Тютерева И.Н. - Московский государственный медико
advertisement
На правах рукописи УДК 618.14-006.6-02:618.14-007.17-039.38 Тютерева Инна Николаевна Оптимизация диагностики плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки 14.01.01 – акушерство и гинекология (мед.науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2013 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России) Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Дамиров Михаил Михайлович Официальные оппоненты: Минкина Галина Николаевна - доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России, профессор кафедры акушерства и гинекологии). Ковалев Михаил Иванович - доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова Минздрава России», профессор кафедры акушерства и гинекологии №1). Ведущее учреждение: ГБУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации Московской области. Защита состоится «__» ______ 201_ года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.06, созданного на базе ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им А.И.Евдокимова» имени А.И. Евдокимова Минздрава России по адресу: 127473, Москва, ул. Делегатская д. 20 стр.1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке имени А.И. Евдокимова Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а) Автореферат разослан __ ________________2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор Юлия Николаевна Пономарева 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. За последние годы отмечается значительное возрастание частоты доброкачественных и предраковых заболеваний шейки матки (ШМ). Совершенствование методов диагностики и лечения этих заболеваний является одной из важнейших задач гинекологии, конечной целью которой является предупреждение их прогрессирования в пре- и инвазивный рак шейки матки (РШМ) (Серов В.Н., Кира Е.Ф.,2008; Пономарева Ю.Н., 2011). По данным мировой статистики РШМ занимает второе место в структуре онкологических заболеваний, составляя 15% от числа всех злокачественных новообразований у женщин (Сухих Г.Т., Прилепская В.Н., 2012). В нашей стране показатель заболеваемости РШМ в 2009 году составил 18,8 случаев на 100 000 женщин (Старинский В.В., Петрова Г.В. и соавт., 2008; Аксель Е.М., 2009). За последние 20 лет прирост частоты заболеваемости у женщин в возрасте до 29 лет составляет около 150% (Бохман Я.В.,2002; Подистов Ю.И.,Лактионов К.П. и соавт.,2006; Amant F et al., 2009). По классификации ВОЗ, предраковые заболевания ШМ и карцинома in situ объединены под интраэпителиальные общим поражения» названием (ПИП). «плоскоклеточные Имеются убедительные доказательства того, что цервикальные неоплазии различной степени тяжести, внутриэпителиальный рак и инвазивный РШМ являются последовательными стадиями малигнизации эпителия ШМ (Кондриков Н.И.,2008). Отмечено, что развитие РШМ происходит постепенно, в течение нескольких лет, поэтому реальной профилактикой этого заболевания является своевременное выявление и лечение предраковых заболеваний (Бохман Я.В.,2002; Козаченко В.П., 2005). В связи с перечисленным, важной задачей клинической гинекологии является разработка новых методов ранней диагностики предраковых заболеваний и РШМ. 4 Установлено, что в основе злокачественного роста лежат стойкие изменения на уровне генома определенных популяций клеток, приводящие к патологической активации собственных протоонкогенов, контролирующих клеточную пролиферацию, дифференцировку и созревание (Ашрафян Л.А, 2009). Отличительной особенностью иммунной системы (ИС) является способность иммунокомпетентных клеток синтезировать и секретировать в общий кровоток антитела (АТ) как к чужеродным антигенам (АГ), так и к АГ собственного организма, т.е. аутоантитела (ААТ). Отмечено, что процесс опухолеобразования сопровождается выработкой повышенных количеств определенных ААТ к опухолеассоциированным АГ (Кузьменко Л.Г. и соавт.,2006; Полетаев А.Б., 2010). Однако ранее не проводились исследования по изучению содержания маркерных ААТ у больных с ПИП ШМ и РШМ. Кроме того, не установлен характер изменения их содержания, возникающий в процессе мониторинга лечения больных с ПИП ШМ. Перечисленные положения определили цель и задачи настоящего исследования. Цель исследования: повышение эффективности диагностики плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки путем выявления иммунологических нарушений при определении ряда специфических аутоантител к опухолеассоциированным антигенам. Задачи: 1. Изучить клинические особенности течения разных форм плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки. 2. Определить уровни специфических аутоантител крови к ряду опухолеассоциированных антигенов у больных с доброкачественными заболеваниями, ПИП ШМ и раком шейки матки. 3. Провести сравнительный анализ профилей иммунореактивности у больных с доброкачественными заболеваниями, ПИП ШМ и РШМ. 4. Оценить прогностическое значение изменений содержания ряда специфических ААТ к опухолеассоциированным АГ и изучить возможности 5 использования данных параметров для раннего прогнозирования злокачественной трансформации. 