аксиненко, ларина конечx

УДК 582.475.4:581.3:581.143.6:574.21:543.97
ИССЛЕДОВАНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ МАССЫ
КЕДРОВОГО СТЛАНИКА ХИМИКО-АНАЛИТИЧЕСКИМИ И
БИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Аксиненко М.А., Ларина Н.П.
Научные руководители: к.б.н. Н.Е. Носкова, к.б.н., доцент И.А. Шадрин
Красноярский государственный аграрный университет
Разработки, внедрения и производства специальной пищевой продукции (БАД), в
современных условиях относится к основным приоритетам развития новых
направлений в сфере питания. К биологически активным добавкам (БАД) проявляют
заинтересованность как потенциальные потребители, так и специалисты из различных
областей науки (производства). В России существуют нормативная, законодательная и
методическая базы, на основе которых производится медико-биологическая оценка
БАД на государственном уровне. В процессе проверки оценивается эффективность и
безопасность биодобавок для жизни и здоровья человека. При этом используются
химико-аналитические, биологические, клинические методы исследования. Физикохимические исследования требуют много времени, часто направлены на определение
конкретного вещества или веществ и не всегда способны выявить токсичное влияние
комплекса химических элементов на биологический объект и его отдаленные
последствия. В этом случае, для предварительной оценки эффективности, качества и
безопасности подобных продуктов целесообразно применение биотестов.
Используемые тест - объекты, сигнализируют об опасности (о токсичности) независимо
от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменение жизненно важных
функций организмов.
Соматический эмбриогенез - самая promising технология микроклонального
размножения хвойных и базовая технология для мультисортового лесного хозяйства. В
лаборатории биотехнологии сельскохозяйственных и лесных культур ИАЭТ КрасГАУ
путем соматического эмбриогенеза получены эмбриогенные клеточные линии сосны
сибирской, кедрового стланика и сосны обыкновенной
Огромное количество ростовых центров в эмбриогенных массах позволяет
предположить высокое содержание различных биологически активных веществ, что
соответственно делает очень заманчивым использование полученных эмбриогенных
масс в продуктах питания, БАДах, в смесях для корма животным, возможно - в
косметических препаратах; в составе биопрепаратов для растений. Первые
исследования физико-химических характеристик эмбриональной массы кедрового
стланика и сосны обыкновенной, показало высокое содержание белка, растворимых
сахаров, наличие незаменимых аминокислот, таких как лизин и аспарагин [THE
PRELIMINARY RESEARCH OF SOMATIC EMBRYONAL LINES OF PINES AS THE
PERSPECTIVE SOURCES OF PROTEIN-CONTAINING BIOADDITIVES
Aksinenko M.A., Larina N.P., Noskova N.E., Martynova O.V.].
Поскольку, эмбриональные массы, полученные в результате индукции
соматического эмбриогенеза, на стадии пролиферации можно выращивать в условиях
биореактора в больших объемах, их можно рассматривать в качестве перспективного
источника биодобавок, а также, для выделения отдельных БАВ.
Применение биотехнологий для получения эмбриональных масс кедрового
стланика как ценного сырья для изготовления БАД и БАВ в любых количествах и в
любое время года, вне зависимости от погоды и урожая, с одной стороны, будет
способствовать развитию хозяйственной деятельности, связанной с фармакологией,
косметологией, пищевой и перерабатывающей промышленностью, растениеводством.
С другой стороны, позволит снизить интенсивность эксплуатации кедровых
насаждений, будет способствовать сохранению кедровых лесов и увеличению
кормовой базы для животных, что создаст благоприятные условия для их размножения,
и, следовательно, будет иметь экологическое значение.
Возможность использования эмбриогенных масс хвойных, полученных путем
соматического эмбриогенеза, в качестве БАД и/или источников БАВ, предусматривает,
наряду с изучением химического состава, и необходимость исследования их
безопасности для живых организмов.
Целью настоящего исследования явилась оценка токсичности эмбриональной
массы кедрового стланика, полученной путем соматического эмбриогенеза с
использованием химико-аналитических и биологических методов.
Объектом исследования являлась стабильно пролиферирующая эмбриональная
линия кедрового стланика (КСТНЧ11.24) содержащая глобулярные зародыши и
суспензорную массу.
