Динамические изменения флуоресцентных показателей у
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи Андреева Оксана Леонидовна ИЗМЕНЕНИЯ СВОЙСТВ СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА В ОЦЕНКЕ СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА ПРИ ПАТОЛОГИИ 03.00.04 – Биохимия Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук профессор С.В. Цвиренко Екатеринбург 2003 ОГЛАВЛЕНИЕ В В Е Д Е Н И Е …………………………………………………….…………....8 ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СВОЙСТВАХ СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА И ИХ ИЗМЕНЕНИЯХ ПРИ ПАТОЛОГИИ 1.1.Биохимические и физико-химические свойства сывороточного альбумина………………….……………………..…..…………………...13 1.1.1. Структура и метаболизм сывороточного альбумина..........…..…14 1.1.2. Связывающие центры молекулы сывороточного альбумина…...16 1.1.3. Механизм связывания лигандов сывороточным альбумином…..20 1.1.4. Факторы, влияющие на изменение структуры центров и связывающей способности сывороточного альбумина……..……….22 1.1.5. Методы исследования свойств связывающих центров альбумина ………………………………………………………………...25 1.2. Флуоресцентный метод определения связывающей способности сывороточного альбумина………………………...………27 1.2.1. Флуоресцентный зонд К-35 для исследования альбумина .……29 1.2.2. Параметры связывания зонда К-35 с альбумином в сыворотке крови ………………………………………………………….31 1.2.3. Флуоресцентный способ определения общей и эффективной концентрации альбумина сыворотки крови …………….35 1.3. Изменения свойств связывающих центров сывороточного альбумина при патологии………………………………………………...37 2 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Состав и характеристика обследуемых групп больных …………..43 2.2.Методы исследования эффективной и общей концентрации альбумина, а также параметров, характеризующих взаимодействие зонда К-35 с альбумином в сыворотке крови ……………………………...….47 2.2.1 Определение общей концентрации альбумина (ОКА)………...…47 2.2.2 Определение эффективной концентрации альбумина (ЭКА)……48 2.2.3 Определение квантового выхода флуоресценции К-35 в сыворотке крови ………………………...………………………………..49 2.2.4. Определение концентрации центров связывания флуоресцентного зонда К-35 с альбумином ………………...……….…50 2.2.5. Определение константы связывания флуоресцентного зонда К-35 с альбумином …………………….……...51 2.2.6. Определение среднего количества центров связывания К-35 в молекуле альбумина…………………...……………52 2.3. Определение влияния метаболитов на флуоресценцию зонда К-35 в альбумине ………………………………………………….52 2.4. Определение других лабораторных параметров в образцах крови обследуемых групп больных. ……………………………………53 2.5. Статистическая обработка результатов…………………..................54 ГЛАВА 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТОДА ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ. ВЛИЯНИЕ СВЯЗЫВАЮЩИХ РАЗЛИЧНЫХ ЦЕНТРОВ ФАКТОРОВ СЫВОРОТОЧНОГО НА СВОЙСТВА АЛЬБУМИНА В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ 3.1. Аналитические характеристики метода флуоресцентных зондов……………………...........................................................................56 3 3.2. Влияние времени суток на свойства связывающих центров сывороточного альбумина………………….....………………..59 3.3. Характеристика флуоресцентных показателей у здоровых лиц…..63 3.4. Сравнительный анализ методов определения альбумина сыворотки крови у больных с хирургической инфекцией………………………….65 3.5. Влияние метаболических факторов на флуоресценцию К-35 в условиях патологических ситуаций ………………………………….…69 3.6. Влияние жирных кислот на флуоресценцию К-35 в условиях патологических ситуаций……………...………………………………...72 3.7. Влияние гемолиза на свойства связывающих центров сывороточного альбумина в условиях патологических ситуаций …………………...74 3.8. Влияние гемодиализа на свойства связывающих центров сывороточного альбумина при заболеваниях почек ………….......……76 ГЛАВА 4. ИЗМЕНЕНИЯ СВОЙСТВ СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ПРИ ПАТОЛОГИИ 4.1 . Изменения флуоресцентных показателей при заболеваниях желудочно-кишечного тракта...………………….……………………..80 4.1.1. Изменения флуоресцентных показателей при гепатите и циррозе печени ……………………………………………………..………………81 4.1.2. Изменения флуоресцентных показателей при панкреатите……83 4.2. Изменения флуоресцентных показателей при заболеваниях почек……………………………………………………………………....84 4.2.1. Изменения флуоресцентных показателей при пиелонефрите ....84 4.2.2. Изменения флуоресцентных показателей при гломерулонефрите………………………….…………………………….86 4.3. Изменения флуоресцентных показателей при заболеваниях системы крови……………………………………………..…………….87 4 ГЛАВА 5. ИЗМЕНЕНИЯ СЫВОРОТОЧНОГО СВОЙСТВ АЛЬБУМИНА И СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У БОЛЬНЫХ С ХИРУРГИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИЕЙ 5.1. Изменения флуоресцентных показателей у больных с хирургической инфекцией…………………………………...………….92 5.1.1. Изменения флуоресцентных показателей при перитоните ……………………………………………………………….92 5.1.2. Изменения флуоресцентных показателей при панкреонекрозе…………………………………………………………..101 5.1.3. Изменения флуоресцентных показателей при сепсисе………...103 5.1.4. Изменения флуоресцентных показателей при холангите...…....106 5.2. Клинико-лабораторные показатели у больных с хирургической инфекцией…………………………………………………………..........108 5.3. Сравнительный анализ флуоресцентных и клинико-лабораторных показателей у больных с хирургической инфекцией…………………134 ГЛАВА 6. КЛИНИКО – ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНФЫХ И ДРУГИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ 6.1. Изменения свойств связывающих центров сывороточного альбумина у больных с хирургической инфекцией в зависимости от тяжести заболевания………….…………………………………......150 6.2. Изменения клинико-лабораторных параметров у больных с хирургической инфекцией в зависимости от тяжести заболевания………..……………………………………………………..160 6.3. Прогностическое значение показателей альбумина при хирургической инфекции………………………………….……………167 6.4. Параметры связывающих центров альбумина, ответственные за изменения флуоресценции зонда К-35 при патологии………………..171 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .………………………………………………….……………175 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….188 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………….190 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ……………………………………………………..191 6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АсАТ – аспартатаминотрансфераза АлАТ – аланинаминотрансфераза АНС – 1 – анилинонафталин – 8 - сульфонат БКЗ – бромкрезоловый зеленый БКП – бромкрезоловый пурпурный БР – билирубин ДМХ - диметиламинохалкон ЖК – жирные кислоты ИТ – индекс токсичности К – константа связывания зонда К-35 с альбумином в сыворотке M – молекулярная масса альбумина МБА – 3 - метоксибензатрон МКА – массовая концентрация альбумина, измеренная любым методом, кроме флуоресцентного с зондом К-35 МСМ – молекулы средней массы НЭЖК – неэстерифицированные жирные кислоты ОКА – общая концентрация альбумина СА – сывороточный альбумин ССА – связывающая способность альбумина ЧСА – альбумин сыворотки крови человека ЭКА – эффективная концентрация альбумина ЭКА/ОКА – параметр, характеризующий физико-химические свойства молекулы альбумина ЭИ – эндогенная интоксикация DQ – квантовый выход флуоресценции зонда К-35, связанного с альбумином в сыворотке, умноженный на приборную константу D N – концентрация альбуминовых центров связывания зонда К-35 в сыворотке крови 7 ВВЕДЕНИЕ Альбумин составляет более половины массы белков плазмы крови и выполняет в организме важные функции [6,7,112,207]. Среди них - связывание множества амфифильных низкомолекулярных веществ – жирных кислот, билирубина, многих других метаболитов, токсинов и ксенобиотиков ( в том числе лекарственных веществ) и перенос их к органам детоксикациибиотрансформации является весьма значимым в обеспечении гомеостаза в условиях нормы и особенно при патологии [171,172,182,192]. Нарушение этой функции ведет к накоплению токсичных компонентов, что является существенным составляющим синдрома эндогенной интоксикации. В связи с этим ценным показателем в оценке состояния больных является определение количества альбумина и большинство клиник широко используют его в практике. Вместе с тем способность альбумина связывать различные метаболиты в настоящее время в широкой клинической практике не оценивается. А между тем уже нескольких десятилетий назад было замечено, что в условиях различных клинических ситуаций способность молекулы альбумина транспортировать подобные вещества и, следовательно, свойства ее связывающих центров могут заметно изменяться [8,49,52,125,126,130,135]. Адекватная и объективная регистрация таких изменений стала возможной в результате разработки новейших технологий анализа состояния связывающих центров альбумина, основанных на применении специальных флуоресцентных зондов, и прежде всего предложенного российскими учеными – флуоресцентного зонда К-35 [88]. Этот метод оказался очень чувствительным, простым и удобным для практического использования. Установлено, что интенсивность флуоресценции зонда К-35 в плазме (сыворотке) крови больных различными заболеваниями, может снижаться на десятки процентов и даже в несколько раз, в то время как общая концентрация альбумина не испытывает столь значительных изменений и часто остается в пределах нормы [6,7,198]. Поэтому есть основания полагать, что опреде8 ление лишь количества сывороточного альбумина, получившее широкое распространение в клинической практике, явно недостаточно. Необходима одновременная оценка и свойств связывающих центров сывороточного альбумина. Особенно это относится к заболеваниям, в патогенезе которых эндотоксикоз играет ведущую роль, зачастую определяя их клиническую картину и исход. В работах отечественных и иностранных авторов показано, что связывающая способность альбумина снижается при желтухах [322], инфаркте миокарда[49,124], отравлениях [8], ожогах [162], почечной недостаточности и сепсисе [126,129,130], операционных осложнениях [129,155]. Однако в настоящее время остаются до конца не изученными механизмы снижения связывающей способности сывороточного альбумина, патогенетические аспекты этого явления, а также клинические возможности альбуминового теста. Для своего расширенного внедрения в клиническую практику метод флуоресцентных зондов требует уточнения аналитических характеристик, дальнейшего накопления клинико-лабораторных сопоставлений при различных заболеваниях. На сегодняшний день имеются лишь эпизодические сообщения об особенностях динамики флуоресцентных показателей у больных различными заболеваниями, их соотношения с общепринятыми клиниколабораторными параметрами. Известны отдельные данные о связи этих показателей с тяжестью состояния больного и исходом заболевания. Недостаточная изученность вместе с зачастую фрагментарным и некомплексным подходом в предыдущих исследованиях изменений свойств связывающих центров сывороточного альбумина при нарушениях функций организма определила цель и задачи настоящей работы. Цель исследования: выяснить закономерности изменений свойств связывающих центров сывороточного альбумина при патологии, установить их клинико-диагностическое значение. Задачи исследования: 1.Установить особенности взаимодействия флуоресцентного зонда К9 35 с альбумином сыворотки крови при патологии. 2.Изучить аналитические характеристики флуоресцентного метода исследования свойств связывающих центров сывороточного альбумина с помощью зонда К-35. 3.Оценить влияние различных факторов на свойства связывающих центров сывороточного альбумина. 4.Изучить особенности динамики флуоресцентных и клинико- лабораторных показателей при патологии, провести их сопоставление. 5.Провести анализ связи показателей, характеризующих свойства связывающих центров сывороточного альбумина, определяемых методом флуоресцентных зондов, с тяжестью состояния больного и исходом заболевания. 6.Установить клинико-диагностическое значение показателей, характеризующих свойства связывающих центров сывороточного альбумина при патологии. Научная новизна: Установлена важная роль изменений свойств связывающих центров сывороточного альбумина в патогенезе заболеваний различной природы. Выявлены общие черты изменений свойств связывающих центров сывороточного альбумина и их особенности при различных заболеваниях. Доказана связь изменений флуоресцентных показателей с характером течения патологического процесса и тяжестью заболевания. Показано, что свойства связывающих центров сывороточного альбумина являются интегральным показателем динамики соотношения процессов образования и выведения (обезвреживания) токсических веществ (метаболитов). Обнаружен характер влияния ряда факторов на свойства связывающих центров сывороточного альбумина. Комплексное сопоставление клинико-лабораторных и флуоресцентных показателей позволило установить, что диагностическая чувствительность параметров, определяемых методом флуоресцентных зондов, значительно 10 превосходит таковую у традиционных клинико-лабораторных тестов. Обоснован эффективный способ объективной оценки состояния организма при патологии с использованием флуоресцентных показателей, характеризующих свойства связывающих центров сывороточного альбумина, в частности при хирургической инфекции. Практическая значимость: С позиций физико-химических и клинико-лабораторных исследований показана необходимость изучения свойств связывающих центров сывороточного альбумина у больных при различных заболеваниях с целью объективной оценки их состояния. Показана значительно более высокая информативность показателей, характеризующих изменения свойств связывающих центров сывороточного альбумина, определяемых методом флуоресцентных зондов, по сравнению с общепринятыми клинико-лабораторными тестами. Полученные данные обосновывают критерии оценки изменений флуоресцентных показателей сыворотки крови, а также возможность для клинической интерпретации этих изменений. Установлен характер влияния практически значимых факторов на результаты измерения флуоресцентных показателей сыворотки крови у больных. Положения, выносимые на защиту: 1.Флуоресцентные показатели, характеризующие свойства связывающих центров сывороточного альбумина, обладают высокими аналитическими характеристиками, но зависят от ряда факторов. 2.При различных заболеваниях происходят значительные изменения свойств связывающих центров сывороточного альбумина. 3.Параметры, характеризующие свойства связывающих центров сывороточного альбумина, зависят от особенностей течения патологического процесса и отражают его динамику. 4.Диагностическая чувствительность параметров, определяемых методом флуоресцентных зондов, значительно превосходит таковую у традици11 онных клинико-лабораторных тестов. 5.Изменения свойств связывающих центров сывороточного альбумина у больных с хирургической инфекцией зависят от тяжести заболевания. 12 ГЛАВА I СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СВОЙСТВАХ СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА И ИХ ИЗМЕНЕНИЯХ ПРИ ПАТОЛОГИИ 1.1. Биохимические и физико-химические свойства сывороточного альбумина Известно, что многие биологически важные функции плазмы крови, основаны на способности белков плазмы связывать, и переносить органические соединения: гормоны, лекарства, жирные кислоты и другие [111,120,129,130,207]. В настоящее время детально изучены вопросы конформационных и функциональных изменений белков плазмы крови, показана их роль в патогенезе, диагностическая и прогностическая значимость при многих заболеваниях [6,7,90,95,171,172]. Более половины массы белков плазмы крови составляет альбумин1. Уникальная способность молекулы сывороточного альбумина (СА) связывать большое количество органических и неорганических лигандов определяет одну из основных функций этого белка - транспорт физиологических метаболитов и лекарственных веществ, а также обеспечение механизма регуляции их уровня в крови [94,111,197,206]. Эволюционно эта функция сформировалась в отношении транспорта жирных кислот (ЖК), билирубина (БР), пиридоксальфосфата, альдостерона, триптофана, Са 2+, Cu 2+ [213]. Молекулярные механизмы процессов связывания СА с разными лигандами еще не раскрыты полностью, но в течение последних лет достигнуты заметные успехи в направлении идентификации лигандсвязывающих участков на белковой молекуле. Познание тонких структурных механизмов взаимодействия СА с низкомолекулярными веществами способствует пониманию транспортной функции этого физиологически активного белка [171,172,174,184]. 1 Здесь и в дальнейшем речь идет только об альбумине крови 13 В результате взаимодействия с разнообразными лигандами молекула СА претерпевает изменения, которые зависят от химических свойств действующих на белок веществ, от характера связей, образующихся в процессе соответствующих реакций. В каждом случае происходят как изменения физико-химических свойств самих лигандов, так и индуцируемые при их связывании структурные пертурбации в молекуле белка. Поэтому, например, происходит ослабление или усиление действия лекарственных веществ в организме. Лигандиндуцированными структурными изменениями белка объясняются известные эффекты стабилизации in vitro препаратов СА, связанного с жирными кислотами (ЖК), триптофаном, ионамидитурирующей температуры, протеолиза, внутримолекулярного дисульфидного обмена. Проявление указанных свойств обусловлено особенностями трехмерной структуры белка, обладающей подвижностью отдельных участков его молекулы при связывании специфических лигандов или в результате их высвобождения [171, 172]. Основой таких структурно-функциональных взаимодействий является структурная лабильность молекулы СА, обеспеченная уникальной петлевой укладкой в пространстве полипептидной цепи [1,3,14,28,81]. Универсальные комплексообразующие свойства альбумина определяются, в конечном счете, особенностями структурной организации этого белка и, в частности, способностью его молекул к конформационным перестройкам [17,51,84,171,172, 211,313]. 1.1.1.Структура и метаболизм сывороточного альбумина Сывороточный альбумин человека (ЧСА) - это глобулярный белок с молекулярной массой около 66 килодальтон. СА синтезируется в печени и секретируется ее клетками в кровь. В плазме крови концентрация ЧСА - 3550 г/л, что составляет 47-62% всех белков плазмы. Всего в кровеносном русле человека содержится около 120-140 грамм альбумина, во внеклеточном пространстве - около 360 грамм [73,316]. Среднее время жизни молекулы альбумина в организме человека - около 20 дней. [172].Структура молекулы 14 альбумина описывается как одна полипептидная цепь, состоящая из 586 аминокислотных остатков. Она включает три так называемых домена, каждый из которых – структурная единица, содержащая 2 большие и 1 малую петли (субдомены). Домены трижды почти точно повторяются в виде индивидуальных глобулярных сегментов, конформация которых фиксирована 17 дисульфидными связями [63,171,179,219,327]. Такое сегментированное устройство придает молекуле альбумина значительную подвижность. При этом изолированные домены сохраняют функциональную специализацию, характерную для цепей молекулы СА [157]. Связывающие центры не являются независимыми, и при взаимодействии с белком некоторых лигандов проявляется эффект кооперативности [6, 7]. Зависимость связывания лигандов от молекулярной организации СА может быть подтверждена данными по взаимодействию различных низкомолекулярных веществ с отдельными фрагментами белка, полученными при ограниченном протеолизе. Такие фрагменты, по данным кругового дихроизма, в основном сохраняют вторичную структуру, характерную для них в составе цельной молекулы. Однако было показано, что эквимолярная смесь двух фрагментов бычьего альбумина с последовательностями 1-306 и 307581 имеет более высокую по сравнению с индивидуальными фрагментами способность к связыванию длинноцепочечных жирных кислот [172]. Показано также, что связывание триптофана комплексом из указанных фрагментов СА вдвое выше, чем это происходит из простой суммы связывающей активности индивидуальных фрагментов [337,342]. Эти результаты исследований явились основанием для развития представления о том, что нативная структура СА формируется из отдельных структурных областей, способных независимо сворачиваться, образуя глобулярные фрагменты во множественных участках полипептидной цепи [246,301,353]. Таким образом, можно считать, что решающим для связывающей способности альбумина является характерное вообще для глобулярных белков свойство находиться в различных молекулярных состояниях, обусловленных 15 изменениями в геометрии молекулы. При этом конформационные изменения могут носить локальный характер и затрагивать тот или иной связывающий центр, что в ряде случаев может индуцировать более глубокие и обширные структурные пертурбации всей белковой глобулы [188,189,190]. 