5. Оценить динамику изменений в содержании специфических аутоантител к ряду опухолеассоциированных антигенов у больных с ПИП в процессе проводимого лечения. Научная новизна. Впервые получены иммунологические данные по уровню содержания специфических аутоантител крови к ряду опухолеассоциированных антигенов у больных с ПИП ШМ, лейкоплакией шейки матки (ЛШМ) и РШМ. Впервые проведено изучение содержания ранних и поздних (генетических/эпигенетических) маркеров онкогенеза у больных с доброкачественными, ПИП ШМ и РШМ. Не установлено достоверных диагностических показателей при сравнении содержания ААТ у больных с CIN I и CIN II ШМ, однако отмечен ряд достоверных показателей между больными с CIN II и CIN III. Впервые диагностированы достоверные различия по уровню содержания маркерных ААТ у больных с CIN III ШМ и с РШМ. Проведен анализ динамики содержания специфических ААТ в процессе лечения больных с разными степенями поражения ПИП ШМ. Разработаны прогностические критерии течения ПИП ШМ по уровню изменения ААТ. Практическая и теоретическая значимость. Разработан и внедрен в клиническую практику метод диагностики содержания специфических ААТ крови к ряду опухолеассоциированных АГ у больных с ПИП ШМ, ЛШМ и РШМ. Впервые получены данные по состоянию иммунного статуса по содержанию специфических ААТ крови у больных с доброкачественными, ПИП ШМ и РШМ, определение которых в комплексе с клиникоинструментальными повышает точность методами (цитологическими, кольпоскопическими) диагностики разрабатывать лечебную тактику. и позволяет дифференцированно 6 Основные положения, выносимые на защиту 1. У больных с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями шейки матки содержание специфических аутоантител крови отличается от их значений у здоровых женщин. 2. У больных с CIN II шейки матки диагностируются достоверные различия по содержанию некоторым маркерных аутоантител, по сравнению со значением у больных с CIN III шейки матки. 3. Оценка состояния иммунного статуса по содержанию специфических аутоантител крови, наряду с традиционным клиникоинструментальным обследованием, позволяет оптимизировать лечебную тактику у больных с ПИП шейки матки. Личное участие Автором лично проводилась разработка анкеты обследования больных с патологией ШМ, сбор анамнестических данных и обследование наблюдаемых больных, простая и расширенная кольпоскопии, забор материала для традиционного и жидкостного цитологического исследования, а также для проведения комплексного иммунологического обследования, в том числе, включающего исследование содержания ряда специфических ААТ к опухолеассоциированным АГ. Автором проводилось динамическое наблюдение за больными с выполнением всего необходимого объема обследования. Лично автором проведена статистическая обработка полученных данных и их интерпретация с использованием современных статистических методов. Внедрение результатов исследования Результаты гинекологических проведённого отделений исследования ГБУЗ ГКБ № внедрены в практику 72 (г. Москва), ДЗМ используются в педагогическом процессе на кафедре акушерства и гинекологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава РФ. 7 Апробация материалов диссертации Материалы диссертации были представлены и доложены на ХI Всероссийском научном форуме «Мать и дитя».- Москва, 2010; на научнопрактической медицине». конференции - Москва, «Инновационные 2011; на XXV технологии Международном в лазерной Конгрессе Репродуктивной медицины с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний». - Москва, 2012. Апробация диссертационной работы состоялась на заседании кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России 24 сентября 2012 года. Публикации Основной материал исследования опубликован в 6 публикациях, из которых 2 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Структура и объем диссертации Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 155 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц, 48 рисунков. Список литературы представлен 181 источниками, из которых 100 - на русском языке, 81 - на иностранных языках. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материал и методы исследования. Материалом исследования явились данные обследования 200 больных, направленных на консультацию в «кабинет патологии ШМ» на базе КДЦ ГБУЗ ГКБ № 72 ДЗМ (г.