опухолевидных образований у берёзы и малины - Ya

муниципальное автономное общеобразовательное учреждение
города Новосибирска «Гимназия № 12»
Секция «Биология»
Исследование микрофлоры
опухолевидных образований у берёзы и малины
Малкова Анастасия Аркадьевна,
ученица 10с класса МАОУ «Гимназия № 12»
Научный руководитель:
Чернухин Валерий Алексеевич,
старший научный сотрудник, к. с-х. н.
Васёва Наталья Павловна,
учитель биологии
высшей квалификационной категории
Новосибирск, 2014
1
Разделы
1. Введение
1.1 Актуальность проблемы
1.2 Цели, задачи, методы и
объекты исследования
1.3 Теоретическая и практическая
значимость
полученных
результатов
2. Теоретическая часть
2.1 Малиновые галлы
2.2 Опухолеобразование у березы
3. Практическая часть
3.1 Засев микрофлоры галлов
малины
3.2 Засев микрофлоры опухолей
березы
3.4
Описание
микрофлоры
малиновых галлов
4. Анализ полученных результатов
5.Выводы и рекомендации
6.Используемая литература
Страницы
3
3
3
3
4-8
4-6
6-8
8
8-10
11-15
14-15
15
16
2
1. Введение
1.1 Актуальность: в Новосибирской области на многих растениях
встречаются опухолевидные образования. Однако в литературе отсутствуют
какие-либо данные о причинах образования многих из них. Нами был
обследован участок Соснового бора возле посёлка Северный (недалеко от ул.
Учительская, г. Новосибирска), где были обнаружены в зарослях малины побеги
с серыми наростами – галлами. Хотя в литературе описана причина образования
галлов - поселение на них личинок галловой мухи – галлицы, но вопрос о
причинах аномального разрастания стебля остаётся открытым.
Помимо новообразований на стеблях малины, нами были обнаружены
берёзы, на поверхности ствола которых есть необычные участки, в которых
сосредоточено огромное количество почек.
Этимология этого явления также не описана.
Мне захотелось понять, что может вызывать данные изменения у берёзы
повислой и малины.
1.2 Цели, задачи, объекты и методы исследования:
Цель: изучить микрофлору опухолевидных образований на малиновых
галлах
и опухолевидных образованиях берёзы, определить какие
микроорганизмы вызвали данные патологические изменения.
Задачи:
1. изучение научной литературы по данной теме;
2. выращивание микроорганизмов на питательной среде, наблюдение
за рассевом и обособлением колоний;
3. определение таксонов бактерий.
Объекты исследования: микроорганизмы, вызывающие опухолевидные
образования у березы повислой и малины.
Методы исследования. В работе используются классические
микробиологические методы: рассев на чашки Петри с агаризованной средой
LB, биохимические тесты микроорганизмов и др.
1.3 Значимость работы:
Теоретическая значимость. Полученные результаты, возможно, впервые
дают возможность понять причины опухолеобразования у изучаемых растений,
так как в литературе (русскоязычной и англоязычной) мне не встетились данные
о причинах этого явления у изучаемых растений.
Практическая значимость. Данные об этимологии опухолеобразования
помогут понять причины этих явлений, возможности их предотвращения и даже
практического использования.
3
2. Теоретическая часть
2.1 Малиновые галлы: Галл (от лат. galla — чернильныйорешек; цецидия) это патологическое образование на органах растений, сопровождающиеся
разрастанием тканей. Их возбудителями могут быть вирусы, бактерии, грибы.
Согласно литературным данным такого рода опухолеобразующие агенты очень
часто приносятся членистоногими (клещами, тлями, галлицами, орехотворками)
или корневыми галлообразующими нематодами. При этом поражаются
участки листьев и других органов растений. Однако могут поражаться и целые
органы, например, листовые почки. Галлы ослабляют растение и могут привести
его к гибели.
Малиновые галлы очень широко распространены на дикорастущей малине
(Rúbus idáeus) в пригородах Новосибирска и выглядят следующим образом
(фото 1).
Фото 1 Малиновые галлы
4
Фото 1 Малиновые галлы
Сами личинки малиновой галлицы, хотя и могут инициировать
галлообразование, но причиной разрастания галлов может стать какой-то
инфицирующий агент – бактерий или вирусы. В настоящее время в
литературных источниках отсутствует, какое либо описание причин
галлообразования у представителей рода малины (Rúbus).