1.1.2. Связывающие центры молекулы сывороточного альбумина Круг веществ, способных связываться с альбумином, огромен: лекарственные препараты, метаболиты (важнейшими из них являются жирные кислоты и гемовые производные), гормоны, ионы металлов, красители [240,250,268,274,289,300,343,344] Точное число лигандов, которое способна связать 1 молекула альбумина, неизвестно, иногда оно превышает 10. Функционирующий в крови альбумин активно взаимодействует с различными лигандами, модифицирующими его структуру [113,174,226,304,338,351]. Вещества, связывающиеся с альбумином, в основном гидрофобны или амфифильны [10]. Участок молекулы альбумина, с которым тот или иной лиганд взаимодействует более длительное время, чем с другими участками, называют центром связывания для данного лиганда. Считается, что связывающие центры на молекуле альбумина сформированы изначально, до взаимодействия с лигандом. Обычно лиганды имеют на молекуле ЧСА несколько центров связывания, которые соответствуют по своей структуре лиганду в большей или меньшей степени и взаимодействия, с которыми происходят с разной силой. Для характеристики связывания лигандов с альбумином используют аппарат равновесной термодинамики и химической кинетики. Важными характеристиками являются два параметра: n-среднее число участков связывания на одной молекуле и К – константа связывания лиганда, равная отношению констант ассоциации и диссоциации «белок-лиганд» [63,99,121,148,201]. Связавшийся с глобулой лиганд может влиять на взаимодействие с ней другого лиганда. Взаимодействия могут быть как конкурентными, так и кооперативными. За период изучения связывания альбумином биологически значимых 16 соединений сложились следующие представления о местах связывания. Существуют два основных центра связывания лекарств: центр I находится в субдомене IIA, его маркером являются варфарин и фенилбутазон. Согласно, Yamasaki K. с соавт.[352] связывающий центр I состоит из трех частично перекрывающихся регионов Ia, Ib, Ic. С регионом Ia связывается специфический маркер варфарин, с Ib – азопропазон, а с Ic связывается специфический маркер n-аминобензоат. Связывание лигандов с этими центрами происходит за счет Ван-дер-Ваальсовых и гидрофобных сил [352]. Центр I I находится в субдомене I I I А и его маркеры – иопановая кислота и бензодиазепам. Связывающие центры состоят из катионной области на поверхности молекулы гидрофобного кармана. При изучении связывания лигандов – маркеров центров различной длины было установлено, что глубина связывающего центра I составляет 19А, а размеры центра I I - 12-16А в глубину и 6-8 А в ширину [238]. Эти представления хорошо коррелируют с моделью J.R.Brown [248], согласно которой гидрофобный карман в домене защищен от молекул воды «стенками» из -спиралей. Кроме двух неспецифических лекарственных центров связывания существуют также более специфические центры связывания. Так, изучение связывания ионов металлов с различными генетическими вариантами альбумина показало, что существует место связывания для двухвалентных катионов Ni+2, Ca+2, Zn+2, Cu+2 в первом домене. Этот центр связывания образован Nконцевым Asp-Ala-His – трипептидом. С ионами металлов взаимодействуют -аминогруппа и карбоксильная группа аспарагина, имидазольная группа гистидина и два депротонированных пептидных азота (Ala-NH и His-NH) [295,302]. Для связывания жирных кислот (речь идет только о неэстерифицированных жирных кислотах) имеются участки, отличные от лекарственных мест связывания [102,180,239]. Один высокоаффинный связывающий участок для ЖК находится в III домене, где две молекулы жирных кислот связываются в антипараллельных направлениях. Согласно Berde C.B., Hudson 17 D.S.[236] второе место связывания ЖК находится в субдомене II В. В норме молекула альбумина связывает 0,4-2 молекулы ЖК и транспортирует их в русле крови [171]. Жирные кислоты оказывают влияние на другие связывающие центры альбумина, хотя места связывания для ЖК и для других лигандов находятся в разных участках молекулы ЧСА [323,332,333,335,339,347, 349]. Молекула билирубина по размеру и по гидрофобности значительно превосходит молекулу жирной кислоты [334]. Связывание билирубина (БР) одна из важнейших функций альбумина. Физиологическое значение связывания БР с альбумином обусловлено нерасворимостью этого естественного метаболита и токсичностью его в свободном состоянии. Низкая растворимость БР в водных растворах объясняется гидрофобностью этого соединения, а также, вероятно, его способностью образовывать внутримолекулярные водородные связи между карбоксильными группами остатков пропионовой кислоты и азотом пирролов в каждой половине дипирролов. Связывание с альбумином сопровождается разрывом таких водородных связей, раскручиванием и растягиванием молекулы БР с образованием полярной формы. Взаимодействие альбумина с БР является единственным путем, посредством которого БР транспортируется в печеночные клетки, где конъюгируется с глюкуроновой кислотой [171]. В серии работ [80,83,211,266,291] показано, что взаимодействие БР с альбумином происходит по гидрофобному механизму и сопровождается проникновением мицелл лиганда в неполярную часть белковой глобулы. Билирубин обратимо связывается с одним первичным наиболее специфичным участком альбумина, где поглощается 1-2 молекулы лиганда, а также еще с одним или двумя центрами, связывающими БР менее прочно [296]. Кроме того, имеется неопределенное число неспецифических участков, связывающих до 10 молекул БР и более [272]. Взаимодействия между белками плазмы и переносимыми веществами имеют первостепенное значение и в транспорте липидов [108,178,233,247,260,287,331]. В работах [187,259,305, 18 336,337], проводится обобщение имеющихся данных по этому вопросу – факт, дающий нам основание не уделять ему внимания в этой главе. Вопрос о количестве и классификации связывающих центров альбумина является предметом многих исследований. Kragd Hansen U.[288] предположил существование пяти регионов связывания. С первым регионом связываются одна или две молекулы длинноцепочечных жирных кислот. Второй регион менее специфичен, с ним связываются октаноат, триптофан, хлоразепам, тироксин, n-йодбензоат и хлориды. С третьим регионом связывается билирубин, красители (феноловый красный, бромфеноловый синий) и иопаноат. Четвертый – это область для связывания ионов металлов, а пятый – для связывания гемина [287]. Aki H. и Yamamoto M. по характеру изменения термодинамических параметров (свободной энергии Гиббса G, энтальпии Н и энтропии S), которые они исследовали методом микрокалориметрии при связывании анионных лекарств, монокарбоновых и дикарбоновых ЖК выделяют три группы мест связывания – S1, S2 и S3 [222,223]. С группой S1 с высокой аффинностью связывались ЖК с короткой и средней длиной цепи и лекарства – маркеры связывающего центра II (ибупрофен, флуфенамид, линолевая и этакриновая кислоты); с группой S2 с низкой аффинностью связывались длинноцепочечные ЖК и те же лекарственные вещества, что и с группой S1. Связывание лигандов с группами S1 и S2 характеризовалось значительным уменьшеием энтальпии и энтропии, отражающим образование водородных и Ван-дер-Ваальсовых связей. Группа S3 содержала высоко аффинные места для маркеров центра 1 и длинноцепочечных ЖК. При связывании веществ с этой группой мест энтальпия незначительно уменьшилась, а энтропия не изменялась или немного увеличивалась. Это свидетельствует о том, что связывание лигандов с этой группой мест происходит за счет только гидрофобных взаимодействий [294]. И хотя авторы интерпретировали свои результаты в терминах различных мест связывания, они отметили, что наблюдаемая гетерогенность термодинамических характеристик при связывании ЖК с ЧСА, возможно, является проявлением различных механизмов взаимодействия 19 ЧСА-лиганд, реализующихся в общем месте связывания. Это предположение согласуется с точкой зрения авторов работы [222,223], которые, изучая связывание стереоизомеров бензодиазепина с альбумином, предложили изменить номенклатуру, используемую для описания связывания лигандов, и использовать термины «I-й и II-й типы связывания», которые не описывают точных молекулярных мест связывания. Классификации связывающих центров, предлагаемые различными авторами, скорее дополняют, а не заменяют друг друга. Так, наличие центров I и II признают большинство авторов [222,223,307,353]. Таким образом, многочисленные экспериментальные данные говорят о том, что на молекуле альбумина хорошо идентифицируются два высокоаффинных центра связывания гидрофобных лекарств. Кроме того, существуют отдельные места связывания для ионов металлов, гемовых производных (в том числе билирубина) и, по-видимому, для жирных кислот. Места связывания занимают больше гидрофобные области на молекуле, могут перекрываться, и для их обозначения представляется подходящим понятие «связывающий регион» или «связывающая область». Эти области сформированы изначально, они обладают значительной гибкостью и могут приспосабливаться для связывания лигандов разной химической структуры. Внутри этих областей лиганды связываются с разными аминокислотными остатками за счет образования водородных связей, Ван-дер-Ваальсовых и электростатических сил, а также гидрофобных взаимодействий. 1.1.3.Механизм связывания лигандов сывороточным альбумином Связывание лигандов с альбумином сопровождается изменением свободной энергии (G) и энтальпии (Н) [148,222,223]. Большинство лигандов имеют на молекуле ЧСА одно высокоаффинное и одно или несколько низкоаффинных мест связывания. Связывание лигандов с центром I или I I с высокой или низкой аффинностью может определяться наличием или отсутствием в молекуле лиганда карбоксильной группы [309,319]. Предполагают, что с 20 высокоафинными центрами связывания жирных кислот молекулы взаимодействуют карбоксильной частью, а метильная часть жирной кислоты остается свободной. С низкоафинными центрами метильные группы связываются также хорошо, как и карбоксильные [287]. Связывание веществ с высокой аффинностью происходит за счет электростатических, Ван-дер-Ваальсовых и гидрофобных взаимодействий, а связывание с низкой аффинностью только за счет гидрофобных [83,222,223,318,320]. Значительную роль в стабилизации комплексов ЧСА с лигандами играют водородные связи [27,267]. Кроме электростатических и гидрофобных взаимодействий при связывании лигандов могут образовываться ковалентные связи. Так, глюкуронид толметина формирует с лизиновыми остатками ЧСА иминные (Шиффовые) комплексы [254,255,256]. При связывании лигандов в молекуле альбумина происходят конформационные перестройки. Они могут быть значительными, например, увеличение или уменьшение -спиралей [348]. Эти перестройки, также как и способность молекулы колебаться между изомерными формами в водном растворе, возможно, обуславливают появление новых мест связывания лигандов различной природы [297,348]. Связывание лигандов может происходить постадийно: после связывания первой молекулы лиганда изменяется конформация связывающей области и формируются новые места связывания: при этом константа связывания может уменьшаться. Так при взаимодействии кетопрофена с альбумином (К1=3,8х106 л/моль, n=35) конформация места связывания меняется так, что константа связывания для следующих молекул лиганда уменьшается в 100 раз, а n возрастает до14 [325]. При связывании жирных кислот константа ассоциации для первой молекулы больше, чем для последующих, однако в случае арахидоновой кислоты эта константа для первой молекулы ЖК меньше, чем для второй, что может быть связано с кооперативными и конкурентными влияниями [326]. При этом связывание лиганда альбумином определяется соответствием между профилями распределения энергии по молекуле лиган21 да и участка альбуминовой глобулы. 1.1.4.Факторы, влияющие на изменение структуры центров и связывающей функции сывороточного альбумина Первичная, вторичная и третичная структуры альбумина могут изменяться при воздействии различных факторов: температуры, длительного хранения, изменения рН, ионной силы раствора, присутствия лигандов, присоединения разных химических групп [13,72,163,277,290]. Примером нарушений первичной структуры белка может служить отщепление от N-концевой части двух аминокислотных остатков - Alа и Asp в результате хранения препаратов альбумина при температуре выше 30оС. Вторичная и третичная структура существенно меняются при изменении кислотности среды – в молекуле альбумина происходят различные конформационные переходы в результате изменения заряда ионизированных групп белка. Такие конформационные переходы влияют на собственную флуоресценцию белка, на флуоресценцию зондов, на параметры связывания различных лигандов [6]. Известны, пять конформаций альбумина, которые могут переходить друг в друга при изменении рН [84]. При этих переходах изменяется длина молекулы за счет увеличения или уменьшения содержания -спиралей. Меняется также доступность для растворения некоторых аминокислотных остатков. В области рН 6-7,5 молекула находится в N-конформации. Эта обычная конформация белка, в которой он имеет эллипсоидную форму с размерами 40х140 А. При увеличении рН от 7 до 9 происходит переход N-В (normal-base). Этот переход инициируется кооперативным титрованием нескольких гистидиновых остатков [142,143]. Значение рН, при котором происходит этот переход, зависит от ионной силы раствора и содержания жирных кислот. Конформационный переход N-В приводит к изменению длины молекулы. Такие изменения можно оценить, используя явление безызлучательного переноса 22 энергии между флуоресцирующей и поглощающей молекулами лигандов, ассоциированных с альбумином. Увеличение рН до 9 приводит к «сжатию» молекулы, а затем, при увеличении рН до 12, молекула растягивается. Повидимому, в области высоких значений рН происходят два конформационных щелочных перехода – первый переход при рН 11,3-11,8, когда совместно диссоциируют, по крайней мере, 6 протонов, второй переход при рН 11,812,0, когда молекула альбумина обратимо денатурирует [276]. С уменьшением рН конформация белка также изменяется. В области рН 3,0-4,5 происходит с переходом N-F (normal-fasten-migrating). Во время перехода N-F расстояние между Тrp (214) и Сys (34) уменьшается [336], т.е. молекула «сжимается». Значение рН, при котором происходит переход N-F зависит от количества связанных с альбумином заряженных лигандов [237], присутствия ионных детергентов. Так, в присутствии 3,5 М мочевины переход в F форму происходит уже при рН 5,4-5,5 [84]. При этом конформационные перестройки, вызванные изменением рН, оказывают влияние на связывающие функции альбумина. Молекула альбумина устойчива к температурной денатурации. Она выдерживает нагрев до 60о С в течение 1 часа [317]. Однако при температуре 35-36оС наблюдали конформационный переход молекулы альбумина, который выражался в коротковолновом сдвиге максимума флуоресценции альбумина на 5-7 нм. Изменением содержания -спиралей в молекуле белка, то есть изменение вторичной структуры происходит также при добавлении различных неорганических солей, например цианада натрия (NaSCN), который влияет на вторичную структуру белка в 100 раз сильнее, чем хлорид калия или мочевина. Жирные кислоты с разной длиной цепи по-разному влияют на третичную структуру молекулы альбумина. Жирные кислоты с длиной цепи до 10 углеродных атомов увеличивают расстояние между Тrp (214) и молекулой билирубина, связанной с альбумином. Длинноцепочечные жирные кислоты (более 10 углеродных атомов в цепи) при низких концентрациях уменьшают 23 это расстояние, а значит увеличивают компактность альбуминовой глобулы. Присоединение ЖК делает белок более устойчивым к воздействию денатурирующих агентов – температуры, мочевины, гуанидиновых солей [315]. Направление влияния ЖК на связывание других лигандов с ЧСА так же зависит от длины цепи и от концентрации ЖК. Это влияние можно объяснить конкурентными взаимодействиями: ЖК могут связываться не только со специфическими центрами, но и с лекарственными местами связывания), изменением доступности мест связывания при компактизации альбуминовой глобулы, изменением их конформации [307]. Другие лиганды, связываясь с альбумином, также могут изменять состояние его глобулы [70,164,235,321]. При этом конформационные перестройки возможны как по всей молекуле, так и в связывающей области. Результатом этого может быть изменение числа мест связывания [326], стереоселективности [306], жесткости альбуминовой глобулы. Взаимные влияния лигандов могут быть как конкурентными, так и кооперативными. Примером конкурентного взаимодействия может быть ингибирование связывания -триптофана при больших концентрациях в плазме вальпроата, вытеснение цефтриаксоном билирубина из билирубин- альбуминовых комплексов. К конкурентным взаимодействиям относится перемещение лигандов из высокоафинного центра связывания в центр с низкой аффинностью, если конкурирующее вещество имеет более высокую концентрацию или аффинность. При аллостерических кооперативных взаимодействиях лиганды, связывающиеся с одним центром, могут изменять конформацию другого центра связывания. Это может происходить, например, при увеличении кислотности среды в результате высвобождения протонов при связывании лигандов. Так диазепам (маркер II центра связывания) предотвращает высвобождение протонов при связывании теноксикама с центром I и значительно увеличивает его аффинность [84]. Таким образом, данные литературы свидетельствуют о том, что альбумин – довольно устойчивая к разрушению молекула, которая вместе с тем, 24 реагирует на малейшие изменения в окружающем ее пространстве. 1.1.5. Методы исследования свойств связывающих центров сывороточного альбумина С тех пор как важность изучения связывающих центров альбумина стала ясна, было предложено множество методов исследования связывания лигандов с альбумином. Наиболее удобным средством исследования центров связывания в молекуле альбумина оказалось использование красителей. Способность красителей связываться с белками и тонко реагировать на состояние белковой молекулы известна давно [139]. Вначале о структуре и поведении альбумина судили по изменению поглощения света красителем. И. Клотц [281,282] использовал метиловый оранжевый и другие красители - органические кислоты с отрицательным зарядом. В дальнейшем С. Чегер [207] редложил достаточно простой метод количественного определения связывающей способности альбумина в образцах сыворотки крови человека Согласно С.Чегеру, к сыворотке добавляют краситель-анион конго красный. После выдерживания ее в течение нескольких часов альбумин агрегирует, образовавшиеся агрегаты альбумина отфильтровывают и измеряют количество связанного с альбумином красителя. Этот метод был использован для исследования изменений связывающей способности альбумина при ряде заболеваний человека [207]. По мере появления приборов, регистрирующих слабые потоки люминесцентного света, стали использовать и флуоресцентные красители. Флуоресценция гораздо более чувствительна к изменениям окружения молекулы красителя, чем поглощение света, и имеет ряд других особенностей, благодаря которым флуоресцентные красители приобрели большое распространение в исследовании белков [63,98]. Краситель может быть связан с белком ковалентно (необратимо) благодаря химической связи или нековалентно (обратимо) благодаря слабым гидрофобным и электростатическим взаимодействиям. Первую группу обыч25 но называют «метками», вторую - «зондами». В 1952 году Г. Вебер впервые применил флуоресцентную метку [350], а Д. Лоуренс - флуоресцентный зонд [293] для изучения структуры альбумина. Выяснилось, что зонды прекрасно чувствуют перестройки в альбумине, которые не показывают метки, то есть зонды являются более чувствительным индикатором конформационных и других перестроек в белковой молекуле, чем метки. Активное использование флуоресцентных зондов для изучения структуры белков началось с 1965 года [26,55,59]. Наиболее подробно исследовано взаимодействие с альбумином отрицательно заряженного зонда 1- анилинонафталин – 8 – сульфоната (АНС). Имеется около пяти центров связывания АНС с бычьим альбумином [225]. При взаимодействии АНС с человеческим альбумином (ЧСА) наблюдается два-три центра, которые имеют более высокую константу связывания. Попадая в эти центры, молекула АНС оказывается в жестком окружении, а ее аминогруппа полностью скрыта от молекул воды [127]. Примерно 90% флуоресценции АНС в ЧСА происходит именно из этих центров. Остальные 2-3 - центра связывают АНС слабее, и в них зонд частично доступен воде [173]. В 1970-1972 г.