Химические исследования проводились на определение в эмбриогенной массе
фосфатов и тяжелых металлов.
Фосфаты определялись по методу, основанному на реакции фосфата с
молибдатом в кислой среде, с последующим образованием молибдатфосфорного
комплекса, его восстановлении до молибденового голубого в присутствии
аскорбиновой кислоты и спектрофотометрическом измерении оптической плотности
окрашенного раствора прямо пропорциональной содержанию фосфора в пробе в мг/кг
сырого веса [ГОСТ Р 51430-99].
Определение тяжелых металлов цинка, меди, свинца и кадмия проводилось
методом инверсионной вольтамперометрии (ГОСТ Р 51301-99, МУ № 31-04/04).
Биологические исследования токсичности эмбриогенной массы проводилось с
использованием в качестве тест-объекта инфузорий Paramecium caudatum (Ehrb.), что
обосновано их достаточно высокой чувствительностью к токсическим воздействиям, их
эффективным и быстрым ответом на изменение среды, легкостью культивирования,
невысокой продолжительностью эксперимента. В ходе острого эксперимента
отслеживалась выживаемость инфузорий в контроле и опыте. Подсчёт инфузорий в
ячейках производили через 5 минут от начала эксперимента, затем через 30 и через 60
минут. По результатам эксперимента рассчитывался индекс токсичности (Ι) по
формуле:
Ι = (М2-М1)/М1, где
Ι – индекс токсичности, М1 и М2 - средние арифметические числа выживших
инфузорий в контроле и опыте, соответственно.
Уровень токсичности определялся по допустимым значениям индекса
(таб.1).
Таблица 1
Допустимые значения индекса токсичности
Индекс(I)
Уровни
0 - 0,25
026 - 0,70
0,71 - 1
допустимый уровень
умеренный уровень
высокий уровень
Достоверность различий результатов эксперимента в контроле и опыте
оценивалась по коэффициенту Стьюдента
Показатели хронического токсического действия на парамеции основаны на
динамике выживаемости и смертности клеток инфузорий в ряду поколений. В ходе
эксперимента эмбриональная масса испытывалась в качестве корма для парамеций.
При этом в контроле кормом для парамеций служили перкарские дрожжи.
Химический анализ показал, что количество фосфатов в эмбриональной массе
кедрового стланика в сыром веществе варьировало в пределах 2,64 - 3,47 мг/кг и в
среднем составило 3,055±0,306 мг/кг сырого веса, что соответствует 279 мг в пересчете
на 100 г сухого веса. Хотя фосфор и является биогенным элементом, но содержание
фосфатов
во многих пищевых продуктах и добавках не редко приводит к их
переизбытку. Согласно ТР/ТС 029/2012 пищевые продукты, сухие, порошкобразные
должны содержать не более 10 г/кг. Суточная потребность в фосфоре для человека в
среднем
составляет
около
1-2
г
в
сутки
[https://ru.wikipedia.org/wiki/%D4%EE%F1%F4%EE%F0]. Следовательно, количество
фосфатов, содержащееся в эмбриональной массе кедрового стланика, не превышает
допустимых норм и не представляется опасным.
Вольтамперометрический анализ выявил незначительное содержание меди в
эмбриональной массе, во многих пробах близкое к пределу обнаружения. Присутствие
свинца и кадмия в ходе анализа не обнаружилось. В тоже время, на
вольтамперограммах во всех пробах чётко прослеживались чрезвычайно высокие пики
накопления цинка. Содержание цинка в эмбриональной массе кедрового стланика
варьировало в пределах от 8,1 до 11,0 мг/кг сырого веса, что составило в среднем 9,55 ±
2,67 мг/кг сырого веса. Цинк относится к биогенным элементам и стоит на втором
месте после железа по важности для человеческого организма, участвуя во всех
процессах, которые обеспечивают его жизнедеятельность. Суточная потребность
человеческого организма в цинке зависит от его возраста и физиологического
состояния и для взрослого человека в среднем варьирует в пределах 15 – 20 мг. В сухом
веществе эмбриональных масс такое количество содержится в 45 – 60 г. Токсичность
наблюдается при дозах более 150 мг в сутки.
