«КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ЦИТОКИНОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ У БЕРЕМЕННЫХ С ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ»

На правах рукописи
ГРИШУК АЛЕКСАНДР ЮЛЬЕВИЧ
«КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ЦИТОКИНОВ И
ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ У
БЕРЕМЕННЫХ С ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ»
14.00.01. – акушерство и гинекология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2007
1
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Российский Государственный Медицинский
Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию»
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор
Макаров Олег Васильевич
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор
Ганковская Людмила Викторовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Минкина Галина Николаевна
Московский государственный медико-стоматологический университет
доктор медицинских наук,
Агаджанова Анна Арамовна
НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН
Ведущая организация: Московский областной научно-исследовательский
институт акушерства и гинекологии (МОНИИАГ)
Защита диссертации состоится «13» ноября 2007 года в 14.00 часов на
заседании диссертационного совета К 208.072.02 в ГОУ ВПО РГМУ
Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ
Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.
Автореферат разослан «28» сентября 2007 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
Кандидат медицинских наук
Л.В. Сапелкина
2
Актуальность исследования.
В настоящее время урогенитальная инфекция (УГИ) представляет
собой серьезную проблему современной медицины. Это обусловлено
неуклонным ростом частоты УГИ, ее определяющим влиянием на
репродуктивное
здоровье
человека,
ведущей
ролью
в
развитии
внутриутробной инфекции, приводящей к перинатальной и младенческой
заболеваемости и смертности (Анохин В.А., Хаертынов Х.С., Хасанова Г.Р.
1999, Сидельникова В.М. 2001, Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С.,
Кудряшова А.В. 2005).
Высокой
частоте
развития
УГИ
способствует:
широкое
распространение микроорганизмов в человеческой популяции в виде
латентной
персистирующей
инфекции,
значительная
генетическая
вариабельность патогенов, приводящая к формированию вирулентных и
резистентных штаммов, физиологическая иммуносупрессия беременных,
разнообразные механизмы уклонения вирусов от иммунологического
надзора (Бубнова Н.И., Младковская Т.Б. 2000, Н.Ю., Анциферова Ю.С.,
Кудряшова А.В. 2005).
Одним из наиболее частых возбудителей УГИ являются вирусы: вирус
герпеса простого 2 типа (ВПГ-2), цитомегаловирус (ЦМВ), энтеровирусы и
другие (Бикбулатов Р.М., Фарбер 1982, Борисенко К.К. 1997, Шабалдин А.В.,
Балянова Л.А., Казакова Л.М. 2000.)
Иммунная защита против вирусов осуществляется в результате
координированной работы адаптивной и естественной систем иммунитета.
(Ярилин А.А. 1999, Abbas A.K., Lichtman A.H., Pober J.S. 1994).
Одним из важных обобщений иммунологии последних лет стало
раскрытие
механизмов
иммунитета,
функционирования
представленной
клеточными
системы
(клетки
естественного
макрофагально-
моноцитарной системы, дендритные клетки, естественные киллеры и др.) и
гуморальными
(цитокины,
противомикробные
пептиды,
комплемент,
кислородные радикалы, ферменты и др.) компонентами (Ковальчук Л.В.,
3
Хорева М.В, Варивода А.С. 2005, Назаров П.Г. 2005, Yang D., Biragyn A,
Kwak LW 2002, Verma S., King A., Loke Y. W. 1997). В настоящее время
активно изучается роль системы естественного иммунитета в развитии ответа
на патогены при вирусных инфекциях урогенитального тракта.
Рецепторы естественного иммунитета (Toll-подобные рецепторы)
представляют
собой
семейство
сигнальных
молекул,
распознающих
консервативные молекулярные образы различных патогенов, включая
вирусы, бактерии, грибы. Показана экспрессия Toll-like рецепторов в
эпителии
эндометрия
и
эпителиальных
клетках
нижних
отделов
репродуктивной системы (Abrahams V. M. and Mor G. 2005). При
урогенитальной инфекции вирусного генеза беременных особое внимание
уделяется TLR-9.
Особый интерес представляет изучение системы цитокинов, как
регуляторов воспалительных реакций, медиаторов естественного иммунитета
и важных молекул противовирусной защиты. Несмотря на обширные
исследования
в этой области, полученные данные противоречивы
(Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С. 2005, . Сухих Г.Т., Ванько Л.В. 2003,
Тетруашвили Н.К. 2000).
Комплексное исследование цитокинов в сыворотке крови, в слизи
цервикального канала, в околоплодных водах, в культуре мононуклеарных
клеток представляется актуальным, так как может иметь диагностическую и
прогностическую
значимость
при
подозрении
на
внутриутробное
инфицирование плода.
Околоплодные воды представляют собой биологический барьер между
плодом и экстраэмбриональными структурами, являясь местом проявления
локальных иммунных реакций (Бубнова Н.И., Младковская Т.Б. 2000).
Проникновение патогенных микроорганизмов в околоплодную среду
вызывает ряд биохимических, гормональных и иммунологических изменений
местного характера. В связи с этим исследование уровня цитокинов и
4
выработки кислородных радикалов
в околоплодных водах несомненно
является актуальным у беременных группы риска по развитию ВУИ.