Москва), в связи с выявлением в цитологических мазках гипер- и паракератоза, а также диагностированной CIN I - CIN III ст. поражения и сомнительными результатами кольпоскопического обследования. Всем пациенткам был проведен экспертный анализ цитологических мазков. При обследовании 27 (13,5%) женщин не диагностировали данных, указывающих на наличие CIN. Традиционные цитологические препараты оказались 8 неудовлетворительными в 23 (11,5%) случаях. Эти пациентки не вошли в состав наблюдаемых нами групп больных. Комплексное исследование было выполнено у 150 больных, у которых было заподозрено наличие доброкачественных, предраковых заболеваний ШМ. Однако после биопсии из измененных тканей ШМ, по данным гистологического исследования CIN I - III степеней поражения были диагностированы у 90 больных, а также у 20 больных морфологически верифицировали ЛШМ (простую форму). Кроме того, исследование проведено у 20 больных, госпитализированных в гинекологические отделения ГБУЗ ГКБ № 72 ДЗМ (г. Москва), в связи с подозрением на РШМ. Таким образом, материалом настоящего исследования явились данные комплексного клинико-лабораторного обследования 130 90 с больных с доброкачественными, ПИП ШМ и РШМ. Основную группу образовали больных гистологически верифицированными различными степенями поражения ПИП ШМ. В нее вошли: 33 больные (средний возраст 31,8 ± 3,56 лет) с CIN I степени поражения; 27 больных (средний возраст 34,7 ± 3,27 лет) с CIN II степени поражения, а также 30 больных (средний возраст 36,8 ± 2,58 лет) с CIN III степени поражения. Группа сравнения включала в себя 20 больных с морфологически подтвержденной ЛШМ (простая форма) (средний возраст 33,5 ± 2,91), а также 20 больных РШМ (средний возраст 42,8 ± 3,45 лет). Контрольную группу образовали 30 женщин (средний возраст 35,2 ± 4,41 лет) без гинекологической патологии (ЗЖ). Кольпоскопическое исследование проводили на аппарате «Кольпоскоп МК-200» (Украина) со стандартным увеличением 8 и 12, с применением цветных фильтров. Вначале работы визуализируемые картины описывали в соответствии с кольпоскопической классификацией, принятой в Барселоне (2002 г.), а с 2011 года – в соответствии с классификацией, принятой в г.Рио-де-Жанейро (Бразилии) в 2011 году. Кольпоскопическое исследование проводили при первичном осмотре пациентки, через 3 месяца, 9 6 месяцев и 1 год спустя после выполненного радиохирургического лечения с целью контроля эффективности терапии. Цитологическое исследование выполнено у всех 130 больных с доброкачественными, ПИП ШМ и РШМ. Проводилась оценка как традиционного мазка, окрашенного по методу Романовского (модификация Паппенгейма), так и тонкослойных мазков при выполнении методики жидкостной цитологии. Материал для традиционного мазка с эктоцервикса забирали цервикальной щеткой Cytobrush и/или шпателем Эйра, тогда как с эндоцервикса — с помощью щетки-эндобраша или специальной щеточкой («cervix bruch»). Мазки окрашивали по методу Романовского (модификация Паппенгейма) и просматривали на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО (Зав. кафедрой - проф., д.м.н. В.В. Долгов; проф., д.м.н. И.П. Шабалова). Также у всех больных брался мазок с поверхности ШМ щеткой типа Cervex-Brush для выполнения цитологического исследования методом жидкостной цитологии. Обработку материала проводили при помощи аппарата для автоматизированной жидкостной цитологической диагностики NOVAPREP® NPS- 25 (Франция). Окрашивание мазков проводили по Папаниколау, интерпретация результатов — согласно терминологической системы Бетесда. Жидкостное цитологическое исследование выполняли на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО. Цитологическое исследование проводили при первичном осмотре пациентки, через месяц, 3 месяца, 6 месяцев и 1 год после проведенного радиохирургического лечения с целью контроля эффективности терапии. Метод определения регуляторных аутоантител. Для оценки сывороточного содержания панели естественных регуляторных ААТ проведена оценка профилей 16 специфических ААТ крови у всех 130 больных с доброкачественными, ПИП ШМ и РШМ. Главными антигенными компонентами проведенного исследования являлись: 10 NOTCH3_РРА; R-Jag_ADD; JAG-I _RPR; sc-Jagged_YCF; NRC-4; E3 SUMO (SSQ); LAGE-1(2)_AGA; MAGE-A3_LEY; NY-ESO/LAGE; SSX-4_PPF; S100; Коллаген; TRAG-3_LGE; HER-2(1)_QVV; Cycl_B; р53. Синтез пептидных фрагментов отобранных белков, был выполнен компанией “Peptide 2.0 Inc” (Chantilly, США). Определение ААТ к АГ проводилось методом стандартного твердофазного иммуноферментного анализа на 96луночных полистироловых опухолеассоциированных относительно планшетах. ААТ При проводили индивидуальной анализе расчет иммунореактивности уровней всех (% пациентов от средней иммунореактивности), что позволило сравнивать между собой лиц как с конституционально высоким, так и с низким уровнем гуморальной реактивности ИС по всем показателям. В работе использовалось определение уровней специфических ААТ к сывороточным АГ в усл.ед. Определение ААТ к АГ проводили на базе специализированной лаборатории Медицинского исследовательского центра «Иммункулус» (г.