ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИЧ-ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ Порядок диагностирования детей младше 18 месяцев при подозрении на ВИЧ Порядок диагностирования детей на ВИЧ-инфекцию и методы диагностики определяются ВИЧ-статусом матери. Дети, рожденные от ВИЧ-инфицированных матерей Дети могут заразиться ВИЧ-инфекцией во время беременности, родов и вскармливании грудным материнским молоком. Вырабатываемые в организме матери специфические антитела (против ВИЧ), во время беременности передаются трансплацентарно и сохраняются после рождения ребенка в его крови до 18 месяцев. Поэтому, в этот период диагностировать точно серологическим методом невозможно. В этом периоде вероятность инфицирования ВИЧ-инфекцией у детей находящихся на искусственном вскармливании предполагается на основании 2-х положительных результатов ПЦР, определяющей провирусной ДНК в крови. • Для определения ВИЧ статуса у ребенка, рожденного ВИЧинфицированной женщиной, методом ПЦР ДНК ВИЧ не используется пуповинная кровь. • Положительный результат ПЦР ДНК ВИЧ в первые 48 часов жизни ребенка позволяет предположить внутриутробное заражение ребенка. • Если в первые 48 часов жизни ребенка обследование методом ПЦР ДНК ВИЧ дает отрицательный результат, а в дальнейшем - положительный, считается, что заражение ребенка произошло во время родов. • К возрасту 3-х месяцев жизни методом ПЦР ДНК ВИЧ можно определить ВИЧ-статус у всех детей, рожденных ВИЧ инфицированными матерями и не получающих грудное вскармливание. • Первое исследование методом ПЦР ДНК ВИЧ следует провести у ребенка в возрасте от одного до двух месяцев. Положительный результат теста ПЦР ДНК ВИЧ означает, что ребенок, с наибольшей вероятностью, инфицирован ВИЧ. Отрицательный результат теста ПЦР ДНК ВИЧ в этом возрасте означает, что, с наибольшей вероятностью, ребенок не инфицирован ВИЧ. • Второе исследование методом ПЦР ДНК ВИЧ следует провести у ребенка в возрасте 3-4 месяцев. • Однократные положительные требуют подтверждения. и/или отрицательные результаты • Положительный результат второго теста ПЦР ДНК ВИЧ означает, что ребенок, с наибольшей вероятностью, инфицирован ВИЧ. Отрицательный результат второго теста ПЦР ДНК ВИЧ в этом возрасте означает, что, с наибольшей вероятностью, ребенок не инфицирован ВИЧ. • Подтверждение положительного результата теста ПЦР ДНК ВИЧ проводится этим же методом в отдельно взятом образце крови как можно раньше (лучше в течение 5-7 дней после получения первого результата) и, желательно, в той же лаборатории. • Два положительных результата ПЦР ДНК ВИЧ свидетельствует о том, что ребенок ВИЧ-инфицирован и требует немедленного клинического обследования для выбора оптимальной тактики дальнейшего ведения. • Для решения начала АРВ терапии определяется вирусная нагрузка методом ПЦР. Два отрицательных результата ПЦР ДНК ВИЧ позволяют считать ребенка не инфицированным, при условии отсутствия грудного вскармливания. • У детей до 18 месяцев находящихся на грудном вскармливании, тестирование для определения провирусной ДНК методом ПЦР проводится не ранее чем через 6 недель после полного прекращения кормления грудью. Положительный результат ПЦР позволяет считать ребенка ВИЧинфицированным и направляется для решения вопроса о лечение. • Отрицательный результат теста ПЦР позволяет считать ребенка не ВИЧ-инфицированным. Ребенку, достигшего 18 месячного возраста, рожденного от ВИЧинфицированной матери, заключительный диагноз ставится на основании анализов ИФА и ИБ с забором крови в комиссионном порядке в Центрах по борьбе со СПИД. У детей начиная с 18 месячного возраста, в пробах крови, полученных в комиссионном порядке, определяются антитела с помощью метода ИФА. При отрицательных результатах – ВИЧ-инфекция не подтверждается, положительных результатах – подтверждается иммуноблоттом. Положительный результат иммуноблотт подтверждает ВИЧ-диагноз, отрицательный результат не подтверждает диагноз. Обследование детей на ВИЧ Методы обследования: ИФА и иммуноблот Биологическим материалом для анализа методом ИФА и иммуноблот служат: пробы крови и сыворотки крови. Обследование детей по клиническим показаниям проводится в той же последовательности, как при обследовании взрослых. Если у ребенка при обследовании методом ИФА положительный результат, то диспансерное отделение рекомендует обследование крови родителей методом ИФА и организует забор крови в комиссионном порядке. Учитывая особенности строения иммунной системы у детей, при положительных результатах ИФА и отрицательном или сомнительном результатах иммуноблота дополнительным подтверждающим тестом является ПЦР. Контроль качества для иммуноферментного анализа Контроль качества – это совокупность методов и действий, которые используются для выполнения требований по обеспечению качества. На все этапы лабораторного процесса (преаналитический, аналитический, постаналитический) в лаборатории должны быть разработаны и утверждены стандартные операционные процедуры (СОП). Качество проводимого ИФА в диагностических лабораториях зависит от очень многих факторов: качества тест-систем, условия их хранения, температурного режима помещений, спектрофотометра, термостата, точности работы автоматических пипеток, квалификации сотрудников лаборатории. Температура воздуха в лаборатории должна быть в пределах 18–21°С, так как колебания температуры влияют на результаты анализов. Необходимо своевременно проводить ежегодную метрологическую поверку аппаратуры и оборудования. Ежедневно вести контроль и запись температурного режима в холодильниках, морозильниках