Цель исследования – оценка диагностической и прогностической
значимости показателей естественного иммунитета у беременных с
урогенитальной инфекцией вирусного генеза
Конкретные задачи исследования включали:
1) Анализ течения беременности и родов у беременных с урогенитальной
инфекцией вирусной этиологии.
2) Сравнительный анализ уровней цитокинов (ИЛ-12, ИФН-γ, ФНО-α) в
периферической
крови,
в
культурах
мононуклеарных
клеток,
в
околоплодных водах у беременных с вирусной инфекцией.
3) Оценка
уровня
экспрессии
Toll-подобного
рецептора
(TLR-9),
ответственного за связывание с вирусной ДНК, МНК периферической
крови и слизистой цервикального канала
здоровых беременных и
беременных с вирусной инфекцией.
4) Определение выработки активных форм кислорода нейтрофилами
периферической крови и околоплодных вод у беременных с вирусной
инфекцией.
5) Выявление возможных маркеров реализации ВУИ у беременных с
вирусной инфекцией.
Научная новизна
Исследована роль факторов естественного иммунитета, включающих
противовирусные цитокины, активные формы кислорода, уровень экспрессии
рецептора TLR-9, распознающего вирусную ДНК, у беременных с
урогенитальной инфекцией вирусной этиологии.
Впервые получены данные об увеличении экспрессии рецептора TLR-9
на клетках слизистой цервикального канала и мононуклерных клетках
периферической крови беременных с вирусной инфекцией
5
Проведен комплексный анализ уровня цитокинов, играющих важную
роль в противовирусной защите (ИЛ-12, ФНО, ИФН) в сыворотке крови, в
культурах
мононуклеарных
клеток, в околоплодных водах
(ОВ) у
беременных с вирусной инфекцией.
Исследована роль различных цитокинов и активных форм кислорода в
околоплодных водах у беременных с вирусной инфекцией, как возможных
маркеров внутриутробного инфицирования плода.
Впервые
сопоставлены
клинические
проявления
ВУИ
у
новорожденных с данными уровня цитокинов, продукции кислородных
радикалов в сыворотке крови и в ОВ у беременных с УГИ вирусного генеза.
Практическая значимость работы
Данные о снижении выработки кислородных радикалов нейтрофилами
крови и околоплодных вод, о дисбалансе в системе цитокинов сыворотки
крови, околоплодных водах и в культуре мононуклеарных клеток, а именно
повышение концентрации ИЛ-12, ФНО и полное отсутствие ИФН, у
беременных с урогенитальной инфекцией вирусной этиологии могут быть
использованы для прогноза течения и тактики ведения беременности, родов и
определения показаний к проведению иммунокоррекции.
Положения, выносимые на защиту
1. У беременных с УГИ вирусной этиологии наблюдается изменения в
системе цитокинов, проявляющиеся в отсутствии ИФН в сыворотке крови и
снижении его концентрации в околоплодных водах.
При этом у беременных с вирусной инфекцией наблюдается
увеличение концентрации ИЛ-12 ,ФНО в сыворотке крови и в культурах
мононуклеарных клеток по сравнению с группой здоровых беременных.
2. Увеличение выработки провоспалительных цитокинов коррелирует
с повышенной экспрессией Toll-подобного рецептора (TLR-9) клетками
слизистой цервикального канала и мононуклеарами периферической крови.
6
3. У беременных с УГИ вирусного генеза наблюдается выраженный
дефицит выработки кислородных радикалов нейтрофилами периферической
крови и околоплодных вод.
4. У здоровых и больных новорожденных, рожденных от матерей с
УГИ вирусной этиологии отмечено увеличение концентрации ИЛ-12 в 3-4
раза по сравнению со здоровыми детьми, рожденными от здоровых матерей.
ИФН не определялся в 100% случаев в пуповинной крови, что является
показанием к назначению терапии препаратами интерферонового ряда.
Апробация материалов диссертации.
Работа апробирована на совместном заседании кафедры акушерства и
гинекологии лечебного факультета ГОУ ВПО РГМУ и сотрудников
гинекологических отделений ГКБ №55 г. Москвы. Основные положения
диссертации отражены в 4 публикациях. Результаты диссертационного
исследования включены в учебную программу и используются в практике
педагогического процесса на кафедре акушерства и гинекологии лечебного
факультета РГМУ.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4-х
глав
собственных
наблюдений,
заключения,
выводов,
практических
рекомендаций, указателя литературы, содержащего 64 отечественных и 50
зарубежных источников. Работа выполнена на 105 страницах машинописного
текста, иллюстрирована таблицами и диаграммами.
7
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Клиническая характеристика пациентов: Проведено клиническое и
лабораторное обследование 127 беременных и 16 небеременных (3 группа).
Первую группу составили беременные, являющиеся носителями
вирусной инфекции (ВПГ и ЦМВИ) (83 женщины), входящие в группу риска
по
внутриутробному инфицированию плода
в третьем триместре
беременности, вторую группу или контрольную составили 44 женщины с
нормально протекающей беременностью,
Методы исследования: В исследуемых группах изучали: данные анамнеза,
течение настоящей беременности, особенности родового акта, оценивали
состояние новорожденных. Всем пациенткам проводили комплексное
клинико–лабораторное обследование.