Москва). Методы лечения. Для верификации диагноза всем 130 больным с доброкачественными, ПИП ШМ и РШМ был произведен забор материала для гистологического исследования с помощью радиоволнового аппарата «Сургитрон™» («Ellman International», США). Выбор объема радиохирургического лечения (эксцизия, конизация) зависел от клинического, направительного диагноза, цитологического, основанного кольпоскопического на результатах обследований. Конизация проводилась после предварительно проведенной биопсии и диагностического выскабливания цервикального канала и установленного гистологического диагноза с помощью специального конизатора. Гистологическое исследование проведено всем 130 больным с доброкачественными, ПИП шейки матки и РШМ. Гистологическое исследование выполняли после предварительной фиксации в 10% растворе нейтрального формалина по Лилли с последующей гистологической обработкой и заливкой в парафин. Депарафинированные срезы толщиной 5 11 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологическое исследование проводили в отделении патоморфологии ГБУЗ ГКБ № 72 ДЗМ (г.Москва). Статистическую обработку данных производили на персональном компьютере PENTIUM IV с использованием пакета программ «Primer Biostatistics 4.03. for Windows» и «Microsoft Excel 2000 for Windows». Вычисляли среднюю арифметическую (М) и среднюю ошибку средней арифметической (m). Различия между группами устанавливались с учетом tкритерия Стьюдента. Статистический показатель считали достоверным при p<0,05. Все цифровые материалы оформлены в виде таблиц, схем и диаграмм с помощью прикладного пакета «Microsoft Graf» в программном продукте «Microsoft Word for Windows». РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Для решения поставленных задач было проведено комплексное клиниколабораторное обследование и лечение 130 больных с доброкачественными, ПИП ШМ и РШМ. Большинство больных с CIN I ШМ были в возрасте 20-27 лет (48,5%), несколько реже эту патологию диагностировали в других возрастных группах. Большинство пациенток с CIN II и с CIN III было в возрасте 36-42 лет (соответственно в 40,7% и 40,0%наблюдений). Около 80% женщин с ПИП ШМ находилось в возрастном периоде высокой сексуальной и репродуктивной активности - от 20 до 39 лет. Аналогичные данные по возрасту больных с разными формами CIN приводят и другие авторы (Бовыкина О.И.,2005; Артамонова Н.В.,2009; Гаврикова М.В.,2010). Анализ социального статуса обследуемых больных с ПИП ШМ показал, что чаще данная патология возникает у женщин, входящих в категорию служащих (63,3%), значительно реже ее диагностировали у неработающих женщин (21,1%).Сходные данные приводят и другие ученые (Базелишина Е.Ю.,2005; Каратюк Т.И.,2011). Курение в течение 3 и более лет отмечали 67,8% больных с ПИП ШМ. Сопоставимый процент курящих женщин был отмечен и среди больных с 12 ЛШМ и РШМ (соответственно у 55,0% и 65,0% больных). В литературе имеются убедительные данные о высоком риске возникновения РШМ у курящих женщин (Берштейн Л.М., 2000). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что более чем у половины больных с ПИП и РШМ отмечался данный фактор риска возникновения этой патологии. Большинство больных с ПИП ШМ (83,3%) не предъявляли жалоб. Жалобы на бели отмечали 18,9% больных, а 4,4% пациенток беспокоили периодические кровяные контактные выделения из половых путей, являющиеся следствием сопутствующих вагинальных инфекций и/или нарушений менструальной функции. Это согласуется с данными литературы, которые также свидетельствуют о нередком бессимптомном течении ПИП ШМ (Вишневская Е.Е.,2002; Литвинова В.В.,2009; Бадалова Л.А., 2012). При анализе анамнестических данных выявлено, что все пациентки с ПИП ШМ в период детства и полового созревания переболели несколькими инфекционными заболеваниями. Общее число перенесенных заболеваний в этом возрасте составило 233, а инфекционный индекс – 2,59, что превышает контрольные показатели у ЗЖ. Аналогичные данные о высокой частоте перенесенных заболеваний в различные периоды жизни у больных с ПИП ШМ приводят и другие авторы (Сычугов Г.В.,2006;Снигур Н.В.,2009; Шамаракова М.В.,2011). Анализируя репродуктивный анамнез, установлено, что общее число беременностей у 130 обследованных больных с доброкачественными, ПИП ШМ и РШМ составило 340, среди которых 134 закончились родами, 174 артифициальным абортом, 13 – самопроизвольным выкидышем, 12 внематочной беременностью, беременностью. Различные а у 7 пациенток осложнения при - неразвивающейся беременности, родах, послеродовом периоде отмечали 54,6% женщин. Операция кесарево сечение была выполнена у каждой 10-й больной с ПИП ШМ. Искусственное прерывание беременности отмечали 75,6% больных с ПИП ШМ, причем большинство пациенток выполняли его неоднократно с частыми 13 осложнениями. Гинекологические заболевания в анамнезе отмечали 68,9% больных с ПИП ШМ. Носителями ВПЧ 16 и/или 18 типа по данным ПЦР была каждая вторая пациентка. Инфекции, передаваемые половым путем (хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз и другие) в анамнезе отмечала каждая третья пациентка. Лечебные манипуляции на ШМ выполняли 34,4% женщин. Кольпоскопическое обследование проведено всем 130 больным на первом этапе обследования. Диагностируемые кольпоскопические картины описывали в соответствии с классификацией, принятой в г.