке. Внутри головки фагов обнаружено также небольшое
количество белка (около 3%).
Таким образом, по химическому составу фаги являются нуклеопротеидами. В зависимости от
типа своей нуклеиновой кислоты фаги делятся на ДНК-овые и РНК-овые. Количество белка и
нуклеиновой кислоты у разных фагов разное. У некоторых фагов содержание их почти одинаковое
и каждый из этих компонентов составляет около 50%. У других фагов соотношение между этими
основными компонентами может быть различно.
23
Кроме указанных основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и
некоторые преимущественно нейтральные жиры.
Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной
клеткой имеют одинаковый цикл.





Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки.
Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина.
Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты.
Деление клетки.
Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический
путь.
Умеренные бактериофаги после деления клетки находятся в состоянии профага (Лизогенный
путь).
Вирулентные бактериофаги развиваются по Литической модели:



Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого
белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК
и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе
клеточный аппарат синтеза белка.
Нуклеиновая кислота фага реплицируется и направляет синтез новых белков оболочки.
Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки
(капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется
лизоцим.
Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200—
1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии.
25. Распространение фагов в природе. Методы обнаружения и получения фагов.
Практическое использование фагов.
Фаги широко распространены в природе.
Выделить их можно из различных субстратов, в которых имеются микробы — хозяева фагов.
Кишечные фаги можно выделить из сточных вод, почвы, испражнений, стафилококковые фаги —
из слизи носа, зева, с кожных покровов, из отделяемого ран. В настоящее время известны фаги
почти у всех патогенных и многих непатогенных микроорганизмов: у бактерий семейства
кишечных, коринебактерий, микобактерий, стрептококков, споровых микроорганизмов,
актиномицетов. Фаги и подобные им агенты не обнаружены у простейших, большинства дрожжей,
плесневых грибов, спирохет, водорослей.
Выделение бактериофага из исследуемого материала и объектов внешней среды производят
обычно в тех случаях, когда не удается выделить культуру микроорганизма. Для выделения фага
производят посев фильтрата исследуемого материала на плотные или жидкие питательные среды
одновременно с культурой микробов, на которых происходит размножение искомого фага (тесткультура). О наличии фага судят по отсутствию роста тест-культуры. Постановку опыта всегда
сопровождают контрольным посевом тест-культуры бактерий на питательные среды. В
контрольной пробирке должен наблюдаться рост микробов, т. е. помутнение среды. На плотных
питательных средах фаги обнаруживают методами Отто или Грациа, которые можно использовать
также для подсчета количества фаговых корпускул в исследуемом материале. После выявления
фага в исследуемом материале определяют его количественное содержание, или титр фага.
24
Титр фага можно выразить двумя показателями:
1) количество активных корпускул фага в 1 мл исследуемого материала;
2) величина наибольшего разведения исследуемой жидкости, при котором фаг еще
проявляет свое литическое действие. Эта величина выражается отрицательным
логарифмом числа 10, где степень указывает разведение фага. Обычно титр фага
составляет 107.
Для титрования фага предложены разные методы, среди которых наибольшее распространение
получили титрование фага в жидкой питательной среде по методу Аппельмана путем
последовательных разведений и метод двухслойных агаров, разработанный Грациа. По методу
этого автора на первый слой (подложку) хорошо просушенного агара наносят второй слой
полужидкого агара, содержащий определенное количество тест-микроба и исследуемый фаг. По
числу негативных колоний фага определяют его количество.
Практическое применение фагов. Бактериофаги используют в лабораторной диагностике
инфекций при внутривидовой идентификации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для
этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов:
на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя,
наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии
определяется тем типом фага, который вызвал ее лизис (образование стерильного пятна, «бляшки»,
или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирования используют для выявления
источника и путей распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование). Выделение
бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.
По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды (например, в воде) можно судить
о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследования проводят при
эпидемиологическом анализе вспышек инфекционных болезней.
Фаги применяют также для лечения и профилактики ряда бактериальных инфекций. Производят
брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый,
стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др.).
Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парентерально или местно в виде жидких,
таблетированных форм, свечей или аэрозолей.
Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для
получения рекомбинантных ДНК.
26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.
Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции,
содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным
методом бактериологического исследования
Изучение свойств микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления
принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их
идентификация.
В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное
бактериологическое исследование, которое длится 18— 24 часов.
При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата
удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.
25
Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое
происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают
посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые
выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.
При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только
конкретный вид бактерий — элективные среды, или среды, позволяющие отличить
предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциальнодиагностические среды.
При бактериологическом методе посев материала на питательные среды производят либо
стеклянным или металлическим шпателем, либо бактериальной петлей таким образом, чтобы
находящиеся в исследуемом материале бактерии рассеять по поверхности питательной среды. В
результате такого рассеивания каждая бактериальная клетка попадает на свой участок среды.
В том случае, если в результате бактериологического метода исследования предполагается в
исследуемом материале содержание малого количества возбудителя, посев производят на жидкую
питательную среду для его накопления, так называемую среду обогащения, которая оптимальна для
данного микроорганизма. Далее осуществляют пересев из жидкой питательной среды на плотные
среды, разлитые в чашках Петри. Засеянную возбудителем среду помещают в термостат обычно
при определенной температуре, что важно для бактериологического метода.
На втором этапе бактериологического метода исследования проводят изучение колоний
бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной
клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и
макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным
глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.
Отмечают культуральные свойства колоний: их форму, величину, цвет, характер краев и
поверхности, структуру, консистенцию. Далее для приготовления мазков используют часть каждой
из намеченных колоний. Окрашивают мазки по Граму, микроскопируют, определяя
тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства выделенной культуры и
проверяя одновременно ее чистоту.
Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирки с оптимальной для данного вида средой,
например, скошенным агаром, с целью накопления чистой культуры для более полного ее изучения.
Пробирки перемещают на 18–24 часа в термостат. На втором этапе, кроме перечисленных
исследований, нередко подсчитывают количество выросших колоний.
Для того чтобы провести такое исследование готовят последовательные разведения взятого
исследуемого материала, из которых на чашки с питательной средой производят высев,
подсчитывают количество выросших колоний, умножают на разведение, из чего определяют
содержание микроорганизмов в материале.
Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение для этой культуры
чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам — третий этап
бактериологичестого метода. Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по
тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным, токсигенным, антигенным
свойствам.
Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре, исследуют морфологию
бактерий и проверяют чистоту культуры выросших бактерий. Далее осуществляют посев
выделенной чистой культуры бактерий на среды Гисса. Желательно провести посев и на другие
среды для определения биохимических свойств.
26
С помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином in vivo или in vitro определяют
токсинообразование микробов. В ряде случаев изучают и другие факторы вирулентности.
Вышеперечисленные исследования, которые проводятся в бактериологической лаборатории,
позволяют определить род или вид возбудителя.
Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий
вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных
разведений химический препарат — антибиотик с жидкой питательной средой разводят в
пробирках, после чего засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или
наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате бактериологического метода
исследования для определения идентичности штаммов, полученная антибиотикограмма может
служить и эпидемиологическим целям.
Могут проводиться повторные исследования при выявлении бактерионосительства т. к. можно
не обнаружить возбудителя в одной порции материала.
27. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным
средам.
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения
сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других
микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.
Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения.
Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют
метаболические процессы микробной клетки (витамины группы В, никотиновая кислота и др.).
Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров
животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и
азотистых веществ.
По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Плотные
среды готовят путем добавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара.
Агар представляет собой продукт переработки особого вида морских водорослей, он плавится при
температуре 80—86°С, затвердевает при температуре около 40°С и в застывшем состоянии придает
среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют
желатин (10—15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови, свернутый
яичный белок) сами по себе являются плотными.
По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференциальнодиагностические.
К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это
триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых
готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — питательный агар. Такие среды служат
основой для приготовления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др.,
удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий.
Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления
микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих
разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из
биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других.
Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации
хлорида натрия, холерного вибриона — в щелочной среде и т. д.
27
Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для разграничения
отдельных видов (или групп) микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что
разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности вследствие
неодинакового набора ферментов.
Особую группу составляют синтетические и полусинтетические питательные среды. В состав
синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли,
углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой
экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научноисследовательской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков,
вакцин и других препаратов.
Требования, предъявляемые к питательным средам.
Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые
для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные
влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую питательную
среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.
28. Ферменты бактерий, их классификация. Принципы конструирования питательных
сред для изучения ферментов бактерий.
В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов,
которые принадлежат к 6 классам:
а) гидролазы - расщепляют белки, углеводы, липиды путем присоединения воды;
б) оксидоредуктазы - катализируют окислительно-восстановительные реакции;
в) трансферазы - осуществляют перенос отдельных атомов от молекулы к молекуле;
г) лиазы - отщепляют химические группы негидролизным путем;
д) изомеразы - принимают участие в обмене углеводов;
е) лигазы - оказывают содействие биосинтетическим реакциям клетки.
Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут локализоваться как внутри клетки —
эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду — экзоферменты. Экзоферменты играют
большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь
источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые,
выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов,
липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов,
например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые
ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они
участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр
является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и — в некоторых случаях
— для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при
установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить
при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий
разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических
сред.
29. Основные принципы культивирования бактерий. Факторы, влияющие на рост и
размножение бактерий. Культуральные свойства бактерий.
28
Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме
нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках
Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей
используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из
стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде
капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и
градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные
пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.
При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив
ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими
пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку
пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее
до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по
скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой.
Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надг писывают,
указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название
культуры).
Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого,
приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность
питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю
сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева
появляется равномерный сплошной рост бактерий.
Для того чтобы культура микроорганизмов могла нормально расти, размножаться и
осуществлять биосинтез какого-либо вещества, необходимы благоприятные условия окружающей
среды. При неблагоприятных условиях изменяются свойства микроорганизмов, подавляется их
жизнедеятельность или происходит гибель. При неблагоприятных условиях изменяются свойства
микроорганизмов, подавляется их жизнедеятельность или происходит гибель.
Физические – температура, влажность среды, концентрация питательных веществ.
К химическим факторам, которые влияют на жизнедеятельность микроорганизмов, относятся:
рН среды, окислительно-восстановительный потенциал (гН2) и присутствие в среде токсичных
веществ.
Биологические факторы – сводятся к взаимоотношению между микроорганизмами,
соприкасающимися в процессе своей жизнедеятельности.
Культуральные свойства бактерий – питательные потребности, условия роста и характер роста
бактерий на бактериол. средах. В питательные потребности включают источники углерода, азота и
ростовых факторов, способность бактерий расти на определенных питательных средах, в условия
роста - рН, Eh, концентрацию О2 плотность, осмотическое давление среды, температуру роста; в
характер роста - скорость роста (быстрый, медленный), внешний вид к-ры на жидких, плотных и
полужидких средах, изменения, к-рые наступают в среде или отдельных ее компонентах в процессе
роста микробов. Сведения о К.с. используют при выборе способов культивирования и при
идентификации выделенной к-ры
30. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.
Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности,
выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на
биологические варианты —биовары (син: биотипы). Биовары, различающиеся по биохимическим
29
свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствительности к
фагу—фаговарами. Культуры микробов одного и того же вида, или биовара, выделенные из
различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами,
которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в
диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний,
пересевая их петлей в пробирку с твердой или, реже, жидкой питательной средой.
Колония представляет собой изолированное скопление бактерий одного вида, или биовара,
выросших на плотной питательной среде в результате размножения одной или нескольких
бактериальных клеток. Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей
морфологии, цвету и другим признакам.
Чистую культуру -бактерий получают для проведения диагностических исследований, которые
заключаются в идентификации, т. е. определении родовой и видовой принадлежности выделенных
бактерий. Это достигается путем изучения их морфологических, культуральных, биохимических и
других признаков (см. схему 1).
Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом
исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.
Культуральные свойства характеризуют питательные потребности, условия и тип роста бактерий
на плотных и жидких питательных средах. Эти свойства устанавливаются по морфологии колоний
и особенностям роста культуры.
Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных
ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике
таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические признаки
бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.
Для идентификации бактерий до рода и вида имеют значение пигменты, окрашивающие колонии
и культуры в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens
(палочка чудесной крови), золотистый пигмент—Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк),
сине-зеленый пигмент—Pseudomonas aeruginosa (палочка синезе-леного гноя).
Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные
исследования по выполнению соответствующего маркера — определению фермента, антигена,
чувствительности к фагам.
31. Микрофлора почвы, воды, воздуха. Патогенные виды, сохраняющиеся во внешней
среде и передающиеся через почву, воду, пищевые продукты, воздух.
Почва. В зависимости от глубины залегания слоя почвы меняется и состав ее микрофлоры. В
верхних слоях, богатых растительными и животными остатками, а также хорошо снабженных
воздухом, преобладают аэробные микроорганизмы, способные разлагать сложные органические
соединения. В более глубоких почвенных слоях содержится меньше органических соединений и
воздуха, вследствие чего там преобладают анаэробные бактерии.
Почва служит местом обитания спорообразующих палочек родов Bacillus и Clostridium.
Непатогенные бациллы (Вас. megatherium, Вас. subtilis и др.) наряду с псевдомонадами, протеем и
некоторыми другими бактериями являются аммонифицирующими, составляя группу гнилостных
бактерий, осуществляющих минерализацию белков. Патогенные палочки (возбудитель сибирской
язвы, ботулизма, столбняка, газовой гангрены) способны длительно сохраняться в почве.
30
В почве находятся также многочисленные представители грибов. Грибы участвуют в
почвообразовательных процессах, превращениях соединений азота, выделяют биологически
активные вещества, в том числе антибиотики и токсины. Токсинообразующие грибы, попадая в
продукты питания человека, вызывают интоксикации - микотоксикозы и афлатоксикозы.
Микрофлора воды отражает микробный состав почвы, так как микроорганизмы, в основном,
попадают в воду с ее частичками. В воде формируются определенные биоценозы с преобладанием
микроорганизмов, адаптировавшихся к условиям местонахождения, освещенности, степени
растворимости кислорода и диоксида углерода, содержания органических и минеральных веществ.
В водах пресных водоемов обнаруживаются различные бактерии: палочковидные
(псевдомонады, аэромонады), кокковидные (микрококки) и извитые. Загрязнение воды
органическими веществами сопровождается увеличением анаэробных и аэробных бактерий, а также
грибов. Микрофлора воды выполняет роль активного фактора в процессе самоочищения ее от
органических отходов, которые утилизируются микроорганизмами. Вместе с сточными водами
попадают представители нормальной микрофлоры человека и животных (кишечная палочка,
цитробактер, энтеробактер, энтерококки, клостридии) и возбудители кишечных инфекций
(брюшного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, лептоспироза, энтеровирусных инфекций). Таким
образом, вода является фактором передачи возбудителей многих инфекционных заболеваний.
Некоторые возбудители могут даже размножаться в воде (холерный вибрион, легионеллы).
Микрофлора воздуха взаимосвязана с микрофлорой почвы и воды. В воздух также попадают
микроорганизмы из дыхательных путей и с каплями слюны человека и животных. Солнечные лучи
и другие факторы способствуют гибели микрофлоры воздуха. В воздухе обнаруживаются
кокковидные и палочковидные бактерий, бациллы и клостридии, актиномицеты, грибы и вирусы.
Много микроорганизмов содержится в воздухе закрытых помещений, микробная обсемененность
которых зависит от степени уборки помещения, уровня освещенности, количества людей в
помещении, частоты проветривания и др. Количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха (так
называемое микробное число, или обсемененность воздуха) отражает санитарно-гигиеническое
состояние воздуха, особенно в больничных и детских учреждениях. Косвенно о выделении
патогенных микроорганизмов (возбудителей туберкулеза, дифтерии, коклюша, скарлатины, кори,
гриппа и др.) при разговоре, кашле, чиханье больных и носителей можно судить по наличию
санитарно-показательных бактерий (золотистого стафилококка и стрептококков), так как последние
являются представителями микрофлоры верхних дыхательных путей и имеют общий путь
выделения с патогенными микроорганизмами, передающимися воздушно-капельным путем.
32. Санитарно – показательные микроорганизмы. Коли – титр, коли – индекс, методы
определения.
Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно и с еще
большей степенью вероятности судить о возможном присутствии патогенов во внешней среде.
Их наличие свидетельствует о загрязнении объекта выделениями человека и животных, так как
они постоянно обитают в тех же органах, что и возбудители заболеваний, и имеют общий путь
выделения в окружающую среду. Например, возбудители кишечных инфекций имеют общий путь
выделения (с фекалиями) с такими санитарно-показательными бактериями, как бактерии группы
кишечной палочки —(в группу входят сходные по свойствам бактерии родов Citrobacter,
Enterobacter, Klebsiella), энтерококки, клостридии перфрингенс. Возбудители воздушно-капельных
инфекций имеют общий путь выделения с бактериями (кокками), постоянно обитающими на
слизистой оболочке верхних дыхательных путей, выделяющимися в окружающую среду (при
кашле, чиханье, разговоре), поэтому в качестве санитарно-показательных бактерий для воздуха
закрытых помещений предложены гемолитические стрептококки и золотистые стафилококки.