Забор околоплодных вод во время беременности проводили с помощью
трансабдоминального амниоцентеза под контролем ультразвукового датчика,
предварительно получив информированное согласие пациентки. Забор
околоплодных вод во время родов осуществляли при нарушении целостности
плодного
пузыря
(преждевременном
излитии
околоплодных
вод,
амниотомии, амниоцентезе во время кесарева сечения) с помощью
внутриматочного катетера.
Определение ДНК УГИ методом ПЦР проводили в условиях
лаборатории клинической генетики научно – производственной фирмы
«ЛИТЕХ» НИИ физико – химической медицины МЗ РФ. Биологическим
материалом для данного исследования являлись околоплодные воды. ДНК
УГИ определяли с помощью диагностической тест – системы «ПОЛИМИК Мк», ТУ-9398-435-17253567-02.
Выделение мононуклеарных клеток и нейтрофилов из периферической
крови проводили путем разбавления гепаринизированнуой венозной крови ром Хенкса, дальнейшим наслоением на двухступенчатый градиент раствора
фиколл-урографина и дальнейшим центрифугированием.
8
Иммунологические методы исследования включали определение уровня
цитокинов: ИЛ-12, ИЛ-1, ИФН-γ, и ФНО-. Исследование проводили на
кафедре иммунологии РГМУ. Определение концентрации цитокинов
проводили методом ИФА с помощью диагностических тест – систем фирмы
«Cytimmune».
Продукцию активных форм кислорода (АФК) измеряли методом
люминол–зависимой
хемилюминесценции
(ЛХЛ).
Регистрацию
ЛХЛ
проводили на хемилюминометре ХЛМ-3 («Бикап», Россия). В качестве
исследуемых клеток использовали нейтрофилы периферической крови и
околоплодных вод. Образец содержал 2х105 нейтрофилов в 2,8 мл
бесцветного раствора Хенкса, 0.1 мл люминола (конечная концентрация в
кювете). В течение 3 мин регистрировали спонтанную хемилюминисценцию.
Затем в кювету добавляли стимулятор – 0,1 мл опсонизированного зимозана
(концентрация 1,43 мг/мл) и регистрировали индуцированную ХЛ.
Оценку экспрессии Toll-подобных (ТLR-9) рецепторов проводили в три
этапа: на первом этапе проводили выделение РНК из мононуклеарных клеток
периферической крови, далее с помощью реакции обратной транскрипции
синтезировали копии ДНК на матрице мРНК. На последнем этапе проводили
полимеразную цепную реакция на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология,
РФ) с помощью которой определяли кол-во копий кДНК.
Результаты исследования и их обсуждение.
Средний возраст в исследуемых группах составил 27,1  5,47 лет, с
индивидуальными колебаниями от 17 до 42 лет, что свидетельствует о
превалировании среди них женщин активного репродуктивного периода.
Большая часть пациенток 1-ой группы вступила в беременность с
отягощенным инфекционным и соматическим анамнезом. При изучении
данных инфекционного анамнеза было выявлено, что 95,7% беременных 1ой группы ранее перенесли детские инфекции, 93,6% - ОРВИ. Среди
пациенток 2-ой группы их количество было меньшим (45,5% и 20,5%
соответственно).
9
Экстрагенитальная патология была выявлена у 2,3% пациенток второй
группы (хр. пиелонефрит), в то время как данная патология была у 61,7%
пациенток первой группы. Так же в первой группе встречались хр. тонзиллит
и гастродуоаденит в 66% и 25,5% случаев соответственно.
Подавляющее
количество
женщин
1-ой
группы
вступило
в
беременность с наличием отягощенного гинекологического анамнеза. У
85,5% пациенток 1-ой группы в анамнезе имели место самопроизвольные
выкидыши и в 53% медицинские аборты. Во второй группе частота
встречаемости прерывания беременности была 15,9% и 4,5% соответсвенно.
В структуре гинекологической патологии обеих групп превалировали
заболевания воспалительного генеза. Наиболее частыми заболеваниями в
структуре
гинекологической патологии являлись хр. сальпингоофорит и
кольпит (соответственно 43% и 31,5% в 1 группе против 11,5% и 4,5% во
второй).
В структуре инфекции у пациенток 1-ой группы во время беременности
выявлялись вирус простого герпеса в 66,2%, цитомегаловирус в 19,3% и
смешанная вирусная инфекция в 14,5%.
Нами проанализировано течение беременности и родов у пациенток 1ой и 2-ой групп.
Токсикоз 1-ой половины беременности во 2-ой группе отмечался у
11,4% (5 бер.) беременных и не потребовал госпитализации, в 1-ой группе
данное
осложнение
отмечалось
у
38,8%
(32
бер.)
беременных,
госпитализация потребовалась у 6 беременных.
