Методическое пособие 12 - Бюро судебно

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
«РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (125284
Москва, ул. Поликарпова, д. 12/13)
ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
«РЕСПУБЛИКАНСКОЕ БЮРО СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН
(420029 Казань, ул. Сибирский тракт, 31 а)
«Утверждаю»
И.о. директора ФГБУ «РЦСМЭ»
Минздравсоцразвития России,
доктор медицинских наук
__ А.В. Ковалев
29 марта 2012 г.
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ФЕНОТИПОВ
ГАПТОГЛОБИНА
В ЖИДКОЙ КРОВИ И В ПЯТНАХ КРОВИ МЕТОДОМ
ВЕРТИКАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В
ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
(Методические рекомендации)
Москва
2012
Авторы:
Эксперт ГАУЗ РБСМЭ МЗ РТ С.В. Снульник;
заведующий отделением судебно-биологических
экспертиз
ФГБУ РЦСМЭ Минздравсоцразвития России,
кандидат
медицинских наук А. А. Гусаров; заведующая
судебнобиологическим отделением ГАУЗ РБСМЭ
МЗ
РТ
М.В. Перельман.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время, дифференцирование крови (жидкой и
в пятнах) по системе гаптоглобина (Нр), имеющей большое
информативное значение, несмотря на наличие специального
оборудования и необходимых реактивов, производится только в
Аннотация
Предлагаемый вариант метода вертикального
электрофореза в полиакриламидном геле позволяет
доказательно и наглядно устанавливать фенотипы гаптоглобина
в жидкой крови и пятнах крови на вещественных
доказательствах с целью определения возможности
происхождения исследуемой крови от проходящих по делу лиц,
что имеет особенно важное значение при их совпадении по
другим, традиционно исследуемым группам и системам крови:
АВО, МК8$. Рр, Юг.
Для исследования жидкой крови достаточно 5-30 мкл
сыворотки, для исследования пятен крови достаточно 20-80 мкл
вытяжки.
Методические рекомендации предназначены для
использования врачами судебно-медицинскими экспертами
судебно-биологических отделений Бюро судебно-медицинской
экспертизы.
36 из 89 судебно-биологических отделений бюро судебно-
Рецензенты:
Е.Х. Баринов - зав. учебной частью кафедры судебной
медицины и права ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития
РФ, к.м.н., доцент, профессор РАЕ
В.А. Калянов - и.о. зав. кафедрой судебной медицины
ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития РФ
первую очередь, изонормальных и героиммунных сывороток,
Рекомендовано к изданию Ученым советом ФГБУ
«РЦСМЭ» Минздравсоцразвития России (протокол № 2 от
29.03.2012г.).
медицинской экспертизы (БСМЭ) Российской Федерации.
Между тем, фенотипы белковой системы гаптоглобина
являются ценным источником информации при групповой
идентификации пятен крови на вещественных доказательствах.
Особенное значение диагностика фенотипов гаптоглобина
приобретает в случаях, когда проходящие по делу лица имеют
одинаковую группу крови по системе АВО.
Необходимость дифференцирования жидкой крови и
следов крови на вещественных доказательствах по системе
гаптоглобина становится как никогда актуальной в условиях
снижения качества и дефицита отдельных иммунореагентов, в
необходимых для производства судебно-биологических
экспертиз и исследований.
У людей различают три типа гаптоглобина, которые
имеют
разную
электрофоретическую
подвижность
молекулярный вес: Нр 1 -1, Нр 2-1, Нр 2-2. Частота
и
встречаемости фенотипов гаптоглобина у взрослого населения
следующая: тип Нр 1-1 - 11%, тип Нр 2-1 - 51%, тип Нр 2-2 -
3)
Для
формирования ПААГ
используют
стекла
размерами 10x20 см.
4) Используют две гребенки с 20-ю зубцами, что
38%.
Методы, предлагаемые для этой цели, прошли
определённую фазу развития: от техники на агаровом и
позволило одновременно исследовать 40 жидких образцов крови
или вытяжек из пятен крови.
крахмальном геле [1, 2], до методики проведения электрофореза
в полиакриламидном геле [3,4,5].
5) В процессе пробоподготовки очистку вытяжек из пятен
крови проводят хлороформом вместе с предметом-носителем.
Определение фенотипов гаптоглобина Нр в судебно-
6) Определение фенотипов гаптоглобина в образцах
биологических отделениях БСМЭ РФ в настоящее время
жидкой и гемолизированной крови проводят в двухслойном
производится по модификациям методик, разработанным в
полиакриламидном геле, одновременно с вытяжками из пятен
конце 1990-х - начале 2000-х годов [6, 7].
крови.