31
Санитарно-показательные микроорганизмы должны отвечать следующим основным
требованиям:
1. должны обитать только в организме людей или животных и постоянно обнаруживаться в их
выделениях;
2. не должны размножаться или обитать в почве и воде;
3. сроки их выживания и устойчивость к различным факторам после выделения из организма в
окружающую среду должны быть равными или превышать таковые у патогенных микробов;
4. их свойства должны быть типичными и легко выявляемыми для их дифференциации;
5. методы их обнаружения и идентификации должны быть простыми, методически и
экономически доступными;
6. должны встречаться в окружающей среде в значительно больших количествах, чем
патогенные микроорганизмы;
7. в окружающей среде не должно быть близко сходных обитателей — микроорганизмов.
Коли-индекс — количество особей кишечной палочки, обнаруживаемое в 1 л (для твердых тел в
1 кг) исследуемого объекта; определяется путем подсчета колоний кишечной палочки, выросших на
плотной питательной среде при посеве определенного количества исследуемого материала, с
последующим пересчетом на 1 л (кг). Коли-индекс — величина, пропорциональная фактическому
содержанию кишечной палочки в исследуемом субстрате.
Коли-титр — это наименьшее количество исследуемого материала в миллилитрах (для твердых
тел — в граммах), в котором обнаружена одна кишечная палочка. Для определения коли-титра
раздельно засевают на жидкие среды десятикратно уменьшающиеся объемы исследуемого
материала (например, 100; 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001 мл).
Для перевода коли-титра в коли-индекс следует 1000 разделить на число, выражающее колититр; для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 разделить на число, выражающее коли-индекс.
33. Микрофлора тела человека в различные возрастные периоды. Роль микробов –
постоянных обитателей тела человека в физиологических процессах. Понятие о
дисбактериозе, его классификация, проявления и методы лечения.
Микрофлора располагается только на коже и на слизистых оболочках полостей, сообщающихся с
внешней средой (кроме матки и мочевого пузыря). Все ткани организма в норме совершенно
свободны от микробов.
Естественная аутомикрофлора тела— единый природный комплекс, состоящий из совокупности
гетерогенных микробоценозов в различных участках человеческого организма.
До рождения организм человека стерилен,— в утробе матери эмбрион защищен от вторжения
микробов плацентарным и другими барьерами.
Микрофлора пищеварительного тракта — самая многочисленная и самая значимая для
поддержания здоровья человека. Особенно велика ее роль в развивающемся детском организме.
Существует два критических момента в процессе формирования кишечного микробиоценоза.
Первый — при рождении ребенка, когда в течение первых суток начинается колонизация
стерильного кишечника, второй — когда ребенка отлучают от грудного вскармливания.
В ходе родов кожа и слизистые ребенка впервые соприкасаются с микрофлорой родовых путей
матери, воздуха, рук медицинского персонала. Вследствие этого кишечная микрофлора первых
32
дней жизни ребенка представлена ассоциацией аэробов (в основном факультативными анаэробами)
— микрококками, энтерококками, клостридиями, стафилококками. К 4-5-му дню жизни видовой
состав фекальной микрофлоры становится более разнообразным, появляются ассоциации
неспорообразующих анаэробов (бифидобактерии, пропионибактерии, пептококки,
пептострептококки, бактероиды и фузобактерии). Однако пока еще доминируют аэробные бактерии
— лактобациллы, кокки, дрожжевые грибки.
Дальнейшее формирование аутомикрофлоры желудочно-кишечного тракта в основном зависит
от типа вскармливания. При грудном вскармливанииу здоровых доношенных детей уже в конце
первой — начале второй недели жизни в микробоценозе толстого кишечника за счет опережающих
темпов роста отчетливо преобладает анаэробная составляющая (более 95%). Оставшаяся часть
(около 4-5% ) представлена разнообразными факультативными аэробами: лактобациллами,
эшерихиями, энтерококками, эпидермальным стафилококком, дрожжевыми грибками.
Роль микробов – постоянных обитателей тела человека в физиологических процессах
Микробные биоценозы поддерживают нормальные физиологические функции и играют
определённую роль в иммунитете. Нарушения в микробных биоценозах во многих случаях могут
привести к возникновению патологических процессов в соответствующих органах.
Важную роль играет микрофлора толстой кишки. Она обладает выраженными
антагонистическими свойствами (особенно анаэробные микробы) и препятствует развитию
патогенных бактерий, которые могут попасть с пищей и водой в кишечник, а также гнилостных
бактерий. Микробы – постоянные обитатели кишечника образуют бактериоцины, антибиотики,
молочную кислоту, спирты, перекись водорода, жирные кислоты, которые подавляют размножение
патогенных видов. Таким образом, анаэробы кишечника участвуют в обеспечении
колонизационной резистентности, так как предотвращают колонизацию (заселение) слизистых
оболочек посторонними микроорганизмами.
Микробы кишечника также участвуют в процессах пищеварения, водно-солевом, белковом,
углеводном, липидном обменах, образуют на слизистой оболочке кишечника защитную плёнку,
способствуют формированию и развитию иммунной системы, участвуют в обезвреживании
токсических соединений, синтезируют биологически активные вещества (витамины, антибиотики,
бактериоцины).
Большое значение имеет E. сoli, которая обладает высокой ферментативной активностью,
синтезирует витамины B1, B2, B12, B5, K, обладает антагонистическими свойствами против
патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae, против стафилококков и грибов p.
Candida.
Понятие о дисбактериозе, его классификация, проявления и методы лечения.
Дисбактериоз (дисбиоз) – это состояние, развивающееся в результате утраты нормальных
функций микрофлоры. При этом происходит нарушение сложившегося равновесия между видами
микробов, а также между ними и организмом человека, т.е. нарушается состояние эубиоза. При
дисбактериозе происходят качественные и количественные изменения бактериальной микрофлоры.
При дисбиозе – изменения и среди других микроорганизмов (вирусов, грибов). Дисбактериозы
вызывают различные эндогенные (внутренние) и экзогенные (внешние) факторы. Чаще всего
развиваются дисбактериозы кишечника.
Вид дисбактериоза по возбудителю:


стафилококковый
протейный
33


дрожжевой
ассоциированный (стафилококковый, протейный, дрожжевой)
По степени компенсации:



компенсированная — клинических проявлений может не быть;
субкомпенсированная — проявления дисбактериоза иногда возникают при диетических
нарушениях, например;
декомпенсированная — приспособительные механизмы истощены, вылечить
дисбактериоз трудно.
Лечение заключается в восстановлении нормальной микрофлоры. Для восстановления
нормальной микрофлоры применяются пробиотики.
Пробиотики – это живые микроорганизмы или вещества, которые нормализуют состав и
функции микрофлоры в организме.
К пробиотикам относятся:
1) эубиотики – препараты, содержащие живые (лиофильно высушенные) микроорганизмы (чаще
представители нормальной микрофлоры, обладающие выраженными антагонистическими
свойствами). Они могут быть монокомпонентными (монокультуры) и поликомпонентными.
2) Пребиотики – вещества немикробного происхождения, компоненты убитых микробных
клеток и /или их метаболиты:
3) Синбиотики – содержат как живые микроорганизмы, так и неклеточные стимуляторы роста
нормальной микрофлоры: нутролин В (лактобациллы + витамины), ацидофилюс, примадофилюс,
мальтидофилюс, бебилайф.
34. Взаимоотношения между микроорганизмами в ассоциациях. Микробы – антагонисты,
их использование в производстве антибиотиков и других лечебных препаратов.
В конкретных экологических условиях между разными группами микробов устанавливаются
определенные взаимоотношения, характер которых зависит от физиологических особенностей и
потребностей совместно развивающихся микробов. Кроме того, микроорганизмы вступают в
различного рода взаимоотношения не только между собой, но и с простейшими, высшими
растениями и другими группами организмов, составляющих почвенное население.
В основном эти взаимоотношения можно условно подразделить на две большие группы:
благоприятные — синергизм и неблагоприятные — антагонизм . Однако взаимоотношения между
микробными сообществами далеко не всегда укладываются в рамки этих подразделений, так как
они чрезвычайно сложны, разносторонни и вариабельны. Изменения во взаимоотношениях
происходят вследствие изменений окружающих условий существования или в результате перехода
микробов из одной стадии развития в другую. Можно отметить следующие формы
взаимоотношений между микроорганизмами: сосуществование, метабиоз, симбиоз, конкуренция,
хищничество, паразитизм, антагонизм.
Сосуществованием, или нейтрализмом, называется такая форма взаимоотношений, когда
организмы, развиваясь совместно, не приносят друг другу ни вреда, ни пользы. Метабиоз —
использование продуктов жизнедеятельности одних микробов другими.
Микробный антагонизм (от греч. antagonizomai — борюсь, соперничаю), при котором один вид
микробов угнетает развитие других, довольно широко распространен в природе.