Одним из наиболее частых осложнений беременности у пациенток с
вирусной инфекций урогенитального тракта была угроза прерывания
беременности. В контрольной группе однократно в течение беременности
угроза прерывания наблюдалась у 34% (15 бер.) пациенток, тогда как у
пациенток основной группы угроза носила рецидивирующий характер, и
наблюдалась в 68,1% (57 бер.).
10
Диагноз плацентарной недостаточности был установлен у 42,6% (35
бер.) пациенток с вирусной инфекцией, что достоверно превышает частоту в
контрольной группе - 2,3% (1 бер.) и увеличение частоты встречаемости
инфекции мочевыводящих путей (40,4% (33 бер.) в 1-ой группе против 2,3%
(1 бер.)
в контрольной, что непосредственно является факторами,
способствующими реализации внутриутробного инфицирования.
Частота гестоза в обеих группах была сопоставима - 40,4% (33 бер.) в
1-ой группе и 40,9% (18 бер.) во второй.
Перечисленные осложнения беременности, несомненно, оказывали
влияние на состояние плода. Так частота синдрома задержки роста плода в 1ой группе составила 31,9% (26 бер.), в то время как во второй группе - всего
4,6% (2 бер.). Хроническая внутриутробная гипоксия плода была у 21,3% (18
бер.) 1-ой группы, во второй же данное осложнения не было выявлено.
Обращает на себя внимание тот факт, что у беременных с вирусной
инфекцией частота своевременных родов достоверно ниже по сравнению с
контрольной группой и составила 47%. (39 бер.) Частота преждевременных
родов (на 34-37 недели беременности) достоверно выше у женщин с
вирусной инфекцией по сравнению со здоровыми беременными. Это может
быть обусловлено тем, что при наличии урогенитальной инфекции, в том
числе и вирусного генеза, происходит стимуляция системы простагландинов,
которые в свою очередь, повышают сократительную активность миометрия.
Наиболее частым осложнением было преждевременное излитие вод у
55% (46 бер.) беременных основной группы, в контрольной группе данное
осложнение наблюдалось у 29,5% (13 бер.) случаев. Обращает на себя
внимание высокая частота острой и хронической гипоксии плода у
беременных основной группы по сравнению с контрольной.
Послеродовой период у матерей контрольной и основной группы
протекал неодинаково. В контрольной группе осложнений послеродового
периода не наблюдалось. В группе беременных с вирусной инфекцией у
11
91,5% (75 бер.) матерей послеродовой период протекал без осложнений,
тогда как у 8,5% (7 бер.) имела место субинволюция матки.
Отмечена более высокая частота заболеваемости среди новорожденных
основной группы по сравнению с контрольной - в 98% случаев
новорожденные были здоровы. Дети, рожденные от матерей с вирусной
инфекцией в 21% были здоровы, остальные 79% имели заболевания. В
структуре
заболеваний
новорожденных
данной
группы
преобладала
гипотрофия плода 21%, пневмония – 17 конъюнктивит – 13%, РДС – 13%,
аспирационный синдром – 11%, менингит – 4%. ВУИ развивалась у 29% (24
новор.) новорожденных.
Таким образом, влияние вирусной инфекции на течение беременности
выражается
в
характерными
развитии
из
ряда
которых
акушерских
являются:
осложнений,
гестоз,
угроза
наиболее
прерывания
беременности, плацентарная недостаточность. Кроме того, показательными
осложнениями со стороны плода при ВУИ являются: признаки хронической
гипоксии плода, СЗРП, высокий процент заболеваний новорожденных.
Диагностически
ценным
методом
выявления
ВУИ
является
комплексная оценка цитокинов и функциональной активности фагоцитов,
включающее в себя определение ИЛ-12, ИЛ-1, ИФН-γ, и ФНО- в
сыворотки крови, околоплодных водах и в культурах мононуклеарных
клеток, определение выработки активных форм кислорода нейтрофилами
периферической крови и околоплодных вод, а также оценка экспрессии Tollподобных рецепторов.
В течение всей беременности система цитокинов играет важную роль в
регуляции воспалительных реакций, межклеточных взаимодействий в
эндометрии, а также в процессе инвазии трофобласта. Однако при различных
воспалительных заболеваниях эта система функционирует еще и как
защитный агент.
Во время беременности отмечено достоверное увеличение ИЛ-12 по
сравнению со здоровыми небеременными донорами.
Наши данные
12
подтверждают тот факт, что продукция ИЛ-12 значительно возрастает у
беременных с вирусной инфекцией, причем результаты статистически
достоверно отличаются
как от здоровых доноров, так и от здоровых
беременных.
В норме концентрация ИЛ-12 достаточно невелика. Концентрация ИЛ12 у здоровых доноров составляла 30,1±6,2 пкг/мл и статистически
достоверно отличалась от концентрации ИЛ-12 у здоровых беременных
(94,2±22,4 нкг/мл р<0.05).
ИЛ-12 у здоровых доноров определялся в 25% (4 дон.) случаев, тогда
как у здоровых беременных – в 100% (44 бер.) случаев.
Во время беременности в связи с активацией многих механизмов
иммунной, в том числе и противовирусной защиты, наблюдается возрастание
концентрации ИЛ-12. Наши результаты подтверждают тот факт, что
продукция ИЛ-12 повышена у беременных с вирусной инфекцией и
составляет 181,5+37,3 пкг/мл (р<0,05).