Нами были разработаны методические рекомендации по
7) Для эффективного заполнения карманов ПААГ
определению фенотипов гаптоглобина в жидкой крови и в
сыворотку жидкой крови замораживают и хранят необходимое
пятнах
время до начала исследования.
методом
вертикального
электрофореза
в
полиакриламидном геле (ПААГ), с внесением ряда
существенных изменений в существующие методики, что
позволило повысить её доказательность.
8)
Герметизацию
камеры
проводят
отрезками
фильтровальной бумаги с применением состава нижнего геля.
9) При приготовлении проявляющего раствора бензидин
растворяют в ледяной уксусной кислоте.
Усовершенствования метода заключаются в следующем:
Изменения в методике, позволили значительно
1) Определение фенотипов Нр проводится в ПААГ
уменьшить расход реагентов, сократить время проведения
толщиной 1 мм (в ранее опубликованных методиках описано
исследований, добиться стабильной четкости результатов и
определение фенотипов Нр в ПААГ толщиной 2 или 3 мм).
большой производительности при определении фенотипов Нр.
2) Уменьшена плотность нижнего ПААГ с 8% до 6,6% и
верхнего слоя ПААГ с 4,5 % до 3,4 %.
На указанный метод определения фенотипов Нр
оформлено рационализаторское предложение №2002/62 от
15.12.2006
года,
выданное
Казанским
государственным
медицинским университетом.
Разработанный
метод
- при отсутствии образцов крови потерпевшего либо
обвиняемого;
по
чувствительности
и
- при исследовании гнилостно измененных образцов
специфичности не уступает вариантам методов горизонтального
крови, мышечной ткани и пятен крови на вещественных
электрофореза, применяемым за рубежом для определения
доказательствах;
фенотипов гаптоглобина [8-10] и выгодно отличается от них
большой экономичностью и использованием отечественных
реагентов.
- для дифференцирования «смешанных» пятен крови
нескольких лиц;
- при исследовании «смешанных» пятен (кровь +
выделения), поскольку Нр определяется лишь в крови, а в
выделениях его не устанавливают;
Методика определения фенотипов гаптоглобина Нр
- для дифференцирования крови человека в следах с
методом вертикального электрофореза в полиакриламидном
геле может быть использована при судебно-медицинском
исследовании
вещественных
доказательств,
- для дифференцирования крови взрослого человека и
для
дифференцирования жидкой крови, следов крови, «смешанных»
следов крови и выделений в следующих случаях:
- при одногруппности образцов крови по системе АВО;
- при получении нечётких результатов при определении
группы крови по системе АВО;
- при решении вопроса о возможной примеси в пятнах
крови лица группы Оар;
- при решении вопроса о возможности происхождения
крови от одного лица труппы АВо, либо нескольких лиц с
различным сочетанием групповых свойств А и В;
примесью крови животных;
новорожденного, поскольку у новорожденных Нр практически
не определяется;
- при влиянии предметов-носителей на результаты по
системе АВО;
- при отсутствии контролен предметов-носителей.
В результате дифференцирования пятен крови по системе
(Нр) значительно повышается доказательность экспертизы
вещественных доказательств.
в 2 мл ледяной уксусной кислоты, затем добавить 10% уксусную
МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ
Используют оборудование и реактивы, стандартные для
судебно-биологических отделений бюро судебно-медицинской
экспертизы.
кислоту.
7.7.5. 75% раствор сахарозы на электродном буфере:
сахароза 1,5 г, дистиллированная вода до 10 мл. Хранить при
температуре + 4-6°С.
ОПИСАНИЕ
7.7.6. Раствор гемоглобина: у донора с типом НР 1-1
Определение фенотипов гаптоглобина в жидкой крови и
пятнах
крови
методом
вертикального
электрофореза
в
полиакриламидном геле проводят в двухслойном ПААГ.
1 этап. Приготовление растворов.
7.7.7. Электродный трис-глициновый буфер: трис 1,5 г,
глицин 12 г, дистиллированная вода 3 литра. Хранить при
комнатной температуре.
взять 1,5 мл крови, отмыть физиологическим раствором 7 раз.
Тщательно убрать физиологический раствор и добавить 2 мл
дистиллированной воды. Хранить в замороженном состоянии.
2 этап. Подготовка прибора (аппарата
для
электрофореза) к работе, формирование ПААГ на 40
исследуемых объектов.
2.7.7. Сборка гелевой ячейки: используют 4 стекла
1.1.2. Полимер «Акрис»: акриламид 150 г, бисакриламид
размерами 10x20 см (два прямоугольных и два с вырезом). С
5 г, дистиллированная вода 0,5 литра. Раствор профильтровать,
внутренней стороны камеры устанавливают стекла с вырезом.