Рио-де-Жанейро (Бразилия) в 2011 году. Анализируя результаты кольпоскопического обследования, следует отметить, что неудовлетворительную кольпоскопию, при которой не визуализировался стык эпителиев определяли у 30,3% больных с CIN I, несколько чаще у больных с CIN II (37,0%) и у каждой второй больной с CIN III (53,3%). Основными кольпоскопическими признаками (КП) у больных с CIN I были: тонкий ацетобелый эпителий с неровными нечеткими краями (72,7%), нежная мозаика (27,3%), нежная пунктация (27,3%), а йоднегативные зоны определяли у 81,8% больных. У больных с CIN II диагностировали следующие КП: у 85,2% больных определяли йоднегативные зоны; плотный ацетобелый эпителий диагностировали у 70,4% пациенток, а у 25,9% тонкий ацетобелый эпителий; у 25,9% больных определяли нежную мозаику, тогда как у 33,3% - грубую мозаику. У больных с CIN III определяли следующие КП: у 90,0% пациенток диагностировали йоднегативные зоны; плотный ацетобелый эпителий у 80,0% больных, а тонкий ацетобелый эпителий - у 10,0%; грубую мозаику определяли у 70,0% больных, а нежную мозаику - у 13,3%; грубую пунктацию – у 43,3%, тогда как нежную пунктацию - у 10,0% больных. Диагностируемые КП при всех степенях ПИП ШМ встречались в различных сочетаниях. Аналогичные данные приводят и другие авторы (Гаврикова М.В.,2010). 14 В результате проведенного исследования выявлена четкая зависимость между выраженностью кольпоскопических изменений и степенью тяжести CIN. Так, у всех больных с CIN I определяли слабо выраженное поражение аномальными КП (тонкий ацетобелый эпителий с неровными нечеткими краями, нежная мозаика, нежная пунктация), в то время как у большинства больных с CIN II- III чаще диагностировали выраженное поражение (плотный ацетобелый эпителий, грубая мозаика, грубая пунктация). У большинства наблюдаемых больных с различными степенями поражения ПИП ШМ диагностировали йоднегативные зоны в местах расположения атипичного эпителия. Информативность кольпоскопического исследования в диагностике ПИП ШМ составила 78,9 ± 3,38%, причем, она значительно возрастала при возникновении выраженных структурных нарушений у больных с CIN III. Цитологическое исследование проведено у 130 обследованных больных с доброкачественными, ПИП ШМ и РШМ. Традиционный цитологический метод показал недостаточно высокую чувствительность в диагностике ПИП ШМ. Так, у 130 больных с цитологически диагностированными CIN ШМ разных степеней поражения, при морфологическом исследовании эту патологию верифицировали только у 90 (69,2%) больных. Среди этих больных CIN I диагностировали у 33 (61,1%) пациенток, CIN II – у 27 (69,8%), а CIN III – у 30 (23,1%) больных, тогда как у остальных пациенток эта патология не была определена. Позитивные заключения по данным традиционного цитологического исследования о наличии CIN составили 69,2%, тогда как негативные – 30,8% Для верификации диагноза всем больным с доброкачественными, ПИП ШМ и РШМ был произведен забор материала для гистологического исследования с помощью радиоволнового аппарата «Сургитрон™» («Ellman International», США). Во всех случаях проводился кольпоскопически ориентированный забор материала из патологически диагностированных зон. Выбор радиохирургической методики был связан с тем, что при проведении 15 биопсии получается практически неповрежденная ткань, подлежащая морфологическому исследованию, поскольку толщина зоны некроза составляет всего 0,05 мм (Легков В.А., 2000). Отмечено, что при сопоставлении результатов цитологического и гистологического методов исследования наибольшее число позитивных заключений получено у больных с CIN III (81,1%), несколько меньше у пациенток с CIN II (72,9%), в то время как у больных с CIN I оно составило всего 58,9%. Выявлена обратная связь между числом ложноотрицательных результатов и степенью тяжести CIN. Наибольшее число ложноотрицательных ответов получено при CIN I (41,1%), тогда как при CIN II оно составило 27,1%, а при CIN III – всего 18,9%. Чувствительность жидкостного цитологического исследования в диагностике ПИП ШМ была значительно выше при всех степенях поражения и, в среднем, составила 81,3%, причем, при наличии CIN II-III степени поражения (H-SIL) он совпадал у 51 (89,5%) из 57 больных с данной степенью поражением. Обобщая полученные результаты цитологического исследования у больных с ПИП ШМ, отмечено, что данный метод является высокочувствительным при CIN II-III степени поражения и недостаточно чувствительным при CIN I степени поражения. Применение жидкостного цитологического исследования значительно повышает точность диагностики ПИП ШМ. Одной из задач настоящего исследования являлось определение специфических изменений гуморального звена иммунитета у больных с ПИП ШМ. Для этих целей у всех пациенток было выполнено исследование 16 маркерных опухолеассоциированных ААТ помощи мультикомпонентных опухолеассоциированными тест-систем антигенами. с при сорбированными Оценка определения опухолеассоциированных антигенов проводилась у 90 больных с ПИП ШМ до лечения и спустя 3-6 месяцев после лечения. По данным литературы, к ранним маркерам опухолевой прогрессии 16 относят ряд опухолеассоциированных АГ, в том числе: NOTCH3, R-Jag, JAGI, sc-Jagged, NRC-4 (6_WEF), E3 SUMO (7_SSQ), LAGE-1, MAGE-A3, NYESO, SSX-4 , TRAG-3, HER-2(1) (Sinani D.,Jones C.,2011).