34
В почве находится множество различных видов микроорганизмов, многие из которых выделяют
вещества, губительно действующие на другие виды микробов. Эти вещества назвали
антибиотиками (от греч. anti — против, bios — жизнь). В настоящее время их широко используют
для лечения инфекционных заболеваний человека, животных и растений. Антибиотические
вещества можно не только получить в результате жизнедеятельности микроорганизмов, но и
выделить из тканей животных, растений. Поэтому в настоящее время антибиотиками называют
продукты обмена любых организмов, способные избирательно убивать микроорганизмы или
подавлять их рост.
Классификация антибиотических веществ может быть основана на различных принципах
(источники получения, химические свойства, антибактериальный спектр и пр.). Чаще всего их
классифицируют по спектру действия на различные микроорганизмы/Различают: 1) антибиотики,
активные в отношении грамположительных микроорганизмов (группа пенициллинов и макролиды
— эритромицин и олеандомицин); 2) антибиотики с широким спектром действия (ампициллин,
левомицетин, тетрациклины, стрептомицин, аминогликозиды); 3) антибиотики с противогрибковым
действием (нистатин, леворин, гризеофульвин); 4) противоопухолевые антибиотики.
35. Влияние на микробы физических, химических и биологических факторов.
Влияние физических факторов.
Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных
диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при
средней (около 37 °С) — мезофилами, при высокой — термофилами.
К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов — обитателей
почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся
бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде.
Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии
(возбудитель псевдотуберкулеза размножается при температуре 4 °С). В зависимости от
температуры культивирования свойства бактерий меняются. Интервал температур, при котором
возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум —
от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.
Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут
в диапазоне температур 10— 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.
При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. На дне
океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250—300 °С
и давлении 262 атм.
Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна,
сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности
навозом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как
показатель загрязненности почвы.
Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких температур. Поэтому их можно долго
хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого газа (—173 °С).
Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов.
Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи,
менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются
микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.
35
Высушивание под вакуумом из замороженного состояния — лиофилизацию — используют для
продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры
микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет)
сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.
Действие излучения. Неионизирующее излучение — ультрафиолетовые и инфракрасные лучи
солнечного света, а также ионизирующее излучение — гамма-излучение радиоактивных веществ и
электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток
времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах,
родильных домах, микробиологических лабораториях. С этой целью используют бактерицидные
лампы УФ-излучения с длиной волны 200—450 нм.
Ионизирующее излучение применяют для стерилизации одноразовой пластиковой
микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных материалов, лекарственных
препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучений,
например Micrococcus radiodurans была выделена из ядерного реактора.
Действие химических веществ. Химические вещества могут оказывать различное действие на
микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей
среде, называются дезинфицирующими. Антимикробные химические вещества могут обладать
бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.
Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным группам, среди
которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсодержащим
соединениям и окислителям.
Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая,
борная); щелочи (аммиак и его соли)
Микроорганизмы подвержены действию не только физических и химических, но и
биологических факторов (симбиоз, метабиоз, антогонизм, паразитизм).
Кроме взаимного влияния микроорганизмов друг на друга существуют и другие биологические
объекты и, следовательно, и другие виды воздействия. Особый интерес представляет фагия. Это
одна из форм взаимодействия между фагами (по своей природе это вирусы) и другими
микроорганизмами (бактериями, актиномицетами, синезелеными водорослями).
36. Стерилизация и дезинфекция. Методы стерилизации питательных сред и лабораторной
посуды.
Стерилизация — обработка объектов, при которой достигается полное уничтожение всех
микроорганизмов. В результате стерилизации объект становится свободным как от патогенных, так
и от сапрофитных микробов. Существуют различные методы и способы стерилизации, в основе
которых лежит действие физических или химических факторов. Критерием гибели
микроорганизмов является необратимая утрата способности к размножению, что можно оценить
путем количественного подсчета числа колоний после высева смывов на чашки с питательными
средами.
Наиболее широко применяют методы тепловой стерилизации: кипячением, сухим жаром в
атмосфере горячего воздуха или влажным жаром при помощи пара, а также прокаливанием
предметов в огне.
Прокаливание на огне — надежный метод стерилизации бактериологических петель,
металлических и стеклянных предметов. Однако применяется ограниченно ввиду их порчи.
36
Стерилизация сухим жаром или горячим воздухом производится в сушильных шкафах или
печах Пастера при температуре 160—170°С в течение 1—1,5 ч по достижении заданной
температуры. Этим методом стерилизуют лабораторную посуду, инструменты, минеральные масла
, вазелин. Жидкости и резину сухим жаром стерилизовать нельзя. Предметы, подлежащие
стерилизации, заворачивают в бумагу или закладывают в металлические пеналы для предохранения
от последующего загрязнения. Необходимо помнить, что при темпера-, туре выше 170°С
начинается обугливание бумаги, ваты, марли, а при более низкой температуре не происходит
гибели спор.
Стерилизация кипячением в течение 30 мин убивает вегетативные формы микробов. Споры
многих бактерий при этом сохраняются, выдерживая кипячение в течение нескольких часов. Для
уничтожения вирусов — возбудителей болезни Боткина необходимо кипячение в течение 45—60
мин. Кипячению в специальных стерилизаторах подвергают шприцы, хирургические инструменты,
иглы, резиновые трубки. Для повышения точки кипения и устранения жесткости воды добавляют
2% гидрокарбоната натрия.
Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование) является наиболее
надежным и быстрым методом стерилизации. Обеспложивание достигается воздействием пара,
температура которого под давлением выше, чем температура кипящей воды: при давлении 0,5 атм
112°С, при 1 атм. 121 °С , при 1,5 атм 127°С и при 2 атм 134°С.
Стерилизация текучим паром проводится в аппарате Коха или в автоклаве при не завинченной
крышке и открытом выпускном кране. На дно аппарата Коха наливают воду и нагревают до 100°С.
Образующийся пар движется вверх через заложенный материал и стерилизует его. Так как
однократное действие паров воды не убивает споры, применяют дробную стерилизацию — 3 дня
подряд по 30 мин. Споры, не погибшие при первом прогревании, прорастают до следующего дня в
вегетативные формы и погибают при втором и третьем прогревания.
Тиндализация – дробная стерилизация, которая проводится при температуре ниже 100 оС.
Тиндализацию проводят на водяной бане по часу при температуре 60 – 65 оС в течение пяти дней
или при 70 – 80 С три дня. Используют для обеззараживания питательных сред, содержащих белок,
кровяную сыворотку, витамины, ферменты.
Дезинфекция — уничтожение патогенных микробов в окружающей человека среде. Методы и
способы дезинфекции. различны, но они преследуют цели уничтожения не всех микроорганизмов, а
только патогенных. Уничтожение возбудителей инфекционных заболеваний в переносчиках
называют дезинсекцией, а в организме грызунов — источников инфекции — дератизацией.
При выполнении различных видов дезинфекции применяют механические, физические и
химические способы и средства. К первым относятся мытье рук с мылом и щеткой, влажная уборка
помещений, стирка белья, проветривание помещений и др., преследующие цель удаления
микроорганизмов с объекта. Физические способы: кипячение, сжигание, обработка паром (текучим
и под давлением) с использованием автоклава и дезинфекционных камер, приводят к уничтожению
патогенных микробов. Применение химических дезинфицирующих средств целесообразно сочетать
с механическими способами и действием физических факторов.
Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех
ингредиентов, которые входят в их состав.


Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного
белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С.
Среды с углеводами и молоком, питательный желатин стерилизуют текучим паром при
температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С.
37


Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая
жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.
Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки,
пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.
Лабораторную посуду стерилизуют:
а) сухим жаром при температуре 150, 160 и 180?С соответственно 2 часа, 1 час и 30 минут.
б) в автоклаве при давлении 1 атм. В течение 20-30 минут
37. Материальные основы наследственности микроорганизмов. Генотип и фенотип. Формы
изменчивости. Факторы, вызывающие изменчивость микроорганизмов. Внутривидовая
ненаследственная изменчивость. Реверсия.
Материальной основой наследственности, определяющей генетические свойства всех
организмов, в том числе бактерии и вирусы, является молекула ДНК. Исключение составляют
только РНК-содержащие вирусы, у которых генетическая информация закодирована в РНК.
Прокариотический геном
У бактерий обычно имеется одна замкнутая хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов,
необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, то есть бактериальная
клетка гаплоидна.
Внехромосомные факторы наследственности
Внехромосомные факторы наследственности бактерий представлены плазмидами, вставочными
последовательностями и транспозонами.
Плазмиды - фрагменты ДНК (от 40 до 50 генов). Выделяют автономные (не связанные с
хромосомой бактерии) и интегрированные (встроенные в хромосому) плазмиды.
Выделяют следующие группы плазмид.




F-плазмиды. F-плазмиды контролируют синтез F-пилей, способствующих спариванию
бактерий-доноров (F+) c бактериями-реципиентами (F-).
R-плазмиды (от англ. resistance, устойчивость) кодируют устойчивость к лекарственным
препаратам.
Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства бактерий и
токсинообразование (плазмиды включают tox+-гены).
Плазмиды бактериоциногении кодируют синтез бактериоцинов - белковых продуктов,
вызывающих гибель бактерий того же или близких видов.
Свойства микроорганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е.
совокупностью генов данной особи. Термин «геном» в отношении микроорганизмов — почти
синоним понятия «генотип».
Фенотип представляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей
средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя
и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень
возможных для данной клетки стенотипических изменений определяются набором генов, каждый
из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.
В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей
среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с
этим фенотипическую изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.
38
Любая наблюдаемая изменчивость является фенотипической. В свою очередь, фенотипическая,
или общая изменчивость включает три компонента:



Наследственная (генетическая, или генотипическая изменчивость) – в значительной мере
обусловлена влиянием генетических факторов. Например, в сходных условиях
выращивается несколько сортов одного вида растений. Тогда различия между
результатами эксперимента (например, урожайность) обусловлены генетическими
особенностями каждого сорта. В основе генетической изменчивости лежит мутационная и
комбинативная изменчивость.
Ненаследственная (модификационная) изменчивость – в значительной мере обусловлена
действием негенетических (экзогенных) факторов. Например, один сорт растений
выращивается в разных условиях. Тогда различия между результатами эксперимента
(например, урожайность) обусловлены влиянием условий выращивания растений.
Неконтролируемая (остаточная изменчивость) – обусловлена неконтролируемыми (по
крайней мере, в данном эксперименте) факторами.
Факторы, вызывающие эту изменчивость, разнообразны. К ним относятся состав питательной
среды, рН окружающей среды, концентрация минеральных солей, температура, ультрафиолетовые
лучи, действие фагов, лекарственных и дезинфицирующих препаратов, различные химические
соединения, ультразвук, ионизирующая радиация и многое другое.
Реверсия (reversion) [лат. reversio — возврат] — восстановление у мутантного организма дикого
фенотипа в результате новой мутации.
38. Формы и механизмы наследственной изменчивости микроорганизмов. Мутации,
репарации, их механизмы.
Наследственные изменения можно подразделить на изменения, возникающие в результате
мутаций и рекомбинаций генетического материала.
Мутации представляют собой изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в
наследственно закрепленной утрате или изменении какого-либо признака (признаков).
Мутации можно классифицировать по происхождению, характеру изменений в первичной
структуре ДНК, фенотипическим последствиям для мутировавшей бактериальной клетки и другим
признакам.
По происхождению мутации можно условно подразделить на спонтанные и индуцированные.
Первые составляют естественный, или спонтанный, фон, величина которого колеблется в
зависимости от типа мутации и вида микробной популяции.
Индуцированными называют мутации, которые получают в эксперименте под влиянием какихлибо мутагенов.
По количеству мутировавших генов различают генные и хромосомные мутации. Первые
затрагивают один ген и чаще всего являются точковыми, вторые распространяются на несколько
генов.
Точковые мутации представляют собой замену или вставку пары азотистых оснований в ДНК,
которая приводит к изменению одного кодона, вследствие чего вместо одной аминокислоты
кодируется другая либо образуется бессмысленный кодон, не кодирующий ни одну из аминокислот.
Последние называют нонсенс мутациями.
У микроорганизма, несущего точковую мутацию в одном гене, может возникнуть вторичная
мутация в этом же гене, в результате которого произойдет восстановление дикого фенотипа. При
39
этом первичную мутацию, которая привела к возникновению мутантного фенотипа, называют
прямой, а мутацию, обусловившую возврат к дикому фенотипу, — обратной.
Хромосомные мутации носят характер крупных перестроек в отдельных фрагментах ДНК. Они
возникают в результате выпадения меньшего или большего числа нуклеотидов (делеция), либо
поворота участка ДНК на 180° (инверсия), либо повторения какого-либо фрагмента ДНК
(дупликация). Один из механизмов образования хромосомных мутаций связан с перемещением Isпоследовательностей и транспозонов из одного участка ДНК в другой или из репликона в репликон
(из хромосомы в плазмиду и наоборот).
Рекомбинация (ре + лат. combinatio — соединение) — возникновение новых
последовательностей ДНК в результате разрывов и последующих восстановлений ее молекул. В
итоге таких изменений ДНК бактерий появляются так называемые рекомбинантные штаммы, или
рекомбинанты
Наиболее изучены три типа передачи ДНК, отличающиеся друг от друга способом ее
транспортировки: трансформация, трансдукция, конъюгация.
Репарации. Клеточный геном (ДНК) не является пассивной мишенью, подвергаемой действию
мутагенных факторов. В исследованиях с бактериями было установлено, что они обладают
специальными системами, восстанавливающими повреждения генетического материала. Эти
системы получили название репарационных,а сам процесс восстановления клеточного генома
(ДНК) — репараций. Способность бактериальных клеток к репарациям обусловливает
относительную стабильность их ДНК. Репарация поврежденной ДНК осуществляется ферментами,
образование которых контролируется специальными генами. Функции многочисленных
репаративных ферментов заключаются в установлении места повреждения ДНК, его «вырезании»,
синтезе поврежденных фрагментов на матрице сохранившейся нити ДНК, ее встраивании в
молекулу репарируемой нити ДНК.
39-41. Генетические рекомбинации. Особенности рекомбинативной изменчивости у
бактерий и эукариотов. Трансформация и ее стадии.
Генетические рекомбинации. Конъюгация, механизмы и этапы конъюгации. F и Hfr –
факторы.
Генетические рекомбинации. Трансдукция, типы трансдукции.
Микроорганизмам, как и клеткам высших организмов свойственны генетические рекомбинации,
которые имеют свои особенности. Они определяются прежде всего способом размножения и
закономерностями передачи генетического материала. Известно, что генетические рекомбинации у
клеток эукариот совершаются в ходе процессов, сопровождающих половое размножение путем
реципрокного (взаимного) обмена фрагментами хромосом. При таком обмене генетическим
материалом из двух рекомбинирующих родительских хромосом образуются две рекомбинантные
хромосомы. Применительно к данным клеткам это означает, что в результате рекомбинаций
возникают две рекомбинантные особи.
Прокариотам не свойственно половое размножение. Рекомбинация у них происходит в
результате внутригеномных перестроек, заключающихся в изменении локализации генов в
пределах хромосомы, или при проникновении в клетку реципиента части ДНК донора.
Последнее приводит к формированию неполной зиготы — мерозиготы. В результате
рекомбинаций в мерозиготе образуется только один рекомбинат, генотип которого представлен в
основном генотипом реципиента с включенным в него фрагментом ДНК донора. Вследствие этого
реципрокность генетических рекомбинаций у бактерий не может быть выявлена.
40
Рекомбинации подразделяют на законные и незаконные. Законная рекомбинация требует
наличия протяженных, комплементарных участков ДНК в рекомбинируемых молекулах. Она
происходит только между близкородственными видами микроорганизмов.
Незаконная рекомбинация не требует наличия протяженных комплементарных участков ДНК.
Незаконная рекомбинация происходит при участии Is-элементов, которые имеют «липкие концы»,
обеспечивающие их быстрое встраивание в бактериальную хромосому.
Генетические рекомбинации происходят при участии ряда ферментов в пределах отдельных
генов или групп сцеплений генов. Существуют специальные гес-гены, детермирующие
рекомбинационную способность бактерий. Передача генетического материала (хромосомных генов)
от одних бактерий к другим происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации, а
плазмидных генов — путем трансдукции и конъюгации.
Трансформация— непосредственная передача генетического материала (фрагмента ДНК)
донора реципиентной клетке.
Процесс трансформации бактерий можно подразделить на несколько фаз:
1) адсорбция ДНК-донора на клетке-реципиенте;
2) проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента;
3) соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей
рекомбинацией.
После проникновения внутрь клетки трансформирующая ДНК деспирализуется. Затем
происходит физическое включение любой из двух нитей ДНК донора в геном реципиента.
Конъюгация бактерий состоит в переходе генетического материала (ДНК) из клетки-донора
(«мужской») в клетку-реципиент («женскую») при контакте клеток между собой.
Мужская клетка содержит F-фактор, или половой фактор, который контролирует синтез так
называемых половых пилей, или F-пилей. Клетки, не содержащие F-фактора, являются женскими;
при получении F-фактора они превращаются в «мужские» и сами становятся донорами. F- фактор
располагается в цитоплазме в виде кольцевой двунитчатой молекулы ДНК, т. е. является
плазмидой. Молекула F-фактора значительно меньше хромосомы и содержит гены,
контролирующие процесс конъюгации, в том числе синтез F-пилей. При конъюгации F-пили
соединяют «мужскую» и «женскую» клетки, обеспечивая переход ДНК через конъюгационный
мостик или F-пили. Клетки, содержащие F-фактор в цитоплазме, обозначаются F+; они передают Fфактор клеткам, обозначаемым F" («женским»), не утрачивая донорской способности, так как
оставляют копии F-фактора. Если F-фактор включается в хромосому, то бактерии приобретают
способность передавать фрагменты хромосомной ДНК и называются Hfr-клетками (от англ. high
frequency of recombination — высокая частота рекомбинаций), т.е. бактериями с высокой частотой
рекомбинаций. При конъюгации клеток Hfr и клеток F" хромосома разрывается и передается с
определенного участка (начальной точки) в клетку F", продолжая реплицироваться. Перенос всей
хромосомы может длиться до 100 мин.