хранить в темной бутыли при температуре + 4-6°С.
Между стеклами вставляют «спейсеры» толщиной 1 мм, а с
1.1.3. Полимер «Трис НС 1»-гелевый раствор: трис 72,6 г,
нижней стороны стекол вставляют сложенный в 4 слоя отрезок
ТЭМЭД-0,92 мл, концентрированная соляная кислота - 5мл,
фильтровальной бумаги шириной 2-3 см, с выступающим
дистиллированная вода до 200 мл. Хранить в темной бутыли при
свободным краем длиной 0,5-1 см. Стекла со спейсерами и
температуре + 4~6°С.
фильтровальной
1.1.4. Раствор для окраски гелевых пластин: бензидин
бумагой
вниз у
крепят
к
камере
прилагающимися зажимами.
50 мг, 10% уксусная кислота 120 мл, пергидроль 10 капель.
2.7.2. Приготовление нижнего разделительного 6,6%
Готовить непосредственно перед окраской. Бензидин растворить
геля: «Акрис» 7,2 мл, трис 4,8 мл, дистилированная вода 18 мл.
11
10
Компоненты смешивают, используют для герметизации камеры
и формирования нижнего геля.
3 этап. Приготовление вытяжек из пятен крови,
подготовка жидкой крови
2.7.3 Герметизация камеры: камеру устанавливают под
В зависимости от насыщенности и давности пятен крови
углом 30-45°. К 10 мл смеси нижнего геля добавляют 20 мг
вырезают участки размерами от 0,3x0,3 см до 3x3 см, можно
персульфата аммония. После растворения персульфата аммония
исследовать соскобы и смывы. Экстрагирование проводят 15%
раствор быстро вносят на внутренний край фильтровальной
раствором сахарозы 18-24 часа в условиях холодильника в
бумаги. После полимеризации образуется ПААГ высотой от 0,5
пробирках «эппендорф» объемом 1,8 мл. После экстрагирования
до 1 см, надежно герметизирующий камеру.
в пробирки вместе с предметом носителем вносят хлороформ в
Камеру устанавливают вертикально, вставляют «гребенку»
соотношении 1:1. Содержимое перемешивают до появления
толщиной 1 мм с 20 зубцами и ниже на 0,5-2 см от зубцов
твердой пены. Пробирки центрифугируют 20 мин при
делают отметку. Гребенки убирают, к оставшемуся объему для
4000 об/мин. Верхний слой служит для исследования. Если
нижнего геля добавляют 60 мг персульфата аммония. После
вытяжка бесцветная добавляют 10 мкл гемоглобина. В карманы
растворения персульфата аммония, раствор быстро вносят на
вносят 60-80 мкл вытяжки. Внесение хлороформа в пробирки к
герметизирующий слой ПААГ. Сверху наносят 5-10 мл
вытяжкам с предметом-носителем позволяет эффективнее
дистиллированной воды для выравнивания свободного края
извлекать сыворотку из пятна крови, сократить время
ПААГ. После окончания полимеризации воду сливают.
приготовления вытяжек. В первый и последний карманы
2.1.4. Приготовление верхнего концентрирующего 3,4%
следует вносить вытяжки из заведомых образцов крови.
геля. «Акрис» 1,4 мл, трис 1,2 мл, дистиллированная вода 8 мл,
После центрифугирования жидкой крови отделяют
персульфат аммония 20 мг, перемешивают, вносят в камеру и
сыворотку, если сыворотка бесцветная, то добавляют 10 мкл
вставляют гребенки. После окончания полимеризации камеру
гемоглобина. Исследование проводят одновременно с
заполняют буферным раствором.
вытяжками из пятен крови в двухслойном ПААГ. Необходимо
Если разгонку необходимо проводить в одной гелевой
помнить, что для полного заполнения 20 или 40 карманов
ячейке (20 исследований), то объемы верхнего и нижнего ПААГ
образцы сыворотки жидкой крови можно накапливать, для этого
уменьшают в 2 раза.
их замораживают при температуре - 20° С и хранят необходимое
13
12
время до исследования. Гемолизированную и загнившую кровь
НЬ. Фенотипы Нр 2-1 и 2-2 имеют многочисленные фракции с
сначала центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. К 1 мл
разной электрофоретической подвижностью. Гомозиготный
верхнего слоя добавляют 1 мл дистиллированной воды,
фенотип Нр 2-2 не представлен отдельным компонентом.
перемешивают. Берут 100 мкл смеси, добавляют 10 мкл 60%
Фракций в фенотипе Нр 2-2 при разных условиях разделения
сахарозы, обрабатывают хлороформом и вносят в карман ПААГ
может быть до 10, а в фенотипе Нр 2-1 - более 10. Группы
в количестве 80 мкл.