г. были предложены новые - незаряженные флуоресцентные зонды для исследования структуры альбумина: диметиламинохалкон (ДМХ) и 3 – метоксибензатрон (МБА)[58]. Они оказались гораздо более чувствительными к перестройкам молекулы альбумина, вызванным изменениями рН, чем использовавшийся до этого зонд АНС [173]. Незаряженный зонд ДМХ связывается с двумя-тремя центрами альбумина. Подобно АНС, он попадает в жесткое окружение и скрыт от молекул воды. Молекула ДМХ контактирует в этих центрах с двумя остатками тирозина, расположенными вблизи поверхности белковой глобулы [64]. Такой контакт с фенольными группами тирозина приводит к частичному тушению флуоресценции ДМХ. При переходе от рН 7 к рН 9 (переход N-В ) эти два остатка тирозина ионизируются: один становится отрицательно заряженным к рН= 9, второй 26 к рН 10,5. Остальные 16 остатков тирозина ионизируются только при рН 10,5. В результате ионизации первых двух остатков тирозина они выходят на поверхность белка, оставив ДМХ в глубине центра связывания, их тушащее влияние уменьшается, а интенсивность флуоресценции ДМХ возрастает. В свою очередь, ДМХ перестает влиять на круговой дихроизм этих остатков тирозина [64]. Дальнейшее увеличение рН приводит к разрыхлению белковой молекулы, что видно по снижению флуоресценции ДМХ, который становится доступным тушащему действию молекул воды. При снижении рН от 7 к 3 (переход N-F) центры связывания разрыхляются, в них проникает вода и тушит флуоресценцию ДМХ. 1.2. Флуоресцентный метод определения связывающей способности сывороточного альбумина Классификация методов исследования альбумина и его связывающих свойств предложена в монографии [112]. Выделяют две большие группы методов изучения связывания лигандов с белками. К первой относятся методы, позволяющие непосредственно определить концентрацию свободного и связанного с белком лиганда (все разновидности диализа, электрофорез, ультрацентрифугирование, хроматография). Это так называемые - «прямые» методы. Они позволяют, например, разделить связанную и несвязную с альбумином форму лекарства. Вторая группа основана на регистрации изменений физико-химических параметров, отражающих процесс взаимодействия специфического или тестового лиганда с альбумином. Она включает абсорбционную спектрофотометрию, собственную флуоресценцию альбумина, триболюминесценцию, электронный парамагнитный резонанс, ядерный магнитный резонанс, дисперсию оптического вращения и круговой дихроизм, спектроскопию комбинационного рассеяния и микрокалориметрию. Все выше перечисленные методы являются «непрямыми». Они используются для регистрации изменения конформации альбумина, состояния его окружения и т.д. при связывании лигандов. Непрямые методы помимо выводов о связывающей 27 способности альбумина позволяют сделать выводы о самой молекуле белка, ее структуре, физико-химическом состоянии центров связывания [6,144,160,208]. Многочисленные экспериментальные и клинические данные говорят о том, что, как правило, при патологии альбумин хуже связывает лиганды, чем в норме [4,6,7,66,81,82,106,123,126,153,154,162,167,177,183,206]. Изменение связывающей способности альбумина (ССА) очень часто сопровождает острые, стремительно развивающиеся состояния [39,49,69,153,154,155,193, 198,207,215,217,345,355]. Это требует быстрого проведения оценки связывающей способности альбумина. Такие методы как диализ, ультрацентрифугирование занимают много времени. Широко используемый метод С. Чегера с абсорбционным красителем конго красным требует около суток [207]. Методы электронного и ядерного магнитного резонанса в настоящее время слишком дороги и сложны для широкого клинического применения. И только методы, не требующие выделения альбумина - спектрофотометрия, флуоресцентная спектроскопия и микрокалориметрия могут удовлетворить в настоящее время требованиям быстроты и относительной дешевизны [6,7]. Молекула ЧСА, будучи небольшой по размеру, не имея специальных рецепторов для связывания того или иного лиганда, имеет небольшое число центров связывания для лигандов (центры I-го и II-го типа) [63]. Механизмы такой универсальности до конца не ясны. Однако именно эта универсальность позволяет, хотя и приблизительно, свести все многообразие связывающих способностей альбумина к оценке состояния одного-двух «центров связывания». Иными словами, можно предполагать, что если известна ССА по отношению к какому-нибудь лиганду у здоровых лиц, то изменение связывания этого лиганда при заболеваниях будет в целом соответствовать изменению ССА по отношению к большинству других лигандов. Если учесть это, задача оценки ССА сводится к выбору «среднего» тестового лиганда, то есть лиганда, не выполняющего специальных функций по отношению к альбуми28 ну, связывание которого с альбумином можно оценить прямо в сыворотке, не выделяя альбумин, наиболее быстрым и простым способом. С этой точки зрения на роль тестового лиганда более всего подходит флуоресцентный зонд. 1.2.1. Флуоресцентный зонд К-35 для исследования альбумина По мере развития исследований, посвященных проблемам свойств связывающих центров сывороточного альбумина появлялись все новые и новые флуоресцентные зонды для их изучения. С точки зрения потенциального клинического применения особый интерес представляли те зонды, которые в сыворотке крови способны избирательно флуоресцировать именно из альбумина, в то время как в сыворотке находится множество других белков. Оказалось, что далеко не все зонды, применяемые для изучения выделенного альбумина, могут быть использованы на цельной сыворотке или плазме крови. Д. Лоуренс в своих первых работах показал, что АНС в сыворотке крови человека флуоресцирует главным образом из альбумина [296]. В 19871988г.г. Р.К. Айдыралиевым [4] были проведены исследования по отбору из всего спектра имеющихся флуоресцентных красителей веществ, флуоресценция которых в сыворотке была бы обусловлена главным образом альбумином. Он отобрал несколько веществ, в том числе краситель под условным названием «К-35», с целью найти такой краситель, который был бы более чувствителен к связыванию альбумином различных лигандов, чем АНС. Далее Ю.И. Миллер [129] провел работу по выявлению такого красителя из группы, отобранной Р.К. Айдыралиевым, который был бы наиболее чувствителен к связыванию альбумином различных лигандов. Наиболее чувствительным оказался краситель под условным названием «К-35». При добавлении к альбумину лекарственных препаратов - маркеров центров связывания I и II -интенсивность флуоресценции К-35 снижалась в несколько раз сильнее, чем флуоресценция АНС [173]. 29 Эти два обстоятельства - избирательная флуоресценция из альбумина в сыворотке крови и наиболее высокая чувствительность к связыванию альбумином лигандов - послужили основанием для дальнейшего изучения зонда К-35. Флуоресцентный зонд К-35 (карбоксифенилимид диметиламинонафталинкарбоновой кислоты) синтезирован Б.М. Красовицким, Л.И. Кормиловой и И.Т. Ермоленко (НПО «Монокристалреактив», г. Харьков, Украина). Он содержит карбоксильную группу, которая в воде при рН 7,4 несет отрицательный заряд [64]. В сыворотке крови зонд флуоресцирует с максимумом спектра флуоресценции в области 515 нм. При разделении сыворотки на фракции значительная флуоресценция наблюдается во фракции альбумина в отличие от фракции липопротеинов, где зонд флуоресцирует очень слабо, так же как и в буферном растворе без белков. Добавление к фракции альбумина глобулинов не отражается на флуоресценции. Следовательно практически весь флуоресцентный сигнал К-35 в сыворотке обусловлен молекулами зонда, связанными с альбумином [64]. Зонд К-35 гораздо более чувствителен к альбуминовым аномалиям, чем АНС. После импульсного возбуждения флуоресценция К-35 в альбумине затухает согласно выражению: F(t) / F(0) = A1*exp( -t/t1) + A2*exp( -t/t2) , где F(o) и F(t) - интенсивность флуоресценции в первый момент и через время t пoсле импульсного возбуждения, t1 = 8,3±0,2 нсек, t2 = 2,1±0,2 нсек, А1/(А1 ± А2) = 0,23 ± 0,03. Это означает, что молекулы зонда, связавшиеся с альбумином и флуоресцирующие там, можно разделить на две группы: около 23% из них связаны с центрами где зонд недоступен воде, а остальные 77% находятся в центрах, где флуоресценция зонда тушится, и, скорее всего, причиной тушения является проникающая к ним вода. Зонд К-35 реагирует и на маркеры центра I (фенилбутазон), и на маркеры центра II (иопановая кислота) [63]. Исследования связывания зонда К-35 с альбумином и характера излучаемой им флуоресценции [133] показали, что снижение ЭКА по отношению 30 к ОКА является следствием изменений структуры связывающих центров молекулы альбумина. Особенность флуоресцентного зонда состоит в том, что он способен регистрировать даже такие малые, локальные конформационные изменения, которые затрагивают лишь связывающий центр: даже смещения одного или нескольких атомов на доли ангстрема могут отразиться на флуоресценции. Большинство других структурных физических методов не обладают такой чувствительностью. Кроме того, другие методы требуют выделения альбумина из сыворотки, тогда как флуоресцентный зонд «работает» прямо в сыворотке. 1.2.2. Параметры связывания флуоресцентного зонда К-35 альбумином в сыворотке крови Преимущество флуоресцентных зондов состоит в том, что в воде они не флуоресцируют, а при связывании с альбумином (или другими биологическими молекулами, для исследования которых данный зонд предназначен) флуоресценция резко возрастает [56,258]. При этом источником флуоресценции являются практически только те молекулы зонда, которые связаны с альбумином. Самым простейшим случаем взаимодействия зонда с биологической молекулой является случай, когда в биологической молекуле есть только один центр или один тип центров связывания, и все центры во всех молекулах совершенно одинаковы. В этом случае интенсивность флуоресценции связанного с ним зонда пропорциональна концентрации связанного зонда. Однако на самом деле ситуация не является такой простой: взаимодействие К-35 с альбумином не удается представить простой моделью одинаковых центров, оно сложнее. В подобной ситуации интенсивность флуоресценции может быть уже не пропорциональна количеству связанного зонда. Для того, чтобы измерить параметры связывания зонда в таких сложных ситуациях, до недавнего времени приходилось использовать другие – не флуоресцентные – методы определения связывания, прежде всего диализ (достаточно сложный и трудоемкий метод). 31 Предложенный недавно флуоресцентный метод определения параметров связывания зондов с биологическими молекулами прост в исполнении [42,47,48]. Для его реализации, как уже говорилось выше, выпущены специальные наборы реактивов. В сыворотке крови здоровых лиц интенсивность флуоресценции К-35 пропорциональна общей концентрации альбумина (ОКА), так что по ее величине можно определить ОКА. Однако у практически здоровых людей иногда, а у больных – очень часто получается более низкая интенсивность флуоресценции: она ниже, чем ОКА. В связи с этим данная величина была названа “эффективной концентрацией альбумина” (ЭКА). Под этим понимается некий эквивалент нормального “здорового” альбумина. У здоровых людей обычно ЭКА близка к ОКА, тогда как у больных величина ЭКА, как правило, ниже, чем ОКА. Молекула К-35 имеет анионную группу при рН 7,4, благодаря которой К-35 растворяется в воде. Максимум спектра поглощения в воде составляет 430 нм, молярная экстинкция в этом максимуме близка к 10750 М-1 см. Квантовый выход флуоресценции раствора К-35 в воде при рН 7,4 очень низок и близок к 0,002 0,001. Это объясняется, очевидно, тушащим действием молекул воды на флуоресценцию К-35. Возможно, тушение происходит благодаря взаимодействию молекул воды с аминогруппой или карбонилом молекулы К-35 (подобно другим зондам: АНС тушится благодаря аминогруппе, а ДМХ – благодаря карбонилу, на который происходит перенос с аминогруппы в возбужденном состоянии) [63]. При добавлении в воду сыворотки крови интенсивность флуоресценции К-35 возрастает в десятки раз. При этом только альбуминовая фракция сыворотки способна вызвать столь значительный рост интенсивности флуоресценции К-35. Как известно в суммарной сыворотке около 95-97% флуоресценции обусловлено молекулами К35, связанными с альбумином. Вероятно, при связывании с альбумином молекула зонда скрывается от воды, благодаря чему интенсивность флуоресценции так сильно растет. Квантовый выход флуоресценции связанного зонда при молярном соотношении связанный зонд/альбумин менее 1 равен 32 0,120,02 в сыворотке, разведенной 1:40. При более сильном разведении сыворотки выход заметно снижается, и при разведении 1:600 его величина ниже примерно на 30% [257]. В растворе сыворотки крови альбумин находится в молярной концентрации А. Если к этому раствору добавить К-35 до конечной концентрации а, то часть зонда свяжется с альбумином. Концентрация связанного зонда обозначается r. Соотношение числа молекул связанного зонда /альбумина равно r/а. Зависимость r от a позволяет оценить параметры связывания зонда К-35 с альбумином в сыворотке крови. Формально концентрация заполненных центров r может возрасти до 5,5 мкМ при концентрации альбумина 2,4 мкМ. Следовательно, среднее количество центров не ниже 2,20,4 на молекулу альбумина. Вместе с тем, точность измерения величины r достаточно высока только до определенных концентраций зонда, а при более высоких концентрациях резко ухудшается. Поэтому была предложена другая оценка концентрации центров по следующей формуле (индексами показаны номера точек): N =r9+(F13-F9)/[(F9—F7)]=(4,90,3) мкМ При концентрации альбумина 2,40,1 мкМ эта оценка дает 2,00,3 центров связывания К-35 в среднем на одну молекулу альбумина. А поскольку удельная флуоресценция связанного зонда К-35 по мере заполнения центров снижается, данная оценка является несколько заниженной. Соответствующая поправка приводит к величине N=5,4 мкМ или 2,2 центра на молекулу альбумина. Если все центры связывания обладают одинаковыми связывающими свойствами, то можно оценить константу связывания: в средней точке кривой титрования, при около 5 мкМ. К= r/[(а-r) x (N-r)]=(4,20,6) x 105 M-1 При этом полученные величины числа центров и константы связывания не могут служить доказательством существования совершенно одинаковых центров связывания, то есть в молекуле альбумина центры связывания 33 не эквивалентны. На сегодняшний день выделяют две гипотетические модели подобных центров. Первый вариант такой гетерогенности – два типа центров связывания. Первый имеет более высокую константу связывания, и квантовый выход флуоресценции в нем выше средней величины (выше 0,12). Второй имеет более низкую константу связывания и низкий выход флуоресценции, не превышающий 0,03. Вначале зонд заполняет преимущественно центры первого типа, а по мере их насыщения – зондом начинают заполняться и центры второго типа. Второй вариант - связывание обеих молекул К-35 в одном и том же центре и «двойной емкости». Первая молекула К-35 хорошо флуоресцирует, но при появлении второй молекулы К-35 флуоресценция снижается. Либо одна молекула зонда лучше защищена от воды, чем две, либо возможно непосредственное электронное взаимодействие двух молекул, приводящее к тушению флуоресценции. Существуют и другие гипотетические модели, однако из-за отсутствия достаточных экспериментальных данных сложно отдать предпочтение какой-либо из них Еще в работах ряда авторов [127,130,133,135], заметивших снижение связывания ряда красителей с альбумином при некоторых заболеваниях, введено понятие «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА): если альбумин частично потерял способность связывать краситель, то можно полагать, что его «эффективная» концентрация как белка, переносящего гидрофобные лиганды, как бы снижена, и параметр ЭКА становится ниже, чем концентрация самих молекул альбумина в плазме крови. Величину ЭКА стали выражать в виде концентрации «функционально полноценного» альбумина, то есть в г/л. При этом полагали, что у здоровых людей ЭКА представляет собой общую концентрацию альбумина (сокращенно ОКА), измеряемую общепринятыми методами и выраженную в г/л. Таким образом, у здоровых людей ЭКА приблизительно равна ОКА, а при нарушениях связывающих свойств альбумина ЭКА не равна ОКА. Было замечено также, что, как правило, при заболеваниях ЭКА становится ниже 34 ОКА, то есть ЭКА< ОКА. Между тем эта терминология была перенесена в предшествующих работах и на зонд К-35 [127,130,131]. Кроме того, был введен относительный параметр 100 х ЭКА/ОКА, который отражает величину ЭКА/ОКА в процентах [60]. Этот параметр характеризует степень нарушений свойств связывающих центров молекулы альбумина при заболевании. Он уже не зависит от концентрации альбумина в сыворотке (плазме), в отличие от параметра ЭКА, который реагирует как на нарушения в молекуле альбумина, так и на саму концентрацию альбумина. Кроме того, было показано, что если снижение флуоресценции зонда происходит в результате конкуренции с метаболитами, занимающими альбуминовые центры, то можно ввести параметр ИТ, названный «индексом токсичности» [60]. ИТ - универсальное отношение, отражающее степень заполнения тканевых центров различными токсическими веществами, поэтому оно и названо индексом токсичности ИТ: ИТ = ОКА/ЭКА - 1 Чем выше ИТ, тем больше токсического лиганда уходит в ткани, вместо того чтобы метаболизироваться печенью. Таким образом, если параметры ЭКА, ОКА и ЭКА/ОКА характеризуют альбумин, то индекс ИТ относится к организму в целом. Таким образом, в результате проведения флуоресцентного теста измеряются два прямых показателя – ОКА и ЭКА – и два производных показателя - ЭКА/ОКА и ИТ. Клинические исследования показали, что в различных ситуациях удобно использовать либо одни, либо другие из этих четырех. 1.2.3. Флуоресцентный способ определения общей и эффективной концентрацией альбумина сыворотки крови Общая концентрация альбумина сыворотки (ОКА) - важный клиниколабораторный параметр, и для его определения существует ряд методов. Это - фотометрические, электрофоретические, иммунологические методы. Из фотометрических методов используют измерение оптической плотности ве35 ществ, образующих с альбумином окрашенный комплекс. В качестве красителей применяют бромкрезоловый зеленый (БКЗ), бромкрезоловый пурпурный (БКП), метиловый оранжевый, натриевую соль 2-4-(оксиазобензол) бензойной кислоты, бромфеноловый голубой и др. Наиболее специфичными и чувствительными являются методы с БКЗ и с БКП, утвержденные в качестве унифицированных [35,96]. Еще до появления методов, основанных на поглощении света БКП и БКЗ, предпринимались попытки разработать флуоресцентный метод определения альбумина, поскольку флуоресцентные методы обычно в 100 и более раз чувствительнее абсорбционных . В 1952 г. Д. Лоуренс обнаружил краситель АНС (1-анилино-8-нафталинсульфонат), интенсивность флуоресценции которого в сыворотке коррелировала с концентрацией в ней альбумина [294]. Однако серьезным мешающим фактором в случаях желтухи оказался билирубин, и метод не получил распространения. Позднее в лаборатории биофизических методов диагностики (НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, г. Москва) были найдены условия, при которых АНС менее чувствителен к индивидуальным вариациям состава сыворотки при патологии [4]. Затем был найден другой флуоресцентный зонд, получивший условное название «К-33», флуоресценция которого из сыворотки еще менее чувствительна к действию мешающих факторов [127, 134]. Это достигалось не только особенностями молекулы К-33, но и снижением рН измеряемой пробы до 4, когда альбумин переходит из N-конформации в F-конформацию. В дальнейшем был предложен метод определения общей концентрации альбумина, в котором применен специальный флуоресцентный зонд К-35 [88]. Использование К-35, проведение измерений при рН 4 в присутствии детергента бридж-35 позволили практически устранить действие факторов, мешающих количественному определению альбумина в сыворотке крови. Данный метод тесно связан с методом определения свойств связывающих центров альбумина, экспериментальное и клиническое обоснование которого содержится в работах [62,124,127,129,130,138]. По своим аналитическим ха36 рактеристикам - правильности и воспроизводимости - он не уступает методу с бромкрезоловым пурпурным и, возможно, превосходит его по устойчивости окраски образующегося комплекса [158]. 