Фото 2 Малиновая галлица
Фото 3 Личинка малиновой галлицы
5
Согласно литературным данным длина тела у малиновой стеблевой мухи до 7
мм. Личинка грязно-белая, с коричневой головкой. Повреждает малину. Зимуют
личинки в почве под кустами на глубине 5-6 см. Весной, когда почва
прогревается до 12-13° С, они окукливаются, а через 8-9 дней из куколок
вылетают мухи.
Самки откладывают яйца на верхушки молодых побегов или в пазухи еще
не развернувшихся листьев. Через 7-8 дней из них отрождаются личинки,
которые вгрызаются внутрь побегов и питаются их сердцевиной, проделывая
спиральные или кольцевые ходы в стеблях. Через 4-5 дней очаги внедрения
личинок в побеги становятся синими, а верхушки побегов начинают увядать и
постепенно усыхают. Перед цветением малины откормившиеся личинки
прогрызают стебель и уходят в почву.
2.2 Опухолеобразование у берёзы
У берез, произрастающих в Новосибирске, можно встретить, по крайней
мере, два вида наростов. Один тип наростов представляет собой очень крупные
шишковидные образования диаметром 25-60 см, на которых почки, как правило,
отсутствуют. Он вызван так называемым трутовиком скошенным, а сами
образования называются чагой.
Чага, или берёзовый гриб — стерильная (бесплодная) форма гриба,
относящегося
к
виду Трутовик
скошенный (лат. Inonotus
obliquus)
отдела Базидиомицеты. Чаще всего встречается на берёзах, отчего и получил
народное название «чёрный берёзовый гриб». Реже поражает некоторые другие
живые
деревья —ольху, рябину, бук, вяз, клён.
Используется
в медицине как противоопухолевое и противогастритное средство.
Фотографии, сделанные на ул. Учительской, приведены ниже (фото 4)
Фото 4 Чага, или берёзовый гриб
6
В данном случае этимология явления хорошо известна. Пользуясь научной
литературой, мы выяснили, что чага образуется в результате заражения
дерева паразитным грибом Inonotus obliquus. Его споры прорастают только в
том случае, если попадают на повреждённые участки коры деревьев. Образуется
нарост неправильной формы.
Нас заинтересовал другой случай, когда опухоли значительно меньше по
размеру – примерно 10-20 см. В этом случае на берёзах мы наблюдаем обилие
почек (фото 5).
Фото 5 Опухолевые образования на стволах берёз
Данный вид новообразования называется
капом.
Кап —
нарост
на дереве с
деформированными
направлениями
роста
волокон древесины.
Обычно
встречается в виде округлого выроста на
стволе или ветке, наполненного мелкими
древесными узелками спящих почек.
Капы
растут
за
счёт
камбия
(образовательная ткань) (фото 6).
Фото 6 Кап на стволе берёзы
7
Кап является прочным материалом и ценится за свою необычную текстуру.
(фото 7). Рисунок на распиле это переплетение годичных слоев,
сердцевины спящих почек в виде концентрических кругов и темных точек. Из
этого материала создают различные элементы искусства (фото 8).
Фото 7 Текстура капа берёзы
Фото 8 Изделия из капа
3. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
3.1 Засев микрофлоры галлов малины.
Цель: вырастить и описать микрофлору малиновых галлов.
Сделав срез на месте образования галла, с помощью автоматической пипетки
добавила в чашку Петри несколько капель дистиллированной воды, и смыв с
галла. После этого растерли микробиологическим шпателем и поставили в
темное помещение на 7 суток.
Фото 9 Малиновая галла в разрезе
Фото 10 Штаммы бактерий, выросшие на
малиновых галлах
8
В результате мы наблюдали образование колоний данного штамма (фото 10).
Описание морфологии колонии. Колонии округлые, с ровными краями, почти
прозрачные. Налёт, свидетельствующий об образовании спор, отсутствует.
3.2 Засев микрофлоры опухолей на берёзе
Цель: вырастить и описать микрофлору опухолей березы.
Для засева был использован кап березы. Автоматической пипеткой капаем
небольшое количество дистиллированной воды в чашки Петри с агаризованной
средой LB. После этого делали смыв со среза капа и эту жидкость добавляли в
чашку.
С
помощью
микробиологического
шпателя,
ранее
продезинфицированного, аккуратно растираем жидкость по всей площади чашки
Петри (фото 11).
Фото 11 Засев микрофлоры
9
Фото 11 Засев микрофлоры
В результате на чашке Петри выросли штаммы (фото 12), представленные мелкими
колониями, округлой формы, белого, грязно-белого цвета или кремовые, выпуклые,
блестящие, с уплотненным центром, край ровный, или слегка волнистый и приподнятый,
иногда прозрачный. По описаниям данные бактерии могут принадлежать к группе Amylovora
и Erwinia multivora.