и термостатах. Тест-системы, реагенты и диагностикумы должны храниться в соответствующих температурных режимах согласно их инструкциям (холодильник, морозильник). Для достижения точности и достоверности результатов анализа в процессе постановки необходимо проводить контроль. Различают внутренний и внешний контроль качества. Внешний контроль качества 1 раз в год проводит Референс лаборатория МЗРуз совместно со специалистами лаборатории Республиканского Центра по борьбе со СПИД. При постановке ИФА, помимо контролей указанных в инструкции тест-системы, дополнительно ставится внутренний контроль – «положительная» сыворотка, закупленная в Референс-лаборатории. Метод определения CD4-лимфоцитов в крови Для уточнения степени и характера иммунодефицита используют методы оценки иммунного статуса. К ним относятся: - определение абсолютного и относительного количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови; - определение абсолютного и относительного количества субпопуляций Т-лимфоцитов СД4 (Т-хелперов) и определение концентрации клеток СД4 на поверхности Т-хелперов; - определение СД8 Т супрессоров/киллеров и соотношение СД4/СД8; определение гуморального иммуноглобулинов M, G, A, E). иммунитета (содержание Снижение количества лимфоцитов проявляется с бессимптомной стадии и длится в течение всей болезни. Лимфопения, нейтропения повышают чувствительность к ВИЧ-инфекции и являются прогностически неблагоприятными признаками. Снижение количества Т-хелперов (СД4) является главным прогностическим показателем Т-клеточного иммунодефицита при ВИЧинфекции. Измерение уровня CD4-лимфоцитов позволяет судить о глубине развившегося у больного иммунодефицита. Уровень снижения количества CD4 клеток может служить критерием для определения вероятности возникновения тех или иных вторичных заболеваний. В норме количество Т-хелперов колеблется от 500 до 1500 в 1 мкл. Снижение абсолютного количества их до 350 и ниже говорит о прогрессировании ВИЧ-инфекции и развитии СПИДа. Определение количества СД8 Т-супрессоров проводится аналогично определению СД4 Тхелперов. Увеличение количества СД8 отмечается на ранней стадии ВИЧинфекции. Соотношение СД4/СД8 соответстсвует 1,5-2. Определение уровня CD4 лимфоцитов проводят моноклональных антител на проточном цитофлюориметре. с помощью В лабораториях кровь исследуется согласно применяемой методике на СД4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это высокоэффективная реакция, при которой происходит амплификация (селективное умножение) специфических последовательностей ДНК до такого уровня, когда их можно определить методом электрофореза или другими методами. ПЦР используемая на практике для ранней диагностики ВИЧ позволяет определить провирусную ДНК, геномную РНК вируса. Выявление ВИЧ и его антигенов необходимо для ранней диагностики перинатального заражения у детей первых лет жизни, т.к. материнские антитела класса G проникают через плаценту. У взрослых эти исследования необходимо проводить в серонегативном периоде (в ИФА), при сомнительных результатах иммуноблота и для контроля эффективности проводимого лечения. При положительных результатах ИФА, отрицательных результатах иммуноблот, дополнительно используется ПЦР по эпидемиологическим и клиническим показаниям. Диагностика ВИЧ-инфекции у детей до года и старше, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, представляет определенные трудности. Это обусловлено тем, что как уже упоминалось, в крови новорожденных (иногда до 12-18 месяцев) циркулируют материнские антитела класса G. Недостаток метода – необходимость дорогостоящего оборудования и достаточно высокая стоимость расходных материалов. Определение количественного показателя присутствия ВИЧ. Концентрация РНК ВИЧ в крови, так называемая “вирусная нагрузка”, в настоящее время считается одним из основных лабораторных маркеров прогрессирования ВИЧ-инфекции. Под «вирусной нагрузкой» подразумевают количество РНК- копий вируса в 1 мл крови. Повышение вирусемии является наиболее ранним признаком начинающегося прогрессирования заболевания и неблагоприятным прогностическим симптомом. Концентрация РНК ВИЧ измеряется в количестве копий РНК ВИЧ в миллилитре крови. Иногда этот показатель измеряется в десятичных логарифмах (log10). «Вирусная нагрузка» от 500 до 10 000-30 000 копий в 1 мл крови соответствует ВИЧ-инфицированности, от 30 000 до 100 000 копий в 1мл крови соответствует ВИЧ ассоциированному комплексу, более 100 000 копий в 1 мл - СПИД. Поскольку в каждом вирусе иммунодефицита человека содержатся две копии РНК количество вирусных частиц в крови в два раза меньше чем показатель “вирусной нагрузки”. Показатель “вирусной нагрузки” используется для определения показаний к началу антиретровирусной терапии и быстрой оценки ее эффективности. «Вирусная нагрузка» более 60 000 копий РНК ВИЧ в миллилитре крови является показанием к началу антиретровирусной терапии. Значимым изменением концентрации РНК ВИЧ считается разница в показателе, по сравнению с предшествующим уровнем, не менее чем в 3 раза. При эффективной антиретровирусной терапии уже к 4-8 неделе отмечается снижение уровня РНК ВИЧ в 3-5 раз. К 12-16 неделе лечения у большинства пациентов уровень РНК ВИЧ становится неопределяемым. Острые инфекционные заболевания (не обязательно связанные с ВИЧинфекцией) и вакцинация могут временно повышать уровень вирусной нагрузки. Поэтому результаты исследования, проведенные в течение 4 недель после таких эпизодов, не могут рассматриваться как критерии к назначению терапии. В этих случаях показано повторное обследование.