1.3. Изменения свойств связывающих центров сывороточного альбумина при патологии Заболевания различной природы сопровождаются разнообразными тяжелыми метаболическими нарушениями, в том числе белкового обмена, и выраженной эндогенной интоксикацией [5,9,15,20,21,24,31,33,34,36,50,66,69, 75,86,103,104,107,110,115,116,118,119,140,170,175,185,186,192,205,212,232,24 3,279,280]. Эндогенную интоксикацию (ЭИ) рассматривают как один из универсальных механизмов патогенеза различных заболеваний, который включает выход в кровь из патологического очага токсических продуктов, их распространение по организму с током крови и воздействие на другие органы и ткани [16,22,24,30,52,118,156,168,194,196,245,249,252,311,328,341,354]. До настоящего времени основное внимание при оценке ЭИ уделяли определению токсемии, или содержанию токсинов в плазме крови. При этом наибольшее распространение в клинике получило измерение молекул средней массы (МСМ) – пептидных компонентов с молекулярной массой 500 – 5000 Да, образующихся в процессе протеолиза в поврежденных тканях и регистрируемых по УФ – поглощению депротеинизированной плазмы [71]. Очевидно, однако, что развитие патологических нарушений в организме при интоксикации будет зависеть от баланса двух противоположно направленных процессов – скорости образования и выхода в кровь эндотоксинов, с одной стороны, и элиминации (детоксикации) этих веществ, осуществляемой защитными системами организма, с другой стороны [29]. Под защитой организма от токсических соединений обычно подразумевают иммунную систему, роль которой важна. Однако иммунная система обеспечивает элиминацию только высокомолекулярных чужеродных веществ с молекулярной массой не менее 5000 Да, а на низкомолекулярные соедине37 ния иммунный ответ не вырабатывается. Элиминацию низкомолекулярных токсинов из крови обеспечивает другая защитная система, представленная транспортными белками крови (альбумином, липопротеинами низкой плотности и α – 1 – кислым гликопротеином, или орозомукоидом), которые эффективно сорбируют как токсины, так и другие низкомолекулярные лиганды [111]. Сывороточный альбумин играет центральную роль в этом процессе, так как обладает уникальной способностью к связыванию большего числа лигандов, отличающихся по своей структуре, в том числе эндогенных метаболитов, гормонов и лекарственных препаратов [6,17,18,129,132,137,171,216, 237,253,286]. Обратимое взаимодействие лиганда с альбумином по форме и биологическому смыслу весьма близко к реакции антиген-антитело: этот процесс стереоспецифичен, носит обратимый характер и обеспечивает направленный транспорт токсина в ткани, где происходит его необратимая инактивация [113]. Таким образом, эффективность защиты организма от низкомолекулярных токсинов можно оценить по способности альбумина к связыванию лигандов. Методический подход к определению связывающей способности альбумина (ССА) по измерению сорбции специального маркера – флуоресцентного зонда был разработан Г.Е. Добрецовым совместно с сотрудниками [48,129,132,292]. Согласно изложенному выше, сывороточный альбумин является важным звеном биохимической перестройки организма в условиях патологических ситуаций, благодаря своей функции переносчика разнообразных эндогенных и экзогенных соединений. При патологии этот белок претерпевает изменения и приобретает новые, не свойственные нативному белку физикохимические свойства [6,7,11,12,186,145,180,181,191,192]. Течение и исход многих интоксикаций существенным образом зависит от состояния транспортных функций сывороточного альбумина. [17,40,57,147,193,194,196,203]. Именно этому белку принадлежит ведущая роль в связывании гидрофобных токсинов и их доставки к местам детоксикации – биотрансформации. 38 Поступление в организм избыточных концентраций экзотоксинов и увеличение концентрации продуктов метаболизма при эндогенной интоксикации приводит к блокированию или аллостерическим изменениям комплексообразующей способности, и тем самым, нарушению транспортной функции альбумина. Тот факт, что при нарушении нормальных функций организма часто снижается способность альбумина связывать низкомолекулярные лиганды, был показан многократно различными методами, в частности, с помощью флуоресцентного зонда К-35 [53]. Эффект снижения связывания веществ с альбумином при некоторых заболеваниях, с одной стороны, объясняется падением концентрации общего альбумина в крови. Содержание самого альбумина снижено при ожогах, ране, энтеропатиях, сепсисе, панкреатите, травме, гепатите, циррозе печени, почечной недостаточности и др. [66,122,129,132,176,199,200,202,209,210,228,229,234,303]. Кроме снижения концентрации альбумина в крови, снижается способность каждой молекулы альбумина связывать вещества, поскольку альбумин уже загружен ингибиторами. Концентрация ингибиторов связывания (т.е. веществ, которые, соединяясь с альбумином, препятствуют связыванию с ним других веществ) повышена при целом ряде заболеваний. К таким ингибиторам относятся жирные кислоты, производные аминокислот, билирубин. Обе причины - и снижение концентрации альбумина в крови, и снижение его транспортной способности в результате действия ингибиторов приводят к одному результату ЭКА уменьшается. Другими словами, часть центров альбумина блокируется. И хотя общая концентрация альбумина (ОКА) может оставаться в пределах нормы, связывающая способность центров альбумина как транспортного белка заметно снижена [132]. Как уже говорилось выше, одна из главных причин блокирования центров состоит в заполнении альбумина такими лигандами, как, например, билирубин. Однако оказалось, что хотя при гипербилирубинемии флуоресцентные зонды всегда показывают значительное снижение ЭКА и индекса 39 ЭКА/ОКА, количественной связи между концентрацией связанного с альбумином билирубина и степенью блокирования альбуминовых центров нет [128]. То есть билирубин - не единственная причина блокирования центров [61,137]. Более того, снижение ЭКА и индекса ЭКА/ОКА наблюдается и при других патологических состояниях, не сопровождающихся гипербилирубинемией. Известны другие низкомолекулярные лиганды, занимающие центры альбумина, например, при патологии почек [129,165]. Не исключается также возможность того, что какие-то компоненты плазмы крови могут адсорбироваться на альбумине вблизи центров связывания, «аллостерически» снижая его способность связывать низкомолекулярные лиганды в специфические центры [6]. Механическая желтуха, гепатит, другие заболевания гепатобиллиарной зоны - состояния, при которых печень не справляется со своей детоксикационной функцией [141,149,329]. Это проявляется, в частности в том, что гепатоциты не способны перерабатывать все метаболиты, доставляемые из крови альбумином. Недостаточностью функции печени полностью объясняются изменения белкового спектра и накопления в организме некоторых неэкскретированных или неметаболизированных веществ в период заболевания гепатитом. Многие тяжелые и критические состояния часто не сопровождаются изменением традиционно измеряемых в клинике биохимических параметров крови, в то время как происходят весьма сильные нарушения ЭКА и ЭКА/ОКА. Поэтому измерения этих показателей, наряду с определением сдвигов лейкоцитарной формулы крови или содержания среднемолекулярных пептидов, может служить информативным критерием тяжести состояния больного. Таким образом, на сегодняшний день имеется достаточное число публикаций отечественных и иностранных авторов о существенной роли в патогенезе многих заболеваний эндогенной интоксикации. Однако, несмотря на 40 традиционный интерес клиницистов к проблеме эндотоксикоза при различных патологических ситуациях, многие аспекты его патогенеза до настоящего времени остаются не исследованными. Вместе с тем синдром ЭИ является непосредственной причиной летального исхода у различных категорий больных [6,7,136,198,204]. Согласно литературным данным [6,7,198], одним из факторов развития эндогенной интоксикации считается снижение связывающей способности альбумина. На протяжении уже почти 50 лет в литературе встречаются сведения о том, что свойства связывающих центров альбумина могут заметно изменяться при нарушениях функций организма. Такие изменения свойств связывающих центров альбумина показаны главным образом с помощью специальных тестовых молекул, напоминающих по структуре природные лиганды, транспортируемые альбумином. Приоритет в этом направлении занимают флуоресцирующие молекулы («Флуоресцентные зонды») и среди них в последние годы – разработанный российскими учеными зонд К-35 [88,127,130]. Интенсивность флуоресценции зонда К-35 в плазме (сыворотке) крови больных различными заболеваниями может снижаться на десятки процентов и даже в несколько раз, в то время как общая концентрация альбумина не испытывает столь значительных изменений и часто остается в пределах нормы [6, 7]. Однако имеющиеся в литературе сведения об изменении свойств связывающих центров сывороточного альбумина являются недостаточно полными. На сегодняшний день остаются не вполне ясными многие аспекты изменений свойств связывающих центров альбумина при заболеваниях, связанные с механизмом и клиническими возможностями данного теста. Несмотря на большое внимание к вопросам, касающимся физико-химических свойств альбумина при заболеваниях различного генеза, до настоящего времени практически не была изучена динамика изменений флуоресцентных показателей у различных категорий больных, ее взаимосвязь с характером те41 чения патологического процесса. Также не решены вопросы объективизации оценки тяжести состояния больных заболеваниями различного генеза и прогноза. В связи с изложенным выше, нам представляется существенным исследовать параметры, характеризующие свойства связывающих центров альбумина у больных заболеваниями различного генеза, в том числе в динамическом режиме. Кроме того, представляется важным сравнить вклад флуоресцентных и общепринятых клинико-лабораторных параметров в оценку состояния различных категорий больных, их диагностическую и прогностическую информативность. Интерес представляет и анализ влияния различных факторов на свойства связывающих центров сывороточного альбумина, а также изучение аналитических возможностей метода флуоресцентных зондов. Изучению этих и других нерешенных вопросов посвящена настоящая работа. 42 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Состав и характеристика обследуемых групп больных Работа основана на результатах динамического исследования параметров, характеризующих свойства связывающих центров сывороточного альбумина, а также других клинико-лабораторных показателей у 237 больных распространенным перитонитом, у 35 больных панкреонекрозом, у 36 – сепсисом, у 31 – холангитом, находившихся на лечении в Городской клинической больнице скорой медицинской помощи (ГКБ СМП), Городской клинической больнице (ГКБ) № 1 и ГКБ № 7 г. Екатеринбурга с июня 1998 года по октябрь 2000 года. Кроме того, флуоресцентные показатели изучали у больных гепатитом, циррозом, панкреатитом, пиелонефритом, гломерулонефритом и лейкозом. Образцы сыворотки крови этих больных были получены в ГКБ №40 и Областной клинической больнице (ОКБ) №1 г. Екатеринбурга. Средний возраст пациентов и их количество в группах представлены в таблице 2.1.1. Группу сравнения составили 198 практически здоровых лиц (96 мужчин и 102 женщины, средний возраст 43,03,0 лет). Данный контингент был разбит на 6 возрастных групп. В первую группу были включены лица в возрасте до 25 лет, вторую группу составила категория людей 26-35 лет, третью 36-45 лет, четвертую 46-55 лет, пятую 56-65 лет и шестую – старше 65 лет. В протокол лабораторных исследований образцов сыворотки крови больных с хирургической инфекцией, помимо флуоресцентных показателей, входили общий анализ крови с подсчетом числа эритроцитов, количества гемоглобина, определением лейкоцитарной формулы, СОЭ, а также биохимических показателей: концентраций билирубина, креатинина, глюкозы, мочевины, общего белка, активности аминотрансфераз и α – амилазы, электролитного состава крови. 43 Таблица 2.1.1. Группы пациентов, их количество и средний возраст в них № Группы пациентов Количество Средний возраст 1 Перитонита 237 50,22,0 2 Панкреонекроза 35 48,62,4 3 Сепсиса 36 47,42,4 4 Холангита 31 66,62,0 5 Гепатита 57 49,92,2 6 Цирроза 22 48,92,3 7 Панкреатита 56 46,63,0 8 Пиелонефрита 24 49,72,8 9 Гломерулонефрита 35 38,12,6 10 Лейкоза 20 49,73,1 11 Сравнения 198 43,0±3,0 12 Всего 751 - Из общего количества больных первой обследуемой группы перитонит аппендикулярного происхождения отмечался у 57 больных. Перитонит, вызванный патологическими изменениями толстой или тонкой кишки был у 20 больных, перфорация язвы желудка или двенадцатиперстной кишки диагностирована у 57, острый деструктивный панкреатит – у 21 человека, у 6 больных отмечен посттравматический перитонит, у 18 – перитонит, возникший как осложнение различной патологии органов брюшной полости, у 19 – в результате холецистита. Диагноз данного заболевания верифицировался на основании клинико-лабораторных данных и интраоперационно. В группе больных панкреонекрозом деструктивный характер воспаления поджелудочной железы (жировой, геморрагический, либо смешанный некроз) у всех пациентов был верифицирован интраоперационно. При этом жировой некроз наблюдался у 5 больных, у 13 – геморрагический, у 13 – смешанный некроз и у 4 больных панкреонекроз был отечной формы (мелкоочаговый панкреонекроз без признаков деструкции парапанкреатической или 44 забрюшинной клетчатки). Всем пациентам с перитонитом и гнойнодеструктивным процессом в поджелудочной железе выполнялись оперативные вмешательства, направленные на купирование воспалительных изменений в брюшной полости, парапанкреатической и забрюшинной клетчатке и самой железе. В анализируемую группу больных сепсисом вошли лица с различными видами хирургического сепсиса, возникшего при гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей и железистых органов, легких и плевры, костей и суставов, после экстренных брюшно-полостных и травматологических операций и др. Чаще всего сепсис возникал при острых гнойно-воспалительных заболеваниях (абцессы, флегмоны, гнойные раны и др.): в 55 % случаев. Группу больных острым гнойным холангитом составили 31 человек (19 мужчин и 13 женщин). Заболевания сердечно-сосудистой системы несколько чаще встречались у больных перитонитом, панкреонекрозом и сепсисом. Среди этой патологии преобладала артериальная гипертензия и ишемическая болезнь сердца, у четверти пациентов потребовалась коррекция недостаточности кровообращения. На втором месте в структуре сопутствующих заболеваний оказались болезни обмена: ожирением страдали 14% больных перитонитом, 8% больных панкреонекрозом и 13% больных сепсисом. Сахарный диабет отягощал течение хирургической инфекции в 8% случаев. Хронический пиелонефрит сопровождал заболевания в 4% случаев. В группе больных холангитом сопутствующая патология была выражена в значительно меньшей степени. Летальность среди больных перитонитом в возрасте до 50 лет составляет 11,2 %, среди больных панкреонекрозом – 31,3 % и сепсисом – 8,7 %. После 50 лет летальный исход в группе больных перитонитом возрастал и составлял 27,1 %, в группе больных панкреонекрозом – 23,5 % и в группе больных сепсисом – 20,0 %. Все лабораторные тесты у больных с хирургической инфекцией на протяжении 10 суток от начала заболевания. 45 Стандартом лечения у данных групп больных являлось назначение антибиотиков, сульфаниламидов, анальгетиков, антигистоминных средств, дезагрегантов. Для коррекции сопутствующей патологии применяли спазмолитики, глюкокортикоиды, антикоагулянты. При тяжелой интоксикации назначали инфузии объемом от 400,0 до 4000,0 мл. Группа пациентов с диагнозом вирусного гепатита В состояла из 57 человек (34 мужчин и 23 женщин). При этом у 38 человек с соответствующей патологией диагностирована хроническая форма, а у 19 – острая форма гепатита В. Диагноз верифицировался на основании клинико-лабораторных данных. Группа пациентов с циррозом печени в острой стадии с выраженной гипербилирубинемией состояла из 22 человек (19 мужчин и 3 женщин). Диагноз цирроза печени верифицировался посредством биопсии. Группу больных хроническим панкреатитом составили 56 человек (21 мужчина и 35 женщин). Группа пиелонефрита (n = 24, 8 мужчин и 16 женщин) представлена больными с различным характером воспалительного процесса в почках – острым (n = 9) и хроническим (n = 15). Группа больных хроническим гломерулонфритом состояла из 35 человек ( 17 мужчин и 18 женщин, средний возраст 41,1 ± 2,9 лет). Группа больных острым лейкозом включала 20 человек (10 мужчин 10 женщин, средний возраст 49,7±3,1 лет), среди которых острый миелобластный лейкоз наблюдался у 13 человек и острый лимфобластный лейкоз – у 7 человек. Забор крови у этой категории больных производился в момент установления диагноза и на курсах индукции, ремиссии и консолидации. Летальность в этой группе больных составила 52,9 %, при этом ранняя летальность (во время проведения химиотерапии) отмечалась у двух больных, у одного больного смерть наступила в стадии ремиссии, у 6 человек были установлены противопоказания к стандартной терапии. Сыворотку венозной крови и плазму капиллярной крови получали обычным способом и использовали для анализа в течение суток после полу46 чения крови. От момента получения до анализа сыворотку хранили при температуре -2…-80С. Контроль качества выполняемых исследований обеспечивал надежность получаемых результатов. 2.2. Методы исследования эффективной и обшей концентрации альбумина, а также параметров, характеризующих взаимодействие зонда К-35 в сыворотке крови Интенсивность флуоресценции К-35 из сыворотки крови изучали при двух условиях. При pH 4,0 и в присутствии неионного детергента интенсивность флуоресценции К-35 зависит практически только от количества молекул альбумина в пробе [132]. Эта интенсивность, выраженная в единицах концентрации, называется «общая концентрация альбумина» (ОКА) При pH 7,4 интенсивность флуоресценции К-35 из сыворотки зависит не только от его концентрации, но и от физико-химического состояния альбуминовой глобулы: присутствия лигандов (метаболитов, токсинов), ковалентной и нековалентной модификации аминокислотных остатков, конформации - т.е. факторов, изменяющихся в зависимости от состояния организма. Эту интенсивность флуоресценции также выражают в единицах концентрации (г/л) и называют «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА). Индекс ЭКА/ОКА не зависит от числа молекул альбумина в пробе и характеризует только физико-химические свойства молекулы альбумина. 2.2.1. Определение общей концентрации альбумина (ОКА) Для определения ОКА флуоресцентным методом использовали наборы реактивов «ЗОНД - АЛЬБУМИН» (НИМВЦ ЗОНД) и анализатор концентрации липидов АКЛ-01 (завод им. В.А. Дегтярева, г. Ковров) [44]. Для оценки вариации измерений параметра ОКА рассчитывали среднеквадратическое расхождение между результатами парных измерений сыворотки крови данного параметра на примере 37 образцов по формуле: S=√1/n∑(ОКА2-ОКА1)2, где n-число парных измерений. Для ОКА оно соста47 вило 1,01 г/л. 2.2.2. Определение эффективной концентрации альбумина (ЭКА) Для определения эффективной концентрации альбумина использовали наборы реактивов «ЗОНД АЛЬБУМИН» НИМВЦ "ЗОНД" и анализатор концентрации липидов АКА-01 (завод им. В.