Переносимая ДНК взаимодействует с ДНК реципиента — происходит гомологичная
рекомбинация.
Трансдукция (от лат. transductio — перенос, перемещение) — передача ДНК от бактерии-донора
к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают три типа трансдукции:
неспецифическую или общую, специфическую и абортивную.
41
Неспецифическая трансдукция. В процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц
в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактерии-донора.
При этом фаг может утратить часть своего генома и стать дефектным.
Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологическую
область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации. Таким образом, при неспецифической
трансдукции трансдуцирующие фаги являются только переносчиком генетического материала от
одних бактерий к другим, поскольку сама фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов
(трансдуктантов).
Специфическая трансдукция характеризуется способностью фага переносить определенные
гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту. Это связано с тем, что образование
трансдуцирующего фага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы
вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки-донора рядом с профагом.
При взаимодействии трансдуцирующих фагов с клетками реципиентного штамма происходит
включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.
Бактерии, лизогенированные дефектным фагом, невосприимчивы, как и нее лизогенные клетки, к
последующему заражению гомологичным вирулентным фагом.
Абортивная трансдукция. При абортивной трансдукции принесенный фагом фрагмент ДНК
бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме
и может в таком виде функционировать. Во время деления бактериальной клетки
трансдуцированный фрагмент ДНК-донора может передаваться только одной из двух дочерних
клеток, т.е. наследоваться однолинейно и в конечном итоге утрачиваться в потомстве.
42. Плазмиды, их свойства и основные генетические функции. Генетический анализ,
принципы составления генетических карт. Генная инженерия. Генетические методы
диагностики инфекционных заболеваний. Молекулярная гибридизация, полимеразная
цепная реакция.
Плазмиды — внехромосомные мобильные генетические структуры бактерий, представляющие
собой замкнутые кольца двунитчатой ДНК. По размерам составляют 0,1—5 % ДНК хромосомы.
Плазмиды способны автономно копироваться (реплицироваться) и существовать в цитоплазме
клетки, поэтому в клетке может быть несколько копий плазмид. Плазмиды могут включаться
(интегрировать) в хромосому и реплицироваться вместе с ней. Различают трансмиссивные и
нетрансмиссивные плазмиды. Трансмиссивные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из
одной бактерии в другую.
Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно
выделить следующие:
1) устойчивость к антибиотикам;
2) образование колицинов;
3) продукция факторов патогенности;
4) способность к синтезу антибиотических веществ;
5) расщепление сложных органических веществ;
6) образование ферментов рестрикции и модификации.
42
Термин «плазмиды» впервые введен американским ученым Дж. Ледербергом (1952) для
обозначения полового фактора бактерий. Плазмиды несут гены, не обязательные для клетки-хозяина, придают бактериям дополнительные свойства, которые в определенных условиях окружающей
среды обеспечивают их временные преимущества по сравнению с бесплазмидными бактериями.
Некоторые плазмиды находятся под строгим контролем. Это означает, что их репликация
сопряжена с репликацией хромосомы так, что в каждой бактериальной клетке присутствует одна
или, по крайней мере, несколько копий плазмид.
Число копий плазмид, находящихся под слабым контролем, может достигать от 10 до 200 на
бактериальную клетку.
Для характеристики плазмидных реплико-нов их принято разбивать на группы совместимости.
Несовместимость плазмид связана с неспособностью двух плазмид стабильно сохраняться в одной
и той же бактериальной клетке. Несовместимость свойственна тем плазмидам, которые обладают
высоким сходством репликонов, поддержание которых в клетке регулируется одним и тем же
механизмом.
Некоторые плазмиды могут обратимо встраиваться в бактериальную хромосому и
функционировать в виде единого репликона. Такие плазмиды называются интегративными или
эписомами.
У бактерий различных видов обнаружены R-плазмиды, несущие гены, ответственные за
множественную устойчивость к лекарственным препаратам — антибиотикам, сульфаниламидам и
др., F-плазмиды, или половой фактор бактерий, определяющий их способность к конъюгации и
образованию половых пилей, Ent-плазмиды, детерминирующие продукцию энтеротоксина.
Плазмиды могут определять вирулентность бактерий, например возбудителей чумы, столбняка,
способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода, контролировать
синтез белковых антибиотикоподобных веществ — бактериоцинов, детерминируемых плазмидами
бактериоциногении, и т. д. Существование множества других плазмид у микроорганизмов
позволяет полагать, что аналогичные структуры широко распространены у самых разнообразных
микроорганизмов.
Плазмиды подвержены рекомбинациям, мутациям, могут быть элиминированы (удалены) из
бактерий, что, однако, не влияет на их основные свойства. Плазмиды являются удобной моделью
для экспериментов по искусственной реконструкции генетического материала, широко
используются в генетической инженерии для получения рекомбинантных штаммов. Благодаря
быстрому самокопированию и возможности конъюгационной передачи плазмид внутри вида,
между видами или даже родами плазмиды играют важную роль в эволюции бактерий.
Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале (воде,
продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в
чистую культуру.
Для проведения этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, в которой определяют
наличие специфичного для данного микроба гена. Обнаружение гена осуществляют его
накоплением. Для этого необходимо иметь праймеры комплементарного З'-концам ДНК. исходного
гена. Накопление (амплификация) гена выполняется следующим образом. Выделенную из
исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на 2 нити. Добавляют
праймеры. Смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры, при наличии в смеси ДНК
искомого гена, связываются с его комплементарными участками. Затем к смеси ДНК и праймера
добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавливают температуру, оптимальную для
функционирования ДНК-полимеразы. В этих условиях, в случае комплементарное™ ДНК гена и
43
праймера, происходит присоединение нуклеотидов к З'-концам праймеров, в результате чего
синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом количество ДНК гена
будет увеличиваться каждый раз вдвое. Проводят реакцию в специальных приборах —
амплификаторах. ПЦР применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.
43. Генетика вирусов. Внутривидовой и межвидовой обмен генетическим материалом.
Геном вирусов имеет простое строение и малую молекулярную массу. Число генов у вирусов
колеблется от 4—6 (парвовирусы) до 150 генов и больше (вирус оспы). В основе изменчивости
вирусов лежат мутации. Мутации носят случайный характер или могут быть направленными.
Вирус, являясь облигатным внутриклеточным паразитом, реализует этот паразитизм на
генетическом уровне. Присутствие нескольких типов вирусов в инфицированных клетках, т.е.
смешанная инфекция, может приводить к таким генетическим взаимодействиям между ними, как
множественная реактивация, рекомбинация, кросс-реактивация и др.; могут иметь место и не
генетические взаимодействия — комплементация и др.
Множественная реактивация — процесс взаимодействия вирусов с поражением разных генов, в
результате которого взаимодействующие вирионы дополняют друг друга благодаря генетической
рекомбинации, образуя неповрежденный вирус. Рекомбинация — обмен генетическим материалом
между вирусами — возможна в виде обмена генами (межгенная рекомбинация) или участками
одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). У вирусов рекомбинация происходит в
процессе заражения двумя или более типами вирусов, отличающимися друг от друга по
генетическим признакам. Вариантом рекомбинации является перекрестная реактивация, или кроссреактивация, происходящая в том случае, когда у одного из штаммов вируса часть генома
повреждена, а другой геном нормальный. При смешанной инфекции двумя такими вирусами в
результате рекомбинации появляются штаммы вируса со свойствами родительских
микроорганизмов.
В качестве примера негенетического взаимодействия вирусов может быть приведена
комплементация: при смешанной инфекции стимулируется репродукция обоих участников
взаимодействия или одного из них без изменения генотипов вирусов. Комплементация широко
распространена среди вирусов и наблюдается между как родственными, так и неродственными
вирусами. Обмен генетическим материалом при этом феномене не наблюдается.
Если геном одного вируса заключен в капсид другого вируса, этот феномен называется
фенотипическим смешиванием, наблюдаемым при смешанной инфекции.
Возможны также генетические взаимодействия неродственных вирусов, изучаемые генетической
инженерией.
Изучение генетики микроорганизмов не только имеет важное биологическое значение, но и
способствует решению многих медицинских проблем, таких, как разработка патогенетических
основ лечения и профилактики инфекционных болезней, способов диагностики (полимеразная
цепная реакция, ДНК-зонды), создание профилактических, лечебных и диагностических
препаратов.