В проведенном нами исследовании были отобраны наиболее часто встречающиеся 5 раковотестикулярных белков. К ним относятся: LAGE-1, NY-ESO, TRAG-3, MAGEA3, SSX-4_PPF. Поздние онкомаркеры (белки противовопухолевой защиты) составили 4 опухолеассоцированных АГ: Cycl_B, S100, р 53,коллаген ( Hamai A.,Pignon P et al.,2012). В литературе встречается большое количество статей, посвященных протеомике и эпигенетике РШМ. Однако отсутствуют работы, посвященные ПИП ШМ. Вместе с тем, исходя из концепции опухолевой прогрессии, морфологически было доказано, что CIN различных степеней тяжести, внутриэпителиальный рак и инвазивный рак являются последовательными стадиями малигнизации плоского эпителия ШМ (Автандилов Г.Г.,2007). Отсутствие данных об изменениях ШМ при возникновении цервикальных неоплазий приводит к потере ценной информации, характеризующей промежуточные диспластичные стадии онкогенеза. В проведенной нами работе был использован подход, основанный на описании ранних и поздних опухолеассоциированных белков. Отмечено, что у пациенток с СIN I, по сравнению со значениями у ЗЖ, достоверным являлся один онкомаркер -E3 SUMO (-10,96±3,56усл.ед)(Рис.1). 1_NOTCH3_PPA 20 18_HER-… 3_R- JAG_ADD 10 16_TRAG-3_LGE 4_JAG-I_RPR 0 15_SSX-4_PPF -10 -20 13_NY-… Норма CIN I 5_sc-… 6_WEF 12_MAGE-A3 7_SSQ 10_LAGE-1(2) Рис. 1. Значение уровней специфических аутоантител крови у больных с изучаемой группы больных с CIN I и у здоровых женщин. 17 При сравнении данных у больных с CIN I и ЛШМ обращала на себя внимание тенденция к повышению показателей JAG-I_RPR, SSX-4_PPF, а также тенденция к снижению показателя NOTCH3_PPA. Полученные данные свидетельствует о том, что при возникновении цервикальной патологии происходит появление первых признаков локальной экспрессии раковотестикулярных АГ, что отражает последовательный процесс дальнейшей раковой трансформации измененной ткани, с локальной экспрессией раковотестикулярных АГ (Ye F.,Zhou C,et al.,2008). Сравнительный анализ изучаемых показателей у больных с CIN I и CIN II шейки матки, не показал достоверной разницы по всем 16 специфическим ААТ. Однако отмечена тенденция к повышению параметра SSQ (-3,75 ± 6,22 усл.ед.). У пациенток с CIN II данный показатель был повышен у 27,78% пациенток, тогда как только у 7,14% больных с CIN I. Данное изменение свидетельствует о том, что имеется тенденция к повышению локальной шоперонной активности поврежденных клеток «процессу внутриклеточной регенерации». При сравнении показателей у больных с CIN II и CIN III отмечены два достоверных показателя: WEF (-0,35 ± 3,46) и MAGE-A3 (0,23 ± 3,82). Причем, отмечается снижение показателей WEF от 5.56% (1) с CIN II до 29,41% (8) с CIN III, а также MAGE-A3 1 (5,56%) до 5 (17,65%) соответственно. Отмечена тенденция к повышению показателя HER2(1)_QVV (-4,33 ± 3,46 усл.ед.). Так, данный показатель был повышен у 5,56% больных с CIN II и у 17,65% больных с СIN III. Полученные данные свидетельствуют о включении механизмов декомпенсации на уровне ядерных транскрипционных факторов и раково-тестикулярных АГ, направленных на раковую трансформацию клеток. Таким образом, следует отметить, что у всех пациенток с CIN II и СIN III в динамике прогрессирования заболевания происходят существенные изменения в спектрах сывороточных ААТ, свидетельствующие о начале переключения ранних маркеров онкогенеза на маркеры антионкогенной 18 защиты, специфичные для рака. Отмечено, что у пациенток с ПИП ШМ, в процессе прогрессирования заболевания (от CIN I до CIN III) отмечается снижение специфических ААТ к WEF, SSQ и MAGE-A3. Это может свидетельствовать о постепенном изменении данных показателей в сторону снижения активационных транскрипционных процессов, снижении ответа ИС на раково-тестикулярные АГ, протекающие на фоне прогрессирующей выраженной декомпенсации ИС организма. При определении уровней специфических ААТ у 20 больных с ЛШМ обращало на себя внимание достоверное изменение уровней ряда маркеров, по сравнению с показателями у ЗЖ. Так, у 64% пациенток с JAG-I_RPR отмечалось повышение АТ выше нормы, тогда как у ЗЖ этот показатель был повышен у 87% пациенток. Установлено, что у 35,5% пациенток с ЛШМ показатель WEF был значительно повышен, тогда как у ЗЖ этот показатель был повышенным только у 6,25% женщин. Сравнительный анализ этих ААТ крови свидетельствует о локальном повышении активности транскрипционных факторов онкогенеза. Отмечена тенденция к повышению ААТ против раково-тестикулярных белков MAGE-A3 (5,13 ± 6,19 усл.ед.), а также тенденция к повышению ААТ против белка NOTCH3_PPA (3,65 ± 2,47 усл.ед). Следует заметить, что повышенный уровень ААТ к MAGE-A3 наблюдался у 32,26% больных ЛШМ и только у 12% ЗЖ Повышение уровня NOTCH3_PPA наблюдалось у 3 (16,13%) больных с ЛШМ, в то время как ни у одной ЗЖ данный показатель не повышался. Данные изменения свидетельствует о включении начальных процессов CIN при возникновении ЛШМ. Сравнительный анализ данных у больных с РШМ и с CIN III показал достоверные различия по уровню маркерных ААТ к MAGE-A3 (-4,22 ± 2,5 усл.