(фенотипы) Нр крови определяют путем сопоставления уровней
расположения фракций исследуемых и контрольных образцов
4 этап. Проведение электрофореза
(рис. 1.).
Входной электрофорез проводят при напряжении 200 В и
силе тока 50 мА 30 мин, затем при напряжении 300 В и силе
тока 80-100 мА 2-3 часа. Электрофорез завершают после
перемещения фронта гемоглобина на 5 см от старта.
5 этап. Окраска гелевых пластин ПААГ
Из прибора сливают буферный раствор, разбирают
гелевые ячейки, извлекают пластины ПААГ, отрезают нижний
край и метят его, отрезая углы ПААГ. Пластины ПААГ
помещают в проявляющий раствор на 20 минут. Затем
добавляют 8—10 капель пергидроля. Учет результатов проводят
в течение часа.
Рис. 1. Фенотипы гаптоглобина; 1— 1-1; 2 — 2-1; 3 — 2-2; 4 — НЬ
6 этап. Учет результатов. На фореграмме выявляют
зоны Нр. Фенотип Нр
1-1
представлен единичной ярко
выраженной, плотной фракцией. Он располагается над полосой
14
15
ЛИТЕРАТУРА
ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА
Предлагаемый способ определения фенотипов Нр в
жидкой крови и пятнах крови методом вертикального
1.
Старостин
Н.Н.
Приготовление
геля
для
электрофореза в полиакриламидном геле толщиной 1 мм
электрофоретического определения типов гаптоглобина // Суд. -
апробирован на заведомых образцах крови в жидком виде и в
мед. эксперт. - 1972. -№3. - С. 44-46.
пятнах.
2. Николенко О.В. К определению типов гаптоглобина в
По сравнению с ранее применяемыми методиками по
пятнах крови // Суд. - мед. эксперт. - 1972. - №2. - С. 31-33.
определению фенотипов Нр, данный метод обладает рядом
существенных преимуществ:
1.
3. Старостин Н.Н. Определение групп гаптоглобина
дискэлектрофорезом в акриаламидном
Высокая чувствительность и специфичность в
эксперт. - 1974. - №3. - С. 21-22.
сочетании с объективной регистрацией и возможностью
фотографирования
результатов
позволяет
иллюстрировать
4. Николенко О.В. К определению групп гаптоглобина в
пятнах крови // Суд. - мед. эксперт.
заключения экспертов.
2.
Высокая
геле// Суд. - мед.
1975. - №1. - С. 39-40.
5. Свирский М.С. Определение фракций гемоглобина и
технологичность
метода
позволяет
гаптоглобина
при
исследовании
пятен
крови
методом
одновременно исследовать в двухслойном ПААГ образцы
электрофореза в вертикальных пластинах полиакриламидного
жидкой крови и пятна крови.
геля // Суд. - мед. эксперт.
3. Высокая производительность метода обеспечивает
определение фенотипов Нр в 40 объектах одновременно.
4.
Высокая
экономичность
метода,
связанная
1981. - №1. - С. 33-36.
6. Барсегянц Л. О. Судебно-медицинское исследование
вещественных доказательств (кровь, выделения, волосы). - М. :
со
Медицина, 1999.-С. 106-112.
значительно меньшим расходом реагентов.
Данный метод был апробирован в ГАУ «Республиканское
7.
Информационное
медицинского
эксперта
письмо
Минздрава
Главного
РФ
судебно-
№416/01-07
от
бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ Республики
13.04.2000 г. Об определении фенотипов гаптоглобина в пятнах
Татарстан» на 20000 объектах, при проведении 500 судебно-
крови
биологических экспертиз.
полиакриламидном геле. - М., - 27 с.
методом
вертикального
электрофореза
в
Федеральное
государственное
бюджетное
учреждение
«Российский
центр
судебно-медицинской
экспертизы»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
(ФГБУ «РЦСМЭ» Минздрава России)
125284, г.Москва, ул. Поликарпова, д. 12/13
Тел.:+7 (495) 945-21-69
Тел.: +7 (495) 653-13-37
Подписано в печать 6.12.2012 г.
Формат 60x90/16
Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Ттез.
Печ.л. 1. Тираж 200. Заказ №1306
Отпечатано в типографии ООО «Корина-офсет»
119049, Москва, ул. Б. Якиманка, 38 «А»
+7(499)238-42-23 ета11: когта@гте1.ги
Факс.: +7 (495) 945-00-97
Эл. почта: таП@гс-5гпе.ги, гс5те@5ис!тес1.тто