В проведенном нами исследовании сыворотки было установлено, что у
здоровых беременных ИФН-γ практически не определялся на системном
уровне. Частота выявления данного цитокина составляла 12% (5 бер.), его
концентрация
в случае выявления не превышала 19,6±4,5 пкг/мл. У
беременных с вирусной инфекцией в 100% (83 бер.) случаев ИФН-γ
определялся.
Дефицит
последствия
при
новорожденных,
продукции
развитии
т.к.
ИФН-γ
вирусной
система
может
инфекции
интерферона
иметь
у
серьезные
беременных
может
не
и
блокировать
пролиферацию вирус-инфицированных клеток и одновременно настроить
практически все звенья иммунитета на элиминацию возбудителя. Одна из
функций ИФН во время беременности – предотвращать трансплацентарное
распространение вирусной инфекции.
В сыворотке здоровых беременных практически не определялся ФНО,
в то же время у беременных с УГИ вирусного генеза концентрация ФНО
составила 125,2±20,5 пкг/мл. Экспрессию этого цитокина индуцируют
13
вирусы. Известно, что в физиологических концентрациях ФНО угнетает
репликацию вирусов герпеса (ВПГ-1 и ВПГ-2) (Баринский И.Ф., Шубладзе
А.К. 1986г.), высокие концентрации этого цитокина могут усиливаить
воспаление и запускать механизмы активации апоптоза клеток трофобласта,
вызывая тем самым
отслойку плаценты и преждевременные роды
(Abrahams V. M. and Mor G. 2005).
Нами проведена оценка продукцию ФНО и ИЛ-12 в культуре
мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и
беременных с УГИ вирусного генеза.
МНК здоровых беременных спонтанно продуцировали высокий, до
194,7±44,3 пкг/мл, уровень ИЛ-12 (рис. 1). При этом в сыворотке крови у них
определяли физиологические (6,3±1,4 пкг/мл) концентрации ИЛ-12.
У
беременных
с
вирусной
инфекцией
отмечено
значительное
увеличение в сыворотке крови концентрации ИЛ-12 Одновременно с этим
возрастала в 2 раза (до 427,1±110,8 пкг/мл) продукция ИЛ-12 в культуре
МНК при вирусной инфекции (рис. 1).
Концентрация ИЛ-12, пкг/мл
*
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
427,1
Здоровые
беременные
*
181,5
194,7
Беременные с
вирусной
инфекцией
30,1
Сыворотка
МНК
Рис. 1 Спонтанная выработка ИЛ-12 мононуклеарными клетками беременных
с вирусной инфекцией и здоровых беременных.
* - значение достоверно отличается от контроля (р0,05)
14
МНК как здоровых беременных, так и беременных с вирусной
инфекцией без стимуляции продуцировали низкий (фоновый) уровень
ФНО, составляющий 20,0±10,0 пкг/мл.
Стимуляция МНК больных
антигенами ВПГ-2 приводила к
увеличению выработки ФНО до 475,0±63,0 пкг/мл, что достоверно
отличалось от контрольной группы 17,0± 14,0 пкг/мл (р0,05).
В последние годы доказано, что TLR широко экспрессируются
клетками иммунной системы, особенно клетками системы естественного
иммунитета, в частности, клетками, участвующими в воспалительном ответе:
макрофагах, нейтрофилах, моноцитах, дендритных клетках (Ковальчук Л.В.,
Хорева М.В., 2005).
Активация TLR на клетках естественного иммунитета ведет
к
экспрессии большого количества генов хемокинов и провоспалительных
цитокинов, в частности ИЛ-1,-2,-6,-8,-12, ФНО, ГМ-КСФ, ИФН-.
Нами была определена экспрессия TLR-9 мононуклеарными клетками
периферической крови и слизистой цервикального канала.
У
беременных
с
вирусной
инфекцией
выявлено
достоверное
увеличение экспрессии TLR-9 мононуклеарными клетками периферической
крови по сравнению со здоровыми беременными (1300000±300000 копий
TLR у здоровых беременных против 2800000±400000 копий TLR у
беременных с вирусной инфекцией). Эти результаты объясняют возрастание
спонтанной выработки провоспалительных цитокинов в культуре МНК этих
больных.
Следует отметить, что действие вирусного антигена ВПГ-2 приводило
к выраженной стимуляции выработки ФНО (спонтанная выработка –
50,0±14,0 пкг/мл, стимуляция ВПГ-2 – 475,0±63,0 пкг/мл) и менее
выраженной продукции ИЛ-12 (спонтанная выработка – 440,0±70,0 пкг/мл,
стимуляция ВПГ-2 – 135,0±38,0 пкг/мл) МНК больных УГИ вирусного
генеза.
15
Клетки цервикального канала женщин с физиологически протекающей
беременностью экспрессировали TLR9 в меньшей степени (в 2 раза) по
сравнению с МНК периферической крови. У беременных с вирусной
инфекцией
уровень экспрессии TLR9, распознающего вирусную ДНК,
возрастал в 10 раз. Это, в свою очередь, может приводить к избыточной
выработке провоспалительных цитокинов как на системном, так и на
локальном уровнях и служить важным механизмом в реализации ВУИ.