А. Дегтярева, г. Ковров) [43]. Состав и технология изготовления реактивов разработана специалистами НИИ физико-химической медицины Минздравмедпрома РФ, опытная партия наборов реактивов выпущена государственным малым предприятием «Научно -исследовательский методический внедренческий центр ЗОНД» (НИМВЦ ЗОНД). Набор предназначен для выполнения 80 определений эффективной и общей концентрации альбумина (ЭКА и ОКА) в сыворотке, плазме или капиллярной крови человека. Набор включает три реактива. Реактив 1 предназначен для приготовления раствора, используемого для разведения сыворотки, плазмы или цельной крови. Это - изотонический буферный раствор с физиологическим рН. Реактив 1 содержит антикоагулянт (ЭДТА), поэтому промывка капилляра для взятия крови рабочим раствором реактива 1 предотвращает свертывание крови в капилляре. Основным компонентом реактива 2 является флуоресцентный краситель К-35 в водном растворе. Реактив 3 предназначен для определения общей концентрации альбумина (в сочетании с реактивом 2). Запаянные ампулы с реактивами набора ЗОНД-АЛЬБУМИН хранятся в темном месте при температуре +2 ...+8ОС в течение всего срока годности набора (этот срок обозначен на коробке). Имеющиеся данные [44,45] говорят о том, что реактивы не теряют своих свойств более двух лет. Одна ампула набора рассчитана на 20 определений ЭКА и ОКА. Если проведено меньшее количество измерений, то возможно хранение уже вскрытых реактивов. Раствор реактива 1, подготовленный к использованию, может хранить48 ся при температуре +2...+8ОС не менее трех суток. Срок его хранения ограничен бактериальной заселенностью раствора, которая вызывает постепенное снижению его рН. При проведении анализа температуру раствора необходимо доводить до комнатной. Для достижения оптимальной точности анализа температура образца при проведении измерений должна составлять +23ОС. Реактив 2 и реактив 3 после вскрытия ампул, по данным независимых исследований, при ограниченном контакте с воздухом могут храниться в темном прохладном месте (в холодильнике) не менее месяца. По данным исследований [44,45,47], наблюдается хорошее соответствие величины ОКА и концентрации альбумина, определенной принятым в лабораторной практике методом с БКЗ. При этом хорошее соответствие наблюдается как для растворов изолированного альбумина, так и для сывороток больных. Результаты этих исследований говорят о высокой воспроизводимости флуоресцентного метода определения ОКА и ЭКА, стабильности применяемых реактивов при хранении в лабораторных условиях, устойчивости окраски образующихся комплексов «реактивы-сыворотка». Точность ЭКА/ОКА отмечается в результате того, что 3-й реактив добавляют в ту же пробу, в которой была измерена ЭКА, поэтому ошибки в дозировании реактивов не сказываются на результате определения ЭКА/ОКА. Для того чтобы выразить, ЭКА и ОКА в единицах г/л анализатор калибровали с помощью флуоресцентных калибраторов НИМВЦ «ЗОНД», которые весьма стабильны во времени. Среднеквадратическое расхождение между результатами парных измерений сыворотки крови для ЭКА на примере 37 образцов составило 0,91 г/л. 2.2.3. Определение квантового выхода флуоресценции К-35 в сыворотке крови При добавлении 14 мк М К-35 к раствору сыворотки в высокой концентрации (разведение 1:40, что соответствует в среднем концентрации альбумина 14 мкМ) практически весь зонд (около 95 %) связывается с альбумином. При этом интенсивность флуоресценции пропорциональна концентра49 ции зонда (a) и квантовому выходу его флуоресценции (Qb1): Fb0 = D * Qb0 * rb0, где концентрация связанного зонда (rb) примерно равна 0,95*а (то есть связано около 95 процентов зонда). D -приборная константа , которая одинакова независимо от того, какой образец сыворотки и в каких условиях измеряется. Тогда удельная флуоресценция зонда (то есть флуоресценция при 1 мкМ полностью связанного зонда) равна в данном образце сыворотки: Fо = D * Qb1 * rb/r = Fb/(0,95 * 14); Отсюда D * Qb1=Fb/13,3. Мы не определяли точную величину квантового выхода флуоресценции и оперировали только произведением D*Q, то есть определяли выход флуоресценции только с точностью до константы D, одинаковой во всех выполненных измерениях 2.2.4. Определение концентрации центров связывания флуоресцентного зонда К-35 с альбумином Другой фактор, определяющий величину интенсивности флуоресценции К-35 в сыворотке - это концентрация связывающих центров альбумина. Для того, чтобы оценить эту величину, к сыворотке, разведенной в 400 раз, добавляли последовательно 5 доз зонда К-35 до концентраций а1, а2, а3, а4 и а5. При этом интенсивность флуоресценции составляла, соответственно, F1, F2, F3, F4 и F5. Есть два способа оценить концентрацию центров связывания N' . Здесь штрихом обозначены величины концентрации центров, которые экспериментально определяются в сыворотке, разбавленной в 400 раз. Для получения концентрации центров в исходной сыворотке нужно умножить N' на 400: N=N' * 400 Первый метод основан на предположении, что при добавлении 5-й порции К-35 все доступные центры альбумина (то есть N') полностью заполнены зондом. 50 Тогда F5 D * Qb * N', откуда N=N' * 400 400 * F5/D * Qb, где величина D * Qb1=Fb/13,3 получена так, как описано выше (см. п.2.1.3.). Второй способ основан на использовании всей совокупности точек F1, F2, F3, F4, F5 и расчете N' и K методом Клотца. Он описан в следующем пункте. 2.2.5. Определение константы связывания флуоресцентного зонда К-35 с альбумином К разбавленной сыворотке 1:400 добавляли раствор К-35 до конечной концентрации а=n*2 мкМ, где n=1,2,3,4 и 5. При этих величинах концентрации а1, а2, а3, а4 и а5 измеряли соответствующие величины интенсивности флуоресценции F1, F2, F3, F4 и F5. Для уменьшения индивидуальных вариаций измеряемых значений флуоресценции их усредняли: были введены средние величины а1 и а2 и средние величины F1 и F2: а1=(а1 + а2) / 2, F1=(F1 +F2 ) / 2, а2=(а4 + а5) / 2 F2=(F4 + F5 ) / 2 Используя аппроксимационный метод Клотца [6], рассчитывали величины константы связывания (К) и концентрации центров связывания (N) следующим образом: К = А / В, где В = ((1/F1) - (1/F2)) / ((1/a1) - (1/a2)); А = (1/F2) - B(1/a2) N'= 1 / A * D * Qb0 , где D*Qb0 = F b0/13,3 (см. пункт 2.1.2) N = N' * 400 2.2.6. Определение среднего количества центров связывания в молекуле альбумина Исходя из того, что в каждом образце сыворотки крови мы измеряли как общую концентрацию альбумина (ОКА), так и концентрацию центров связывания К-35 (величина N), можно определить для каждого образца сред51 нее количество центров связывания К-35 на одну молекулу альбумина (n): n=N / (ОКА/m ), где m - молекулярная масса альбумина (г/моль), а отношение ОКА/m представляет собой молярную концентрацию альбумина. 2.3. Определение влияния метаболических факторов на флуоресценцию зонда К-35 в альбумине В альбумине имеются специальные центры связывания жирных кислот. В результате заполнения этих центров жирными кислотами они оказывают аллостерическое влияние на параметры центров, связывающих билирубин или флуоресцентные зонды [6]. Мы исследовали влияние стеариновой кислоты на флуоресценцию К-35 в сыворотках больных. В пунктах 2.2.4 и 2.2.5 описан опыт, когда к 2 мл сыворотки "1:400" добавляли 20 мкл раствора 200 мкМ К-35 и измеряли интенсивность флуоресценции, обозначенную как F1. В специальной серии экспериментов альбумин вначале обрабатывали раствором стеариновой кислоты в этаноле 0.16 мМ, а уже затем к нему добавляли К-35: к 2 мл сыворотки "1:400" добавляли 50 мкл раствора стеариновой кислоты 0,16 мМ (до молярного соотношения кислота/альбумин=1,1/1). Затем добавляли 20 мкл раствора 200 мкМ К-35 и измеряли интенсивность его флуоресценции (F1с). Затем добавляли стеариновую кислоты до молярного соотношения 5,5/1 и измеряли флуоресценцию К-35 (F2с). Параллельно проводили такое же измерение пробы, к которой не добавлялась жирная кислота (в ней интенсивность флуоресценции обозначена как F1). Таким образом, имеется три различные величины интенсивности флуоресценции 2 мкМ К-35 в разведенной сыворотке (1:400): -зонд добавлен к необработанной сыворотке (F1); -зонд добавлен к сыворотке, к которой предварительно добавили стеариновую кислоту (F1c); 52 -после предыдущей процедуры к сыворотке, уже содержащей зонд и стеариновую кислоту, дополнительно добавлена стеариновая кислота (F2c). Исследовали влияние спирта, в котором добавляли стеариновую кислоту, на результаты измерений. Для этого в 10 образцах сыворотки крови больных перитонитом и 10 образцах сыворотки крови здоровых лиц проводили такие же измерения, какие описаны в случае со стеариновой кислотой, но вместо стеариновой кислоты в спирту добавляли только спирт. Исследования влияния спирта на результаты измерений в данном опыте показали, что сам спирт не влияет на флуоресценцию К-35. Для исследования влияния мочевины к 2 мл сыворотки “1:400” добавляли 50 мкл раствора мочевины 20 мМ, затем 20 мкл раствора 200 мкМ К-35 и измеряли интенсивность его флуоресценции. Влияние молекул средней массы (МСМ) на флуоресценцию К-35 оценивали по результатам изучения колрреляционной зависимости параметра ЭКА/ОКА, выраженного в процентах от концентрации МСМ в исследованных образцах сыворотки крови. 2.4. Определение других лабораторных параметров в образцах сыворотки крови обследуемых групп больных Билирубин в сыворотке крови определяли по диазореакции в присутствии кофеинового реагента с помощью наборов реактивов фирмы БиоЛАСНЕМА - Теств (Брно). Активность аминотрансфераз АсАТ-АлАТ определяли методом Райтмана-Френкеля с помощью наборов реактивов Био-LACHEMA – Тест, Брно. Креатинин в сыворотке крови определяли по реакции с пикриновой кислотой с помощью наборов реактивов Био-LACHEMA – Тест, Брно. Глюкозу в сыворотке крови определяли глюклзлоксидазным методом с помощью наборов реактивов Био-LACHEMA – Тест, Брно. Мочевину в сыворотке крови определяли по реакции с диацетилмоноксимом с помощью наборов реактивов Био-LACHEMA – Тест, Брно. Опреде53 ление общего белка в сыворотке крови проводили по биуретовой реакции с помощью наборов реактивов Екатеринбургского предприятия по производству бакпрепаратов. Молекулы средней массы (МСМ) в сыворотке крови определяли методом спектрофотометрии при 254 нм. Уровень МСМ выражали в условных единицах экстинкции. Содержание лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, концентрацию гемоглобина, величину гематокрита и СОЭ определяли традиционными методами [96]. Определение концентрации альбумина электрофоретическим методом проводили на агарозном геле с использованием наборов реактивов, оборудования и методики «Beckman» (Австрия) на системе Paragon. Для идентификации белкрв гелевые пластинки окрашивали голубыми красителями (8 – амино – 7 – (3 нитрофенилазо) – (фенилазо) – 1 – нафтол – 3,6 – дисульфидная кислотная натриевая соль;). Сканирование гелевых пластинок осуществляли на денситометре «Apprais» с программным обеспечением при длине волны 600 нм. При проведении электрофоретического исследования строго соблюдались условия опыта, включая разведение сыворотки, правила денсиметрирования, предложенные фирмой [2]. Для определения концентрации альбумина унифицированным методом с БКЗ использовали наборы реактивов Био – LАСНЕМА – Тест, Брно. 2.5. Статистическая обработка результатов Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с использованием пакета «Statictica». Методы статистической обработки данных включали: проверку характера распределения данных, вычисление для каждого вариационного ряда средней арифметической и показателей вариации – дисперсии, среднего квадратического отклонения [32,97]. Проверка гипотез о равенстве двух средних производилась с помощью t-критерия Стьюдента и U критерия тест Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводился с вычислением частных коэффициентов корреляции. Для сравнения величин, 54 выраженных в процентах, использовали критерий согласия 2, рассчитанный с помощью пакета «Statistica». В работе данные представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М ± m). Различия между средними величинами считались достоверными при р < 0,05. Диагностическую чувствительность (ДЧ) флуоресцентных и клиниколабораторных показателей определяли по формуле: ДЧ = ИП__*100% ИП + ЛО где ИП – истинноположительные результаты, а ЛО – ложноотрицательные. 55 ГЛАВА 3 АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА СВОЙСТВА СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ Изучение изменений свойств связывающих центров сывороточного альбумина при патологии, их патогенетической роли и возможности использовать эти показатели в клинической практике предполагают детальное представление о соответствующих величинах у здоровых людей, аналитических характеристиках метода измерения, о групповой и индивидуальной вариабельности показателей, о влиянии различных внешних и внутренних факторов на определяемые характеристики. Данные в этом отношении единичные и далеко не полные. В связи с этим были проведены специальные исследования, представленные в данной главе. 3.1. Аналитические характеристики метода флуоресцентных зондов Интенсивность флуоресценции зонда К-35 в сыворотке при измерении ЭКА (первый тест при использовании стандартной методики) [41,42] зависит главным образом от трех величин: концентрации альбуминовых центров связывания (N), константы связывания альбумином зонда (К) и квантового выхода флуоресценции (DQ) тех молекул зонда, которые связывались с альбуминовыми центрами. Воспроизводимость измерения показателей DQ, N и К была изучена на 17 образцах сыворотки крови больных с хирургической инфекцией (9 мужчин и 8 женщин, средний возраст 46,73,2 лет) и 7 – здоровых лиц (3 мужчин и 4 женщин, средний возраст 43,55,3 лет) путем независимого приготовления двух параллельных проб каждого образца сыворотки крови, к которым независимо добавляли зонд и определяли изучаемые параметры (табл. 3.1.1.). Параллельные пробы готовили и измеряли в один день. 56 Таблица 3.1.1. Параметры, ответственные за изменение флуоресценции зонда К-35 убольных с хирургической инфекцией и здоровых лиц при повторном измерении одного и того же образца Группа Показатель DQ Измерение Больных Здоровых 1 2 1 2 1 2 50,98±5,12 53,19 5,30 1,72±0,16 1,74±0,17 1,95± 0,14 1,97± 0,17 71,34±6,90 69,45±6,14 1,85± 0,17 1,84± 0,18 1,98 ±0,15 1,97 ±0,16 К (М-1) х 10-5 N (мкМ) Воспроизводимость характеризовали величиной относительного среднего квадратичного отклонения V (в процентах) от среднего арифметического значения измеряемого параметра при повторном измерении одного и того же образца. Также использовали значение среднего квадратического отклонения S (в единицах определяемого параметра). Для оценки расхождения между результатами, полученными в двух сериях (1,2) для каждого (k–го) образца внутри серии вычисляли: расхождение Dk = X1k – X2k, где X1k , X2k – среднее арифметическое значение параметра для k – го образца в 1-й и 2-ой серии соответственно; максимальное относительное расхождение: RDmax=max 2Dk___ X1k + X2k При добавлении зонда К-35 до конечной концентрации a=14 мкМ к сыворотке крови, разбавленной в 40 раз, практически весь зонд (около 95%) оказывается связанным с альбумином [273].При этом интенсивность его флуоресценции (Fb) пропорциональна концентрации связанного зонда (rb 0,95a) и выходу Q: Fb = DQxrb DQ (0,95a), откуда DQ Fb/13,3, где D – приборная константа, одинаковая независимо от того, какой и когда измеряется образец сыворотки. 57 Для оценки величин N и К проводили титрование каждого образца сыворотки, разбавленной в 400 раз зондом, концентрацию которого увеличивали пятью ступенями по 2 мкМ от 2 до 10 мкМ. Добавленным концентрациям зонда a1, a2, a3, a4 и a5 соответствовали интенсивности флуоресценции F1, F2, F3, F4 и F5. Если считать, что при 5 мкМ зонда все центры альбумина (их около 2-3 мкМ) заполнены зондом, то приближенно F5 = DQN; N(мкМ) = F5/DQ = F5/(Fb/13,3). В результате проведения вышеописанных экспериментов установлено, что среднеквадратическое отклонение между данными двух измерений квантового выхода флуоресценции в группе больных составило 1,42, а в группе здоровых лиц – 1,13. Коэффициент вариации 2,90% для больных и 1,52% для здоровых. При оценке константы связывания зонда с альбумином величина среднеквадратического отклонения составила 0,14 и 0,09, а коэффициент вариации 8,12 и 5,26% для больных и здоровых соответственно. В случае определения концентрации альбуминовых центров связывания величина среднеквадратического отклонения в группе пациентов с хирургической инфекцией равнялась 0,13, а коэффициент вариации был равен 6,89%. У здоровых лиц эти величины были равны 0,07 и 3,57%. Анализ расхождения между результатами, полученными в двух сериях, (табл. 3.1.2.) показал, что расхождение Dk при определении DQ составило 3,24 (6,48 %) и 2,93 (4,19 %), при определении К - 0,1 (5,56 %) и 0,07 (3,90 %), при определении N - 0,1 (5,29 %) и 0,08 (4,08 %) у больных с хирургической инфекцией и здоровых лиц соответственно. Максимальное относительное расхождение RDmax составило 0,06 и 0,04 при определении DQ, 0,06 и 0,04 при определении К, 0,05 и 0,04 при определении N в обследуемых группах соответственно. 58 Таблица 3.1.2. Параметры, ответственные за изменение флуоресценции зонда К-35 у больных с хирургической инфекцией и здоровых лиц в параллельных сериях измерения Группа Показатель DQ К (М-1) х 10-5 N (мкМ) Серии измерения 1 2 1 2 1 2 Больных Здоровых 51,01±5,36 47,77±4,81 1,71±0,17 1,81±0,17 1,88±0,18 1,98±0,19 73,73±3,92 70,94±3,67 1,80±0,15 1,73±0,16 1,97±0,18 1,89±0,16 Таким образом, полученные данные показывают, что измерение параметров, характеризующих свойства связывающих центров альбумина является весьма воспроизводимым. Следует отметить, что при измерении этих параметров у здоровых лиц их воспроизводимость выше, чем при аналогичных опытах с образцами сыворотки крови в группе больных. 3.2. Влияние времени суток на изменение свойств связывающих центров альбумина Для изучения влияния времени суток на изменения свойств связывающих центров альбумина образцы капиллярной крови получали у 37 больных различными заболеваниями в первой и второй половине дня трижды: (в 8, 11, 14 и 16, 19, 22 часов соответственно). В каждом из образцов измеряли эффективную и общую концентрации альбумина, на основании которых рассчитывали относительные параметры ЭКА/ОКА и ИТ. Соответствующие результаты данного исследования представлены в таблицах 3.2.1. и 3.2.2. 59 Таблица 3.2.1. Изменения флуоресцентных показателей в группе больных различными заболеваниями в течении первой половины дня (n = 31) Время 8-00 час. 11-00 час. 14-00 час. ЭКА, г/л 18,72 ± 0,45 18,55 ± 0,50 18,45 ± 0,50 ОКА, г/л 29,11 ± 1,27 28,94 ± 1,39 28,61 ± 1,41 ЭКА/ОКА, % 65,99 ± 4,96 65,38 ± 4,58 65,87 ± 4,11 ИТ 0,53 ± 0,02 0,54 ± 0,03 0,54 ± 0,03 Показатель Таблица 3.2.2. Изменения флуоресцентных показателей в группе больных в течение второй половины дня (n = 6) Время 16 – 00 час. 19 –00 час. 22 – 00 час. ЭКА, г/л 18,17 ± 1,93 18,17 ± 1,77 17,17 ± 1,77 ОКА, г/л 27,98 ± 2,14 28,45 ± 2,06 27,44 ± 2,11 ЭКА/ОКА, % 65,04 ± 5,96 64,12 ± 6,04 64,00 ± 6,10 0,54 ± 0,,6 0,56 ± 0,06 0,58 ± 0,06 Показатель ИТ Как видно из таблиц 3.2.1. и 3.2.2, параметры ЭКА, ОКА и их расчетные величины у данной категории больных в среднем по всей совокупности данных в течении изучаемого времени наблюдения каких-либо изменений не претерпевали. Изменения флуоресцентных показателей не претерпевают существенных изменений и у отдельно взятых больных: больного А., 42 г. и больного Я., 29 лет (рис.3.2.1., 3.2.2) 60 40 35 ЭКА,ОКА 30 25 20 15 10 ЭКА 5 ОКА 0 1 Часы 2 3 80 70 ЭКА/ОКА 60 50 40 30 20 10 0 ИТ 1 2 Часы 3 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 Часы 3 Рис 3.2.1. Изменения ЭКА, ОКА, ЭКА/ОКА и ИТ у больного А. в течении первой половины дня 1 – 8-00 час., 2 – 11-00 час., 3 – 14-00 час. 61 ЭКА,ОКА 40 35 30 25 20 15 10 5 0 ЭКА ЭКА/ОКА 1 Часы 2 Часы 2 ОКА 3 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 3 0,7 0,6 0,5 ИT 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 Часы Рис 3.2.2. Изменения ЭКА, ОКА, ЭКА/ОКА у больного Я., в течении второй половины дня 1 – 16-00 час., 2 – 19-00 час., 3 – 22-00 час. 62 Следовательно, показатели, характеризующие изменения свойств связывающих центров альбумина в течении дня не изменяются Таким образом, время суток не оказывает существенного влияния на параметры, измеряемые методом флуоресцентных зондов и их интегральные величины, а следовательно и оценку состояния больного, проводимую с их помощью. 