Фото 12 Штаммы, выросшие на березе повислой
3.4 Исследование микрофлоры малиновой галлы
10
3.4.1 Грамотрицательность. Этот факт был определён не окраской по
Граму [1], а на основе установленного нами быстрого лизиса бактерий в
лизирующем буфере следующего состава: 10 мМ Tris-HCl, pH 8,5, 0.1 мМ ЭДТА,
0.1 М NaCl, 0.3 мг/мл лизоцим, который был получен из микробиологической
лаборатории ООО «СибЭнзайм».
В пробирку с 400 мкл лизирующего буфера с помощью
микробиологической петли была добавлена из культуры на чашке Петри
биомасса целевого штамма объёмом примерно со спичечную головку, после чего
биомасса суспендировалась автоматической пипеткой.
Через несколько минут пробирка со взесью стала прозрачной и вязкой.
Фото 13 Справа – нелизированные бактерии в лизирующем буфере, слева – лизированные
бактерии в лизирующем буфере после 5 минутного суспендирования пипеткой.
Данный факт свидетельствует о том, что бактерии являются
грамотрицательными,
так
как
последние
имеют
в
отличие
от
грамположительных тонкую клеточную стенку и очень быстро (за несколько
секунд) лизируются даже в человеческой слюне, где есть лизоцим.
11
Итак, после обработки лизирующим буфером раствор стал прозрачный и
вязкий. Данный факт говорит о том, что бактериальные стенки и мембраны были
разрушены, а ДНК вышла в раствор.
Способностью к такому быстрому лизису обладают только
грамотрицательные штаммы, так как у них очень тонкая клеточная стенка. Для
столь глубокого лизиса грамположительным штаммам необходимо 0,5-5 часов
суспендирования.
Таким образом, данный штамм относится к грамотрицательным
бактериям.
3.4.2 Тест на каталазу. После нанесения капли перекиси водорода на
колонии на чашки Петри наблюдали интенсивное образование пузырей, что
свидетельствует о наличии высокой активности каталазы в данном штамме.
Таким образом, данный штамм является каталазоположительным.
Фото 14 Определение на каталозоположительность
3.4.3 Определение морфологии клеток. При микроскопировании было
установлено, что штамм представлен одиночными палочковидными клетками
размером 0,5-0,8х1,2-1,5 мкм. Структуры, похожие на споры (например, более
мелкие округлые образования), не выявлены.
3.4.4 Выделение ДНК. Биомасса объёмом примерно со спичечную головку
лизировалась так, как описано в пункте 2. Далее к 400 мкл полученного лизата
добавляли стирального порошка объёмом со спичечную головку. Лизат
перемешивали пипеткой 1 минуту. Далее к полученной смеси добавляли 50 мкл
уксусной кислоты и 1 мл 96% этилового спирта.
ДНК выпадала в осадок. Этот осадок был передан в микробиологическую
лабораторию ООО «СибЭнзайм», где для меня определили первичную
12
последовательность небольшого участка гена рибосомной ДНК, точнее гена т.н.
16S РНК малой субъединицы рибосомы.
Само определение последовательности гена 16S рибосомной РНК
проводили в НИИ молекулярной биологии лабораторию рекомбинантных
вакцин (наукоград Кольцово).
В
данном
учреждении
нам
выдали
следующий
фрагмент
последовательности гена 16S рибосомной РНК общей длиной 451 нуклеотид:
5’-gAAgGTtAGcTACCTacTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGcGGTGtGTAC
AAGGCCCGGGAACGTATTCACCGtAgCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTT
CACGGAGTCGAGTTGCAGACTCCGATCCGGACTACGACGCACTTTATGAGGTCCGCTTGC
TCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTA
AGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCT
TTGAGTTCCCGACATTACTCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACT
TAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACgACAGCCATGCAgCACCTGTCTCAcGGTTCC
CGAAGGCACTAAGGcATCTCTGCCGAATTCCG-3’
Данная последовательность использовалась для идентификации вида
бактерии в соответствии с общепринятой методикой [3].
Полученная последовательность гена рРНК анализировалась нами с
помощью программы BLAST, расположенной на сервере по адресу
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearc
h&LINK_LOC=blasthome
Полученную последовательность гена рРНК мы ввели в данные этой
программы (Скрин 1)
Скрин 1 Анализирование программой BLAST
13
В результате мы получили следующие результаты (Скрин 2):
Скрин 2 Анализирование программой BLAST
Полученные результаты свидетельствуют о том, что данный вид относится
вероятнее всего к Erwinia rhapontici, так как последовательность участка гена
рРНК имеет с ним 100% гомологию. Для межвидовых различий характерно
отличие в несколько процентов последовательностей [3]
Таким образом, на основе полученных результатов мы можем сделать
вывод о том, что микробактериальная микрофлора, населяющая галлы
малиновой галлицы, представлена бактерий Erwinia rhapontici.
4. АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Обратимся к литературным источникам и попытаемся проанализировать
полученные результаты.
Как следует из Википедии (http://en.wikipedia.org/wiki/Erwinia) бактерии
рода Erwinia относятся к тому же семейству, что и кишечная палочка
(Escherichia coli) сальмонелла, и возбудитель чумы (Yersinia), то есть к семейству
Enterobacteriaceae. Название рода было дано в честь знаменитого
американского фитопатолога Эрвина Смита (1854 – 1927).
На основе полученных нами экспериментальных данных и литературных
источников позвольте выдвинуть следующую модель, объясняющую причину
галлообразования.
Поскольку эрвинии относятся к семейству энтеробактерии, значительная
часть представителей, которых встречается в микрофлоре кишечника, можно
предположить, что и данный фитопатоген также может встречаться в кишечнике
14
насекомых. Попадая из кишечника личинок, он способствует не только
внутрикишечному, но и внекишечному частичному перевариванию
растительного субстрата. В пользу этого факта говорят и следующие данные,
найденные мной в статье Корнеева О.С., Божко О.Ю. [5] где выдвинуто
предположение, что эрвинии могут использоваться человеком для получения
низкомолекулярных сахаров из полисахаридов.
Факультативно-анаэробные бактерии Erwinia rhapontici являются
продуцентами
высокоактивного
фермента
изомальтулозосинтазы,
катализирующего реакцию изомеризации сахарозы в изомальтулозу ‒
природный заменитель сахара [1, 2]. Изомальтулоза отличается рядом
преимуществ по сравнению с известными сахарозаменителями, а именно: имеет
чистый сладкий вкус, низкую калорийность (2,0 ккал/г), устойчива к
изменениям температуры и рН. За рубежом изомальтулоза широко применяется
в пищевой и фармацевтической промышленности как заменитель сахарозы. В
России разработаны концептуальные аспекты биотехнологии изомальтулозы с
помощью фермента бактериального происхождения [3, 4].
5. ВЫВОДЫ И РЕКОМЕНДАЦИИ
Изучив литературные источники по данной теме и проведя ряд
исследований микрофлоры срезов малиновых галлов и опухолевидных
образований березы, можно отметить:
1) причина этих явлений, деятельность бактерий рода Erwinia rhapontici, которые
являются:
- грамотрицательными;
- каталазоположительными;
- представителями одиночных палочковидных клеток.
2) Заражение малины Erwinia rhapontici проходит в результате поселения на ней
малиновой галлицы, в кишечнике которой они, предположительно, обитают.
3) В некоторых странах способность Erwinia rhapontici катализировать реакцию
изомеризации сахарозы в изомальтулозу широко используется в пищевой и
фармацевтической промышленности как заменитель сахарозы.
15
6. ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Жизнь растений. Том 1. Введение Бактерии и актиномицеты\ Под редакцией
члена-корреспондента АН СССР, профессора Н.А. Красильников, профессора
А.А. Уранов М. 'Просвещение', 1974, 487 с. с ил.; 31 л. ил., карт
2. Беликов С.И., Грачев М.А., Земская Т.И., Манакова Е.Н., Парфенова В.В.
Определение таксономического положения бактерий из озера Байкал методом
анализа последовательностей фрагментов 16S рРНК. // Микробиология. – 1996. –
Т. 65. - С. 855-864.
3. Пиневич А.В. Микробиология. Биология прокариотов. Т.1. 2009, Издательство
СПбГУ
4. Фитопатогенные микроорганизмы: Учеб.- метод. комплекс для студентов
биол. фак. спец. G - 31 01 01 «Биология» / Р. А. Желдакова, В. Е. Мямин. – Мн. :
БГУ, 2006. – 116 с.
5. Вестник ОГУ №4/Апрель УДК 577.1 О.С.Корнеева О.Ю.Божко ГОУ ВПО
«Воронежская государственная технологическая академия» Применение
изомальтулозосинтетазы Erwinia rhaponticiс целью трансформации сахарозы в
изомальтулозу
6. http://dendrology.ru/forest/item/f00/s01/e0001848/index.shtml
7. Спицына Т.П. «Основы токсикологии»
16