В настоящее время интерес многих исследователей привлекают
иммунологические исследования околоплодных вод (ОВ), представляющей
собой биологический барьер между плодом и экстраэмбриональными
структурами, местом проявления локальных иммунных реакций.
Нами
проведено
исследование
уровня
провоспалительных
и
противовоспалительных цитокинов рожениц с нормально протекающей
беременностью (2 группа) и рожениц с УГИ вирусного генеза (1 группа).
Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Концентрация и частота выявления цитокинов в околоплодных водах у
здоровых беременных и беременных с УГИ вирусной этиологии.
Цитокины
здоровые беременные
(группа 2,n =38)
беременные с УГИ
(1 группа, n = 56)
концентрация
(пкг/мл)
частота
выявляемости
(%)
частота
концентрация
выявляемости
(пкг/мл)
(%)
ИЛ-1β
40,1±2,3
38
98,4*±13,0
56
ИЛ-12
6,3±1,4
05
20,4±16,0
22
ИФН-γ
261,4±62,4
93
9,8*±6,0
05
ИЛ-4
13,4±4,0
25
55,7*±19,0
25
16
* - значение достоверно отличается от группы здоровых беременных.
(Частота выявляемости - отношение количества проб, содержащих значимые
концентрации цитокинов к общему количеству проб)
Как видно из таблицы, показатели исследуемых интерлейкинов (ИЛ-1β,
ИЛ-4, ИЛ-12) у здоровых беременных были значительно ниже аналогичных
показателей в ОВ пациенток с УГИ вирусного генеза. В ОВ 2-ой группы
(здоровые) достаточно редко определяются ИЛ-12, в то время как ИФН-γ –
определяется с высокой частотой. Надо отметить, что частота выявляемости
коррелирует с концентрацией: те цитокины, которые редко определяются,
имеют в ОВ низкие концентрации и наоборот.
При анализе цитокинов, основными клетками – продуцентами которых
являются макрофагальные клетки, было установлено, что содержание ИЛ-1β
у здоровых беременных 2-ой группы (40,1±2,3 пкг/мл) было в 2,4 раза ниже
по сравнению с женщинами 1-ой группы (98,4±13,0 пкг/мл), в то время как
содержание ИЛ-12 в ОВ беременных с вирусной инфекцией достоверно не
отличалось от уровня этого цитокина в ОВ здоровых рожениц (20,4±16,0 и
6,3±1,4 пкг/мл соответственно)
Содержание противовоспалительного цитокина ИЛ-4, продуцируемого
Тh 2, достоверно (в 4,3 раза) увеличено в ОВ пациенток с УГИ по сравнению
со здоровыми роженицами. Таким образом у рожениц с УГИ вирусного
генеза отмечено увеличение выработки как провоспалительных цитокинов,
так и противоспалительных.
В ОВ у здоровых
беременных определена высокая концентрация
ИФН-γ (261,2±62,4 пкг/мл) по сравнению с женщинами с УГИ вирусного
генеза (9,8±6,0 пкг/мл). Причем выявляется ИФН-γ в ОВ только у 5% (4 бер.)
рожениц данной группы, в то время как у здоровых частота его
выявляемости составляет 93% (41 бер.)
17
Известно, что ИФН-γ обладает спектром как противовирусного, так и
иммуномодулирующего
действия
(активирует
фагоцитоз,
увеличивает
цитотоксические реакции Т-клеток и ЕК), представляется значимым при
борьбе с вирусной инфекцией (Veith G.L., Rice G.E., 1999) По всей
видимости, в процессе борьбы
с инфекционным агентом происходит
истощение его выработки активированными лимфоцитами и именно с этим
может быть связанно значительное снижение или полное исчезновение ИФНγ при вирусной инфекции.
Система цитокинов тесно связана с активностью фагоцитарных клеток,
играющих важную роль как в регуляции иммунной системы, так и в
обеспечении противоинфекционной защиты организма.
Нами проведен сравнительный анализ окислительного метаболизма
нейтрофилов периферической крови и околоплодных вод у беременных с
УГИ вирусного генеза.
Вначале
были исследованы образцы периферической крови у
пациенток с нормально протекающей беременностью на сроке гестации 3540 недель методом люминол-зависимой хемилюминисценции (ЛХЛ).
Интенсивность ЛХЛ нейтрофилов беременных составила 12,510
квант/с4ж, что несколько выше по сравнению с группой здоровых доноров,
значение
хемилюминесценции
которых
составило
8,510
квант/с4ж.
Известно, что во время беременности отмечается активация системы
фагоцитов, связанная с повышенной противоинфекционной защитой (Xing Z
and Wang J , 2000). Проведенные исследования наглядно демонстрируют, что
в большинстве случаев у здоровых беременных продукция активных форм
кислорода несколько выше по сравнению со здоровыми небеременными
донорами.