3.3. Флуоресцентные показатели у здоровых лиц Исследованиями последних лет установлено, что альбуминовые показатели ЭКА и ОКА, определяемые методом флуоресцентных зондов, реагируют на различные нарушения функций организма [6,7,198]. Однако высокая чувствительность метода создает определенные проблемы с группами пациентов, принимаемыми в качестве «контрольных». Для параметра ОКА границы нормальных значений, как ожидается, должны совпадать с таковыми для концентрации альбумина, определяемой унифицированными методами. Для функционального по своему содержанию показателя ЭКА подобной аналогии нет. По определению полагается, что в группе здоровых лиц ЭКА=ОКА и ЭКА/ОКА приближается к 100%. Систематических популяционных данных о показателях определения альбумина флуоресцентным методом не существует. Поэтому весьма актуальным является накопление и анализ данных по альбуминовым показателям здоровых лиц. Было обследовано 198 человек (96 мужчин и 102 женщины, средний возраст 43,0±3,0 лет). Данный контингент был разбит на 6 возрастных групп. В первую группу были включены лица в возрасте до 25 лет, вторую группу составила категория людей 26-35 лет, третью 36-45 лет, четвертую 46-55 лет, пятую 56-65 лет и шестую – старше 65 лет. Результаты проведенных исследований показали, что концентрация альбумина во всей обследованной группе, измеренная флуоресцентным методом (ОКА), колеблется от 34 г/л до 47 г/л и в среднем составляет 40,0±2,0 г/л, что соответствует нормальным величинам, измеренным унифицирован63 ными методами [96]. Средняя величина ЭКА на 12,5% ниже ОКА и составляет 35,0±2,0 г/л (пределы колебания 29 г/л- 45 г/л). Вследствие этого среднее значение величины ЭКА/ОКА равно 0,88. При этом индивидуальные значения ЭКА/ОКА в 140 случаях из 198 были выше 0,80 и не превышали 1. Среднее значение индекса токсичности (ИТ=ОКА/ЭКА-1) равно 0,14 и только в девяти случаях он был заметно выше (ИТ=0,4). Близость значений медианы и среднего арифметического свидетельствовала о нормальном характере распределения этих показателей. Обращает на себя внимание тот факт, что величина ЭКА/ОКА у женщин в среднем достоверно ниже (р<0,001), а ИТ – выше (р<0,05), чем у мужчин: среднее значение ЭКА/ОКА - 0,84 у женщин и 0,91 – у мужчин. Границу ИТ>0,14 перешли 45,7% мужчин и 59,0% женщин. В целом полученные данные согласуются с результатам, опубликованным ранее [177] и данным биохимического анализа. Данные альбуминовых показателей в разных возрастных группах здоровых людей представлены в таблице 3.3.1. Как видно из таблицы, в первых двух возрастных группах показатели ЭКА, ОКА и их расчетные индексы наиболее приближены к «норме», предполагаемой по определению [48]. Напротив, в самой старшей возрастной группе параметры, характеризующие связывающие центры сывороточного альбумина, в наибольшей степени отклонялись от таковых, в возрастной группе до 25 лет и от значений, рекомендуемых в качестве референтных разработчиками наборов реактивов. При этом такое отклонение всех определяемых показателей происходило постепенно по направлению от первой к шестой возрастной группе. 64 Таблица 3.3.1. Флуоресцентные показатели в разных возрастных группах здоровых людей № Группа n 1 До 25 лет 58 Средний возраст 21,00,4 44,01,0 ЭКА/ОКА, % 88,11,0 0,130,01 2 26-35 лет 40 39,02,0 43,51,6 89,61,5 0,120,01 3 36-45 лет 34,00,4 34,01,0 41,01,5 83,61,0 0,190,02 4 22 49,00,5 33,52,0* 38,51,6 86,81,6 0,150,02 56-65 лет 18 61,00,5 31,01,0* 36,01,0* 84,41,5 0,190,02* Старше 65 лет 29 74,01,0 30,51,0* 37,01,0* 81,91,0* 0,230,02* ЭКА, г/л ОКА, г/л 39,01,0 30,00,4 31 46-55 лет 5 6 ИТ Примечание: * - результаты достоверны (р<0,05)относительно первой возрастной группы По-видимому, наблюдаемые закономерности, характерные для самой старшей возрастной группы могут быть связаны с такими возрастными физиологическими изменениями, как снижение метаболических возможностей печени и сердечного выброса, уменьшение максимальной частоты сердечных сокращений на фоне нагрузки, снижение почечного кровообращения, увеличение периферичекого сопротивления [87]. Существенным представляется уменьшение внутрисосудистого объема и содержания жидкости в тканях, что по-видимому, отражается на связывающих свойствах альбумина. 3.4. Сравнительный анализ методов определения альбумина сыворотки крови у больных с хирургической инфекцией Учитывая важность показателя концентрации альбумина в оценке состояния тяжелых больных, а также возможных изменений свойств альбумина при эндогенной интоксикации, влияющих на результаты измерения, нами проведен сравнительный анализ различных методов определения альбумина у больных с хирургическрй инфекцией. В биохимических лабораториях клиник для определения альбумина сыворотки крови используются методы с бромкрезоловым зеленым (БКЗ) и бромкрезоловым пурпурным (БКП), 65 утвержденных в качестве унифицированных. Содержание альбумина может быть оценено по результатам электрофоретического исследования белков сыворотки крови (расчет доли фракции альбумина от общего количества белка). При этом следует иметь в виду, что электорофоретическая подвижность белков сыворотки, в частности альбумина, в условиях патологии может меняться [65,100]. Для данного исследования использовали сыворотку крови больных перитонитом (n = 14, 10 мужчин и 4 женщины, средний возраст 55,5±4,0 лет) и панкреонекрозом (n = 5,мужчины, средний возраст 41,0±2,0 лет) - пациентов реанимационного отделения Городской Клинической Больницы Скорой Медицинской Помощи г. Екатеринбурга. Образцы сыворотки крови от пациентов с указанными заболеваниями получали в первые, третьи и пятые сутки пребывания пациента в отделении. Одновременно анализировались образцы сыворотки крови 6 практически здоровых людей (3-х мужчин и 3-х женщин, средний возраст 44,2±3,0 лет). Образцы сыворотки крови больных и здоровых поступали в один и тот же промежуток времени и анализировались в одинаковых условиях. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.4.1. Отмечается сильная степень линейной связи между величиной ОКА и концентрацией альбумина, определенной методом электрофореза (рис.3.4.1.). В этом случае коэффициент корреляции для проб сыворотки крови здоровых лиц составил 0,90. Коэффициент корреляции для сывороток больных оказался равен 0,80; среднее квадратичное отклонение от линии регрессии составило 5,9 г/л или 9% от среднего значения, что в 1,5 раза превышает допустимый коэффициент аналитической вариации для определения концентрации альбумина. 66 60 ОКА, г/л 50 40 30 20 10 0 0 10 20 Аэ, г/л30 Сыворотки больных 40 50 60 Сыворотки здоровых Рис. 3.4.1 Соответствие между результатами определения концентрации альбумина в сыворотках больных и здоровых лиц электрофоретическим методом (Аэ, г/л, по горизонтали) и флуоресцентным методом с зондом К-35 (ОКА, г/л, по вертикали). Параллельное исследование образцов сыворотки крови здоровых и больных флуоресцентным способом и методом с БКЗ показало прямую положительную взаимосвязь между величиной ОКА и концентрацией альбумина (рис.3.4.2.). В данном случае коэффициент корреляции для образцов сыворотки крови здоровых лиц составил 0,99, а для больных перитонитом и панкреанекрозом – 0,96. 60 ОКА, г/л 50 40 30 20 10 0 0 10 20 Ау,г/л 30 Сыворотки больных 40 50 60 Сыворотки здоровых Рис. 3.4.2 Соответствие между результатами определения концентрации альбумина в сыворотках больных и здоровых лиц унифицированным методом с БКЗ (Ау, г/л, по горизонтали) и флуоресцентным методом с зондом К-35 (ОКА, г/л, по вертикали). 67 Средняя величина концентрации альбумина у больных гнойновоспалительными заболеваниями брюшной полости, определенная методом электрофореза составила 31,81,7 г/л, методом с БКЗ – 27,00,9 г/л, а общая концентрация альбумина, измеренная методом флуоресцентных зондов равнялась 27,41,2 г/л. Таблица 3.4.1. Концентрация альбумина, измеренная методом флуоресцентных зондов (ОКА), методом электрофореза (Аэ) и унифицированным методом с БКЗ (Ау) у больных с хирургической инфекцией и здоровых лиц Показатели Группы Здоровых лиц (n = 6) Больных (n = 19) ОКА,г/л Аэ, г/л Ау,г/л 39,32±3,11 40,33±3,87 39,49±2,96 27,4±1,2* 31,8±1,7* 27,0±0,9* Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) относительно здоровых лиц Внимания заслуживает тот факт, что величина данного показателя, исследуемого двумя последними методами в группе больных достоверно (р<0,05) отличалась от таковой, определенной методом электрофореза. Вместе с тем в группе здоровых лиц подобные различия не носили характер достоверных. Анализ полученных результатов свидетельствует, что флуоресцентный метод дает хорошее совпадение значений концентрации альбумина с унифицированным методом с БКЗ не только у здоровых, что было показано и ранее [6,46], но и у больных с выраженной интоксикацией, когда свойства альбумина заметно изменены. Это подтверждает применимость флуоресцентного метода для измерения показателя альбумина у широкого круга больных. Метод флуоресцентных зондов, равно как и метод с БКЗ, демонстрируют более высокую чувствительность к изменениям, развивающимся в организме при хирургической инфекции, превосходя характеристики электрофоретического метода. 68 Последнее обстоятельство, а также значительная продолжительность выполнения измерения и вероятность погрешностей на этапах многостадийного электрофоретического метода, делают его применение для мониторирования тяжелых больных малопривлекательным. Из двух методов, дающих практически совпадающие результаты – с БКЗ и флуоресцентного, предпочтение следует отдать последнему, поскольку он позволяет судить не только о количестве, но и о структуре и функциональной активности альбумина. Показатель общей и эффективной концентрации альбумина дает ценную информацию к оценке состояния больных, а флуоресцентный метод может быть рекомендован для широкого использования в клинике неотложных состояний. 3.5. Влияние различных метаболитов на связывающую способность сывороточного альбумина при патологии Представляло интерес изучить влияние отдельных лигандов на связывающую способность альбумина по отношению к зонду К-35. Для исследования были выбраны метаболиты, концентрация которых в патологии сравнима с концентрацией альбумина в плазме крови (600-700 мкМ). Только в этом случае имеет смысл рассматривать какие-либо конкурентные взаимодействия между метаболитами и «тестирующей» молекулой – флуоресцентным зондом К-35, - по отношению, к которой определяют ЭКА/ОКА. Полагали, что показатель кооперативности для метаболитов не превосходит 5, и поэтому не были включены в исследования вещества, концентрация которых в патологии составляет менее 40 мкМ. Таким образом, для исследований были выбраны: мочевина (концентрация при патологии до 6 мМ), неэстерифицированные жирные кислоты (до 4 мМ), молекулы средней массы (МСМ). Последний параметр в настоящее время широко используется для оценки степени интоксикации организма. Подробное описание влияния жирных кислот на связывающую способность альбумина содержится в п.3.6 данной главы. 69 Для проверки влияния конкурентного связывания с альбумином низкомолекулярных метаболитов, обычно повышающихся в сыворотке крови больных в неотложных состояниях и особенно гнойно-воспалительными заболеваниями брюшной полости (мочевины, креатинина, МСМ) к образцам сыворотки крови был добавлен каждый из этих метаболитов при максимально возможной концентрации. При добавлении мочевины в концентрации 20 мМ к образцам сыворотки крови здоровых лиц (n=7) и больных перитонитом (n=11) не наблюдали достоверного ее влияния на связывание К-35 с альбумином. Данные, полученные в результате этого эксперимента, представлены в таблице 3.5.1.1. Таблица 3.5.1.1 Влияние мочевины при добавлении в концентрации 20 мМ на связывание флуоресцентного зонда К-35 с альбумином Показатели Группы обследуемых Здоровые лица, (n=7) Больные перитонитом, (n=11) ОКА, г/л ЭКА, г/л ЭКА/ОКА % Без добавления мочевины С добавлением мочевины Без добавления мочевины С добавлением мочевины Без добавления мочевины С добавлением мочевины 454,5 44,84,6 37,23,8 36,93,7 82,57,9 82,48,0 29,32,1 28,42.0 18,81,6 18,01,5 64,25,9 63,4 5,8 Содержание в сыворотке так называемых молекул средней массы (МСМ) - показатель, часто используемый для оценки тяжести клинического состояния при заболеваниях, сопровождающихся явлениями интоксикации [7]. МСМ – продукты деградации биологических структур, белков: усиление процессов катаболизма наблюдается при многих патологических состояниях. Параметр, представляющий собой отношение ЭКА/ОКА, определяемый методом флуоресцентных зондов, также связан со степенью интоксикации организма и тяжестью клинического состояния больного. В связи с этим вопрос о взаимосвязи показателей ЭКА/ОКА и МСМ 70 представляет интерес. На рис. 3.5.1 и 3.5.2 представлена зависимость параметра ЭКА/ОКА от концентрации МСМ в обследованных образцах сыворотки крови здоровых лиц (n=7) и больных перитонитом (n=17). Видно, что между этими параметрами корреляция отсутствует (r = 0,31 и r = 0,39 для ЭКА/ОКА больных и здоровых соответственно). 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 100 200 300 400 МСМ Рис. 3.5.1. Уровень МСМ и параметр ЭКА/ОКА у больных с хирургической инфекцией. 96 ЭКА/ОКА 94 92 90 88 86 84 82 246 248 250 252 254 256 258 МСМ Рис. 3.5.2. Уровень МСМ и параметр ЭКА/ОКА у здоровых лиц Полученные результаты свидетельствуют, с нашей точки зрения, об отсутствии прямого действия молекул средней массы на связывающую способность альбумина. 71 Таким образом, на связывающую способность альбумина по отношению к флуоресцентному зонду К-35 не оказывают влияния такие метаболиты, как мочевина и МСМ, присутствующие в крови больных гнойновоспалительными заболеваниями брюшной полости. 3.6. Влияние жирных кислот на флуоресценцию К-35 Важным фактором, способным изменить взаимодействие абсорбционных и флуоресцентных красителей с сывороточным альбумином (и, следовательно, повлиять на результаты определения концентрации белка), являются неэстерифицированные жирные кислоты. Как известно, в альбумине имеются специальные центры связывания жирных кислот. В результате заполнения этих центров последними они оказывают аллостерическое влияние на параметры центров, связывающих билирубин или флуоресцентные зонды [6, 340]. В частности, добавление до трех молекул некоторых жирных кислот на молекулу альбумина приводит к увеличению флуоресценции зонда К-35 [45]. Ранее в работе [45] исследовалось влияние олеиновой и пальмитиновой кислот. Данные исследования были проведены в образце слитой сыворотки здоровых людей. Мы изучили влияние стеариновой кислоты на флуоресценцию К-35 в образцах сыворотки крови нескольких групп больных с диагнозами: панкреонекроз, сепсис, перитонит, пиелонефрит, гепатит, цирроз. К сыворотке вначале добавляли стеариновую кислоту до молярного соотношения кислота/альбумин = 1,1/1, а затем зонд и измеряли интенсивность его флуоресценции (F1с). Затем добавляли кислоту до конечного соотношения 5,5/1,0 и измеряли флуоресценцию (F2с). Параллельно проводили такое же измерение пробы, к которой жирная кислота не добавлялась (в ней интенсивность флуоресценции обозначена как F1). СоотношениеF1с/F1 и F2c/F1c при различных заболеваниях приведено в таблице 4.2.1. Они показывает, что добавление стеариновой кислоты оказывает вполне заметное влияние: как правило, F1c ниже F1. 72 Таблица 3.6.1. Параметры, характеризующие влияние стеариновой кислоты на флуоресценцию К-35 в образцах сыворотки крови здоровых лиц и различных групп пациентов Группы n F1с/F1 F2c/F1c Диапазон F2c/F1c Здоровые Панкреонекроз Сепсис Перитонит Пиелонефрит Гепатит Цирроз 40 23 12 67 11 43 13 0,88+0,04 0,89+0,07 0,85+0,03 1,00+0.08 1,07+0,04 0,98+0,06 0,96+0,08 2,29 0,05 2,62 0,06* 2,71 0,12* 2,93 0,07* 2,41 0,06* 2,83 0,09* 2,54 0,07* 1,95 – 2,65 1,83 – 4,09 2,31 – 3,49 1,99 – 4,85 1,5 – 3,0 2,05 – 4,20 2,15 – 2,71 Доля случаев с F2c/F1c>2,65 0 47 3 76 4 67 1 22 2 58 2 31 5 Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) относительно группы здоровых лиц В случае перитонита величина F2c/F1c в 1,3 раза выше, чем в группе здоровых лиц (p<0,001). В группе панкреонекроза, пиелонефрита и цирроза увеличение данного параметра менее выражено (в 1,14, 1,05 и 1,11 раз соответственно). Величина F2c/F1c повышается в 1,2 раза у пациентов с сепсисом и гепатитом. Однако параметр F2c/F1c не одинаков у разных людей: диапазон вариаций у здоровых лиц – от 1,95 до 2,65, т.е. отклонения от среднего значения в группе не превышают 18%, в то время как у больных перитонитом ширина этого диапазона увеличивается в 4 раза. У больных панкреонекрозом и гепатитом ширина диапазона параметра F2c/F1c увеличена в 3 раза, у больных сепсисом в 1,7 раза, у пациентов с пиелонефритом – в 2 раза. Параметр F2с/F1с отражает способность жирной кислоты регулировать связывающие свойства альбумина , т.е. отражает аллостерическое действие жирной кислоты на связывающие центры альбумина. У здоровых людей эта способность почти одинакова (параметр варьирует в очень малых пределах). При перитоните влияние жирной кислоты на связывающую способность альбумина резко возрастает - параметр F2c/|F1c становится значительно выше. При этом в 67% случаев измерения этого параметра у больных перитонитом его величина превышала верхнюю границу для здоровых лиц (была выше 73 2,65), у больных панкреонекрозом величина параметра F2c/F1c превышала верхнюю границу здоровых в 47% случаев, у больных сепсисом в 76% случаев, в группе пиелонефрита в 22% случаев, у пациентов с гепатитом – в 58% случаев и циррозом – в 31% случаев. Таким образом, чувствительность молекул альбумина к аллостерическому влиянию на нее жирных кислот значительно возрастает при нарушениях функций организма. Добавление флуоресцентного зонда К- 35 к альбумину, в котором увеличено содержание жирной кислоты, приводит к снижению флуоресценции зонда по сравнению с альбумином без добавления кислоты. 3.7. Влияние гемолиза на свойства связывающих центров сывороточного альбумина Для изучения влияния гемолиза на свойства связывающих центров сывороточного альбумина исследовали 7 нормальных и 10 патологических образцов сыворотки крови. Сначала измеряли исходную ЭКА в каждом из этих образцов. Затем при идентичной процедуре измерения к каждому из них добавляли гемолизат эритроцитов в количестве 10 мкл, 15 мкл, 20 мкл и 25 мкл. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.7.1. и рис. 3.7.1., 3.7.2. Таблица 3.7.1 Эффективная концентрация альбумина в образцах сыворотки крови здоровых и больных лиц Группы ЭКА, г/л Исходное При добавлении 10 мкл крови При добавлении 15 мкл крови При добавлении 20 мкл крови При добавлении 25 мкл крови Здоровых (n = 7) 34,21±2,04 %изменения Больных (n = 10) 17,43±0,67 %изменения 24,93±2,00 -27,13 13,92±0,90 -20,14 21,34±1,97 -37,62 10,67±1,01 -38,78 16,80±1,54 -50,89 7,89±0,78 -54,73 12,47±1,06 -63,55 7,11±0,78 -59,21 Как видно из таблицы, исходные значения ЭКА в группах больных ниже, чем у здоровых лиц. 74 40 35 34,21 ЭКА, г/л 30 25 24,93 21,34 20 16,8 15 12,47 10 5 0 1 2 3 4 5 Стадии измерения ЭКА г/л Рис. 3.5.1 График зависимости уровня ЭКА от количества добавленного гемолизата эритроцитов в образцы сыворотки здоровых лиц: 1- исходное, 2при добавлении 10 мкл, 3-15 мкл, 4- 20 мкл, 5- 25 мкл 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 17,41 13,63 10,67 7,89 1 2 3 4 7,11 5 Стадии измерения Рис. 3.5.2 График зависимости уровня ЭКА от количества добавленного гемолизата эритроцитов в образцы сыворотки больных: 1- исходное, 2- при добавлении 10мкл, 3- 15 мкл, 4- 20 мкл, 5- 25 мкл Затем при постепенном увеличении объема добавляемого гемолизата эритроцитов в обеих исследуемых группах отмечается монотонное уменьшение ЭКА. При этом в группе здоровых лиц в ходе последней процедуры измерения зафиксировано снижение данного параметра на 63,5 %, а в группе больных – на 59,2 %. Особого внимания заслуживает тот факт, что между значениями ЭКА и количеством добавленного гемолизата эритроцитов выявлена статистически значимая обратная корреляционная зависимость с коэф75 фициентом корреляции r = -0,79 и r = -0,85 для групп здоровых и больных соответственно (рис. 3.7.1. и 3.7.2.). Таким образом, присутствие микроколичеств гемолизата эритроцитов в образцах сыворотки крови различного контингента людей оказывает существенное влияние на изменения свойств связывающих центров сывороточного альбумина и результаты измерения соответственно. 