44. Основные группы антимикробных химиопрепаратов, применяемых в терапии и
профилактики инфекционных болезней.
В 1932 г. Г. Домагк синтезировал первый сульфаниламидный препарат — стрептоцид,
явившийся родоначальником многочисленной группы сульфаниламидных соединений(табл. 8.1), к
которым чувствительны ряд грамположительных и грамотрицательных бактерий, прежде всего
пиогенные стрептококки, менингококки, гонококки, кишечная палочка и др.
44
Изучение механизма антибактериального действия сульфаниламидов привело к открытию
антиметаболитов— соединений, имеющихьструктурное сходство с важнейшими метаболитами,
участвующими в анаболических или катаболических реакциях. Включение антиметаболита в эти
реакции приводит соответствующие бактерии к задержке размножения и последующей гибели.
Сульфаниламиды оказывают бактериостатическое действие.
Помимо сульфаниламидов, к антиметаболитам относятся аналоги изоникотиновой кислоты,
азотистых оснований и других соединений.
Однако антиметаболиты нашли сравнительно ограниченное применение в химиотерапии
инфекционных заболеваний.
Это объясняется однотипностью многих биохимических реакций, протекающих в клетках
бактерий и человека, поэтому один и тот же антиметаболит блокирует образование продуктов,
необходимых для жизнедеятельности микробов и определенных клеток организма человека.
К препаратам, блокирующим процессы репликации и транскрипции относится группа
хинолонов.
К препаратам, нарушающим энергетический метаболизм, относятся производные оксихинолина.
Из производных тиосемикарбазона применяется фарингосепт, обладающий бактериостатической
активностью в отношении пиогенного стрептококка и других гемолитических стрептококков,
встречающихся на миндалинах при ангинах, а также в полости рта при гингивитах и стоматитах.
45. Антибиотики. Классификация. Механизмы действия антибактериальных препаратов
на микробы.
Антибиотики — химиотерапевтические вещества, продуцируемые микроорганизмами,
животными клетками, растениями, а также их производные и синтетические продукты, которые
обладают избирательной способностью угнетать и задерживать рост микроорганизмов, а также
подавлять развитие злокачественных новообразований.
За тот период, который прошел со времени открытия П.Эрлиха, было получено более 10 000
различных антибиотиков, поэтому важной проблемой являлась систематизация этих препаратов. В
настоящее время существуют различные классификации антибиотиков, однако ни одна из них не
является общепринятой.
В основу главной классификации антибиотиков положено их химическое строение.
Наиболее важными классами синтетических антибиотиков являются хинолоны и фторхинолоны
(например, ципрофлоксацин), сульфаниламиды (сульфадиметоксин), имидазолы (метронидазол),
нитрофураны (фурадонин, фурагин).
По спектру действия антибиотики делят на пять групп в зависимости от того, на какие
микроорганизмы они оказывают воздействие. Кроме того, существуют противоопухолевые
антибиотики, продуцентами которых также являются актиномицеты. Каждая из этих групп
включает две подгруппы: антибиотики широкого и узкого спектра действия.
Антибактериальные антибиотики составляют самую многочисленную группу препаратов.
Преобладают в ней антибиотики широкого спектра действия, оказывающие влияние на
представителей всех трех отделов бактерий. К антибиотикам широкого спектра действия относятся
аминогликозиды, тетрациклины и др. Антибиотики узкого спектра действия эффективны в
отношении небольшого круга бактерий, например полет-миксины действуют на грациликутные,
ванкомицин влияет на грамположительные бактерии.
45
В отдельные группы выделяют противотуберкулезные, противолепрозные,
противосифилитические препараты.
Противогрибковые антибиотики включают значительно меньшее число препаратов. Широким
спектром действия обладает, например, амфотерицин В, эффективный при кандидозах,
бластомикозах, аспергиллезах; в то же время нистатин, действующий на грибы рода Candida,
является антибиотиком узкого спектра действия.
Антипротозойные и антивирусные антибиотики насчитывают небольшое число препаратов.
Противоопухолевые антибиотики представлены препаратами, обладающими цитотоксическим
действием. Большинство из них применяют при многих видах опухолей, например митоми-цин С.
Действие антибиотиков на микроорганизмы связано с их способностью подавлять те или иные
биохимические реакции, происходящие в микробной клетке.
В зависимости от механизма действия различают пять групп антибиотиков:
1. антибиотики, нарушающие синтез клеточной стенки. К этой группе относятся, например, βлактамы. Препараты этой группы характеризуются самой высокой избирательностью действия: они
убивают бактерии и не оказывают влияния на клетки микроорганизма, так как последние не имеют
главного компонента клеточной стенки бактерий — пептидогликана. В связи с этим β -лактамные
антибиотики являются наименее токсичными для макроорганизма;
2. антибиотики, нарушающие молекулярную организацию и синтез клеточных мембран.
Примерами подобных препаратов являются полимиксины, полиены;
3. антибиотики, нарушающие синтез белка; это наиболее многочисленная группа препаратов.
Представителями этой группы являются аминогликозиды, тетрациклины, макроли-ды,
левомицетин, вызывающие нарушение синтеза белка на разных уровнях;
4. антибиотики — ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот. Например, хинолоны нарушают
синтез ДНК, рифампицин — синтез РНК;
5. антибиотики, подавляющие синтез пуринов и аминокислот. К этой группе относятся,
например, сульфаниламиды.
Источники антибиотиков.
Основными продуцентами природных антибиотиков являются микроорганизмы, которые,
находясь в своей естественной среде (в основном, в почве), синтезируют антибиотики в качестве
средства выживания в борьбе за существование. Животные и растительные клетки также могут
вырабатывать некоторые вещества с селективным антимикробным действием (например,
фитонциды), однако широкого применения в медицине в качестве продуцентов антибиотиков они
не получили.
Таким образом, основными источниками получения природных и полусинтетических
антибиотиков стали:
• Актиномицеты (особенно стрептомицеты) — ветвящиеся бактерии. Они синтезируют
большинство природных антибиотиков (80 %).
• Плесневые грибы — синтезируют природные бета-лактамы (грибы рода Cephalosporium и
Penicillium)H фузидиевую кислоту.
• Типичные бактерии — например, эубактерии, бациллы, псевдомонады — продуцируют
бацитрацин, полимиксины и другие вещества, обладающие антибактериальным действием.
46
Способы получения.
Существует три основных способа получения антибиотиков:
• биологический синтез (так получают природные антибиотики — натуральные продукты
ферментации, когда в оптимальных условиях культивируют микробы-продуценты, которые
выделяют антибиотики в процессе своей жизнедеятельности);
• биосинтез с последующими химическими модификациями (так создают полусинтетические
антибиотики). Сначала путем биосинтеза получают природный антибиотик, а затем его
первоначальную молекулу видоизменяют путем химических модификаций, например присоединяют определенные радикалы, в результате чего улучшаются противомикробные и фармакологические характеристики препарата;
• химический синтез (так получают синтетические аналоги природных антибиотиков, например
хлорамфеникол/левомицетин). Это вещества, которые имеют такую же структуру,
46. Механизмы устойчивости микробов к лекарственным препаратам. Пути преодоления
устойчивости. Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам и другим
антимикробным веществам. Основные критерии эффективности антибиотикотерапии.
Осложнения при антибиотикотерапии.
Антибиотикорезистентность — это устойчивость микробов к антимикробным химиопрепаратам.
Бактерии следует считать резистентными, если они не обезвреживаются такими концентрациями
препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и
приобретенной.
Природная устойчивость. Некоторые виды микробов природно устойчивы к определенным
семействам антибиотиков или в результате отсутствия соответствующей мишени (например,
микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувствительны ко всем препаратам,
действующим на этом уровне), или в результате бактериальной непроницаемости для данного
препарата (например, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных
соединений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет «маленькие»
поры).
Приобретенная устойчивость. Приобретение резистентности — это биологическая
закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. Она, хотя и в
разной степени, справедлива для всех бактерий и всех антибиотиков. К химиопрепаратам
адаптируются не только бактерии, но и остальные микробы — от эукариотических форм
(простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной
резистентности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так
называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множественная
устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность).
