Иммуноэлектрофорез белков

Лабораторное занятие 2.
Иммунохимические методы, основанные на принципе преципитации.
Иммуноэлектрофорез белков.
ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ по Грабар и Уильямс
1. Приготовить веронал-мединаловый буфер для электрофореза
Рабочий р-р
*5 кратный
’
Веронал-мединаловый
буфер (VMB) рН 8,6
веронал(5,5 диэтил0,8 г
4,0 г
барбитуровая кта; барбитал)
мединал (Na-соль
5,5’4,12 г
20,6 г
диэтилбарбитуровой к-ты; веронал натрия)
азид натрия
0,01 г
0,05 г
вода
до 1 л.
до 1 л.
!! Веронал растворить при нагревании в
небольшом объеме, добавить мединал и довести
до нужного объема
2. Приготовить 1,5% гель агарозы на веронал-мединаловом буфере (рН
8,6).
 Взвесить
сухую
агарозу
из
расчета
1,5%
концентрации
агарозного геля
 Добавить буфер VMB и расплавить агарозу на водяной бане до
однородной консистенции
 Охладить агарозный гель до 54-56°С.
3. Приготовление стеклянной пластинки с агарозным гелем
 Стекло протереть спиртом для обезжиривания поверхности
 нанести теплый гель агарозы на стеклянную пластинку на
столике для заливки гелей.
 Объём агарозного геля рассчитывается формуле=длина стекла
*ширина*0,2 см высоты геля
 После застывания геля вырезать по шаблону лунки и канавки.
NB! Из канавок гель удаляется после фореза.
4. Проведение первого этапа иммуноэлектрофореза – электрофорез
образцов.
 В вырезанные в геле лунки внести 5-10 мкл образца, в крайние
лунки – известные белки или сыворотку крови. В первую и
последнюю лунки добавляют краску (бромфеноловый синий)
 Стекло устанавливается в камеру, гель на 1 см. прикрывается по
бокам мостиками из фильтровальной бумаги в 4 слоя.
 Электрофорез проводят при напряжении тока 120В 30-40 минут.
5.
Постановка
второго
этапа
иммуноэлектрофореза
–
иммунопреципитация .
 После фореза удалить гель из канавок и залить специфическую
антисыворотку по 100 мкл.
 Инкубировать во влажной камере 24 ч.
 Пластинку поместить в забуференную воду на 12-24 ч. для
отмывки от несвязавшихся белков.
 Пластинку высушить в фильтровальной бумаге и окрасить 0,1%
раствором амидно-чёрного.
6. Приготовить краску для выявления преципитатов в геле
а) 1 г. амидо-чёрного растворить в 1 л. 7% уксусной кислоты
б) 100 мг Кумасси, 50 мл 96% этанол, 100 мл 85% о-фосфорной
кислоты – смешать и довести до 1000 мл. Профильтровать, хранить при
20°С.