3.8. Влияние гемодиализа на свойства связывающих центров сывороточного альбумина при заболеваниях почек Детоксикационная терапия является неотъемлемой частью лечения любого патологического состояния, сопровождающегося синдромом эндогенной интоксикации [76,109,] Общеизвестно, что развитие эндотоксикоза обусловлено накоплением токсичных компонентов в крови, лимфе, интерстициальном пространстве и неспособностью собственно детоксицирующих систем и органов справиться с их детоксикацией. Выраженность проявлений и сроки развития синдрома эндогенной интоксикации во многом зависят от функционального состояния физиологических систем защиты, направленных на нейтрализацию и выведение токсических продуктов [195]. Большая роль в детоксикационных процессах принадлежит альбумину сыворотки крови, который осуществляет связывание и перенос токсических метаболитов к местам естественного выделения. К таким метаболитам относятся: 3 – карбокси – 4-метил – 5-пропил – 2-фуранпропиеновая кислота, индоксил сульфат, гиппуровая кислота, неэстерифицированные жирные кислоты (НЭЖК), n – крезол, а также неидентифицированные соединения [182]. Токсическое действие этих веществ выражается в угнетении эритропоэза, стимулировании развития гломирулярного склероза, депрессии фатоцитоза, ингибировании гепатоцитарной глутатион – Б – трансферазы и др. Кроме того, блокирование связывающих центров человеческого сывороточного альбумина вышеперечисленными метаболитами приводит к смещению равновесия между связанной и свободной формами нутриентов и гормонов, транспортируемых ЧСА, а так76 же существенно влияет на фармокинетику связывающихся с альбумином лекарственных препаратов [74]. Поэтому реаниматологи и интенсивисты на сегодняшний день патогенетически обоснованно подключают в комплексное лечение активные методы детоксикации в комбинациях и моновариантах [198]. Гемодиализ – один из них, особенно, когда речь идет о развитии хронической почечной недостаточности, сопровождающей многие критические состояния. Cодержание альбумина в плазме крови больных с хронической почечной дисфункцией является важным прогностическим фактором, связанным с показателем выживаемости данной категории больных, находящихся как на программном гемодиализе, так и на непрерывном амбулаторном перитонеальном диализе, причем низкое содержание ЧСА в плазме крови коррелирует с высокой смертностью среди этих пациентов [54,346]. Необходимо, однако, отметить, что транспортная функция альбумина определяется не столько общей, сколько «активной» («эффективной») концентрацией белка, т.е. содержанием молекул ЧСА с нормальной нативной конформацией и комплексообразующей способностью [6]. Объектом настоящего фрагмента исследования явилось изучение эффективной и общей концентраций альбумина, а также их интегральных индексов у больных с хронической почечной дисфункцией до и после проведения очередной процедуры программного гемодиализа. Рабочий протокол исследования включал 19 пациентов с хронической почечной дисфункцией (12 мужчин и 7 женщин, средний возраст 36,6 ± 2,2 лет), находящихся на программном гемодиализе с различными сроками выполнения очередной процедуры (от 21-ой до 880-ой), соответственно начатыми в 2000 и 1992гг. При этом у 14 из них хроническая почечная дисфункция явилась исходом гломерунефрита, у 4 - пиелонефритом и по одному случаю тубулоинтерстициального нефрита на фоне дисплазии почек, сахарного диабета и злокачественной артериальной гипертензии. Средние значения флуресцентных показателей у больных с хронической почечной дисфункциией до и после проведения очередной процедуры программного гемодиализа. 77 средняя продолжительность которой составила 4,26 ± 0,11 часа, представлены в таблице 3.8.1. Таблица 3.8.1 Параметры флуоресценции К-35 у больных с хронической почечной дисфункцией до и после проведения очередной процедуры программного гемодиализа Параметры ОКА, г/л ЭКА, г/л ЭКА/ОКА, % ИТ До процедуры 47,05±1,30 29,70±0,87 64,02±1,91 0,61±0,07 После процедуры 50,53±1,49 39,42±1,43* 78,19±1,97* 0,30±0,03* % изменения +6,89 +24,66 +18,12 -50,82 Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) относительно исходных величин Как видно из таблицы, в группе больных с хронической почечной дисфункцией до проведения очередной процедуры программного гемодиализа ЭКА была снижена по отношению к группе сравнения на 15,11%, параметр ЭКА/ОКА – на 27,3%, а индекс токсичности увеличен в 5 раз. Результатом проведения очередной процедуры данного вида детоксикационной терапии в среднем по группе этой категории больных явилось увеличение уровня ЭКА на 24,7%, что соответствует уровню референтных величин. При этом величина параметра, представляющего собой отношение ЭКА/ОКА возросла на 18,1%, а ИТ снизился в 2 раза. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в результате программного гемодиализа происходят существенные изменения свойств связывающих центров сывороточного альбумина. Его применение позволяет за короткий промежуток времени снизить концентрацию токсичных лигандов в циркуляторных системах, «разгрузить» собственные детоксицирующие системы организма и значительно ослабить их повреждающие воздействие на органы и системы [53], что находит отражение в повышении значений ЭКА, ЭКА/ОКА и существенном снижении ИТ. По всей вероятности, программный гемодиализ позволяет инактивировать не только гидрофильные компоненты эндотоксемии, но и воздейство- 78 вать на гидрофобные лиганды, деблокируя центры связывания альбумина, и тем самым, улучшая его транспортную функцию. Результаты, полученные в ходе этого эксперимента показали, что детоксикационный потенциал альбумина существенно возрастает в процессе сорбционной делигандизации. Это обусловлено разгрузкой центров связывания и повышением комплексообразующей способности альбумина [165]. Такой делигандизованный альбумин может рассматриваться как жидкий адсорбент, который, помимо высокого детоксикационного эффекта, обладает естественной высокой биосовместимостью. Представленные в данном фрагменте работы данные могут быть использованы не только для мониторинга функциональных характеристик сывороточного альбумина пациентов с хронической почечной дисфункцией, находящихся на различных сроках программного гемодиализа, но также для оценки эффективности новых экстракорпоральных методов лечения этого тяжелого состояния. Таким образом, представленные в данной главе результаты исследований показали высокую воспроизводимость флуоресцентного метода определения параметров, характеризующих свойства связывающих центров альбумина, а также хорошее соответствие величины ОКА и концентрации альбумина, определяемой другими, общепринятыми в лабораторной практике, методами. Полученные данные свидетельствуют о том, что свойства связывающих центров альбумина не зависят от влияния различных растворимых метаболитов, присутствующих в крови, а также времени суток. То есть данные факторы не объясняют причину снижения связывающей способности альбумина при заболеваниях различного генеза. В то же время свойства связывающих центров альбумина изменяются в результате действия гемолиза и аллостерического влияния неэстерифицированных жирных кислот, что необходимо учитывать при интерпретации результатов, получаемых методом флуоресцентных зондов. 79 ГЛАВА 4 ИЗМЕНЕНИЯ СВОЙСТВ СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ПРИ ПАТОЛОГИИ Объективная и своевременная оценка состояния организма при патологии является неотъемлемой задачей современной клинико-лабораторной диагностики. В настоящее время в клинической практике для оценки состояния больных различными заболеваниями существует целый ряд общепринятых диагностических тестов, получивших широкое распространение. Между тем известно, что важным механизмом компенсации увеличения концентрации продуктов метаболизма, характерного для патологии, является образование комплексов различных соединений с белками плазмы крови, уникальной способностью к которому обладает сывороточный альбумин. При эндогенной интоксикации, сопровождающей то или иное заболевание, в организме создаются условия для образования форм альбумина с измененными физико-химическими характеристиками, что препятствует обмену между тканями и сосудистым руслом, переносу токсинов к органам детоксикации-биотрансформации. Поэтому особое значение имеют методы, позволяющие судить не только о количестве, но и функциональной активности альбумина. В этом отношении перспективным представляется использование метода флуоресцентных зондов для оценки свойств связывающих центров альбумина [47,133]. В настоящем разделе представлен клинический материал исследований изменений свойств связывающих центров сывороточного альбумина при заболеваниях различного генеза методом флуоресцентных зондов с использованием К –35. Нами проведено изучение изменений флуоресцентных показателей у больных гепатитом, циррозом, панкреатитом, пиелонефритом, гломерулонефритом и лейкозом. 80 4.1. Изменения флуоресцентных показателей при заболеваниях желудочно-кишечного тракта 4.1.1. Изменения флуоресцентных показателей при гепатите и циррозе печени Общая концентрация альбумина в сыворотке крови при остром и хроническом вирусном гепатите В и циррозе печени не отличалась от таковой в группе сравнения (табл.4.1.1.1.). Напротив, ЭКА у пациентов с этими заболеваниями достоверно ниже (р<0,001) относительно данного показателя в группе сравнения. При этом ЭКА снижается в среднем на 34,3% в группе острого вирусного гепатита В , на 15,6% - в группе хроническокого вирусного гепатита В и на 42,5% - в группе цирроза. Вследствие этого происходит снижение параметра, представляющего собой отношение ЭКА/ОКА (на 27,5% в группе острого вирусного гепатита В, на 17,1% в группе хронического вирусного гепатита В и на 33,9% в группе цирроза ) и возрастает индекс токсичности (на 72% и на 78% в данных обследуемых группах пациентов соответственно). Различия между группой здоровых лиц и больных заболеваниями гепатобиллиарной системы становится особенно значительным, если рассмотреть долю пациентов, имеющих сниженную величину ЭКА/ОКА. Так среди лиц группы сравнения величины ЭКА/ОКА ниже 74% не наблюдалось. Больные гепатитом и циррозом печени в основном имели ЭКА/ОКА ниже этой границы. У больных гепатитом низкие величины ЭКА/ОКА отмечены в 81,0%случаев, а в группе цирроза – в 100% случаев. Примерно такие же изменения претерпевает индекс токсичности ИТ. В группе сравнения величина ИТ близка к нулю, и только у 15 из 198 здоровых лиц ИТ превышает величину 0,26. Напротив, в группе гепатита 84% больных имеют ИТ больше 0,26, а в группе цирроза все больные имеют высокую величину ИТ (среднее значение – 0,77). 81 82 Анализ динамики изменений флуоресцентных показателей у больных гепатитом на 1 – е, 7 – 8 – е и 14 -15 – е сутки наблюдения показал их постепенное улучшение, которое, однако, не достигало уровня таковых в группе сравнения. Таким образом, изменения флуоресцентных показателей при заболеваниях гепатобиллиарной системы однонаправленны. Причем при циррозе печени они более заметны, что связано, по-видимому, с более выраженной гепатодепрессией и накоплением метаболитов при этом заболевании. 4.1.2. Изменения флуоресцентных показателей при панкреатите У пациентов с хроническим панкреатитом средние величины ЭКА, ОКА и ЭКА/ОКА сыворотки крови значительно ниже аналогичных показателей в группе сравнения (табл.4.1.2.1.). ЭКА у данной категории пациентов снижена на 49,1%, ОКА – на 29% по отношению к группе сравнения. Вследствие этого параметр ЭКА/ОКА снижается на 29,5% и в 4 раза возрастает ИТ. Таблица 4.1.2.1 Параметры, характеризующие свойства связывающих центров сывороточного альбумина в группе сравнения и больных хроническим панкреатитом Группы Показатели ОКА, г/л Диапазон ЭКА, г/л Диапазон ЭКА/ОКА, % Диапазон Доля случаев (%) с ЭКА/ОКА< 74% ИТ Диапазон Доля случаев (%) с ИТ>0,26 Сравнения (n = 198) 40,00±2,00 34-47 35,00±2,00 29-45 88,00±0,60 80,14-100,00 Панкреатита (n = 56) 28,40±1,60 16-42 17,80±1,30 8-29 62,00±2,40 42,10-80,70 0 92,8 0,17±0,01 0-0,22 0,68±0,07 0,24-1,38 0 89,5 % изменения -29,0 -49,1 -29,5 +75,0 Примечание: - различия достоверны (р<0,05) относительно группы сравнения. 83 Также отмечается более выраженная вариация всех показателей флуоресценции у больных хроническим панкреатитом по сравнению со здоровыми лицами (табл. 4.1.2.1.). Так диапазон значений ЭКА у больных хроническим панкреатитом был шире по отношению к группе сравнения в 1,3 раза, ОКА – в 2 раза, ЭКА/ОКА – в 1,9 раза, ИТ – в 5,2 раза. Обращает на себя внимание тот факт, что при хроническом панкреатите изменения изучаемых параметров в сторону ухудшения носят более выраженный характер, чем в группе пациентов с панкреонекрозом (острым панкреатитом), которые рассмотрены в пункте 5.1.2. главы 5. Это свидетельствует о нарастающем при хроническом панкреатите изменении свойств сывороточного альбумина и истощении резерва механизмов детоксикации. Обнаруженные особенности свойств связывающих центров сывороточного альбумина при хроническом панкреатите могут быть связаны с накоплением токсичных веществ не столько в результате уменьшения процессов детоксикации, сколько с увеличением образования метаболитов в кишечнике вследствие недостаточной секреции ферментов, нарушения процессов переваривания органических веществ, изменения количества и спектра кишечной микрофлоры. 4.2. Изменения флуоресцентных показателей при заболеваниях почек 4.2.1. Изменения флуоресцентных показателей при пиелонефрите Общая концентрация альбумина в сыворотке крови у больных пиелонефритом соответствует уровню референтных величин (табл. 4.2.1.1.). Напротив, ЭКА у этой категории больных снижается на 20% относительно группы сравнения. Закономерно происходит снижение параметра, представляющего ЭКА/ОКА на 27,3 % и в 4 раза возрастает ИТ. 84 Таблица 4.2.1.1 Параметры, характеризующие свойства связывающих центров сывороточного альбумина в группе больных пиелонефритом Группа Показатель ОКА, г/л ЭКА, г/л ЭКА/ОКА, % ИТ Сравнения (n = 198) 40,00±2,00 35,00±2,00 88,00±5,60 0,14±0,01 Пиелонефрита (n =24) 45,00±4,00* 28,00±2,00 65,90±3,00* 0,56±0,10* % изменения -20,00 +11,11 -25,11 +75,00 Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) относительно группы сравнения Интерес представляет сравнение изучаемых показателей у больных с различным характером воспалительного процесса в почках – острым и хроническим (табл.4.2.1.2.). ОКА значительно снижена при остром пиелонефрите (- 19,0 %, р<0,05), в то время как при хроническом заболевании ОКА даже несколько выше, чем у здоровых (+16, 3 %, р>0,05). В обоих случаях ЭКА достоверно снижена (р<0,05), однако, у больных с острым процессом в большей степени (24,4±3,4 г/л и 36,5±2,6 г/л соответственно). Вместе с тем отношение ЭКА/ОКА х 100 ниже у хронических больных – 69,0±4,9 г/л и 62,3±5,5 г/л. Последнее свидетельствует о нарастающем при хроническом пиелонефрите изменении свойств связывающих центров сывороточного альбумина и истощении резерва детоксицирующих механизмов. Таблица 4.2.1.2 Параметры, характеризующие свойства связывающих центров сывороточного альбумина в группах больных острым и хроническим пиелонефритом Группа Острого пиелонефрита Хронического Показатель (n = 9) пиелонефрита (n = 15) ОКА, г/л 30,44±2,92 46,52±3,74* Диапазон 20,00-44,00 30,00-48,00 ЭКА, г/л 24,4±3,40 36,50±2,59* Диапазон 11,00-27,00 24,00-36,00 ЭКА/ОКА, % 69,03±4,88 62,30±5,52 Диапазон 51,80-74,07 50,29-69,16 ИТ 0,56+0,04 0,55±0,05* Диапазон 0,32-0,67 0,39-0,66 Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) относительно группы больных острым пиелонефритом 85 Таким образом, показатели, определяемые методом флуоресцентных зондов, могут быть использованы как дополнительные дифференциальнодиагностические критерии острого и хронического поражения канальцевого аппарата почек. 4.2.2. Изменения флуоресцентных показателей при гломерулонефрите У больных гломерулонефритом в первые сутки после поступления на стационарное лечение ОКА остается на уровне референтных величин (35 – 55 г/л). Напротив, ЭКА в среднем по группе снижается на 14,6 %, параметр ЭКА/ОКА – на 27,4 %, а ИТ увеличивается в 4,3 раза (табл. 4.2.2.1.). Таблица 4.2.2.1 Флуоресцентные показатели у больных гломерулонефритом Группы Показатель ОКА, г/л ЭКА, г/Л ЭКА/ОКА, % ИТ Сравнения Гломерулонефрит % изменения 40,00±2,00 35,00±2,00 88,00±5,60 0,17±0,01 46,11±2,01* 29,89±0,90 63,90±2,04* 0,60±0,05* +13,3 -14,6 -27,4 +71,7 Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) относительно группы сравнения Таким образом, данное заболевание сопровождается снижением ЭКА, ЭКА/ОКА и увеличением ИТ, причем изменения этих показателей происходили примерно на том же уровне, что и у больных пиелонефритом. Полученные данные свидетельствуют о снижении функциональных свойств альбумина у больных с заболеваниями почек, что позволяет использовать метод флуоресцентных зондов для оценки их состояния. 86 4.3. Изменения флуоресцентных показателей при заболеваниях системы крови В практике ведения больных с опухолевыми процессами кроветворной ткани большое значение придается оценке функционального состояния систем детоксикации и выведения продуктов метаболизма. Компенсаторные резервы последних во многом определяют возможность проведения необходимой терапевтической схемы и в конечном итоге эффективность лечения больного. Важная роль механизмов детоксикации обусловлена тем, что развитие опухолевого процесса и применение цитостатиков вызывают развитие синдрома эндогенной интоксикации [206]. Учитывая активное участие сывороточного альбумина в процессах обезвреживания и транспорта различных метаболитов, нами проведено изучение возможности использования показателей связывающей способности альбумина для оценки состояния больных острым лейкозом при проведении цитостатической терапии. В группе больных острым лейкозом ОКА снижена на 19%, однако это различие не достоверно. Напротив, ЭКА достоверно (р<0,05) снижается на 44%. В соответствии с этим параметр ЭКА/ОКА в группе больных снижается на 31% и в 4,7 раза возрастает индекс токсичности (табл.4.3.1.) После лечения в среднем по группе больных острым лейкозом отмечается улучшение всех исследуемых флуоресцентных параметров, однако только для индекса токсичности подобные изменения носили достоверный (р<0,05) характер. Следует отметить, что показатели ОКА и ЭКА, исследованные в группах больных миелобластным и лимфобластным лейкозом, практически не различались. Параметр, представляющий собой отношение ЭКА/ОКА, в группе больных миелобластным лейкозом на 5% ниже, чем в группе больных лимфобластным лейкозом, а индекс токсичности достоверно (р<0,01) был выше для группы больных миелобластным лейкозом, что может быть связано с более тяжелым течением болезни. 