Генетические основы приобретенной резистентности. Устойчивость к антибиотикам
определяется и поддерживается генами резистентности (r-генами) и условиями, способствующими
их распространению в микробных популяциях. Приобретенная лекарственная устойчивость может
возникать и распространяться в популяции бактерий в результате:
• мутаций в хромосоме бактериальной клетки с последующей селекцией (т. е. отбором) мутантов. Особенно легко селекция происходит в присутствии антибиотиков, так как в этих условиях
мутанты получают преимущество перед остальными клетками популяции, которые чувствительны
к препарату. Мутации возникают независимо от применения антибиотика, т. е. сам препарат не
влияет на частоту мутаций и не является их причиной, но служит фактором отбора. Далее
резистентные клетки дают потомство и могут передаваться в организм следующего хозяина
47
(человека или животного), формируя и распространяя резистентные штаммы. Мутации могут быть:
1) единичные (если мутация произошла в одной клетке, в результате чего в ней синтезируются
измененные белки) и 2) множественные (серия мутаций, в результате чего изменяется не один, а
целый набор белков, например пени-циллинсвязывающих белков у пенициллин-резистентного
пневмококка);
• переноса трансмиссивных плазмид резистентности (R-плазмид). Плазмиды резистентности
(трансмиссивные) обычно кодируют перекрестную устойчивость к нескольким семействам
антибиотиков. Впервые такая множественная резистентность была описана японскими
исследователями в отношении кишечных бактерий. Сейчас показано, что она встречается и у
других групп бактерий. Некоторые плазмиды могут передаваться между бактериями разных видов,
поэтому один и тот же ген резистентности можно встретить у бактерий, таксономически далеких
друг от друга. Например, бета-лактамаза, кодируемая плазмидой ТЕМ-1, широко распространена у
грамотрицательных бактерий и встречается у кишечной палочки и других кишечных бактерий, а
также у гонококка, резистентного к пенициллину, и гемофильной палочки, резистентной к
ампициллину;
• переноса транспозонов, несущих r-гены (или мигрирующих генетических последовательностей). Транспозоны могут мигрировать с хромосомы на плазмиду и обратно, а также с
плазмиды на другую плазмиду. Таким образом гены резистентности могут передаваться далее
дочерним клеткам или при рекомбинации другим бактериям-реципиентам.
Реализация приобретенной устойчивости. Изменения в геноме бактерий приводят к тому, что
меняются и некоторые свойства бактериальной клетки, в результате чего она становится
устойчивой к антибактериальным препаратам. Обычно антимикробный эффект препарата
осуществляется таким образом: агент должен связаться с бактерией и пройти сквозь ее оболочку,
затем он должен быть доставлен к месту действия, после чего препарат взаимодействует с
внутриклеточными мишенями. Реализация приобретенной лекарственной устойчивости возможна
на каждом из следующих этапов:
• модификация мишени. Фермент-мишень может быть так изменен, что его функции не
нарушаются, но способность связываться с химиопрепаратом (аффинность) резко снижается или
может быть включен «обходной путь» метаболизма, т. е. в клетке активируется другой фермент,
который не подвержен действию данного препарата.
• «недоступность» мишени за счет снижения проницаемости клеточной стенки и клеточных
мембран или «эффлюко-механизма, когда клетка как бы «выталкивает» из себя антибиотик.
• инактивация препарата бактериальными ферментами. Некоторые бактерии способны
продуцировать особые ферменты, которые делают препараты неактивными (например, беталактамазы, аминогликозид-модифицирующие ферменты, хлорамфениколацетилтрансфераза). Беталактамазы — это ферменты, разрушающие бета-лактамное кольцо с образованием неактивных
соединений. Гены, кодирующие эти ферменты, широко распространены среди бактерий и могут
быть как в составе хромосомы, так и в составе плазмиды.
Для борьбы с инактивирующим действием бета-лактамаз используют вещества — ингибиторы
(например, клавулановую кислоту, сульбактам, тазобактам). Эти вещества содержат в своем составе
бета-лактамное кольцо и способны связываться с бета-лактамазами, предотвращая их разрушительное действие на бета-лактамы. При этом собственная антибактериальная активность таких
ингибиторов низкая. Клавулановая кислота ингибирует большинство известныхбета-лактамаз. Ее
комбинируют с пеницил-линами: амоксициллином, тикарциллином, пиперациллином.
Предупредить развитие антибиотикорезистентности у бактерий практически невозможно, но
необходимо использовать антимикробные препараты таким образом, чтобы не способствовать
48
развитию и распространению устойчивости (в частности, применять антибиотики строго по показаниям, избегать их использования с профилактической целью, через 10—15 дней антибиотикотерапии менять препарат, по возможности использовать препараты узкого спектра
действия, ограниченно применять антибиотики в ветеринарии и не использовать их как фактор
роста).
Как и всякие лекарственные средства, практически каждая группа антимикробных
химиопрепаратов может оказывать побочное действие, причем и на макроорганизм, и на микробы,
и на другие лекарственные средства.
Осложнения со стороны макроорганизма
Наиболее частыми осложнениями антимикробной химиотерапии являются:
Токсическое действие препаратов. Как правило, развитие этого осложнения зависит от свойств
самого препарата, его дозы, способа введения, состояния больного и проявляется только при
длительном и систематическом применении антимикробных химиотерапевтических препаратов,
когда создаются условия для их накопления в организме. Особенно часто такие осложнения
бывают, когда мишенью действия препарата являются процессы или структуры, близкие по составу
или строению к аналогичным структурам клеток макроорганизма. Токсическому действию
антимикробных препаратов особенно подвержены дети, беременные, а также пациенты с
нарушением функций печени, почек.
Побочное токсическое влияние может проявляться как нейротоксическое (например,
гликопептиды и аминогликозиды оказывают ототоксическое действие, вплоть до полной потери
слуха за счет воздействия на слуховой нерв); нефротоксическое (полиены, полипептиды,
аминогликозиды, макролиды, гликопептиды, сульфаниламиды); общетоксическое (противогрибковые препараты — полиены, имидазолы); угнетение кроветворения (тетрациклины, сульфаниламиды, левомицетин/хлорамфеникол, который содержит нитробензен — супрессор функции
костного мозга); тератогенное [аминогликозиды, тетрациклины нарушают развитие костей, хрящей
у плода и детей, формирование зубной эмали (коричневая окраска зубов),
левомицетин/хлорамфеникол токсичен для новорожденных, у которых ферменты печени не
полностью сформированы («синдром серого ребенка»), хинолоны — действуют на развивающуюся
хрящевую и соединительную ткани].
Предупреждение осложнений состоит в отказе от противопоказанных данному пациенту
препаратов, контроле за состоянием функций печени, почек и т. п.
Дисбиоз (дисбактериоз). Антимикробные химиопрепараты, особенно широкого спектра, могут
воздействовать не только на возбудителей инфекций, но и на чувствительные микроорганизмы
нормальной микрофлоры. В результате формируется дисбиоз, поэтому нарушаются функции ЖКТ,
возникает авитаминоз и может развиться вторичная инфекция (в том числе эндогенная, например
кандидоз, псевдомембранозный колит). Предупреждение последствий такого рода осложнений
состоит в назначении, по возможности, препаратов узкого спектра действия, сочетании лечения
основного заболевания с противогрибковой терапией (например, назначением нистатина),
витаминотерапей, применением эубиотиков и т. п.
Отрицательное воздействие на иммунную систему. К этой группе осложнений относят прежде
всего аллергические реакции. Причинами развития гиперчувствительности может быть сам
препарат, продукты его распада, а также комплекс препарата с сыворото㕇ными белками.
Возникновение такого рода осложнений зависит от свойств самого препарата, от способа и
кратности его введения, индивидуальной чувствительности пациента к препарату. Аллергические
реакции развиваются примерно в 10 % случаев и проявляются в виде сыпи, зуда, крапивницы, отека
Квинке. Относительно редко встречается такая тяжелая форма проявления аллергии, как
49
анафилактический шок. Такое осложнение чаще дают бета-лактамы (пенициллины), рифамицины.
Сульфаниламиды могут вызвать гиперчувствительность замедленного типа. Предупреждение
осложнений состоит в тщательном сборе аллергоанамнеза и назначении препаратов в соответствии
с индивидуальной чувствительностью пациента. Кроме того, антибиотики обладают некоторым
иммунодепрессивным действием и могут способствовать развитию вторичного иммунодефицита и
ослаблению напряженности иммунитета.
Эндотоксический шок (терапевтический). Это явление, которое возникает при лечении
инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Введение антибиотиков вызывает гибель и
разрушение клеток и высвобождение больших количеств эндотоксина. Это закономерное явление,
которое сопровождается временным ухудшением клинического состояния больного.
Взаимодействие с другими препаратами. Антибиотики могут способствовать потенцированию
действия или инактивации других препаратов (например, эритромицин стимулирует выработку
ферментов печени, которые начинают ускоренно метаболизировать лекарственные средства разного
назначения).
Побочное воздействие на микроорганизмы.
Применение антимикробных химиопрепа-ратов оказывает на микробы не только прямое
угнетающее или губительное воздействие, но также может привести к формированию атипичных
форм микробов (например, к образованию L-форм бактерий или изменению других свойств
микробов, что значительно затрудняет диагностику инфекционных заболеваний) и
персистирующих форм микробов. Широкое использование антимикробных лекарственных средств
ведет также к формированию антибиотикозависимости (редко) и лекарственной устойчивости —
антибиотикорезистентности (достаточно часто).
50