Следующей
задачей
исследования
было
изучение
продукции
кислородных радикалов нейтрофилами периферической крови у беременных
с урогенитальной инфекцией вирусного генеза. Нами было обследовано 16
беременных с вирусной инфекцией.
18
В ходе исследования мы выделили две подгруппы, различающиеся по
интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции(рис 2):
1. беременные с вирусной патологией с исходно низким уровнем
продукции АФК (60%)
2. беременные с вирусной патологией с исходно высоким уровнем
продукции АФК (40%)
Были
обнаружены существенные различия в продукции активных
форм кислорода. При изучении ЛХЛ нейтрофилов крови беременных с
урогенитальной
инфекцией
показано,
что
данные
клетки
обладали
измененной способностью продуцировать АФК как спонтанно, так и в ответ
на стимуляцию, опсонизированным зимозаном.
У беременных с вирусной инфекцией в 40 % случаев имеет место
активация нейтрофилов в отношении выработки активных форм кислорода.
Остальные 60% беременных с вирусной инфекцией обладают резко
пониженным хемилюминесцентным ответом, причем резко снижены оба
показателя, как спонтанная, так и индуцированная выработка АФК (рис 2).
По-видимому, этот феномен связан с длительной персистенцией вируса у
больных и его влиянием на синтез цитокинов, регулирующих выработку
АФК.
интенсивность ЛХЛ, квант/с4пи
Cпонтанная хемилюминисценция
Индуцированная хемилюминисенция
16
11,75
14
10,25
12
8,5
10
8
6
4
2
0,1
1,5
*
*
0,25
1,8
1,75
0
Здоровые
доноры
Здоровые
беременные
Беременные с Беременные с
УГИ вирусной УГИ вирусной
тиологии
этиологии
(Группа I)
(Группа II)
19
Рис.2. Значения спонтанной и индуцированной хемолюминисценции нейтрофилов
в периферической крови в группе беременных с вирусной инфекцией.
* - значение достоверно отличается от показателя в группе здоровых
беременных (р≤0,05)
Таким
образом,
неполноценность
у
беременных
функциональной
с
вирусной
активности
периферической крови заключается в нарушении
инфекцией
нейтрофилов
кислород-зависимых
механизмов противовирусной защиты. Дефицит продукции активных форм
кислорода лейкоцитами периферической крови является показанием к
назначению иммунотерапии.
При изучении ЛХЛ нейтрофилов ОВ у беременных с нормальным и
осложненным течением беременности, было обнаружено, что данные клетки
отличаются различной способностью к выработке АФК как спонтанно, так и
под действием опсонизированного зимозана. При этом наиболее выраженные
изменения ЛХЛ наблюдались у беременных с УГИ вирусной этиологии.
Кинетика ЛХЛ нейтрофилов беременных с УГИ вирусной этиологии
приобретала характерный вид со значительным преобладанием спонтанной
продукции АФК (увеличивается в 2,5-3,5 раза по сравнению с контрольной
группой) над продукцией индуцированной (уменьшается в 3-4 раза по
отношению к контролю).
Нами
проанализирована
структура
патологии
новорожденных,
родившихся от пациенток, включенных в исследование. Подробный анализ
структуры патологии новорожденных, рожденных от матерей 1- ой и 2- ой
групп представлен в таблице 2.
Таблица 2
Структура патологии новорожденных, родившихся от матерей с УГИ
вирусного генеза (1-ая группа) и здоровых матерей (2-ая группа).
Патология новорожденного
1-ая группа (n=83)
2-ая группа (n=44)
20
Признаки недоношенности
5 (6,02%)*
2 (4,5%)
СЗРП
6 (7,2%)*
1 (2,3%)
гипоксия плода
12 (14,5%)*
-
родовая травма
15 (18,0%)*
2 (4,5%)
пороки развития
7 (8,4%)**
2 (4,5%)
признаки ВУИ плода
17 (20,5%)*
-
2 (2,4%)
-
антенатальная гибель плода
указана достоверность различий для средних значений признаков с использованием
параметрического критерия Стьюдента; уровни значимости различий p<0.05, p<0.01 и
обозначены * и ** соответственно.
От 127 матерей родились живыми 127 новорожденных, из которых 81
детей родились доношенными (в сроке 38-40 недель) и 46 новорожденных
родились недоношенными (в сроке 32-37 недель).
Дети, рожденные от матерей 1- ой группы, имели в среднем вес 2 кг
960 грамм  0,96, рост 49,5  0,56 см; во 2- ой группе - вес 3 кг 500 грамм 
0,89 и рост 51,8 см  0,38 см. Таким образом, дети, рожденные от матерей с
высоким риском развития ВУИ плода, имели меньший росто-весовой
показатель, в отличие от детей, родившихся от здоровых матерей.
УГИ во время беременности также является фактором риска развития
внутриутробной гипоксии плода и асфиксии новорожденного в родах. Во
время беременности развитие хронической внутриутробной гипоксии плода
диагностировалось
по клиническим данным (ухудшение сердцебиения
плода, уменьшение его подвижности и др.) и данным ультразвукового и
кардиотокографического исследований плода. Находившиеся в стационаре
беременные
получали
соответствующее
лечение,
на
фоне
которого
показатели со стороны плода улучшались.