87 Таблица 4.3.1. Параметры, характеризующие функциональное состояние альбумина у больных с разными формами лейкоза Группа Сравнения (n=198) Больных острым лейкозом (n=20) Больных миелобластным лейкозом (n=13) Больных лимфобластным лейкозом (n=7) ЭКА После До лелечечения ния ОКА После До лелечечения ния ЭКА/ОКА х 100% 35,02,0 40,02,0 88,00,56 До лечения После лечения ИТ До лечения После лечения 0,140,01 19,0 1,0* 23,0 2,0* 32,0 1,0 34,0 1,0 60,0 1,6* 67,0 3,0* ** 0,69 0,05* ** 18,5 1,0* 22,5 2,0 32,5 1,0 33,5 3,0 59,3 1,6* 63,9 5,7* 0,74 0,05* 19,5 3,0* 24,5 2,0* 31,5 3,0 34,5 3,0 62,4 5,7* 65,9 0,06* 0,64 0,18* 0,50 0,07* ** 0,60 0,08* ** 0,50 0,07* ** Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) относительно группы сравнения ** - различия достоверны (р<0,05) относительно значений соответствующих показателей до лечения Таблица 4.3.2. Параметры, характеризующие функциональное состояние альбумина у больных с острым лейкозом в зависимости от исхода заболевания Группа Выживших больных (n=10) Больных с летальным исходом (n=10) ЭКА До леПосле чения лечения 23,0 25,0 2,0 2,0 17,0 1,0* - ОКА До леПосле чения лечения 35,0 36,0 1,5 2,0 27,0 1,0* - ЭКА/ОКАх100% До леПосле чения лечения 65,7 68,9 2,3 3,3 56,8 2,6* - ИТ До лечения 0,55 0,07 0,79 0,07* После лечения 0,46 0,07 - Примечание: различия между исследуемыми группами достоверны (р<0,05) 88 Заслуживает внимания тот факт, что флуоресцентные параметры у больных острым лейкозом достоверно (р<0,05) различались в зависимости от исхода заболевания (табл.4.3.2.). В группе больных острым лейкозом с летальным исходом заболевания величина ЭКА была на 26 % ниже таковой в группе больных с благоприятным исходом заболевания. Снижение на 21% наблюдалось и для ОКА. В соответствии с этим параметр ЭКА/ОКА у данной категории больных был снижен на 11 % и на 25 % возрастал индекс токсичности. В группе больных острым лейкозом с благоприятным исходом отмечалось положительное (хотя и незначительное) влияние химиотерапии. В этом случае индекс токсичности уменьшался на 22 %. У больных с ранней летальностью среднее значение ЭКА составило 16,0 ±1,4 г/л; ОКА – 27,5±1,1 г/л; ЭКА/ОКА – 58,76±7,45 %; ИТ – 0,76±0,22. Напротив, у больного, умершего в стадии ремиссии, флуоресцентные показатели были значительно лучше. Так, ЭКА составила 27 г/л, ОКА – 38 г/л, параметр ЭКА/ОКА – 71,05% и индекс токсичности был равен 0,41. Таким образом, параметры ЭКА, ЭКА/ОКА у больных острым лейкозом значительно снижены, а ИТ увеличен. Проведение химиотерапии у данной категории больных сопровождается достоверным (р<0,05) уменьшением индекса токсичности, характеризующим степень заполнения организма токсическими веществами. Изучение параметров флуоресценции может быть использовано в оценке интенсивности проводимой терапии, прогнозировании исхода заболевания, а также развития лекарственной и эндогенной интоксикации. Полученные результаты свидетельствуют о том, что модифицированный в условиях патологического процесса альбумин в сыворотке крови с низкой связывающей способностью играет патогенетическую роль в развитии заболеваний желудочно-кишечного тракта, почек, системы крови. Накопление различных продуктов метаболизма при указанных заболеваниях приводит к изменению физико-химических свойств молекулы альбумина. 89 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 ЭКА, г/л 6 7 8 ОКА, г/л Рис 4. Показатели ОКА и ЭКА у пациентов с заболеваниями желудочнокишечного тракта, почек и системы крови По горизонтали – обследованные группы: 1 - больные острым гепатитом, 2 - хроническим гепатитом, 3 – циррозом, 4 - панкреатитом, 5 - пиелонефритом, 6 - гломерулонефритом, 7 - лейкозом, 8 - Здоровые лица Средние величины ЭКА и ОКА у рассматриваемого в данной главе контингента больных представлены на рис. 4. Как видно из рисунка, наиболее низкие значения ЭКА зарегистрированы у больных циррозом печени, что характеризует максимальную перегруженность связывающих центров альбумина патологическими метаболитами. Сравнительно небольшое снижение ЭКА у больных с заболеваниями почек, по-видимому, связано с тем, что при патологии такого рода преимущественно повышается содержание гидрофильных соединений. Связываясь с низко- и среднемолекулярными органическими веществами и токсинами, поступающими в кровь при заболеваниях различного генеза, альбумин снижает свою комплексообразующую способность, его эффективная концентрация снижается на фоне незначительного изменения общей концентрации . 90 ГЛАВА 5 ИЗМЕНЕНИЯ СВОЙСТВ СВЯЗЫВАЮЩИХ ЦЕНТРОВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У БОЛЬНЫХ С ХИРУРГИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИЕЙ Правильный выбор наиболее информативных критериев оценки состояния больных с хирургической инфекцией непосредственно связан с улучшением результатов их лечения. По-мнению многих авторов, в настоящее время отсутствуют надежные критерии оценки эндотоксикоза, универсальные для патологических состояний, требующих проведения интенсивной терапии [153,196]. Вместе с тем, согласно имеющимся данным, при хирургической инфекции происходит избыточное накопление токсических метаболитов в организме, которое вызывает различной степени интоксикацию и нарушение гомеостаза [67,68, 150,151,152,159,161]. Известно, что наиболее серьезные нарушения при хирургической инфекции наблюдаются в показателях белкового обмена, что связано с угнетением белковообразовательной функции печени, усиленным катаболизмом белков в тканях, нарушением функций пищеварительного тракта [78]. Данные факторы являются основными в патогенезе синдрома эндогенной интоксикации, развитие которого во многом определяет тяжесть состояния этой категории больных. Для выявления подобных нарушений широко используются различные автоматические анализаторы, но к сожалению, они не дают возможности адекватно оценить выраженность эндогенной интоксикации и изменения физико-химических свойств альбумина – одного из транспортеров токсических веществ. В связи с этим, мы изучили возможность использования показателей, характеризующих свойства связывающих центров сывороточного альбумина, определяемых методом флуоресцентных зондов в оценке состояния больных с хирургической инфекцией и сравнили ее с возможностью подоб- 91 ной оценки с помощью общепринятых клинико-лабораторных параметров у данной категории больных. В данной главе представлены результаты исследований динамики изменений флуоресцентных показателей у больных с хирургической инфекцией, параллельно которым проводилось изучение динамических изменений общепринятых клинико-лабораторных параметров. Кроме того, нашли отражение результаты сравнительного анализа диагностической ценности обеих групп исследуемых параметров при заболеваниях данного вида. 5.1. Изменения флуоресцентных показателей, характеризующих свойства связывающих центров сывороточного альбумина при хирургической инфекции 5.1.1. Изменения флуоресцентных показателей при перитоните Средние данные о параметрах ОКА, ЭКА и их интегральных величин в течение первых десяти суток госпитализации больных с хирургической инфекцией приведены в таблицах 5.1.1.1., 5.1.1.2., 5.1.1.3. Как видно из таблицы 5.1.1.1, при перитоните в первые сутки наблюдения снижены оба измеряемых параметра: ОКА – на 26 % и ЭКА – на 47 % по отношению к группе сравнения. Одни авторы считают, что причина снижения уровня альбумина в крови у больных перитонитом – выход его в брюшную полость вследствие проницаемости брюшины, другие видят причину в интенсивном катаболизме белков [225].Возможно, здесь нет противоречия. Деградация альбумина в норме происходит в тканях, и вполне естественно предположить, что высокая проницаемость брюшины для альбумина и высокая скорость его распада после выхода под действием бактериальных протеаз – звенья одной цепи. При этом если у здоровых лиц диапазон значений ОКА весьма узок (от 31 до 45 г/л), то у больных перитонитом он становится в 2,9 раза шире (от 7 до 47 г/л). 92 Таблица 5.1.1.1. Динамические изменения флуоресцентных показателей у больных перитонитом Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ОКА, % ИТ Группа сравнения 35,00±2,00 40,00±2,00 88,00±0,09 0,14±0,01 Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ОКА, % ИТ Группа сравнения 35,00±2,00 40,00±2,00 88,00±0,09 0,14±0,01 1-е 2-е 3-е 4-е 5-е 21,25±0,87* 34,06±0,90*8 63,16±1,16* 0,72±0,03* 19,89±0,58* 31,98±0,87* 61,15±1,04* 0,69±0,04* 19,70±0,75* 30,98±1,18* 62,09±1,20* 0,64±0,03* 19,77±0,74* 32,87±0,80* 65,26±1,05* 0,62±0,03* 21,73±1,48* 30,73±1,48* 70,04±2,14* 0,66±0,08* продолжение таблицы 5.1.1.1. 6-е 7-е 8-е 9-е 10-е 19,86±0,98* 30,46±1,08* 66,03±2,57* 0,54±0,07* 20,73±0,95* 32,32±1,84* 64,74±1,91* 0,60±0,06* 18,80±0,77* 28,85±1,06* 64,89±1,83* 0,64±0,05* 19,23±0,89* 28,73±0,79* 61,50±2,21* 0,51±0,05*8 18,21±1,05* 30,50±1,88* 60,56±1,83* 0,69±0,06* Примечание: * - различия достоверны (р < 0,05) относительно группы сравнения Таблица 5.1.1.2. Динамические изменения флуоресцентных показателей в группе больных перитонитом с благоприятным исходом заболевания Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ОКА% ИТ Группа сравнения 35,00±2,00 40,00±2,00 88,00±0,09 0,14±0,01 1-е 2-е 3-и 4-е 5-е 20,98±0,85 33,48±1,12 62,25±1,16 0,63±0,03 20,59±0,73 33,27±0,83 62,52±1,07 0,65±0,04 20,44±0,83 32,58±1,28 62,31±1,29 0,63±0,03 20,51±0,99 32,27±1,15 66,46±1,58 0,61±0,03 21,94±1,59 31,84±1,19 69,00±2,64 0,47±0,05 продолжение таблицы 5.1.1.2. Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ОКА% ИТ Группа сравнения 35,00±2,00 40,00±2,00 88,00±0,09 0,14±0,01 6-е 7-е 22,26±1,15 30,16±0,97 65,47±3,15 0,40±0,0 20,16±0,97 29,42±2,18 61,47±2,38 0,48±0,06 93 8-е 18,8±2,90 25,56±2,90 59,80±2,18 0,59±0,06 9-е 23,93±1,96 33,64±2,41 70,71±3,52 0,48±0,08 10-е 25,90±1,57 36,00±2,41 72,96±2,38 0,43±0,04 Таблица 5.1.1.3 Динамические изменения флуоресцентных показателей в группе больных перитонитом с неблагоприятным исходом заболевания Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ ОКА % ИТ Группа сравнения 35,00±2,00 40,00±2,00 1-е 2-е 3-и 4-е 5-е 15,5±1,13* 27,0±1,45 15,44±1,10* 27,11±1,56 16,21±1,65 29,07±1,88 18,06±0,80 32,13±1,91* 14,0±1,57* 25,57±2,20 88,00±0,09 57,9±4,76 57,25±2,84 59,89±2,77 60,29±2,98* 57,25±2,81* 0,14±0,01 0,99±0,15* 0,72±0,08* 0,73±0,09* 0,75±0,07* 0,80±0,09* Продолжение таблицы 5.1.1.3. Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ ОКА % ИТ Группа сравнения 35,00±2,00 40,00±2,00 6-е 7-е 8-е 9-е 10-е 14,56±1,35* 24,11±2,02* 15,0±1,29* 24,67±2,58 12,77±1,68* 23,08±1,75 13,11±1,2* 23,33±2,61* 12,25±0,97* 20,6±1,27* 88,00±0,09 60,98±2,28 61,1±2,69 55,78±2,44 55,90±2,80* 52,25±1,73* 0,14±0,01 0,69±0,05* 0,65±0,07* 0,84±0,07* 0,83±0,09* 0,89±0,06* Примечание: * - различия достоверны (р < 0,05) относительно значений соответствующих параметров и суток наблюдения в группе больных перитонитом с благоприятным исходом заболевания В результате в 60 % образцов сыворотки крови больных перитонитом ОКА выходит за пределы диапазона величин ОКА в группе здоровых лиц: в 92,8 % случаев ОКА у больных ниже и в 4 % случаев она выше 45 г/л. При этом в целом по группе больных перитонитом флуоресцентные показатели на протяжении всех суток наблюдения существенных изменений не претерпевали. Однако ситуация коренным образом меняется, если всех пациентов разделить на две группы: с благоприятным и неблагоприятным исходом заболевания. Характер изменений свойств связывающих центров сывороточного альбумина зависел от тяжести перитонита. Из общего числа наблюдаемых пациентов с перитонитом (237) у 44 (18,6 %) наступил летальный исход (у 20 женщин и 24 мужчин). У этого контингента больных изначально уровень определяемых показателей был значительно ниже такового в группе больных с благоприятным исходом заболевания, постепенно снижаясь в среднем к де94 сятым суткам наблюдения (таблица 5.1.1.3.). За день до наступления смерти уровень ЭКА составил в среднем 10,73±0,64 г/л, ОКА – 21,92±0,99 г/л, параметр ЭКА/ОКА был равен 47,35±1,10 %, ИТ – 1,01±0,04. Это свидетельствует о резких изменениях свойств связывающих центров сывороточного альбумина вследствие послеоперационных осложнений (прогрессирования перитонита, нагноение ран, абцессов, а так же развития полиорганной недостаточности). На рис. 5.1.1.1. приведены кривые для случая осложненного перитонита, закончившегося летальным исходом на 7-е сутки после поступления (больная Д., 88 л.). Отмечалось снижение всех определяемых показателей, причем наиболее выраженным было снижение ЭКА к 10-м суткам (на 66 %). На рис.5.1.1.2 приведен противоположный случай – перитонит с благоприятным исходом (больной Б., 64 г.). Как видно из рисунка, на вторые сутки наблюдения в данном случае отмечается снижение параметров ЭКА, ОКА, а затем их постепенное повышение, которое к 10 суткам достигает максимальных величин (31 г/л и 39 г/л соответственно). Закономерно этому возрастает параметр ЭКА/ОКА (на 20 %) и уменьшается ИТ (в 2,2 раза). Аналогичная направленность в изменениях флуоресцентных показателей отмечается и в среднем по группе больных перитонитом с благоприятным исходом заболевания. Особого внимания заслуживает тот факт, что постепенное увеличение показателей ЭКА, ОКА, ЭКА/ОКА и уменьшение ИТ в группе больных перитонитом с благоприятным исходом заболевания наблюдалось на фоне повышения общей эффективности лечения, проявляющейся в более быстром регрессе клинических проявлений распространенных форм гнойного перитонита. В результате лечения в данной группе больных ЭКА к 10 суткам наблюдения повышалась на 19 %. При этом величина ЭКА/ОКА возрастала на 15 %. 95 30 ЭКА г/л 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 5 6 7 5 6 7 5 6 7 СУТКИ 50 ОКА г/л 40 30 20 10 0 1 2 3 4 ЭКА/ОКА СУТКИ 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 ИТ СУТКИ 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 СУТКИ Рис. 5.1.1.1. Изменения показателей ЭКА, ОКА, ЭКА/ОКА, ИТ при тяжелом течении перитонита, закончившегося летальным исходом на 7 сутки (больная Д.) По горизонтальной оси – сутки от начала развития перитонита 96 ЭКА, г/л 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 7 8 9 10 11 12 9 10 СУТКИ 50 ОКА, г/л 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 СУТКИ 100 ЭКА/ОКА 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ИТ СУТКИ 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 СУТКИ Рис. 5.1.1.2. Изменения показателей ЭКА, ОКА, ЭКА/ОКА, ИТ при благоприятном исходе перитонита (больной Б.) По горизонтальной оси – сутки от начала развития перитонита 97 Особый интерес представляют значения флуоресцентных показателей в сыворотке крови у больных перитонитом исходно при поступлении в отделение. В рамках этого фрагмента работы под наблюдением находились 14 больных перитонитом (8 мужчин и 6 женщин, средний возраст 43,1+4,8 лет), у которых все исследования исходно проводились при поступлении в отделение («нулевые сутки»), а также на первые, третьи и пятые сутки наблюдения. Соответствующие данные представлены в таблице 5.1.1.4. Таблица 5.1.1.4 Флуоресцентные показатели у больных перитонитом в разные сроки наблюдения Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ОКА, % ИТ При поступлении 40,6±1,88 46,5±2,43 87,7±1,88 0,17±0,02 1-е 3-е 5-е 26,10±4,00* 36,10±4,00* 70,31±4,40* 0,43±0,09* 30,12±4,00* 43,05±4,00 63,00±6,70* 0,65±0,20* 24,00±4,00* 34,00±6,00* 70,90±7,10* 0,44±0,14* Примечание : * - различия достоверны (р < 0,05), относительно исходных величин Как видно из таблицы, у больных перитонитом исходно при поступлении в отделение показатели ЭКА и ОКА были несколько выше, чем у лиц группы сравнения. Причем оба показателя уменьшались в одинаковой степени – около 15% (р<0,05). Практически неизменными по отношению к группе сравнения были показатели ЭКА/ОКА и ИТ. Через одни сутки наблюдения величина ОКА снижается до уровня таковой в группе сравнения, в то время как ЭКА становится на 36,2% (р<0,05) меньше. При этом достоверно падает доля «эффективного» альбумина (19,8%, р<0,05) и растет индекс токсичности (+158,8%, р<0,05). На третьи сутки эти изменения становятся еще более выраженными (-30,0 и 261,0% соответственно, р<0,05). Через пять суток отмечается тенденция нормализации значений, хотя уровень ЭКА остается достоверно сниженным. Одинаковая степень изменения ЭКА, ОКА и неизменное отношение ЭКА/ОКАх100 дает основание полагать, что этот феномен 98 связан с изменением водного баланса в сосудистом русле и развивающейся гемоконцентрацией. Если предположение, верно, то можно ориентировочно оценить дефицит жидкости – примерно 20% объема. Таким образом, в самый ранний период развития перитонита транспортные свойства альбумина остаются неизменными, что говорит о преобладании в патогенезе в этот период явлений перераспределения жидкости, нарушении вводно-электролитного баланса над явлениями интоксикации. Однако уже через одни сутки степень заполнения альбумина как универсального транспортного белка заметно увеличивается, что свидетельствует о быстром нарастании интоксикации при относительно стабильном балансе жидкости и белков в сосудистом русле. Полученные данные иллюстрируют, что флуоресцентное исследование альбумина, кроме оценки накопления в организме различных метаболитов, позволяет получить косвенную информацию и о функциональном состоянии сосудистого русла, что весьма ценно при острой патологии. Результаты динамических изменений флуоресцентных показателей, полученных на 237 больных перитонитом, когда число их измерений в каждые сутки наблюдения было различно и в итоге анализу подвергались средние значении в каждый определенный момент исследования, мы сравнили с результатами изучения этих параметров у отдельно взятой выборки больных перитонитом из 26 человек, в образцах сыворотки крови которых измерение ЭКА, ОКА и расчет их относительных величин производился на протяжении всех суток наблюдения. Соответствующие данные представлены в таблицах 5.1.1.5.,5.1.1.6 и 5.1.1.7. Как видно из этих таблиц и таблиц 5.1.1.1., 5.1.1.2, 5.1.1.3., наблюдаемые закономерности в изменениях флуоресцентных параметров во всей группе больных перитонитом и отдельно взятой выборке идентичны. Различия в цифровых данных составляют от 0,1% до *.03%. Это тает нам основание говорить о достоверности выводов, сделанных в отношении всей группы больных перитонитом и других групп больных с хирургической инфекцией. 99 Таблица 5.1.1.5. Динамические изменения флуоресцентных показателей у отдельно взятой выборки больных перитонитом Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ ОКА, % ИТ Группа сравнения 35,00±2,00 40,00±2,00 88,00±0,09 0,14±0,01 Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ ОКА, % ИТ Группа сравнения 35,00±2,00 40,00±2,00 88,00±0,09 6-е 7-е 8-е 9-е 10-е 19,94±0,98* 30,66±1,08* 65,11±2,96* 20,41±0,95* 31,93±1,84* 63,52±2,09* 18,92±0,80* 30,05±1,06* 63,96±1,83* 19,71±0,90* 29,96±0,80* 63,79±2,84* 19,05±1,05* 31,14±1,88* 61,06±1,83* 0,14±0,01 0,54±0,06* 0,59±0,06* 0,60±0,05* 0,51±0,05*8 0,64±0,06* 1-е 2-е 3-е 4-е 5-е 21,03±0,86* 19,64±0,57* 33,94±0,90*8 31,66±0,89* 62,96±1,15* 61,92±1,06* 19,73±0,77* 30,99±1,19* 63,06±1,26* 19,82±0,79* 32,13±0,82* 64,68±1,07* 20,99±1,56* 31,02±1,48* 68,16±2,14* 0,69±0,03* 0,61±0,04* 0,65±0,03* 0,61±0,07* 0,63±0,05* Примечание: * - различия достоверны (р < 0,05) относительно группы сравнения Таблица 5.1.1.6 Динамическме изменения флуоресцентных показателей в отдельно взятой выборке больны перитонитом с благоприятным исходом заболевания Сутки, Группа Показатель сравнения ЭКА, г/л 35,00±2,00 ОКА, г/л 40,00±2,00 ЭКА/ОКА 88,00±0,09 % ИТ 0,14±0,01 1-е 2-е 3-и 4-е 5-е 21,36±0,85 34,09±1,13 62,77±1,16 21,07±0,84 34,16±0,90 61,98±1,07 21,13±0,85 33,29±1,30 63,27±1,29 21,60±1,00 32,99±1,15 66,47±1,61 21,95±1,60 31,91±1,19 68,98±2,70 0,62±0,04 0,63±0,04 0,60±0,04 0,56±0,05 0,45±0,05 Продолжение таблицы 5.1.1.6. Сутки, Группа Показатель сравнения ЭКА, г/л 35,00±2,00 ОКА, г/л 40,00±2,00 ЭКА/ОКА 88,00±0,09 % ИТ 0,14±0,01 6-е 7-е 8-е 9-е 10-е 22,19±1,20 30,74±0,99 69,96±3,15 21,21±1,15 30,03±2,20 66,32±2,43 20,98±3,00 29,86±3,00 67,23±2,90 23,77±2,00 33,99±2,63 69,98±3,50 25,24±1,60 35,79±2,38 70,35±2,94 0,40±0,04 0,47±0,06 0,50±0,06 0,46±0,08 0,46±0,04 100 Таблица 5.1.1.7. Динамические изменения флуоресцентных показателей в отдельно взятой выборке больных перитонитом с неблагоприятным исходом заболевания Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ОКА % ИТ Группа сравнения 35,00±2,00 40,00±2,00 1-е 2-е 3-и 4-е 5-е 15,18±1,12* 27,14±1,42 15,39±1,11* 27,05±1,49 16,09±1,53 28,92±1,86 17,94±0,79 30,89±1,78* 14,06±1,43* 26,08±2,40 88,00±0,09 56,59±4,68 59,93±2,734 56,89±2,90 59,07±2,98* 56,91±2,81* 0,14±0,01 0,92±0,13* 0,74±0,08* 0,76±0,09* 0,73±0,07* 0,82±0,09* продолжение таблицы 5.1.1.7. Сутки Показатель ЭКА, г/л ОКА, г/л ЭКА/ОКА % ИТ Группа сравнения 35,00±2,00 40,00±2,00 6-е 7-е 8-е 9-е 10-е 14,93±1,60* 24,89±2,02* 14,66±1,42* 24,91±2,61 12,77±1,68* 23,08±1,75 13,11±1,2* 23,33±2,61* 12,25±0,97* 20,6±1,27* 88,00±0,09 60,09±2,28 59,02±2,88 55,78±2,44 55,90±2,80* 52,25±1,73* 0,14±0,01 0,68±0,07* 0,69±0,07* 0,84±0,07* 0,83±0,09* 0,89±0,06* Примечание: * - различия достоверны (р < 0,05) относительно значений соответствующих параметров и суток наблюдения в группе больных перитонитом с благоприятным исходом заболевания Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что параметры, характеризующие свойства связывающих центров сывороточного альбумина, могут служить критерием оценки состояния больных перитонитом. 5.1.2. Изменения флуоресцентных показателей при панкреонекрозе Данные о показателях флуоресценции в группе больных панкреонекрозом представлены в таблице 5.1.2.1. Как видно из таблицы, в первые сутки наблюдения все исследуемые параметры значительно отличались от таковых в группе сравнения. При этом величина ЭКА была ниже на 45,7 %, ОКА – на 26,3 %, ЭКА/ОКА – на 27,4 %, а ИТ – выше в 3,7 раз. На протяжении последующих суток наблюдения в среднем по группе эти параметры существенных изменений не претерпевали. 101