ед) (Рис. 2). Причем, у больных с РШМ только у 1 (4,76%) пациентки выявили снижение уровня данного маркера, в то время как ее диагностировали у 5 (17,65%) больных с CIN III. Напротив, определяли увеличение числа лиц РШМ с повышенным уровнем ААТ к MAGE-A3, по 19 сравнению со значениями у больных с CIN III (14,29% (2) против 5,88% (1) соответственно). 1_NOTCH3_PPA 33_Coll_PST-12 20 3_R- JAG_ADD 10 27_S100_KHK 4_JAG-I_RPR 0 24_cycl B_YSC-1 5_sc- Jagged_YCF -10 23_P53_LMF 6_WEF -20 18_HER-… CIN III 7_SSQ 16_TRAG-3_LGE 15_SSX-4_PPF 10_LAGE-1(2) 12_MAGE-A3 13_NY-… Рис. 2. Значение уровней специфических аутоантител крови у больных с CIN III и РШМ. Сравнивая данные у больных РШМ со значениями у ЗЖ, отмечалось достоверное повышение ААТ к белку p53 (14,24 ± 2,92 усл.ед), причем, это повышение было обусловлено снижением количества пациенток с нормальными границами ААТ к p53 (61,9% (12 пациенток) против 37,5% (11 женщин) у ЗЖ) (Рис. 3). Следует отметить наличие достоверных отличий между группами РШМ и нормы по ААТ к Cyclin B1 (-9,16±1.86 усл.ед). Так, при РШМ наблюдалось отсутствие повышенных уровней данного маркера. 1_NOTCH3_PPA 33_Coll_PST-12 20 3_R- JAG_ADD 27_S100_KHK 4_JAG-I_RPR 10 24_cycl B_YSC-1 23_P53_LMF 0 -10 18_HER-2(1)_QVV Рак 5_sc- Jagged_YCF 6_WEF 7_SSQ 16_TRAG-3_LGE 15_SSX-4_PPF 10_LAGE-1(2) 12_MAGE-A3 13_NY-… Рис. 3. Значение уровней специфических аутоантител крови у здоровых женщин и больных с РШМ. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что при последовательном прогрессировании заболевания от ПИП до РШМ, наблюдается достоверное повышение противоопухолевой защиты организма 20 за счет тканевой экспрессии белка p53 и вторичного появления ААТ к Cyclin B1 в сыворотке крови, а также снижение системного иммунологического контроля механизмов, активирующих клеточную пролиферацию и нормальный клеточный цикл. Это согласуется с данными других авторов (Kisseljov F.L.,Sakharova,et al.,2008). При определении уровней специфических ААТ крови через 3 месяца после проведенного оперативного лечения, достоверное повышение наблюдалось для ААТ к NY-ESO/LAGE, cyclin B1, S100, collagen; а также отмечали достоверное снижение ААТ к JAG-I, sc-Jagged, SSX-4, p53. При анализе полученных данных в динамике проводимого оперативного лечения было выявлено снижение маркерных ААТ, отражающих ранние этапы онкогенеза. Так, уровень ААТ к JAG-I до лечения был повышен у 85,71% больных, тогда как после лечения только у 45% пациенток. Аналогичные изменения наблюдались для ААТ к SC-Jagged: до лечения повышенные значения определяли у 66,7% пациенток, а после лечения – только у 35% женщин. Полученные данные свидетельствуют о том, что оперативное удаление диспластически измененных тканей снижению процессов аномальной приводит к достоверному клеточной дифференцировки и диспластической трансформации эпителиальных клеток пораженных тканей. При анализе уровней ААТ к раково-тестикулярным АГ в динамике проводимого лечения были выявлены разнонаправленные процессы иммунного ответа. Так, отмечали повышение белков NY-ESO , тогда как для белка SSX-4 было выявлено достоверное снижение специфичных ААТ. При анализе уровней ААТ к маркерам позднего онкогенеза были выявлены cледующие разнонаправленные изменения. Так, для ААТ к белку p53 было обнаружено достоверное снижение в динамике проводимой терапии: до лечения повышенные уровни наблюдались у 47,62% больных, а после лечения – только у 10%. Данный факт можно интерпретировать как снижение процессов активации апоптоза за счет оперативного удаления диспластических клеточных элементов. 21 Особую роль в динамике ААТ имеют маркеры соединительной ткани. Так, через 3 месяца после оперативного лечения у пациенток с CIN ШМ наблюдалось повышение ААТ к коллагену до 8.7 ± 4.18 у.е. Повышенный уровень указанных ААТ до лечения встречался у 19,05% больных и у 45% пациенток – после лечения. Данный факт можно интерпретировать как непосредственное участие иммунной системы в процессах локальной продукции коллагена и послеоперационной репарации соединительной ткани. Через 6 месяцев после лечения у 90 больных с ПИП ШМ по данным комплексного обследования рецидивы заболевания были выявлены у 2 больных – одна больная с CIN II и одна больная CIN III. Анализ динамики опухолеассоциированных ААТ показал, что достоверные различия между группами, у которых диагностировали рецидив заболевания и без рецидива заболевания, наблюдались только по особенностям иммунофизиологии соединительной ткани. В группе, где был диагностирован рецидив заболевания, было выявлено достоверное повышение ААТ к коллагену через 6 месяцев после лечения, уровень которого достигал 30.54 ± 1.68 у.