21
Гипоксия плода в родах развивалась у 12 рожениц 1-ой
группы
(14,5%). Среди детей, родившихся от здоровых матерей 2-ой группы
гипоксия в родах не наблюдалась.
Диагноз
устанавливался
на
основании
ведущего
симптома
-
окрашивание околоплодных вод меконием, частота которого при головном
предлежании плода составляет 9-20% в популяции и достигает 35% при
родах
высокого риска,
а также
на изменениях
кардиомониторных
показателей (частоты сердечных сокращений, ритма и т.д.)
Наиболее тяжелым последствием прекращения или уменьшения
поступления кислорода является развитие асфиксии новорожденного. По
данным нашего исследования асфиксия была зарегистрирована у 2
новорожденных, родившихся от матерей 1-ой группы (2%). В обоих случаях
в родах произошло преждевременное излитие околоплодных вод, имел место
патологический прелиминарный период, длительный безводный период,
развилась
акушерская
первичная
слабость
ситуация
родовой
послужила
деятельности.
показанием
для
Сложившаяся
оперативного
родоразрешения. Подобный неблагоприятный фон послужил причиной
развития гипоксии плода и асфиксии новорожденного.
Среди новорожденных, родившихся от матерей 2- ой группы данное
осложнение не отмечалось.
ВЫВОДЫ
1. У беременных с УГИ вирусной этиологии наблюдются изменения уровня
цитокинов, характеризующиеся:
-отсутствием ИФН-γ в сыворотке крови и достоверным снижением
(менее 9 пкг/ мл) в околоплодных водах
- увеличением концентрации ИЛ-12, ФНО в сыворотке крови и в
культурах мононуклеарных клеток по сравнению с группой здоровых
беременных
22
2. В клетках слизистой церикального канала и мононуклеарных клетках
периферической крови больных с УГИ отмечено 10-ти и трехкратное
увеличение
экспрессии
рецептора
Toll-подобного
(TLR9),
распознающего неметилированные CpG повторы вируснуой ДНК, по
сравнению с клетками здоровых беременных.
3. У беременных с УГИ вирусного генеза наблюдается выраженный
дефицит
выработки
кислородных
радикалов
нейтрофилами
периферической крови и околоплодных вод.
4. У здоровых и больных новорожденных, рожденных от матерей с УГИ
вирусной этиологии отмечено увеличение концентрации ИЛ-12 в 3-4
раза по сравнению со здоровыми детьми, рожденными от здоровых
матерей. ИФН не определялся в 100% случаев в пуповинной крови, что
является
показанием
к
назначению
терапии
препаратами
интерферонового ряда.
5. Прогностическими критериями реализации ВУИ у рожениц с УГИ
вирусного генеза можно считать увеличение в ОВ концентрации ИЛ-1
выше 100 пкг/мл, значительное снижение ИФН-γ до 3,0 пкг/мл и 5-ти–
кратное увеличение ИЛ-4 по сравнению с уровнем этих цитокинов в ОВ
здоровых рожениц
Практические рекомендации
1.
В план обследования пациенток с УГИ вирусного генеза может быть
включено определение уровня цитокинов
в сыворотке крови и в
околоплодных водах, для выявления внтриутробного инфицирования
2.
Прогностическими критериями реализации ВУИ у рожениц с УГИ
вирусного генеза можно считать
увеличение в околоплодных водах
концентрации ИЛ-1 выше 100 пкг/мл, значительное снижение ИФН-γ (до
3,0 пкг/мл)
3.
5-ти–кратное увеличение ИЛ-4 в ОВ рожениц, родивших детей с ВУИ,
по сравнению с уровнем ИЛ-4 в ОВ здоровых рожениц необходимо
23
учитывать при дальнейшем ведении новорожденных, входящих в группу
риска по развитию аллергических заболеваний.
4.
Полное отсутствие
ИФН-γ в пуповинной крови новорожденных
является показанием к назначению терапии препаратами группы
интерферона.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Ганковская О.А.,
Гришук А.Ю. Врожденный иммунитет при урогенитальной инфекции
вирусного генеза у беременных. Аллергология и иммунология, том 7,
№3, сент. 2006, стр. 382.
2. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Ганковская О.А.,
Гришук А.Ю. Повышение выработки цитокинов (ИЛ-12, ФНО) и
экспрессии гена TLR-9 мононуклеарными клетками беременных с
урогенитальной
инфекцией
вирусного
генеза.
Тезисы
на
Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология
2006» Москва, 2006г., стр. 33.
3. Ганковская О.А., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., Гришук А.Ю. Анализ
выработки цитокинов у беременных женщин с вирусной инфекцией.
Тезисы
на
четвертом
Московском
Международном
Конгрессе
«Биотехнология», Москва, 2007г., стр. 101.
4. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Гришук А.Ю.,
Ганковская О.А., Макаров О.В. Оценка уровней цитокинов у
беременных женщин с вирусной инфекцией. Вопросы гинекологии,
акушерства и перинатологии. - 2007. - т. 6 - №2 - с. 11-13.
24