ПДК содержания цинка в сырых растительных продуктах составляет не более 10мг/кг,
для пектиновых веществ 25 (ТР/ТС 021/2011). Следовательно, эмбриональные массы
кедрового стланика можно рассматривать в качестве потенциального источника цинка,
как биогенного элемента в составе БАД, и, возможно, в составе косметических средств.
В ходе тестирования эмбриональной массы кедрового стланика Paramecium
caudatum поведение инфузорий и морфология их тела не изменялись по сравнению с
контролем. Форма тела также оставалась без изменений на протяжении всего
эксперимента. Средние показатели выживаемости инфузорий в контроле и в опыте
достоверно не различались (t = 0,53, что меньше критического уровня (1,29) для
доверительной вероятности P=0,80). Индекс токсичности вытяжки в опыте составил
0,03734, что соответствует допустимому уровню токсичности.
Хронический эксперимент показал, что добавление вытяжки из эмбриональной
массы не только не проявляет токсичности по отношению к тест-объекту, но
стимулирующее действие на размножение парамеций. За все время эксперимента
количество парамеций в контроле увеличилось на 60 %, а в опыте – более чем на 81 %.
При этом интенсивность размножения шла по экспоненте. В первые сутки
эксперимента лаг-фаза и в контроле и опыте завершилась делением, и количество
клеток инфузорий в обоих случаях увеличилось вдвое и составило одинаковое
значение. В течение вторых суток регенеративная активность в контроле была
достоверно значительно слабее (P=0,99) по сравнению с опытом: количество клеток
инфузорий в контроле увеличилось на 20%, тогда как в опыте этот показатель составил
62%.
При использовании вытяжки эмбриональной массы в качестве корма для
инфузорий уже на вторые сутки визуально наблюдалось значительное увеличение
плотности культуры парамеций по сравнению с контролем, где использовался
традиционный корм – пекарские дрожжи.
Таким образом, химико-аналитическими исследованиями установлено, что
количество фосфатов, содержащееся в эмбриональной массе кедрового стланика, не
превышает допустимых норм и не представляется опасным. В ходе анализа выявлено
незначительное содержание меди и отсутствие таких тяжелых металлов, как свинец и
кадмий. В эмбриональной массе кедрового стланика обнаружено относительно высокое
содержание цинка (9,55 ± 2,67 мг/кг сырого веса при влажности 96,7%). В ходе
биотестирования эмбриональной массы кедрового стланика Paramecium caudatum
вытяжка из эмбриональной массы не только не проявляла токсичности по отношению к
тест-объекту, но и оказывала стимулирующее действие на размножение парамеций.
Отсутствие токсичности, присутствие стимулирующего эффекта, содержание в составе
биогенного элемента цинка позволяет рассматривать эмбриональную массу кедрового
стланика в качестве потенциального источника БАВ в составе БАД, и, возможно, в
составе косметических средств.
Библиография.
1.
Aksinenko M.A., Larina N.P., Noskova N.E., Martynova O.V. The preliminary
research of somatic embryonal lines of pines as the perspective sources of protein-containing
bioadditives Экология, окружающая среда и здоровье человека: XXI век: мат-лы
Международ. (заоч.) науч.-практ. конф. / Краснояр. гос. аграр. ун-т. – Красноярск, 2014.
С. 26-28
2.
ГОСТ Р 51430-99. Соки фруктовые и овощные. Спектрофотометрический метод
определения содержания фосфора
3.
ГОСТ Р 51301-99. Продукты пищевые и продовольственное сырье.
Инверсионно-вольтамперометрические методы определения содержания токсичных
элементов (кадмия, свинца, меди и цинка).
4.
МУ 31-04/04. Количественный химический анализ проб пищевых продуктов,
продовольственного сырья, кормов и продуктов их переработки. Методика выполнения
измерений массовых концентраций цинка, кадмия, свинца и меди методом
инверсионной вольтамперометрии на анализаторах типа ТА. Томск: ООО
«Томьаналит», 2004. 19 с.
5.
ТР/ТС 029/2012. Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов
и технологических вспомогательных средств