е. (p < 0.025, Критерий КолмогороваСмирнова, U-тест Манна-Уитни). Динамика опухолеассоциированных ААТ в группе больных с рецидивом заболевания по всем изучаемым показателям отсутствовала, что может свидетельствовать о наличии ряда иммунопатологических процессов, таких как резко сниженная продукция иммуноглобулинов, вторичный иммунодефицит по гуморальному типу, опухолевая иммуносупрессия. С другой стороны, в группе больных без рецидивирования заболевания наблюдалась отчетливая динамика по различным ААТ, что свидетельствовало о работе гуморального звена иммунной системы у этих пациентов. Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о возникающих изменениях маркерных ААТ к 16 опухолеассоциированным АГ у больных с ПИП ШМ, ЛШМ, РШМ и 22 возможности использования данных показателей в дополнительной диагностике CIN, а также при оценке эффективности проведенной терапии. ВЫВОДЫ 1. Большинство больных с CIN (75 – 83,3%) не предъявляют жалоб. Жалобы на бели (18,9%) и периодические кровяные выделения из половых путей (4,4%) были связаны с сопутствующими вагинальными инфекциями и/или нарушением менструальной функции. 2. Информативность кольпоскопического исследования в диагностике плоскоклеточных интраэпителиальных поражений ШМ составила 78,9 ± 3,38%, причем, она значительно возрастала при возникновении выраженных структурных нарушений у больных с CIN III. 3. При сопоставлении результатов традиционного цитологического и гистологического методов исследований наибольшее число позитивных заключений получено у больных с CIN III ШМ (81,1%), тогда как у больных с CIN I – оно составило всего 58,9%. Применение жидкостной цитологии значительно повышает точность диагностики, причем, при наличии CIN II-III степенях поражения она составила 89,5%. 4. Отмечено изменение уровня содержания специфических ААТ крови к ряду опухолеассоциированных АГ у больных с ПИП ШМ, ЛШМ, РШМ, по сравнению с их значениями у ЗЖ. 5. Сравнительный анализ содержания специфических ААТ крови у больных с CIN I и CIN II ШМ, не показал достоверной разницы по всем 16 специфическим ААТ. Диагностирован ряд достоверных показателей по содержанию специфических ААТ крови между больными с CIN II и CIN III (WEF и MAGE-A3). 6. Отмечены достоверно значимые изменения содержания маркерных ААТ крови у больных с РШМ и больными с CIN III ШМ (MAGE-A3). 7. Оценка динамики содержания специфических ААТ в процессе лечения больных с CIN позволяет оптимизировать лечебную тактику. 23 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для более точной диагностики ПИП ШМ целесообразно комплексно применять кольпоскопическое Традиционному РАР - и исследованию цитологическое следует исследования. предпочитать метод жидкостной цитологии. 2. Проведение кольпоскопического исследования позволяет определить характер, степень выраженности и границы патологического процесса на ШМ, определить зону с наибольшими изменениями и провести прицельный забор материала из патологически диагностированных зон для гистологического исследования. 3. Для улучшения диагностики ПИП ШМ в состав комплексного дооперационного обследования целесообразно включать определение профилей 16 специфических ААТ крови. 4. После проведения кольпоскопически ориентированного забора материала радиохирургическим методом, в послеоперационном периоде у больных с ПИП ШМ целесообразно, наряду с традиционными методами оценки течения заболевания, определять динамику содержания специфических ААТ. Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. Дамиров М.М., Шабалова И.П., Бушкова А.С., Тютерева И.Н. Особенности микроциркуляции, цитологической диагностики и течения послеоперационного периода у больных лейкоплакией шейки матки.// Материалы ХI Всероссийского научного форума «Мать и дитя».- М., 2010.С. 355-356. 2. Дамиров М.М., Заборский В.М., Бушкова А.С., Тютерева И.Н., Слюсарь Н.Н. Особенности состояния микроциркуляции у больных с лейкоплакией шейки матки. // «Лазерная медицина».- 2011.- том 15, вып.2.- С.79. 3. Дамиров М.М., Тютерева И.Н., Ганцев Ш.Х., Полетаева А.А., Полетаев А.Б., Юсупов А.С. Аутоиммунитет и рак. Новые подходы к ранней 24 диагностике злокачественного роста.// Креативная хирургия и онкология.2011.- №3.- С.89-93. 4. Ганцев Ш.Х., Дамиров М.М., Тютерева И.Н., Скурыдин С.В., Полетаева А.А., Юсупов А.С., Полетаев А.Б. Аутоиммунитет и рак. Динамический анализ изменений в составах аутоантител как инструмент мониторинга за эффективностью лечения предраковых состояний на модели дисплазии шейки матки.// Креативная хирургия и онкология.-2011.-[Электронный ресурс]. URL: http:// eoncosurg.com/?p=305 (дата обращения 18.10.2011). 5. Тютерева И.Н., Дамиров М.М, Полетаев А.Б., Полетова Т.Н., Созаева Л.Г. Особенности изменения уровня сывороточных аутоантител крови у пациенток с интраэпителиальными поражениями шейки матки в динамике проводимого лечения. // Материалы XXV Международного Конгресса Репрод. медицины с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний»-2012-С143-144 6. Тютерева И.Н. Особенности состава аутоантител крови у больных интраэпителиальными поражениями шейки матки. //Материалы с III Конференции молодых ученых, посвященной 80-летию со дня рождения В.В.Гаврюшова -17.04.2012 - С 122-125.
